Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek w ramach projektu CLARITY

Podsumowanie

Neuronalna morfologia dendrytyczna często leży u podstaw funkcji. Rzeczywiście, wiele procesów chorobowych, które wpływają na rozwój neuronów, objawia się fenotypem morfologicznym. Protokół ten opisuje prostą i potężną metodę analizy nienaruszonych altan dendrytycznych i związanych z nimi kolców.

Streszczenie

Aktywność mózgu, sygnały elektrochemiczne przekazywane między neuronami, jest determinowana przez wzorce połączeń sieci neuronalnych oraz przez morfologię procesów i podstruktur w tych neuronach. W związku z tym wiele z tego, co wiemy o funkcjonowaniu mózgu, pojawiło się wraz z rozwojem technologii obrazowania, które umożliwiają dalszy wgląd w to, jak neurony są zorganizowane i połączone w mózgu. Ulepszenia w oczyszczaniu tkanek pozwoliły na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości grubych wycinków mózgu, ułatwiając rekonstrukcję morfologiczną i analizę podstruktur neuronalnych, takich jak altany dendrytyczne i kolce. Równocześnie, postępy w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów zapewniają metody szybkiej analizy dużych zbiorów danych obrazowych. W pracy przedstawiono stosunkowo szybką metodę przetwarzania, wizualizacji i analizy grubych warstw znakowanej tkanki nerwowej w wysokiej rozdzielczości przy użyciu oczyszczania tkanek CLARITY, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazu. Protokół ten ułatwi wysiłki zmierzające do zrozumienia wzorców połączeń i morfologii neuronów, które charakteryzują zdrowe mózgi, oraz zmian w tych cechach, które pojawiają się w chorych stanach mózgu.

Wprowadzenie

Zrozumienie organizacji przestrzennej, wzorców połączeń i morfologii złożonych trójwymiarowych struktur biologicznych jest niezbędne do określenia funkcji konkretnych komórek i tkanek. Jest to szczególnie prawdziwe w neurobiologii, w której ogromny wysiłek włożono w zbudowanie wysokiej rozdzielczości neuroanatomicznych map ośrodkowego układu nerwowego^1,2. Dokładne zbadanie neuronów, które składają się na te mapy, daje różne morfologie, z połączeniami i lokalizacjami, które odzwierciedlają funkcję tych różnych zestawów neuronów^3,4. Co więcej, badanie struktur subkomórkowych, zwłaszcza kolców dendrytycznych, może informować o dojrzałości synaps, odzwierciedlając w ten sposób procesy rozwojowe i stany chorobowe neurologiczne^5,6,7. W związku z tym podejścia, które poprawiają rozdzielczość i przepustowość obrazowania, są niezbędne do lepszego zrozumienia funkcji mózgu we wszystkich skalach.

Ostatnie osiągnięcia poszerzyły molekularny i genetyczny zestaw narzędzi do oznaczania i manipulowania populacjami neuronów. Opracowanie nowych markerów fluorescencyjnych, w połączeniu z nowymi metodami wprowadzania tych markerów do neuronów, pozwala na zróżnicowane znakowanie populacji oddziałujących neuronów w obrębie tego samego zwierzęcia lub próbki mózgu^8,9,10,11. Ponieważ światło jest rozpraszane przez nieprzezroczyste lipidy i biorąc pod uwagę wysoką zawartość lipidów w tkance mózgowej, obrazowanie populacji neuronów ograniczało się głównie do cienkich odcinków lub opierało się na zaawansowanych technikach mikrostropii (np. mikroskopii konfokalnej, wielofotonowej i arkuszowej) w celu zobrazowania głębokich struktur. Wysiłki te zostały jednak znacznie wzmocnione przez postępy w technikach oczyszczania tkanek. Jedną z takich technik jest przezroczysta, wymieniana lipidami sztywna obrazowanie z hybrydyzacją akrylamidową/barwienie immunologiczne/hybrydyzacja in situ (CLARITY), w której interesujące tkanki są podawane za pomocą monomerów hydrożelowych (akrylamid i bis-akrylamid), a następnie myte detergentami¹². Monomery hydrożelowe hybrydyzują, tworząc stabilne rusztowanie hydrożelowe 3D, które jest optycznie przezroczyste i przepuszczalne dla etykiet makromolekuł. Kwasy nukleinowe i białka są utrzymywane w zhybrydyzowanej matrycy, podczas gdy lipidy są usuwane przez pranie detergentowe (Rysunek 1). W ten sposób uzyskuje się stabilną tkankę, która jest wystarczająco sztywna, aby zachować pierwotny kształt i orientację komórek i cząsteczek nielipidowych, a jednocześnie optycznie wystarczająco przezroczysta, aby łatwo obrazować głębokie struktury w wysokiej rozdzielczości. To utrzymanie struktury i orientacji tkanki pozwala na obrazowanie grubych plastrów, zachowując w ten sposób połączenia międzykomórkowe i relacje przestrzenne. Co więcej, ponieważ lokalizacja i dostępność białek i kwasów nukleinowych jest utrzymywana podczas procesu oczyszczania, oczyszczone tkanki są w stanie przechowywać markery oparte na ekspresji, a także znaczniki egzogenne. W związku z tym CLARITY nadaje się jako skuteczna metoda obrazowania dużych ilości głębokich struktur mózgu i połączeń między tymi strukturami w wysokiej rozdzielczości.

Użycie CLARITY znacznie poprawia podejście do obrazowania populacji neuronów. Technika ta jest szczególnie skuteczna w generowaniu dużych ilości danych obrazowych. CLARITY dobrze współpracuje z wieloma formami fluorescencji opartej na białkach. Protokół ten wykorzystuje podejście oparte na lentiwirusie do rzadkiego znakowania komórek za pomocą EGFP i tdTomato; jednak rutynowo stosuje się transgeniczne allele reporterowe wykazujące ekspresję tdTomato lub EGFP w celu znakowania komórek do rekonstrukcji. Ważne jest, aby wybrać fluorofor, który jest zarówno fotostabilny, jak i jasny (np. EGFP lub tdTomato). Dodatkowo, użycie silnego promotora do ekspresji fluoroforu zapewnia doskonały kontrast i jakość obrazu. Wady tej techniki wynikają z tego, że prawidłowa analiza tak dużej ilości danych może być zarówno pracochłonna, jak i czasochłonna. Specjalistyczne mikroskopy mogą pomóc w zwiększeniu przepustowości i zmniejszeniu obciążenia pracą. Jednak budowa, posiadanie i/lub eksploatacja zaawansowanych mikroskopów jest często zbyt kosztowna dla wielu laboratoriów. W pracy przedstawiono wysokoprzepustową, stosunkowo szybką i prostą metodę wizualizacji dużych ilości tkanki nerwowej w wysokiej rozdzielczości przy użyciu oczyszczania tkanek dużych skrawków metodą CLARITY w połączeniu ze standardową mikroskopią konfokalną. Protokół ten opisuje to podejście poprzez następujące kroki: 1) wypreparowanie i przygotowanie tkanki nerwowej, 2) oczyszczenie tkanki, 3) zamontowanie tkanki, 4) obrazowanie przygotowanych wycinków oraz 5) przetwarzanie obrazów pełnych warstw za pomocą rekonstrukcji i analizy oprogramowania do wizualizacji mikroskopii (Rysunek 2). Wysiłki te skutkują obrazami o wysokiej rozdzielczości, które można wykorzystać do analizy populacji neuronów, wzorców połączeń neuronalnych, morfologii dendrytycznej 3D, obfitości i morfologii kolców dendrytycznych oraz wzorców ekspresji molekularnej w nienaruszonej tkance mózgowej.

Protokół

Poniższy protokół jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami w Baylor College of Medicine.

1. Preparacja i przygotowanie tkanek

1. Poddaj mysz eutanazji z przedawkowaniem izofluranu, umieszczając mysz w zamkniętym pojemniku z ręcznikiem nasączonym izofluranem (lub innymi środkami zatwierdzonymi przez UUCAC).
2. Perfuzję zwierzęcia przeszyderczo za pomocą igły 25 G z 10 ml lodowatego PBS, a następnie 10 ml 4% PFA.
3. Przeanalizuj interesujący Cię obszar (lub tkankę) mózgu.
4. Wypreparowaną tkankę należy umieścić na noc w 4% PFA w temperaturze 4 °C. Właściwe utrwalenie jest kluczem do tego protokołu. Nie pomijaj ani nie skracaj tego kroku.
5. Po utrwaleniu w 4% PFA przez co najmniej 12 godzin, przenieść tkankę do mieszaniny 4% akryloamidu hydrożelu na 24 godziny w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Podczas rozmrażania hydrożelu upewnij się, że nie uległ polimeryzacji, może się to zdarzyć, jeśli hydrożel stanie się zbyt ciepły. Rozmrozić na lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji.

2. Oczyszczanie tkanek

1. Umieścić tkankę mózgową (nadal zanurzoną w hydrożelu) w inkubatorze próżniowym na 3 godziny w temperaturze 37 °C i próżni -90 kPa. Pozostaw górną część rurki odkręconą, aby próżnia mogła się prawidłowo wytworzyć.
2. Myć chusteczkę PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej (25 °C), delikatnie wstrząsając.
3. Umieść spolimeryzowaną próbkę tkanki w komorze elektroforetycznej, zwracając uwagę na orientację tkanki w komorze.
4. Napełnij komorę i zbiornik dostarczonym buforem SDS do elektroforezy.
5. Badaj próbkę przy napięciu 70 V, 1 A i 35 C, przy stałym prądzie dla około 2 h/mm tkanki.
   1. Okresowo sprawdzaj próbkę; może to wymagać więcej czasu w komorze, aby prawidłowo się oczyścić. Dobrym punktem wyjścia do oczyszczenia jest 1-2 h na mm tkanki mózgowej. Cały mózg myszy potrzebuje 8-10 godzin na wystarczające oczyszczenie. Zapamiętaj orientację próbki przed wyjęciem jej z komory i pamiętaj, aby włożyć ją z powrotem do komory w tej samej orientacji.
      UWAGA: Rysunek 3A pokazuje, jak będzie wyglądał w pełni oczyszczony mózg. Na tym etapie mózg będzie wyglądał na nieprzezroczysty i niejasny ze względu na obecność rozpuszczonej SDS, ale po ekstrakcji lipidów nie powinno być żadnego żółtego odcienia tkanki.

3. Przygotowanie i montaż oczyszczonej tkanki

1. Po tym, jak próbka zakończy oczyszczanie i stanie się wystarczająco przejrzysta, umyć ją w PBS przez noc w temperaturze pokojowej. Wymieniaj PBS na nowy PBS tak często, jak to możliwe. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla usunięcia resztkowych SDS, które mogą tworzyć osady w późniejszych krokach.
2. Po ostatnim umyciu w PBS myj chusteczkę przez 5 minut w wodzie dejonizowanej o temperaturze pokojowej trzy razy. Na tym etapie tkanka stanie się nieprzezroczysta i może się rozszerzyć.
3. Inkubować tkankę w roztworze dopasowania współczynnika załamania światła (patrz tabela 1) przez co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej. Rysunek 3B pokazuje kawałek oczyszczonej tkanki po inkubacji w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła.
4. Podczas inkubacji tkanki w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła należy skonstruować odpowiednią komorę do obrazowania próbki, jeśli to konieczne.
5. Budowa komory obrazowania dla małych próbek/wycinków tkanek
   1. Używając szklanej prowadnicy jako podstawy do montażu, połóż gumowe lub plastikowe przekładki i zabezpiecz super klejem. Jeśli gotowe przekładki nie są dostępne, użyj plastikowych pierścieni wykonanych ze stożkowych przekrojów rur.
   2. Upewnij się, że te elementy są przymocowane do szkiełka bez żadnych otworów (Rysunek 3C).
   3. Umieść oczyszczoną tkankę w komorze montażowej wstępnie wypełnionej roztworem dopasowującym współczynnik załamania światła.
   4. Bezpiecznie zamocuj chusteczkę, umieszczając na niej szklane szkiełko nakrywkowe i uszczelniając je lakierem do paznokci.
   5. Zobrazuj tę tkankę, dodając kroplę roztworu montażowego pasującego do współczynnika załamania światła bezpośrednio na powierzchni szkła.
6. Duża komora do obrazowania tkanek
   1. Zbuduj tę komorę, jeśli tkanka jest większa niż 5 mm grubości (odpowiednia dla całych mózgów lub półkul).
   2. Używając szklanego naczynia o średnicy 10 cm z wysoką ścianką, umieść stożkową rurkę o pojemności 50 ml pośrodku, upewniając się, że średnica stożka jest wystarczająco duża, aby pomieścić tubus używanej soczewki obiektywu.
   3. Przygotuj 3% agarozy w wodzie i wlej ją do przestrzeni między szklanym naczyniem a stożkową rurką, pozostaw do ostygnięcia na 1 godzinę (Rysunek 3D). W ten sposób utworzy się pierścień z litej agarozy (Rysunek 3E).
   4. Bezpiecznie przyklej tkankę do dna komory za pomocą super kleju i napełnij komorę roztworem dopasowującym współczynnik załamania światła. Nałóż klej, aby przykleić tkankę do obszaru, który nie będzie obrazowany, aby umożliwić odzyskanie tkanki z naczynia bez uszkadzania obszarów zainteresowania.
      UWAGA: Ten preparat jest wrażliwy na czas, ponieważ ośrodki o współczynniku załamania światła mogą zacząć polimeryzować, jeśli nie zostaną zachowane z powietrza i nie będą przechowywane w temperaturze 4 °C.

4. Obrazowanie oczyszczonych próbek tkanek

1. Uzyskaj obraz za pomocą mikroskopu konfokalnego dopasowanego do obiektywu 25x/0,95 NA z odległością roboczą 4 mm.
2. Włącz wszystkie odpowiednie urządzenia do przetwarzania obrazu. Umieść próbkę na stoliku i umieść kroplę roztworu pasującego do współczynnika załamania światła na górze komory montażowej.
3. Ostrożnie podejdź do mediów zanurzeniowych z obiektywem i uformuj ciągłą kolumnę mediów.
4. Korzystając z epifluorescencji, znajdź odpowiednie pole obrazowania.
5. Rozpocznij procedurę akwizycji obrazu od przetestowania odpowiednich ustawień.
   1. Zacznij od ustawienia rozdzielczości i prędkości skanowania, korzystając z Rysunek 4A jako przewodnik. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego należy całkowicie zamknąć otwór, aby uzyskać najmniejszy przekrój optyczny, a tym samym najlepszą rozdzielczość z.
   2. Stopniowo zwiększaj moc lasera/wzmocnienie czujnika, aż do uzyskania odpowiedniego obrazu o wysokim stosunku sygnału do szumu.
   3. Jeśli korzystasz ze standardowego obrazowania dwukolorowego EGFP/tdTomato, ustaw ustawienia zbierania światła, używając Rysunek 4B jako przewodnika.
   4. Ustaw parametry z-stack na podstawie obserwowanych punktów początkowych i końcowych tkanki. Ustaw rozmiar kroku w oparciu o żądaną rozdzielczość z, używając Rysunek 4C jako przewodnik.
      UWAGA: Mniejsze rozmiary kroków zapewnią większą rozdzielczość z, ale wprowadzą również dłuższy czas przebywania lasera, co potencjalnie prowadzi do wybielania próbki.
   5. Jeśli ustawienia akwizycji obrazu są zadowalające, uzyskaj obraz.
   6. Upewnij się, że obraz ma wysoki stosunek sygnału do szumu i pokazuje wyraźne granice struktur ( Rysunek 4D).

5. Przetwarzanie obrazów i kwantyfikacja 3D za pomocą oprogramowania do analizy mikroskopowej

UWAGA: Pakiety oprogramowania do analizy obrazów mikroskopowych są potężnymi narzędziami do trójwymiarowej wizualizacji i przetwarzania obrazów. Wiele z tych programów doskonale nadaje się do obsługi dużych zbiorów danych, które są generowane na podstawie obrazowania oczyszczonych próbek tkanek. Poniższe kroki i związane z nimi rysunki odpowiadają przepływowi pracy w oprogramowaniu Imaris.

1. Otwórz stos obrazów i zaimportuj go do wybranego oprogramowania analitycznego.
2. Wyświetl obraz w przestrzeni trójwymiarowej i wprowadź dowolne zmiany w tabelach przeglądowych za pomocą regulatora wyświetlania, aby lepiej zobrazować obraz.
   UWAGA: Rysunek 5A pokazuje możliwą ekstremalną głębokość obrazowania dostępną za pomocą mikroskopii 2-fotonowej w połączeniu z oczyszczaniem tkanek metodą CLARITY. Rysunek 5B pokazuje wyraźne procesy dendrytowe, jak również wyraźnie widoczne morfologie kręgosłupa z z-stack przedstawione w Rysunek 5A.
3. Aby odfiltrować dowolne spójne tło, kliknij przycisk Przetwarzanie obrazu i wybierz filtr odejmowania tła.
   UWAGA: Rysunek 5C pokazuje obraz ze stałym sygnałem zamglonego tła przed przetworzeniem. Rysunek 5D pokazuje obraz po zastosowaniu filtra odejmowania tła.
4. Obserwuj obraz 3D i zapoznaj się z nim, patrząc na niego pod różnymi kątami i na wielu poziomach powiększenia.
5. Rozpocznij śledzenie dendrytów, wybierając najpierw narzędzie Śledzenie filamentu.
6. Kliknij Edytuj filament ręcznie, pomiń automatyczne tworzenie.
7. Ustaw tryb na automatyczną ścieżkę i zaznacz opcję Automatyczne centrowanie i Automatyczne korekcje średnicy.
8. Shift + kliknij prawym przyciskiem myszy treść komórki, aby ustawić punkt początkowy.
9. Prześledź neuron na całej długości dendrytu; kliknij lewym przyciskiem myszy na końcu dendrytu, aby ustawić punkt zakończenia, aby umożliwić oprogramowaniu automatyczne obliczenie ścieżki między punktem początkowym i końcowym.
10. Powtórz ten krok dla wszystkich dendrytów i w pełni prześledź strukturę komórki.
11. Zwizualizuj śledzoną komórkę i potwierdź jej dokładność. W razie potrzeby dokonaj ręcznych regulacji.
12. Wybierz kartę Tworzenie.
13. Wybierz opcję Ponownie oblicz średnicę dendrytu.
14. Postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora, aby uzyskać dokładniejszy dendryt.
15. Wybierz kartę Rysuj.
16. Kliknij przycisk radiowy Grzbiet, aby rozpocząć rysowanie grzbietów.
17. Ustaw przybliżoną średnicę grzbietu zgodnie z potrzebami i użyj narzędzia pomiarowego, aby uzyskać dokładne odwzorowanie średnic kręgosłupa.
18. Kliknij na środek głów kręgosłupa, aby dodać nowy kręgosłup.
19. Powtórz to dla wszystkich kolców dendrytu.
    UWAGA: Ważne jest, aby obserwować dendryt pod wszystkimi możliwymi kątami podczas ręcznego dodawania kolców.
20. Sprawdź nowo dodane kolce pod kątem dokładności i wprowadź zmiany w razie potrzeby.
21. Wybierz kartę Tworzenie.
22. Wybierz opcję Recompute Spine Diameter (Oblicz ponownie średnicę kręgosłupa), aby umożliwić oprogramowaniu określenie prawidłowych średnic głowy i szyi, które mają kluczowe znaczenie dla dalszej analizy danych.
23. Postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora tworzenia średnicy grzbietu, aby zakończyć.
24. Obserwuj wynik obliczeń i w razie potrzeby dokonaj ręcznych korekt. Rysunek 5E pokazuje w pełni śledzony neuron wraz z kolcami.
25. Aby utworzyć klasyfikowaną listę grzbietów, wybierz zakładkę Narzędzia.
    UWAGA: Aby to zadziałało, musi być zainstalowane rozszerzenie MATLAB.
    1. Aby zainstalować rozszerzenie MATLAB, otwórz okno preferencji.
    2. Wybierz opcję Narzędzia niestandardowe.
    3. Dodaj odpowiednie środowisko uruchomieniowe MCR programu MATLAB.
26. Kliknij Klasyfikuj kolce.
27. Edytuj żądane parametry klasyfikacji kręgosłupa.
28. Kliknij Classify Spines w rozszerzeniu MATLAB. Rysunek 5F pokazuje dendryt pokryty kolorowymi sklasyfikowanymi kolcami.
29. Wybierz kartę Statystyki.
30. Skonfiguruj żądane statystyki, aby określić ilościowo dane, klikając przycisk Konfiguruj w lewym dolnym rogu tej zakładki.
31. Po wybraniu metody reprezentacji statystyk wyeksportuj dane za pomocą przycisku Eksportuj statystyki na karcie do pliku znajdującego się w prawym dolnym rogu tego okna.
32. Wykres statystyk przy użyciu preferowanej metody tworzenia wykresów.

Wyniki

Po pozyskaniu obrazu, reprezentatywna morfologia komórki została przeanalizowana za pomocą wbudowanych statystyk i skryptów klasyfikujących w oprogramowaniu do analizy. Zebrane dane (Rysunek 6A) pokazują, że neuron 2 ma większą strukturę dendrytyczną z większą gęstością kolców. Ogólnie rzecz biorąc, dane sugerują, że neuron 2 ma bardziej złożoną strukturę dendrytyczną w porównaniu z neuronem 1. Aby uzasadnić ten wynik, przeprowadzono standardową analizę Sholla, która potwierdza, że neuron 2 ...

Dyskusja

Przed pojawieniem się współczesnych technik oczyszczania tkanek badanie morfologii neuronów polegało na czasochłonnym cięciu, obrazowaniu i rekonstrukcji sąsiednich bardzo cienkich odcinków. Elektroforetyczne oczyszczanie tkanek w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym zapewnia niezakłócony obraz pełnej morfologii neuronów. Od nienaruszonych drzew dendrytycznych po najmniejsze buliony synaptyczne, obrazowanie i ilościowe określanie morfologii neuronów nigdy nie było bardziej wykonalne.

Przygoto...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurka stożkowa 15 ml	Thermo Scientific	339650
Igła 25 G x 1" BD		305127
30% akrylamid (No-Bis)	National Diagnostics	EC-810
50 ml Rurka stożkowa	Thermo Scientific	339653
Elektroforetyczne rozwiązanie do oczyszczania tkanek	Logos	C13001
Histodenz	Sigma	D2158-100G
Zestaw roztworów hydrożelowych	Logos	C1310X
Imaris	Oxford Instruments	N/A
Paraformaldehyd 16%	EMS	15710
PBS, 1x, 500 mL, 6 butelek/opakowanie	fisher	MT21040CV
VA-044	Wako	925-41020
X-CLARITY System polimeryzacji	Logos	C20001
System oczyszczania tkanek X-CLARITY II	Logos	C30001