Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Organotypowe kultury warstwowe jako przedkliniczne modele mikrośrodowiska guza w pierwotnym raku trzustki i przerzutach

3.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62541

⸱

22 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University Medical Center Schleswig-Holstein, 2Institute of Medical and Marine Biotechnology, University of Lübeck, 3Fraunhofer Research and Development Center for Marine and Cellular Biotechnology, 4Institute for Surgical Pathology, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 5Tumorbank Comprehensive Cancer Center Freiburg, Medical Center - University of Freiburg, 6Core Facility Histopathology and Digital Pathology Freiburg, Medical Center - University of Freiburg

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje przygotowanie organotypowych kultur plastrowych (OTSC). Technika ta ułatwia hodowlę ex vivo nienaruszonej tkanki wielokomórkowej. OTSC mogą być natychmiast użyte do zbadania ich odpowiedniej odpowiedzi na leki w środowisku wielokomórkowym.

Streszczenie

Realistyczne modele przedkliniczne pierwotnego raka trzustki i przerzutów są pilnie potrzebne, aby przetestować odpowiedź na terapię ex vivo i ułatwić spersonalizowane leczenie pacjentów. Jednak brak mikrośrodowiska specyficznego dla nowotworu w obecnie stosowanych modelach, np. liniach komórkowych pochodzących od pacjentów i ksenoprzeszczepach, pozwala jedynie na ograniczony wgląd predykcyjny. Organotypowe kultury warstwowe (OTSC) składają się z nienaruszonej tkanki wielokomórkowej, którą można szybko wykorzystać do badania odpowiedzi na lek w rozdzielczości przestrzennej.

Ten protokół opisuje wytwarzanie i hodowlę żywotnych wycinków nowotworowych raka trzustki i jego przerzutów. Krótko mówiąc, tkanka jest odlewana w niskotopliwej agarozie i przechowywana w zimnym buforze izotonicznym. Następnie za pomocą wibratomu generowane są plastry tkanek o grubości 300 μm. Po przygotowaniu plastry są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz przy użyciu wkładek do hodowli komórkowych i odpowiedniego podłoża hodowlanego. Podczas hodowli można monitorować zmiany w różnicowaniu i żywotności komórek. Ponadto technika ta umożliwia zastosowanie leczenia do żywotnej ludzkiej tkanki nowotworowej ex vivo i późniejsze analizy, takie jak profilowanie transkryptomu i proteomu.

OTSC dają unikalną okazję do przetestowania indywidualnej odpowiedzi na leczenie ex vivo i zidentyfikowania indywidualnych profili transkryptomicznych i proteomicznych związanych z odpowiednią odpowiedzią różnych wycinków guza. OTSC mogą być dalej badane w celu zidentyfikowania strategii terapeutycznych w celu personalizacji leczenia pierwotnego raka trzustki i przerzutów.

Wprowadzenie

Istniejące przedkliniczne modele gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) i odpowiadające im przerzuty są słabymi predyktorami odpowiedzi na leczenie u pacjentów, co jest główną wadą w rozwoju leków i identyfikacji biomarkerów predykcyjnych1. Chociaż modele takie jak organoidy pochodzące od pacjentów i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów są obiecujące, ich zastosowanie pozostaje ograniczone2. Głównymi ograniczeniami tych modeli in vitro są brak mikrośrodowiska guza i ksenoprzeszczep u gatunków innych niż ludzie z obniżoną odpornością. Szczególnie w przypadku PDAC i jego przerzutów, mikrośrodowisko guza znacznie zyskało zainteresowanie w ciągu ostatnich lat ze względu na jego kluczowe funkcje w biologii nowotworu. Składa się ze składników komórkowych i bezkomórkowych, takich jak (mio-)fibroblasty, komórki gwiaździste trzustki, komórki odpornościowe, naczynia krwionośne, macierz zewnątrzkomórkowa, cytokiny i czynniki wzrostu3. To mikrośrodowisko nie jest niefunkcjonalnym składnikiem guza, ale indukuje progresję guza i przerzuty i wydaje się znacząco przyczyniać do oporności na radio- i chemioterapię4. Mikrośrodowisko PDAC nie tylko mechanicznie upośledza dostarczanie leków, ale także wykazuje aktywność immunologiczną i wymiatającą leki5,6,7. W związku z tym pilnie potrzebne są modele przedkliniczne, które odzwierciedlają złożoną interakcję komórek nowotworowych i mikrośrodowiska guza, aby odpowiednio przetestować odpowiedź pacjentów na leczenie ex vivo i kierować zindywidualizowanym leczeniem klinicznym.

Hodowle ex vivo świeżych próbek guza reprezentują bliskie przybliżenie guza in situ. Organotypowe kultury plastrów (OTSC) zostały niedawno opracowane i przebadane pod kątem kilku nowotworów, takich jak rak głowy, szyi, piersi, prostaty, płuc, okrężnicy i trzustki8,9,10,11,12. Wykazano, że OTSC utrzymują swoją podstawową morfologię, aktywność proliferacyjną i mikrośrodowisko podczas uprawy przez określony, zależny od tkanki okres11,12,13. OTSC PDAC utrzymywały swoją żywotność, morfologię i większość składników mikrośrodowiska guza przez 4-9 dni w kilku badaniach in vitro5,12,14. Patrząc perspektywicznie, technika ta umożliwia natychmiastowe zastosowanie leczenia do żywotnej ludzkiej tkanki nowotworowej ex vivo, a następnie dalsze analizy, takie jak profilowanie transkryptomu i proteomu.

Ustanowienie OTSC daje wyjątkową okazję do przetestowania odpowiedzi na leczenie ex vivo, zaraz po operacji. W ten sposób OTSC pozwolą prospektywnie zidentyfikować strategie terapeutyczne w celu personalizacji leczenia choroby przerzutowej. Protokół ten opisuje wytwarzanie i hodowlę żywotnych OTSC raka trzustki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki tkanek zostały pobrane i przetworzone po zatwierdzeniu przez lokalną komisję etyki Uniwersytetu w Lubece (# 16-281).

1. Pobieranie i obsługa świeżych tkanek

UWAGA: Z każdą nieutrwaloną próbką tkanki ludzkiej należy obchodzić się ostrożnie, aby zapobiec ryzyku infekcji patogenami przenoszonymi przez krew. Wszyscy pacjenci powinni zostać przebadani pod kątem ujemnego wyniku testu na obecność wirusa HIV, HBV i HCV przed rozpoczęciem przetwarzania tkanki. Nosić fartuch ochronny i obchodzić się z próbkami tkanek ludzkich w rękawiczkach.

  1. Natychmiast po zabiegu należy pobrać świeżą, nieutrwaloną i niezamrożoną próbkę tkanki PDAC o minimalnym rozmiarze 0,4 x 0,4 cm i przetransportować próbkę do laboratorium w roztworze do przechowywania tkanek.
  2. Jeśli to możliwe, natychmiast przetrzyj świeżą tkankę.
  3. Alternatywnie, należy przechowywać tkanki w roztworze do przechowywania tkanek na mokrym lodzie w temperaturze 4 °C przez noc. Jednak przechowywanie tkanek może powodować upośledzenie żywotności i generalnie należy tego unikać.

2. Przygotowanie

  1. Preparat z agarozy o niskiej temperaturze topnienia
    1. Przygotować 100 ml niskotopliwej agarozy (8%), rozpuszczając 8 g agarozy w 100 ml podgrzanego roztworu Ringera i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.
    2. Po ogłoszeniu resekcji guza rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej.
    3. Umieścić agarozę w podgrzanej łaźni wodnej (37 °C), pozwalając jej ostygnąć do temperatury fizjologicznej przed przygotowaniem.
  2. Konfiguracja wibratomu
    1. Umieść żyletkę w uchwycie wibratomu i wykonaj automatyczną regulację kąta zgodnie z instrukcjami producenta, jeśli dotyczy.
    2. Schłodzić płaszcz komory tnącej za pomocą agregatu chłodzącego lub mokrego lodu.
    3. Napełnij komorę tnącą około 100 ml fizjologicznego roztworu tnącego (np. roztworu Ringera).
    4. Umieść zamontowaną żyletkę we wstępnie schłodzonym roztworze do cięcia, pozwalając żyletce ostygnąć.

3. Zanurzanie tkanek w niskotopliwej agarozie

  1. Umyć próbkę tkanki schłodzonym (4 °C) PBS i umieścić tkankę w PBS na dużej (~14 cm) szalce Petriego na lodzie.
  2. Makroskopowo widoczny nadmiar tkanki łącznej z lodu należy usunąć za pomocą skalpela, ponieważ może to zmniejszyć wydajność cięcia.
  3. Umieść chusteczkę na małej szalce Petriego (~3 cm).
  4. Dostosować orientację tkanki tak, aby pozostała makroskopowo widoczna tkanka łączna miała taką samą orientację jak płaszczyzna dna płytki Petriego. Dno szalki Petriego ma taką samą orientację jak płaszczyzna cięcia.
  5. Wlej przygotowaną, niskotopliwą agarozę do małej szalki Petriego.
  6. W razie potrzeby dostosuj orientację tkanki za pomocą kleszczy.
  7. Umieść szalkę Petriego na mokrym lodzie, aby szybciej stwardniała agaroza.
  8. Ostrożnie przeciąć tkankę za pomocą skalpela, pozostawiając co najmniej 5 mm otaczającej agarozy z każdej strony tkanki.
  9. Ostrożnie przenieś osadzoną tkankę i przyklej ją do uchwytu na próbkę za pomocą super kleju.
  10. Po kilku sekundach umieścić uchwyt na próbkę w komorze cięcia.
  11. W razie potrzeby dostosuj orientację tkanki w kierunku żyletki.

4. Krojenie tkanki zatopionej w agarozie za pomocą wibratomu

  1. Określ zewnętrzne granice zakresu cięcia (oś y) zgodnie z rozmiarem próbki tkanki.
  2. Wyreguluj ostrze w kierunku górnej części bloku tkanki.
  3. Ustaw prędkość cięcia na 0,04 mm/s, amplitudę cięcia na 1 mm i grubość plastra na 300 μm.
  4. Ostrożnie pokrój pierwsze plastry i przenieś je do osobnego pojemnika ze schłodzonym (4 °C) roztworem do krojenia na mokrym lodzie.

5. Kultura organotypowych kultur plastrowych

  1. Przygotuj 6-dołkową płytkę z 1 ml odpowiedniego podłoża uprawowego na dołek.
    1. Podłoże A: Zaawansowany DMEM/F12, 10% FBS, 1% penicylina/streptomycyna.
    2. Medium B: RPMI 1640, 10% FBS, 1% penicylina/streptomycyna, 4 μg/ml insuliny, 8 ng/ml EGF, 0,3 μg/ml hydrokortyzon.
      UWAGA: Pożywka zapewniająca optymalne warunki hodowli może się różnić w zależności od tkanki i pacjenta. Porównano dwa różne podłoża do hodowli tkankowych, jedno oparte na DMEM/F12 (pożywka A), drugie oparte na RPMI (pożywka B). Nie stwierdzono istotnych różnic między tymi pożywkami. Do wszystkich eksperymentów przedstawionych w tym protokole użyto pożywki A.
  2. Umieść 6-dołkową płytkę z podłożem w inkubatorze, pozwalając na dostosowanie temperatury i pH przed uprawą.
  3. Umieść plastry na wkładkach do hodowli komórkowych (np. hydrofilowych wkładkach PTFE o wielkości porów 0,4 μm) za pomocą filtra patrzącego.
  4. Usuń nadmiar roztworu tnącego, umieszczając załadowany filtr na sterylnej szmatce.
  5. Umieść załadowany filtr w przygotowanej płytce 6-dołkowej. Nie dodawaj żadnego dodatkowego podłoża do wkładu.
  6. Umieścić płytkę 6-dołkową w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
  7. Zmieniaj pożywkę co 2 dni, powtarzając kroki 5.1, 5.2 i 5.5 z nową płytką 6-dołkową.
    UWAGA: Organotypowe kultury warstwowe mogą być hodowane przez różne okresy w zależności od indywidualnego pytania badawczego.

6. Test żywotności resazuryny

UWAGA: Test żywotności resazuryny mierzy ogólną aktywność metaboliczną organotypowych kultur warstwowych na podstawie redukcji niefluorescencyjnej niebieskiej rezuryny do czerwonej fluorescencyjnej rezorufiny w żywych komórkach15. Test nie ma toksycznego wpływu na komórki i może być wielokrotnie stosowany do kultur w zależności od indywidualnego pytania badawczego. Żywotność mierzono za pomocą testu rezazuryny co 2-3 dni.

  1. Przygotowanie roztworu podstawowego resazuryny
    1. Wyłącz światło sterylnego kaptura, ponieważ roztwór podstawowy resazuryny jest wrażliwy na światło.
    2. Przygotować roztwór podstawowy z 10 mg/ml soli sodowej resazuryny w 1x PBS.
    3. Przechowywać roztwór podstawowy w podwielokrotnościach chronionych przed światłem w temperaturze 4 °C w lodówce do czasu użycia.
  2. Ocena ogólnej żywotności warstw
    1. Wyłącz światło sterylnego kaptura, ponieważ roztwór podstawowy resazuryny jest wrażliwy na światło.
    2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy resazuryny w stosunku 1:250 odpowiednią pożywką.
      UWAGA: Pożywka używana do rozcieńczania powinna być taka sama, jak używana do uprawy (podłoże A lub podłoże B).
    3. Przygotować 1 ml końcowego roztworu resazuryny na plasterek i dodać dodatkowy 1 ml do ślepej próby, np. dla 6 plasterków rozcieńczyć 28 μl roztworu podstawowego resazuryny w 7 ml pożywki.
    4. Dozować roztwór rezazuryny na płytki 6-dołkowe, po 1 ml rozcieńczonego roztworu rezazuryny na studzienkę.
    5. Przenieś filtry uprawowe z plastrami do studzienek z roztworem rezazuryny. Jedna studzienka z roztworem resazuryny jest pusta jako ślepa kontrola.
      UWAGA: Aby uprościć procedurę doświadczalną, krok ten można połączyć ze zmianą pożywki (krok 5.7). Jednak w przypadku, gdy potrzebne są dodatkowe pomiary żywotności, test można przeprowadzić w dowolnym momencie podczas uprawy kultur plastrów.
    6. Umieścić plastry tkanek w inkubatorze na 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    7. Przygotować nowe 6-dołkowe płytki z pożywką hodowlaną, jeśli hodowla plastrów jest kontynuowana (patrz kroki 5.1 i 5.2).
    8. Wyjmij filtry hodowlane wraz z plastrami z roztworu resazuryny i usuń nadmiar roztworu, umieszczając załadowany filtr na sterylnej szmatce.
    9. Przenieś filtry uprawowe z plastrami na wcześniej przygotowaną płytkę hodowlaną.
    10. Z każdego 6-dołkowego dołka weź 100 μl roztworu resazuryny i przenieś go na 96-dołkową płytkę. Z ślepej próby umieścić trzy próbki (3 x 100 μl) w oddzielnych studzienkach płytki 96-dołkowej.
    11. Określ ilościowo ekstynkcję za pomocą fotometru płytkowego zgodnie z instrukcjami producenta. Długość fali wzbudzenia jest ustawiona na 545 nm, a długość fali emisji jest ustawiona na 600 nm.

7. Utrwalanie formaliny i zatapianie parafiny w OTSC

  1. Ostrożnie przenieś wyhodowane plastry tkanki do plastikowej kasety do zatapiania. Aby to zrobić, wykonaj poniższe czynności.
    1. Umieść filtr uprawowy z zamontowanym plastrem na szalce Petriego.
    2. Za pomocą skalpela ostrożnie wytnij membranę filtracyjną z zamontowanym plasterkiem tkanki.
    3. Ostrożnie przenieś membranę filtracyjną z zamontowanym plastrem do nylonowej torby do biopsji i umieść ją w kasecie do zatapiania.
    4. Następnie przenieś plastikowe kasety do zatapiania do pojemnika ze wstępnie schłodzoną (4 °C) 4,5% formaliną. Plastry można przechowywać w roztworze formaliny w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia, ale należy je inkubować przez co najmniej 24 godziny
      UWAGA: OTSC należy przenosić z dużą ostrożnością, ponieważ łatwo się rozrywają.
  2. Ostrożnie płucz utrwaloną w formalinie kulturę plastrów pod bieżącą wodą z kranu przez 1,5 godziny.
  3. Odwodnić plaster tkanki utrwalony w formalinie przez inkubację w 70% etanolu (2x przez 3 godziny), 95% etanolu (1x przez noc, 1x przez 3 godziny), a następnie w etanolu absolutnym (1x przez 3 godziny, 1x przez noc).
  4. Oczyścić plaster tkanki utrwalony w formalinie przez 3-godzinną inkubację w ksylenie dwukrotnie.
  5. Zanurzyć tkankę w parafinie w temperaturze 60 °C (1x na noc, 1x na 2 h). Osadź tkankę w bloku parafiny w formie do zatapiania tkanek.
  6. Blok tkanki zatopionej w parafinie o grubości 4 μm należy przeciąć mikrotomem i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C zawierającej wodę destylowaną. Przenieś sekcje na szkiełka podstawowe.
  7. Inkubować skrawki parafiny przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C w celu związania tkanki ze szkłem. Inkubować szkiełka przez noc w temperaturze 37 °C.

8. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)

  1. Odparafinować skrawki z kroku 7.7 poprzez inkubację w ksylenie (3x przez 5 min).
  2. Ponownie uwodnić przez inkubację w alkoholu bezwodnym (2x przez 5 min), 95% alkoholu (2x przez 5 min) i 70% alkoholu (1x przez 5 min). Krótko spłukać wodą destylowaną.
  3. Plamić w roztworze hematoksyliny Mayer przez 5 min. Spłukiwać bieżącą wodą z kranu przez 10 min.
  4. Barwienie przeciwstawne w 0,5% roztworze eozyny przez 40 s. Spłucz wodą destylowaną.
  5. Odwodnić przez inkubację odpowiednio w 70% alkoholu (maksymalnie 1 min), 95% etanolu (2x przez 3 min) i alkoholu bezwodnego (2x przez 3 min).
  6. Usunąć ksylen w trzech zmianach (po kilka sekund każda). Umieść kroplę podłoża montażowego i przykryj szkiełka nakrywkowe.

9. Immunohistochemia OTSC

  1. Odparafinować skrawki przez inkubację w ksylenie 2x przez 10 min, a następnie 1:1 etanol/ksylol przez 10 min.
  2. Przenieś szkiełka do 100% etanolu (2x przez 3 min), 96% etanolu (2x przez 3 min), 70% etanolu (1x przez 3 min), a następnie do 50% etanolu (1x przez 3 min).
  3. Wykonaj pobieranie antygenu, aby zdemaskować epitop antygenowy. Podgrzewaj szkiełka w kuchence mikrofalowej w buforze cytrynianowym przez 5 minut przy 900 W, a następnie 2x przez 8 minut przy 600 W. Pozwól szkiełkom ostygnąć do temperatury pokojowej przez 20 minut.
  4. Prać w PBS 3x przez 3 min na shakerze.
  5. Przeprowadzić przepuszczalność błon komórkowych przez inkubację w 0,1% Triton X-100 w PBS (200 μL na szkiełko) w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  6. Umyj w PBS przez trzy zmiany, każda po 3 minuty na shakerze.
  7. Inkubować skrawki z 3% roztworem H2O2 w metanolu (200 μl na szkiełko) w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 10 minut w celu zablokowania endogennej aktywności peroksydazy.
  8. Prać w PBS 3x przez 3 min na shakerze.
  9. Dodać 200 μl buforu blokującego (1:50 surowicy końskiej w PBS) i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 25 min.
  10. Odcedź bufor blokujący ze szkiełek, przechylając szkiełko na chusteczce papierowej.
  11. Nanieść 200 μl odpowiednio rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego w rozcieńczalniku do przeciwciał na szkiełka podstawowe i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez noc. Jako kontrolę ujemną należy użyć odpowiedniej izoformy mysich immunoglobulin w tym samym rozcieńczeniu, co przeciwciało pierwszorzędowe.
  12. Myć 3x przez 3 min w PBS na shakerze.
  13. Na szkiełka nanieść 200 μl biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego (roztwór w PBS w stosunku 1:50) i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  14. Myć 3x przez 3 min w PBS na shakerze.
  15. Przed zastosowaniem należy przygotować kompleks peroksydazy na bazie awidyny/biotyny zgodnie z instrukcjami producenta. Na szkiełka nanieść 200 μl kompleksu awidyna-biotyna-peroksydaza i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  16. Myć 3x przez 3 min w PBS na shakerze.
  17. Nałożyć 200 μl roztworu substratu DAB (świeżo przygotowanego bezpośrednio przed użyciem: 1 kropla DAB na 1 ml podłoża), 200 μl na szkiełko. Pozwól na rozwój koloru przez 1-3 minuty, aż do osiągnięcia pożądanej intensywności koloru.
  18. Spłukiwać bieżącą wodą z kranu przez 10 min.
  19. Przeciwbarwić slajdy, zanurzając boki w Hematoksylinie na 5 minut.
  20. Spłukiwać bieżącą wodą z kranu przez 10 min.
  21. Przykryj szkiełka wodnym medium montażowym i szkiełkami nakrywkowymi. Zamontowane prowadnice mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej na stałe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat procesu hodowli OTSCs z tkanek nowotworowych pobranych na świeżo, niezamrożonych. Próbki pierwotnych PDAC oraz przerzutów pobrano bezpośrednio po resekcji chirurgicznej i przechowywano przez noc na mokrym lodu w temperaturze 4 °C w roztworze do przechowywania tkanek. Próbki zostały przetworzone, a plastry poddano hodowli zgodnie z opisem w protokole. Makroskopowa morfologia każdego OTSC nie uległa znacznym zmianom podczas hodowli. Jednakże powierzchnia OT...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

OTSC świeżych próbek guza są bliskim przybliżeniem guza in situ. Utrzymują swoją wyjściową morfologię, aktywność proliferacyjną i mikrośrodowisko podczas uprawy przez określony, zależny od tkanki okres 11,12,13. Technika ta umożliwia natychmiastowe zastosowanie leczenia do żywotnej ludzkiej tkanki nowotworowej ex vivo, a następnie dalsze analizy, takie jak profilowanie transkryptomu i proteomu. Szczególną zalet...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawnili potencjalnych konfliktów interesów.

Podziękowania

R. Braun był wspierany przez Szkołę Naukowców Klinicystów w Lubece (DFG #413535489) oraz Program Finansowania Juniorów Uniwersytetu w Lubece.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zaawansowany DMEM/F-12 MediumGibco12634028
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaRoth6351.28% w roztworze Ringera
Rozcieńczalnik przeciwciał, redukujący tłoDakoS3022
AquaTexMerck108562
Bioetanol (99%, denaturowany)CHEMSolute2,21,19,010
Kwas cytrynowy monohydratSigma AldrichC7129
Rozszczepiona kaspaza-3 (Asp175) (5A1E) Technologiasygnalizacji komórkowej9664Rozcieńczenie 1:400
Derby Extra Double Edge Safety Razor BladesDerby Tokai
Kasety do zatapianiaRothH579.1
Eozyna Y-roztwór 0,5% wodnyMerck10,98,44,100
Eukitt Szybkoutwardzalne podłoże montażoweSigma-Aldrich3989
Płodowa surowica bydlęcaGibco10270106
Roztwór formaldehydu 4,5%, buforowanyBü fa ChemikalienB211101000
Roztwór ałunu hemowego kwasowy wg MayerRothT865
Human EGFMilteniy Biotec130-097-794
HydrokortyzonSigma Aldrich (Merck)H0888
Nadtlenek wodoru 30%Merck1,08,59,71,000
Insulina ludzkaSigma Aldrich (Merck)12643
Płynny system chromogenów do substratów DAB+DakoK3468
MACS Roztwór do przechowywania tkanekMilteniy Biotech130-100-008
MetanolMerck10.600.092.500
Szkiełka mikroskopowe Superfrost PlusThermo ScientificJ1800AMNZ
Wkładka do hodowli komórkowych Millicell, 30 mm, hydrofilowy PTFE, 0,4 i mikro; mMillipore (Merck)PICM0RG50
Monoklonalna mysz anty-ludzka  Cytokeratyna 7 (klon OV-TL 12/30)DakoM70181:200 rozcieńczenie
Monoklonalny mysz anty-ludzka Ki67 Klon MIB-1DakoM72401:200 rozcieńczenie
Mysz monoklonalna Anty-wimentyna (klon V9)DakoM07251:200 rozcieńczenie
Kontrola ujemna Mysz IgG2aDakoX09431:200 rozcieńczenie
Kontrola ujemna Mysz IgG1DakoX093101-2Rozcieńczenie 1:200
Parafina (temperatura topnienia 56°- 58°)Merck10,73,37,100
Penicylina-Streptomycyna (10.000 U/ml)Gibco15140122
PBS pH 7,4 (1x) Klasa cytometrii przepływowejGibcoA12860301
Sól sodowa resazuryny; 10 mg/ml w PBSSigma AldrichR7017rozcieńczenie 1:250
Roztwór RingeraFresenius Kabi2610813
RPMI-1640 MediumSigma Aldrich (Merck)R8758
Płytka testowa do hodowli tkanek 6TPP92006
Triton X-100Sigma Aldrich9002-93-1
Zestaw peroksydazy ABC VECTASTAIN EliteVector LaboratoriesPK-6200
Ksylen (ekstra czysty)J.T.Baker8,11,85,000
Sprzęt
Czytnik mikropłytek ClarioStarBMG Labtech
Centrum Osadzania Parafiny E61110Leica
Rotary Microtom Microm HM355SThermo Scientific
System transferu sekcji Microm STSThermo Scientific
VT 1200S VibratomLeica
mAb królika

Bibliografia

  1. Nevala-Plagemann, C., Hidalgo, M., Garrido-Laguna, I. From state-of-the-art treatments to novel therapies for advanced-stage pancreatic cancer. Nature Reviews. Clinical Oncology. 17 (2), 108-123 (2020).
  2. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  3. Waghray, M., Yalamanchili, M., di Magliano, M. P., Simeone, D. M. Deciphering the role of stroma in pancreatic cancer. Current Opinion in Gastroenterology. 29 (5), 537-543 (2013).
  4. Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
  5. Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210(2017).
  6. Hessmann, E., et al. Fibroblast drug scavenging increases intratumoural gemcitabine accumulation in murine pancreas cancer. Gut. 67 (3), 497-507 (2018).
  7. Feig, C., et al. The pancreas cancer microenvironment. Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).
  8. Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
  9. Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
  10. Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).
  11. Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8352-8356 (2010).
  12. Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
  13. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
  14. Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Science Reports. 9 (1), 2133(2019).
  15. O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  16. Beutler, B., Cerami, A. Tumor necrosis, cachexia, shock, and inflammation: a common mediator. Annual Review of Biochemisty. 57, 505-518 (1988).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modele raka trzustkiex vivo testy lek whodowla skrawk w tkankisekcjonowanie w wibrotomieinterfejs powietrze cieczprofilowanie transkryptomuprofilowanie proteomubarwienie na cleaved caspase 3
Organotypowe kultury warstwowe jako przedkliniczne modele mikrośrodowiska guza w pierwotnym raku trzustki i przerzutach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.