Artykuł metodologiczny

Wychwyt znakowanych fluorescencyjnie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych in vitro i w rdzeniu kręgowym

DOI:

10.3791/62537

⸱

23 maja 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół znakowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z makrofagów barwnikami PKH i obserwowania ich absorpcji in vitro i w rdzeniu kręgowym po podaniu dokanałowym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEVs) to pęcherzyki o długości 50-150 nm wydzielane przez wszystkie komórki i obecne w płynach ustrojowych. SV przenoszą biomolekuły, takie jak RNA, białka i lipidy, z komórek dawcy do komórek akceptorowych, co czyni je kluczowymi mediatorami sygnałowymi między komórkami. W ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) sEV mogą pośredniczyć w sygnalizacji międzykomórkowej, w tym w interakcjach neuroimmunologicznych. Funkcje sEV można badać, śledząc wychwyt znakowanych sEV w komórkach biorcy zarówno in vitro, jak i in vivo. W artykule opisano znakowanie sEV z kondycjonowanych pożywek komórek makrofagów RAW 264.7 przy użyciu barwnika błonowego PKH. Pokazuje wychwyt różnych stężeń znakowanych sEV w wielu punktach czasowych przez komórki Neuro-2a i pierwotne astrocyty in vitro. Pokazano również wychwyt sEV dostarczanych dooponowo w neuronach rdzenia kręgowego myszy, astrocytach i mikrogleju uwidoczniony za pomocą mikroskopii konfokalnej. Reprezentatywne wyniki wskazują na zależną od czasu zmienność w wychwytywaniu sEV przez różne komórki, co może pomóc w potwierdzeniu pomyślnego dostarczania sEV do rdzenia kręgowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEVs) to nanosize'owe pęcherzyki błonowe o zakresie wielkości 50-150 nm. Pochodzą z ciał wielopęcherzykowych (MVB) i są uwalniane z komórek po fuzji MVB z błoną plazmatyczną. sEV zawierają miRNA, mRNA, białka i bioaktywne lipidy, a cząsteczki te są przenoszone między komórkami w postaci komunikacji międzykomórkowej. sEV mogą być internalizowane przez komórki biorcze przez różne szlaki endocytarne, a to wychwytywanie sEV przez komórki biorcze odbywa się za pośrednictwem rozpoznawania cząsteczek powierzchniowych zarówno na EV, jak i komórkach docelowych1.

sEVs zyskały zainteresowanie ze względu na ich zdolność do wywoływania zmian molekularnych i fenotypowych w komórkach akceptorowych, ich użyteczność jako środka terapeutycznego oraz ich potencjał jako nośników dla cząsteczek ładunkowych lub środków farmakologicznych. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, obrazowanie i śledzenie sEV może być trudne, zwłaszcza w przypadku badań in vivo i warunków klinicznych. W związku z tym opracowano wiele metod oznaczania i obrazowania sEV, aby wspomóc ich biodystrybucję i śledzenie in vitro i in vivo2.

Najczęstszą techniką badania biodystrybucji sEV i interakcji komórek docelowych jest znakowanie ich cząsteczkami barwnika fluorescencyjnego3,4,5,6,7. EV były początkowo znakowane barwnikami błony komórkowej, które były powszechnie używane do obrazowania komórek. Te barwniki fluorescencyjne na ogół barwią dwuwarstwę lipidową lub białka będące przedmiotem zainteresowania na sEV. Kilka barwników lipofilowych wykazuje silny sygnał fluorescencyjny po włączeniu do cytozolu, w tym DiR (jodek 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetrametyloindotrikarbocyjaniny), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′-tetrametyloindokarbocyjaninowy) i DiD (sól 1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetrametylo indokarbocyjaninianu 4-chlorobenzenosulfonianu)8,9,10,11.

Inne barwniki lipofilowe, takie jak PKH67 i PKH26, mają wysoce fluorescencyjną polarną grupę główną i długi alifatyczny ogon węglowodorowy, który łatwo interkaluje się w dowolną strukturę lipidową i prowadzi do długotrwałego zatrzymywania barwnika i stabilnej fluorescencji12. Barwniki PKH mogą również oznaczać EV, co pozwala na badanie właściwości EV in vivo13. Wiele innych barwników zostało użytych do obserwacji egzosomów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej, w tym barwniki znakujące lipidy14 i barwniki przepuszczalne dla komórek, takie jak ester sukcynimidylowy dioctanu karboksyfluoresceiny (CFDA-SE)15,16 i ester acetoksymetylu kalceiny (AM)17.

Badania nad przesłuchami między różnymi komórkami w OUN za pośrednictwem sEV dostarczyły ważnych informacji na temat patogenezy chorób neurozapalnych i neurodegeneracyjnych18. Na przykład, sEV z neuronów mogą rozprzestrzeniać peptydy beta-amyloidowe i fosforylowane białka tau oraz pomagać w patogenezie choroby Alzheimera19. Dodatkowo, EV pochodzące z erytrocytów zawierają duże ilości alfa-synukleiny i mogą przekraczać barierę krew-mózg i przyczyniać się do patologii choroby Parkinsona20. Zdolność sEV do przekraczania barier fizjologicznych21 i przenoszenia swoich biomolekuł do komórek docelowych sprawia, że są one wygodnymi narzędziami do dostarczania leków terapeutycznych do CNS22.

Wizualizacja wychwytu sEV przez niezliczone komórki OUN w rdzeniu kręgowym umożliwi zarówno badania mechanistyczne, jak i ocenę korzyści terapeutycznych egzogennie podawanych sEV z różnych źródeł komórkowych. W artykule opisano metodologię oznaczania sEV pochodzących z makrofagów i obrazowania ich wychwytu in vitro i in vivo w lędźwiowym rdzeniu kręgowym przez neurony, mikroglej i astrocyty w celu jakościowego potwierdzenia dostarczania sEV przez wizualizację.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Drexel University College of Medicine. Myszy CD-1 w ciąży w ciąży w czasie wykorzystano do hodowli astrocytów, a wszystkie matki otrzymano 15 dni po zapłodnieniu. Dziesięciodwunastotygodniowe myszy C57BL/6 wykorzystano do eksperymentów z wychwytem in vivo.

1. Izolacja sEV z komórek makrofagów RAW 264.7

  1. Hodowla RAW 264,7 komórek w 75 cm2 kolbach w pożywce zubożonej w egzosomy DMEM zawierającej 10% zubożonej w egzosomy płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zubożonej w egzosomy i 1% penicyliny-streptomycyny (pen-strep) przez 24-48 godzin.
  2. Zebrać 300 ml kondycjonowanej pożywki i odwirować przy 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Zebrać sklarowany osad i odwirować w temperaturze 2 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Przenieść supernatant do probówek wirówkowych, wirować przez 35 minut w temperaturze 12 000 × g w temperaturze 4 °C.
  5. Zebrać supernatant i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
  6. Przenieść do probówek ultrawirówek i wirować przez 80 minut w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C.
  7. Przechowywać supernatant (pożywkę zubożoną w egzosomy), ponownie zawiesić osad w 2 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i odwirowywać przez 1 godzinę w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C.
  8. Zawiesić osad w 100 μl PBS w celu dalszej charakterystyki przy użyciu analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) lub w buforze testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) do western blot.

2. Charakterystyka sEV

  1. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    UWAGA: Rozkład wielkości i liczba/stężenie cząstek oczyszczonych sEV z ogniw RAW 264.7 zostały zmierzone za pomocą NTA.
    1. Rozcieńczyć sEV w przefiltrowanym PBS, aby uzyskać 20-60 pęcherzyków na pole widzenia w celu optymalnego śledzenia.
    2. Wprowadzić rozcieńczoną próbkę do celi przepływowej za pomocą pompy strzykawkowej o stałym natężeniu przepływu.
    3. Zrób 3-5 filmów po 30 sekund każdy. Ustaw czas otwarcia migawki i wzmocnienie, a następnie ręcznie ustaw ostrość ustawień aparatu, aby uzyskać maksymalną liczbę pęcherzyków, które mają być widoczne i mogą być śledzone i analizowane.
    4. Przesuwaj próbki między każdym nagraniem, aby wykonać powtórzone pomiary. Zoptymalizuj ustawienia NTA po akwizycji i utrzymuj stałe ustawienia między próbkami.
    5. Przeanalizuj każdy film za pomocą oprogramowania NTA, aby uzyskać średnią wielkość i stężenie pęcherzyków.
    6. Wykonuj wszystkie pomiary NTA z identycznymi ustawieniami systemowymi w celu zapewnienia spójności.
  2. Plama zachodnia
    1. Określ ilościowo całkowite ilości białka w sEV, lizatach komórkowych i pożywkach zubożonych w egzosomy za pomocą zestawu do oznaczania białek zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. W celu przygotowania lizatu komórkowego należy hodować komórki RAW 264,7 w kolbach o długości 75cm2 do uzyskania 80-90% zlewu. Odłącz komórki z 0,25% trypsyną na 10-15 min, zneutralizuj trypsynę pożywką hodowlaną i osadź komórki, wirując z prędkością 400 × g przez 5 min. Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce wzrostowej.
    3. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przenieś 1 × 106 komórek do innej probówki. Przemyć komórki dwukrotnie PBS, stosując te same warunki wirowania, co powyżej, i dodać 50 μl buforu do lizy (bufor RIPA z dodatkiem koktajlu inhibitorów proteazy) do osadu komórkowego z ostatniego wirowania.
    4. Zwirować komórki i trzymać je na lodzie przez 20 minut. Mieszaninę poddać odwirowaniu w temperaturze 10 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, zebrać supernatant (tj. lizat) w świeżych probówkach do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    5. Skoncentrować 2 ml pożywki zubożonej w egzosomy do 100 μl za pomocą filtrów odśrodkowych o natężeniu 3 kDa przed ilościowym określeniem ilości białka. Wymieszaj sEV z buforem do lizy w stosunku 1:1, wiruj przez 30 s i inkubuj na lodzie przez 15 minut, aby określić ilościowo ilość białka.
    6. Wymieszaj równe ilości białka (2 μg) sEVs, lizatu komórkowego RAW 264.7 i pożywki zubożonej w egzosomy z redukującym buforem próbki.
    7. Denaturacja próbek w temperaturze 95 °C przez 5 minut, przetrzymywanie ich na lodzie przez 5 minut i wirowanie przez 2 minuty w temperaturze 10 000 × g. Załaduj próbki do 12% żelu białkowego tris-glicyny i uruchom żel pod napięciem 125 V przez 45 minut.
    8. Przenieść białko na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) pod napięciem 25 V przez 2 godziny.
    9. Po przeniesieniu należy zablokować membrany PVDF buforem blokującym (patrz Tabela Materiałów) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    10. Inkubować blot z przeciwciałami pierwszorzędowymi na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Podstawowymi stosowanymi przeciwciałami były anty-CD81 (1:1,000), anty-alfa-1,3/1,6-mannozylotransferaza (ALG-2)-oddziałujące białko X (Alix) (1:1,000), anty-kalnexin (1:1,000) i dehydrogenaza anty-gliceraldehydowo-3-fosforanowa (GAPDH) (1:1,000).
    11. Przemyj bloty 3 x 15 min 1x solą fizjologiczną buforowaną Tris, 0,1% Tween 20 (TBST) i inkubuj w temperaturze pokojowej z koziami przeciwciałami drugorzędowymi anty-mysimi IgG-chrzanowymi (HRP) lub osłem anty-króliczymi przeciwciałami drugorzędowymi IgG-HRP (1:10 000) przez 1 godzinę na shakerze.
    12. Przemyj bloty 3 x 15 min 1x TBST i wykryj białka za pomocą substratu HRP.
    13. Analizuj blot za pomocą wzmocnionej chemiluminescencji przy użyciu obrazowania western blot.
  3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
    1. Napraw sEV poprzez ponowne zawieszenie ich w 2% paraformaldehydzie (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym (PB); wir przez 2 x 15 s.
    2. Umieść kroplę 10 μl zawiesiny sEV na czystym parafilmie. Unosić pokrytą węglem siatkę formvar na kropli powlekaną stroną skierowaną w stronę zawieszenia. Pozwól membranom wchłonąć się przez 20 minut w suchym środowisku.
    3. Umieść kratki (membraną do dołu) na kropli PB do prania przez 3 x 2 min.
    4. Przenieść siatki do 50 μl 1% aldehydu glutarowego na 5 minut.
    5. Myć kratki 100 μl wody destylowanej przez 8 x 2 min.
    6. Porównaj próbkę, umieszczając siatki na kropli 1% octanu uranylu na 2 minuty.
    7. Zanurzyć próbkę w 50 μl 0,2% octanu uranylu z 2% roztworem metylocelulozy na 10 minut na pokrytym parafilmem naczyniu z lodem.
    8. Użyj pętli ze stali nierdzewnej, aby przytrzymać kratki i usunąć nadmiar płynu za pomocą bibuły filtracyjnej.
    9. Wysusz siatkę na powietrzu przez 10 minut, będąc jeszcze w pętli.
    10. Obserwować pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym przy napięciu 80 kV.

3. Etykietowanie sEV

  1. Rozcieńczyć 20 μg sEV w 1 ml buforu rozcieńczającego lub taką samą objętość PBS w 1 ml buforu rozcieńczalnika do kontroli barwnika.
  2. Rozcieńczyć 3 μl barwnika PKH67 lub PKH26 w 1 ml buforu rozcieńczalnika i wymieszać pipetując.
  3. Dodać rozcieńczony barwnik PKH do rozcieńczonych sEV i wymieszać przez pipetowanie. Inkubować przez 5 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. W celu kontroli barwnika należy zmieszać rozcieńczony barwnik z rozcieńczonym PBS z kroku 3.1.
  4. Dodać 2 ml 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS do probówki z mieszanką barwnika i sEV oraz do probówki kontrolnej barwnika, aby wchłonąć nadmiar barwnika.
  5. Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 2 ml PBS i wirować przez 1 godzinę w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C. Powtórzyć płukanie z PBS i ponownie zawiesić oznakowane sEVs lub kontrolę barwnika w równej objętości PBS.
  6. Określić ilościowo ilość białka całkowitego metodą Bradforda.

4. Wychwyt sEVs przez komórki Neuro-2a

  1. Umieścić 18-milimetrowe szkiełka nakrywkowe na płytce 12-dołkowej i płytkę 10 ×10 4 komórki Neuro-2a w każdym dołku w sumie 1 ml kompletnego podłoża DMEM zawierającego 10% FBS i 1% paciorkowca pióra.
  2. Zmień pożywkę na pożywkę zubożoną w egzosomy DMEM, gdy zbieg komórek wynosi 80-90%. Dodaj 1, 5 lub 10 μg znakowanych sEV do każdej studzienki przez 1, 4 i 24 godziny w celu wychwytu zależnego od dawki i czasu lub dodaj równą objętość kontroli barwnika.

5. Pierwotne kultury astrocytów

  1. Znieczulić 4 młode po urodzeniu 4 dni po urodzeniu, wywołując hipotermię.
  2. Zbierz mózgi na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty roztwór soli Hanka (HBSS) uzupełniony 10 mM kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES).
  3. Wypreparuj oba płaty korowe i usuń opony mózgowe. Zmiel chusteczki wysterylizowanym ostrzem.
  4. Przenieść tkanki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej bufor dysocjacyjny papainy/dezoksyrybonukleazy I i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Mieszać co 5 minut
    UWAGA: W przypadku 4 kory myszy 9 ml papainy o stężeniu 7,5 U/ml w HBSS aktywuje się w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut, filtruje przez filtr strzykawkowy 0,22 μm i miesza z dezoksyrybonukleazą I do końcowego stężenia 0,1 mg/ml.
  5. Odessać supernatant i dodać 5 ml kompletnego DMEM, aby dezaktywować aktywność enzymu. Ostrożnie rozetrzeć tkanki, aby oddzielić je od nich, za pomocą szklanej pipety serologicznej o pojemności 5 ml i wypolerowanej płomieniowo pipety Pasteura.
  6. Przepuścić zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 40 μm i odwirować komórki w temperaturze 250 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać pożywkę i zasiać komórki w 10 ml kompletnego DMEM w kolbie o średnicy 75cm2. Zastąp pożywkę sklarowaną nad osadem 15 ml świeżej pożywki DMEM 4 godziny po posiewie.
  7. Po 14 dniach in vitro przenieść kolbę do wytrząsarki orbitalnej w celu odłączenia mikrogleju i oligodendrocytów przy 320 obr./min na 6 godzin.
  8. Trypsynizować pozostałe astrocyty za pomocą 5 ml enzymu dysocjacji komórek (tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 5 ml kompletnego DMEM w celu inaktywacji działania enzymatycznego i zagnieździć komórki w ilości 250 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Ponownie zawieś komórki w kompletnym DMEM. Nasiona 5 × 104 komórki na szkiełkach nakrywkowych 12 mm #1.5 w płytce 24-dołkowej.

6. Wychwyt sEV przez astrocyty

  1. Gdy astrocyty osiągną 80-90% konfluencji, zmień pożywkę na pożywkę zubożoną w egzosomy DMEM.
  2. Dodaj 1 μg nieznakowanych, znakowanych sEV, równą objętość kontroli barwnika lub PBS do komórek. Używaj komórek do barwienia 1 h i 24 h po zabiegu sEV.

7. Immunofluorescencja

  1. Przepłukać komórki PBS 3x i utrwalić je 4% PFA w PB przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Przemyć stałe komórki 3 x 5 min PB i przepuścić je za pomocą 0,1% Triton X-100 w PB przez 10-15 min, a następnie przemyć PB 3 x 5 min.
  3. Zablokuj komórki 5% normalną surowicą kozią (NGS) w PB przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami: białkiem 2 związanym z mikrotubulami (MAP2A, 1:500) dla komórek Neuro-2a lub kwaśnym białkiem fibrylarnym gleju (GFAP, 1:500) dla pierwotnych astrocytów w świeżym 5% NGS/PB przez noc w temperaturze 4 °C z delikatnym wstrząsaniem.
  5. Przemyć 3 x 10 min PB i dodać sprzężone z fluoroforem przeciwciała drugorzędowe (Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; lub Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488) w 5% NGS i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na bujaku.
  6. Przemyć 3 x 10 min PB i inkubować z 1 μg/ml barwnika jądrowego 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie umyj komórki 3x PB.
  7. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach #1 za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu. Pozostawić je do wyschnięcia przez noc w ciemności i przechowywać przygotowane szkiełka podstawowe w temperaturze 4 °C do czasu zobrazowania pod mikroskopem konfokalnym.

8. Absorpcja sEV in vivo

  1. Wykonać dokanałowe wstrzyknięcie 5 μg nieznakowanych lub znakowanych sEV zawieszonych w 10 μl PBS lub równej objętości (10 μl) kontroli barwnika (przygotowanej w sekcji 3) do myszy C57BL/6.
  2. Po 6 i 18 godzinach od wstrzyknięcia sEVs, głęboko znieczulij myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg masy ciała ketaminy i 10 mg/kg masy ciała ksylazyny.
  3. Wykonaj perfuzję wewnątrzsercową myszy z 0,9% soli fizjologicznej, aby wypłukać krew, a następnie świeżo przygotowaną lodowatą 4% PFA/PB.
  4. Wypreparować rdzeń kręgowy i umieścić w 4% PFA/PB w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Kriochronić tkanki w 30% sacharozie w PB w temperaturze 4 °C przez 24 godziny lub do momentu, gdy tkanki opadną. Przechowywać tkanki w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania immunohistochemii.

9. Immunohistochemia

  1. Osadź rdzeń kręgowy L4-L5 w związku OCT. Zamrażać na suchym lodzie do całkowitego zestalenia.
  2. Tkanki należy przeciąć na głębokość 30 μm (przekrój poprzeczny dla rdzenia kręgowego) za pomocą kriostatu i zebrać skrawki na 24-dołkowej płytce zawierającej PB. Umyj sekcje 3 x 5 min 0,3% Tritonem w PB.
  3. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania za pomocą 5% NGS w 0,3% Triton/PB przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  4. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe: Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1,000), Iba1 dla mikrogleju (1:2,000) z 5% NGS w 0,3% Triton/PB i inkubować sekcje przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
  5. Przemyć skrawki 3 x 5 min 0,3% Tritonem/PB i dodać przeciwciała drugorzędowe (Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488, 1:500 lub Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488, 1:500) w 5% NGS/PB przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Przemyć 3 x 5 min PB i inkubować skrawki w 1 μg/ml DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj sekcje 3 x 5 min PB.
  7. Zamontuj sekcje na czystym szkiełku samoprzylepnym (Tabela materiałów) za pomocą cienkiego pędzla pod mikroskopem świetlnym.
  8. Zwilż szkiełko nakrywkowe medium montażowym. Utwardzać przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej.
  9. Obraz pod mikroskopem konfokalnym z odpowiednimi laserami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po wyizolowaniu sEV z pożywek kondycjonowanych RAW 264.7 poprzez wirowanie, NTA zostało użyte do określenia stężenia i rozkładu wielkości oczyszczonych sEVs. Średnia wielkość sEV pochodzących z RAW 264,7 wynosiła 140 nm, a szczytowa wielkość cząstek wynosiła 121,8 nm, co potwierdza, że większość wykrywalnych cząstek w pomiarze rozpraszania światła mieściła się w zakresie wielkości egzosomów lub sEV przy 50-150 nm (Rysunek 1A). Zgodnie z sugestią zawartą w minimalnych informacjach do badań pęcherzyków ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole pokazaliśmy znakowanie sEV barwnikami PKH oraz wizualizację ich wychwytu w rdzeniu kręgowym. Lipofilowe barwniki fluorescencyjne PKH są szeroko stosowane do znakowania komórek za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej 3,5,6,12,24,25. Ze względu na stosunkowo długi okres półtrwania i nisk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty z NIH NINDS R01NS102836 oraz Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) przyznane Seena K. Ajit. Dziękujemy dr Bradleyowi Nashowi za krytyczną lekturę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra 0,5 mlMilliporePrzeciwciało
Abcamab1864291:1000
Przeciwciało anty-CalnexinAbcamAb102861:1000
Przeciwciało anty-CD81Santa Cruz Biotechnologysc-1660291:1000
Przeciwciało monoklonalne anty-GAPDH (14C10)Sygnalizacja komórkowa Technologia21181:1000
Przeciwciało przeciwko kwaśnemu białku fibrylarnemu przeciwglejowemuSigma-AldrichMAB3601:500 dla IF; 1:1000 dla
przeciwciała IHC anty-Iba1Wako019-197411:2000
Przeciwciało anty-MAP2ASigma-AldrichMAB3781:500
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)VWR0332
Sitko do komórek, 40 μ mVWR15-1040-1
Probówki wirówkoweThermo Scientific3118-005012 000 x g
Szkiełko nakrywkowe, 12 mm, #1.5Mikroskopia elektronowa Sciences72230-01
Szkiełko nakrywkowe, 18 mm, #1.5Mikroskopia elektronowa Sciences72222-01
DAPISigma-AldrichD9542-1MG1 µ g / ml
DC Test białkaBio-Rad500-0116
Deoksyrybonukleaza I (DNAza I)MiliporeSigmaD4513-1VL
Osioł Anty-króliczy IgG H& L (HRP)Abcamab162841:10000
Osioł IgG przeciw królikom H& L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-212061:500
Podwójnie matowe szkiełka mikroskopowe, #1Thermo Scientific12-552-5
DPBS bez wapnia i magnezuCorning21-031-CV
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)Corning10-013-CV
Zubożona w egzosomy płodowa surowica bydlęcaGibcoA27208-01
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Corning35-011-CV
System obrazowania FluorChem MBiałkoSimple
FV3000 Mikroskop konfokalnyOlympus
Goat Anti-Mouse IgG H& L (HRP)Abcamab67891:10000
Kozia anty-mysia IgG H& L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110011:500
Kozia IgG1 Anty-Mysia IgG1, Alexa Fluor 594InvitrogenA-211251:500
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)VWR02-0121
HEPESGibco15630080
Podłoże HRPThermo Scientific34094
Bufor blokujący przechwycenie, TBSLI-COR Biosciences927-60001
Bufor próbek Laemmli SDSAlfa AesarAAJ61337AC
Micro Cover Glass, #1VWR48404-454
Microm HM550Thermo Scientific
System NanoSight NS300Malvern Panalytical
Oprogramowanie NanoSight NTA 3.2Malvern Panalytical
Neuro-2a Linia komórkowaATCCCCL-131
Normalna kozia surowicaLaboratoriesS-1000
Związek OCTSakura Finetek4583
PapainaWorthington Biochemical CorporationNC9597281
Paraformaldehydowamikroskopia elektronowa19210
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122
PKH26Sigma-AldrichMINI26-1KT
PKH67Sigma-AldrichMINI67-1KT
Koktajl inhibitorów proteazyThermo Scientific1862209
Membrana transferowa PVDFMDISVFX8302XXXX101
RAW 267.4 Linia komórkowaATCCTIB-71
Bufor RIPASigma-AldrichR0278
Chlorek soduAMRESCO0241-2.5KG
Złote szkiełka Superfrost Plus SzkiełkasamoprzylepneThermo Scientific15-188-48
Kolby T-75Corning431464U
Tecnai 12 Cyfrowy transmisyjny mikroskop elektronowyFirma
TEM GridsMikroskopia elektronowa NaukiFSF300-cu
Tris-Glycine Protein Gel, 12%InvitrogenXP00120BOX
Tris-Glycine SDS Running BufferInvitrogenLC26755
Tris-Glycine Transfer BufferInvitrogenLC3675
TrypLE ExpressGibco12605028enzym
Triton X-100Acros Organics327371000
Trypsyna, 0,25%Corning25-053-CL
Tween 20Probówki ultrawirówkowe Sigma-AldrichP1379
Beckman344058110 000 x g
anty-Alix Z677094 wektorowa FEIdysocjacji komórek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).
  2. Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594(2020).
  3. Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
  4. González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81(2021).
  5. Chuo, S. T. -Y., Chien, J. C. -Y., Lai, C. P. -K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91(2018).
  6. vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  7. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  8. Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
  9. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  10. Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
  11. Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316(2015).
  12. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029(2015).
  13. Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
  14. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  15. Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108(2011).
  16. Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
  17. Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
  18. Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
  19. De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203(2015).
  20. Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71(2017).
  21. Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
  22. Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  24. Hoen, E. N. M. N. -t, et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
  25. Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169(2018).
  26. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
  27. Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
  28. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).
  29. Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
  30. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533(2020).
  31. Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
  32. Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
  33. Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10(2018).
  34. Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wch anianie SEVznakowanie fluorescencyjnemikroskopia konfokalnakom rki Neuro 2aastrocyty pierwotnepodanie dokana oweWestern blottransfer adunku biomolekularnego

Powiązane artykuły