Opisujemy protokół znakowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z makrofagów barwnikami PKH i obserwowania ich absorpcji in vitro i w rdzeniu kręgowym po podaniu dokanałowym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wychwyt znakowanych fluorescencyjnie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych in vitro i w rdzeniu kręgowym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEVs) to pęcherzyki o długości 50-150 nm wydzielane przez wszystkie komórki i obecne w płynach ustrojowych. SV przenoszą biomolekuły, takie jak RNA, białka i lipidy, z komórek dawcy do komórek akceptorowych, co czyni je kluczowymi mediatorami sygnałowymi między komórkami. W ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) sEV mogą pośredniczyć w sygnalizacji międzykomórkowej, w tym w interakcjach neuroimmunologicznych. Funkcje sEV można badać, śledząc wychwyt znakowanych sEV w komórkach biorcy zarówno in vitro, jak i in vivo. W artykule opisano znakowanie sEV z kondycjonowanych pożywek komórek makrofagów RAW 264.7 przy użyciu barwnika błonowego PKH. Pokazuje wychwyt różnych stężeń znakowanych sEV w wielu punktach czasowych przez komórki Neuro-2a i pierwotne astrocyty in vitro. Pokazano również wychwyt sEV dostarczanych dooponowo w neuronach rdzenia kręgowego myszy, astrocytach i mikrogleju uwidoczniony za pomocą mikroskopii konfokalnej. Reprezentatywne wyniki wskazują na zależną od czasu zmienność w wychwytywaniu sEV przez różne komórki, co może pomóc w potwierdzeniu pomyślnego dostarczania sEV do rdzenia kręgowego.
Wprowadzenie
Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEVs) to nanosize'owe pęcherzyki błonowe o zakresie wielkości 50-150 nm. Pochodzą z ciał wielopęcherzykowych (MVB) i są uwalniane z komórek po fuzji MVB z błoną plazmatyczną. sEV zawierają miRNA, mRNA, białka i bioaktywne lipidy, a cząsteczki te są przenoszone między komórkami w postaci komunikacji międzykomórkowej. sEV mogą być internalizowane przez komórki biorcze przez różne szlaki endocytarne, a to wychwytywanie sEV przez komórki biorcze odbywa się za pośrednictwem rozpoznawania cząsteczek powierzchniowych zarówno na EV, jak i komórkach docelowych1.
sEVs zyskały zainteresowanie ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Drexel University College of Medicine. Myszy CD-1 w ciąży w ciąży w czasie wykorzystano do hodowli astrocytów, a wszystkie matki otrzymano 15 dni po zapłodnieniu. Dziesięciodwunastotygodniowe myszy C57BL/6 wykorzystano do eksperymentów z wychwytem in vivo.
1. Izolacja sEV z komórek makrofagów RAW 264.7
- Hodowla RAW 264,7 komórek w 75 cm2 kolbach w pożywce zubożonej w egzosomy DMEM zawierającej 10% zuboż....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po wyizolowaniu sEV z pożywki kondycjonowanej komórek RAW 264.7 za pomocą wirowania, do oznaczenia stężenia i rozkładu wielkości oczyszczonych sEV wykorzystano NTA. Średnia wielkość sEV pochodzących z komórek RAW 264.7 wynosiła 140 nm, a wielkość cząstek w piku wynosiła 121,8 nm, co potwierdza, że większość wykrywalnych cząstek w pomiarze rozpraszania światła mieściła się w zakresie wielkości egzosomów lub sEV wynoszącym 50-150 nm (Rysunek 1A). Zgodnie z wytycznymi zawartymi w minimalnych in.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym protokole pokazaliśmy znakowanie sEV barwnikami PKH oraz wizualizację ich wychwytu w rdzeniu kręgowym. Lipofilowe barwniki fluorescencyjne PKH są szeroko stosowane do znakowania komórek za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej 3,5,6,12,24,25. Ze względu na stosunkowo długi okres półtrwania i nisk.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez granty z NIH NINDS R01NS102836 oraz Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) przyznane Seena K. Ajit. Dziękujemy dr Bradleyowi Nashowi za krytyczną lekturę manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Filtry odśrodkowe Amicon Ultra 0,5 ml | MilliporePrzeciwciało | ||
| Abcam | ab186429 | 1:1000 | |
| Przeciwciało anty-Calnexin | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Przeciwciało anty-CD81 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Przeciwciało monoklonalne anty-GAPDH (14C10) | Sygnalizacja komórkowa Technologia | 2118 | 1:1000 |
| Przeciwciało przeciwko kwaśnemu białku fibrylarnemu przeciwglejowemu | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 dla IF; 1:1000 dla |
| przeciwciała IHC anty-Iba1 | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Przeciwciało anty-MAP2A | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | VWR | 0332 | |
| Sitko do komórek, 40 μ m | VWR | 15-1040-1 | |
| Probówki wirówkowe | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12 000 x g |
| Szkiełko nakrywkowe, 12 mm, #1.5 | Mikroskopia elektronowa Sciences | 72230-01 | |
| Szkiełko nakrywkowe, 18 mm, #1.5 | Mikroskopia elektronowa Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µ g / ml |
| DC Test białka | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoksyrybonukleaza I (DNAza I) | MiliporeSigma | D4513-1VL | |
| Osioł Anty-króliczy IgG H& L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Osioł IgG przeciw królikom H& L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Podwójnie matowe szkiełka mikroskopowe, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS bez wapnia i magnezu | Corning | 21-031-CV | |
| Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Zubożona w egzosomy płodowa surowica bydlęca | Gibco | A27208-01 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| System obrazowania FluorChem M | BiałkoSimple | ||
| FV3000 Mikroskop konfokalny | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H& L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Kozia anty-mysia IgG H& L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Kozia IgG1 Anty-Mysia IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | 1:500 |
| Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Podłoże HRP | Thermo Scientific | 34094 | |
| Bufor blokujący przechwycenie, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Bufor próbek Laemmli SDS | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| System NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | ||
| Oprogramowanie NanoSight NTA 3.2 | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Linia komórkowa | ATCC | CCL-131 | |
| Normalna kozia surowica | Laboratories | S-1000 | |
| Związek OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papaina | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehydowa | mikroskopia elektronowa | 19210 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Koktajl inhibitorów proteazy | Thermo Scientific | 1862209 | |
| Membrana transferowa PVDF | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Linia komórkowa | ATCC | TIB-71 | |
| Bufor RIPA | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Chlorek sodu | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Złote szkiełka Superfrost Plus Szkiełka | samoprzylepne | Thermo Scientific | 15-188-48 |
| Kolby T-75 | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Cyfrowy transmisyjny mikroskop elektronowy | Firma | ||
| TEM Grids | Mikroskopia elektronowa Nauki | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | enzym |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsyna, 0,25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | Probówki ultrawirówkowe Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Beckman | 344058 | 110 000 x g |
Bibliografia
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in viv....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
