Wstrzyknięcia wektorów AAV do optogenetyki w znieczulonym i przytomnym, zachowującym się mózgu naczelnych innych niż człowiek

Podsumowanie

Zgodnie z obecną implementacją, optogenetyka u naczelnych wymaga wstrzyknięcia wektorów wirusowych do mózgu. Optymalna metoda iniekcji powinna być niezawodna i, w przypadku wielu zastosowań, zdolna do celowania w pojedyncze miejsca o dowolnej głębokości, które można łatwo i jednoznacznie zidentyfikować w histologii pośmiertnej. Przedstawiono metodę iniekcji o tych właściwościach.

Streszczenie

Techniki optogenetyczne zrewolucjonizowały badania neurobiologiczne i są gotowe zrobić to samo dla neurologicznej terapii genowej. Kliniczne zastosowanie optogenetyki wymaga jednak wykazania bezpieczeństwa i skuteczności na modelach zwierzęcych, najlepiej na naczelnych innych niż ludzie (NHP), ze względu na ich neurologiczne podobieństwo do ludzi. Liczba potencjalnych wektorów, które są potencjalnie przydatne w neurobiologii i medycynie, jest ogromna i nie istnieje jeszcze żaden wysokoprzepustowy sposób testowania tych wektorów. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na techniki umożliwiające wielokrotne przestrzenne i objętościowo dokładne wstrzyknięcia wektorów wirusowych do mózgu NHP, które można jednoznacznie zidentyfikować za pomocą histologii pośmiertnej. Opisana w niniejszym dokumencie jest taka metoda. Kaniule iniekcyjne są zbudowane ze sprzężonych rurek z politetrafluoroetylenu i stali nierdzewnej. Kaniule te są autoklawowalne, jednorazowe i mają niską minimalną objętość ładowania, dzięki czemu idealnie nadają się do wstrzykiwania drogich, wysoce skoncentrowanych roztworów wektorów wirusowych. Obojętny, barwiony na czerwono olej mineralny wypełnia martwą przestrzeń i tworzy widoczną menisk z roztworem wektorowym, umożliwiając natychmiastowy i dokładny pomiar szybkości i objętości iniekcji. Olej jest ładowany do tylnej części kaniuli, co zmniejsza ryzyko jednoczesnego wstrzyknięcia z wektorem. Kaniule można załadować w 10 minut, a zastrzyki można wykonać w 20 minut. Ta procedura dobrze nadaje się do wstrzykiwań zwierzętom obudzonym lub znieczulonym. W przypadku zastosowania do dostarczania wysokiej jakości wektorów wirusowych, procedura ta może wytworzyć silną ekspresję białek optogenetycznych, umożliwiając optyczną kontrolę aktywności i zachowania neuronów w NHP.

Wprowadzenie

Optogenetyka u naczelnych (NHP) zazwyczaj polega na wstrzykiwaniu wektora wirusowego bezpośrednio do mózgu. Jedna klasa wektorów, która dobrze nadaje się do tego zastosowania, opiera się na wirusie związanym z adenowirusem (AAV). Wektory te składają się z kapsydu białkowego otaczającego jednoniciowy genom DNA, który z kolei składa się z promotora, genu opsyny i opcjonalnie innych elementów kodujących białka i regulatorowych genów. Postępy w klonowaniu molekularnym ułatwiły manipulowanie tymi składnikami i ich łączenie w celu opracowania nowych wektorów. W związku z tym kolekcja wektorów AAV, która jest potencjalnie przydatna dla optogenetyki NHP, jest duża i szybko rośnie.

Obecnie użyteczność wektora AAV dla optogenetyki NHP wymaga testów in vivo. Fakt ten stanowi istotną barierę dla postępu. Zwierzęta muszą być wykorzystywane oszczędnie, a testowanie wielu wektorów u jednego zwierzęcia wymaga, aby miejsca wstrzyknięć były rozsądnie rozmieszczone w stosunku do architektury neuronalnej i dobrze oddzielone w stosunku do rozprzestrzeniania się wirusa. Dokładna ocena histologiczna wymaga, aby wstrzyknięcia były dokładne przestrzennie i objętościowo. Technika iniekcji stosowana wcześniej do ogniskowego dostarczania środków farmakologicznych^1,2,3,4 została dostosowana i uproszczona do wykonywania takich iniekcji. Ta technika wstrzykiwania jest niedroga, wykorzystuje jednorazowe, sterylizowalne składniki, może być stosowana u znieczulonych lub obudzonych małp zachowujących się i może być stosowana do celowania w różne obszary mózgu o dowolnej głębokości. Poniższy protokół opisuje krok po kroku procedury wytwarzania jednorazowych składników i wykonywania zastrzyków do mózgu NHP. Omówiono zalety i wady tej techniki.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych i przekroczyły minimalne wymagania zalecane przez Instytut Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych oraz Stowarzyszenie Oceny i Akredytacji Międzynarodowej Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi. Wszystkie procedury zostały ocenione i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Waszyngtońskiego (protokół UW IACUC #4167-01). W badaniu wzięło udział pięć zdrowych makaków (2 Macaca mulatta, 3 Macaca nemestrina; samiec w wieku 4-11 lat). We wszystkich zabiegach chirurgicznych stosowano sterylne narzędzia i techniki.

1. Tworzenie kaniuli (Rysunek 1A)

1. Przygotowanie każdej części
   1. Stępić końcówkę igły podskórnej (30 G, długość 13 mm) za pomocą młynka tarczowego.
   2. Wytnij rurkę ze stali nierdzewnej (30 G, średnica wewnętrzna = 0,16 mm, średnica zewnętrzna = 0,31 mm) na długość dostosowaną do głębokości docelowego obszaru mózgu (25 mm dobrze nadaje się do wstrzyknięcia grzbietowej powierzchni kory mózgowej). Za pomocą szlifierki tarczowej ukosuj jeden koniec przeciętej rury i wygładź drugi. Usuń zadziory z wnętrza tubki za pomocą przeciągacza.
   3. Przyciąć rurkę z politetrafluoroetylenu (PFTE) (średnica wewnętrzna = 0,23 mm ± 0,02 mm, ścianka = 0,23 mm ± 0,02 mm, 1 mm odpowiada 42 nL ± 7 nL płynu) na długość odpowiednią do ilości roztworu wektorowego, który ma zostać załadowany (1 μl roztworu wektorowego zajmuje 24 mm rurki). Rozszerz oba końce rurki PTFE poprzez włożenie igły podskórnej.
2. Wprowadzić stępioną igłę podskórną na około 5 mm do jednego końca rurki PTFE. Włóż nieskośny koniec rurki ze stali nierdzewnej około 5 mm do drugiego końca (Rysunek 1A).
3. Wykonaj testy przed wstrzyknięciem. Wstrzyknąć przefiltrowaną wodę przez piastę igły podskórnej kaniuli. Upewnij się, że woda wypływa ze skośnej rurki ze stali nierdzewnej z końcówki i że woda nie wycieka z żadnego złącza.

2. Procedura iniekcji dla znieczulonych zwierząt

1. Przygotowanie do zabiegu
   1. Sterylizuj narzędzia i materiały chirurgiczne, korzystając z procedur podanych w Tabeli materiałów.
   2. W razie potrzeby wykonaj rezonans magnetyczny głowy, aby celować w głębokie struktury mózgu (Rysunek 2A).
   3. Bezpośrednio przed zabiegiem należy uspokoić zwierzęta ketaminą (10-15 mg/kg) i podać domięśniowo antybiotyki (cefazolinę) i leki przeciwbólowe (buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu i meloksykam). Następnie dostarczyć propofol przez cewnik dożylny (IV) w żyły odpiszczelowej lub głowowej.
   4. Zaintubuj zwierzę i przenieś je do izofluranu. Prawidłowe znieczulenie należy potwierdzić stabilnym tętnem, ciśnieniem krwi, częstością oddechów, rozluźnionymi mięśniami szkieletowymi oraz brakiem odruchów powiekowych lub odruchów odstawienia.
   5. Ogol głowę zwierzęcia. Nałóż sztuczną maść na łzy na rogówkę, aby zapobiec wysuszeniu.
2. Przygotowanie obszaru iniekcji
   1. Umieść głowę zwierzęcia w ramie stereotaktycznej. Nałóż chirurgiczny roztwór peelingujący na ogoloną skórę za pomocą gąbek z gazy, delikatnie dociśnij, aby uwolnić wszelkie zanieczyszczenia i spłucz alkoholem izopropylowym. Powtórz ten proces trzy razy. Przykryj zwierzę sterylną zasłoną z okienkami. Naciąć skórę i odbić mięsień. Umieść manipulator na ramieniu stereotaktycznym, ustaw go tak, aby celował w docelowy obszar mózgu i zaznacz pozycję kraniotomii na czaszce za pomocą wysterylizowanego długopisu.
   2. Usuń manipulator stereotaktyczny i wykonaj kraniotomię. W razie potrzeby naciąć oponę twardą (np. w celu uwidocznienia punktów orientacyjnych bruzdy). Wróć manipulator do ramienia stereotaktycznego.
3. Wczytywanie rozwiązania wektorowego (Rysunek 1C)
   1. Delikatnie przenieś roztwór wektora do wysterylizowanej probówki PCR za pomocą pipetora P20, unikając pęcherzyków.
   2. Przymocuj kaniulę, ze ściętą końcówką skierowaną w dół, do pionowo zorientowanego uchwytu stereotaktycznego. Podłączyć strzykawkę Luer-lock o pojemności 1 ml do piasty igły podskórnej kaniuli.
   3. Zanurz ściętą końcówkę kaniuli w roztworze wektorowym.
      UWAGA: Strzykawka powinna być już podłączona; Doczepienie go w tym momencie wprowadziłoby bąbelki do roztworu wektorowego.
   4. Załaduj roztwór do kaniuli, wywierając delikatne podciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Wizualnie śledź łąkotkę między roztworem a powietrzem.
   5. Po załadowaniu roztworu wektorowego kontynuuj delikatne podciśnienie, aż roztwór dotrze do piasty igły. Wyjąć strzykawkę o pojemności 1 ml i wstrzyknąć kolorowy olej mineralny do piasty igły podskórnej.
      UWAGA: Olej należy wstrzykiwać powoli wzdłuż wewnętrznej ścianki piasty igły, aby utworzyć wyraźny menisk z roztworem wektorowym i uniknąć pęcherzyków powietrza.
   6. Przymocuj piastę igły podskórnej do jednego z dwóch otwartych portów 3-kierunkowego zaworu odcinającego Luer-lock.
      UWAGA: Przymocowanie igły podskórnej do zamkniętego portu spowoduje wprowadzenie niepożądanego ciśnienia powietrza za olejem.
   7. Zamknąć port podłączony do piasty igły podskórnej, napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml powietrzem i podłączyć ją do jednego z dwóch pozostałych portów. Na koniec zamknij pozostały port kranu, aby podłączyć strzykawkę do kaniuli.
   8. Powoli wepchnij powietrze do kaniuli. Gdy kolorowy olej pojawi się na końcu igły w rurki PTFE, sprawdź, czy między roztworem a kolorowym olejem nie ma powietrza.
   9. Jeśli obecne jest powietrze, należy zastosować podciśnienie do strzykawki, aby zawrócić kolorowy olej do piasty igły. Usuń pęcherzyk i zastosuj nadciśnienie, aż kropla roztworu wektorowego będzie widoczna na ściętej końcówce kaniuli.
   10. Wyjmij strzykawkę o pojemności 1 ml, aby uwolnić niepożądane ciśnienie powietrza za olejem i zamknij kurek, aby zapobiec wydostawaniu się wektora z kaniuli grawitacyjnie.
   11. Przyklej plastikową linijkę do rurki PTFE, aby zmierzyć ruch menisku podczas wstrzykiwania (Rysunek 1B, D, F).
4. Wprowadzenie kaniuli do docelowego obszaru mózgu (Rysunek 1B)
   1. Przymocuj kaniulę do manipulatora stereotaktycznego.
   2. Ręcznie przenieś rurkę pompy (która jest zakończona złączem Luer-lock) od niesterylnego asystenta do chirurga. Chirurg powinien chwycić łącznik Luer-lock przez ściankę sterylnej tulei, przymocować drugi sterylny kran do łącznika, szczelnie owinąć go taśmą, a następnie upuścić kołnierz tulei, pozwalając mu rozciągać się wzdłuż rurki pod wpływem grawitacji.
   3. Podłącz kran przymocowany do rurki kaniuli do kranu podłączonego do pompy powietrza. Ustaw pompę powietrza na niskie ciśnienie, włącz ją i zwiększaj ciśnienie, aż olej przejdzie przez kaniulę i na końcu kaniuli będzie widoczna kropla roztworu wektorowego.
   4. Wyreguluj położenie plastikowej linijki na rurki PTFE, aby zmierzyć ruch menisku podczas wstrzykiwania.
   5. Wbij kaniulę w dół za pomocą manipulatora stereotaktycznego i zapisz głębokość, na której końcówka sięga do powierzchni (opona twarda lub pia mater).
   6. Skieruj kaniulę do najgłębszego miejsca, które ma zostać wstrzyknięte wzdłuż toru. Powierzchnia pokryje się wgłębieniami. W przypadku wstrzykiwania kory powierzchniowej należy wizualnie potwierdzić, że kaniula wniknęła w powierzchnię, za pomocą mikroskopu chirurgicznego lub lup powiększających, jeśli są dostępne.
   7. Aby zminimalizować niewłaściwe ukierunkowanie spowodowane uciskiem tkanki, należy wprowadzić kaniulę powoli (1 mm/min), szybko (0,5 mm/s) z 1-5 minutowym odczekaniem na dole lub przekroczyć najgłębsze miejsce wstrzyknięcia o 500 μm, a następnie wycofać.
5. zastrzyk
   1. Wstrzyknąć 0,5 μl roztworu wektorowego za pomocą elektrycznej pompy powietrza przez 10-30 s. Potwierdź przepływ wtrysku, śledząc menisk między kolorowym olejem a roztworem wektorowym w rurki PTFE.
   2. Odczekać 1 minutę i wycofać kaniulę do następnego miejsca wstrzyknięcia wzdłuż toru.
   3. Po ostatnim wstrzyknięciu pozostaw kaniulę na miejscu na 10 minut, aby uniknąć wypływu wektora.
   4. Schować kaniulę i wyrzucić ją do pojemnika na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne.
   5. Opcjonalnie należy wstrzyknąć niewielką ilość (≤1 μl) mikrogranulek fluorescencyjnych w pobliżu miejsca wstrzyknięcia wektora, aby ułatwić identyfikację miejsca wstrzyknięcia post mortem.
   6. Powtórz tę procedurę zgodnie z potrzebami dla innych rozwiązań wektorowych w innych lokalizacjach (Rysunek 2B).
6. Zamknięcie gabinetu
   1. Zszyj oponę twardą, mięsień i skórę.
   2. Usuń małpę z ramy stereotaktycznej i odłącz wszystkie monitora.
   3. Wyjąć małpę ze znieczulenia izofluranem i ekstubować po powrocie odruchu połykania.
   4. Zapewnij leczenie pooperacyjne (3-5 dni meloksykamu i 7-10 dni cefaleksyny). Monitoruj zwierzę co najmniej raz na 10 minut, aż będzie w stanie utrzymać stabilną, wyprostowaną pozycję siedzącą.

3. Chirurgia i wstrzyknięcie wektora AAV dla rozbudzonych zwierząt zachowujących się (Rysunek 1D)

UWAGA: Wariant techniki może być użyty do wykonania zastrzyków do mózgów rozbudzonych, zachowujących się małp, jak opisano poniżej.

1. Jednoczesna iniekcja z nagrywaniem
   1. Aby zarejestrować aktywność elektryczną w miejscu wstrzyknięcia, pokryj zewnętrzną stronę kaniuli żywicą epoksydową (dół ~15 mm) i rurką poliimidową (pozostała długość). Odsłoń metal na końcówce, zeskrobując z niej żywicę epoksydową (Injectrode, Rysunek 1F)². Alternatywnie, włóż kaniulę i oddzielną elektrodę zewnątrzkomórkową, obok siebie, do dwulufowej rurki prowadzącej (Dwulufowa rurka prowadząca, Rysunek 1E).
2. Wprowadzenie kaniuli do docelowego obszaru mózgu.
   1. Umieść małpę w kabinie doświadczalnej, ogranicz ruchy głowy i wyczyść komorę zapisu zamontowaną na czaszce przy użyciu standardowych technik.
   2. Przymocuj rurkę prowadzącą do mikronapędu. Wprowadzić kaniulę iniekcyjną do rurki prowadzącej.
   3. Przesuń kaniulę, aż końcówka wystaje z rurki prowadzącej.
   4. Podłączyć zawór odcinający do elektrycznej pompy powietrza. Aby potwierdzić prawidłowe działanie systemu, należy wypchnąć kroplę roztworu wektorowego z końcówki za pomocą pompy powietrza i potwierdzić ruch menisku roztworu olejowo-wektorowego.
   5. Wyjmij kaniulę ~5 mm do rurki prowadzącej, aby chronić ją przed uszkodzeniem podczas wprowadzania rurki do mózgu. Włóż rurkę prowadzącą do mózgu.
   6. Przyłóż kaniulę do miejsca, w które ma zostać wstrzyknięte za pomocą mikronapędu. Zidentyfikuj miejsce docelowe za pomocą zapisu elektrycznego (Rysunek 2C) lub stymulacji.

Rysunek 1: Konfiguracja chirurgii i aparatury. (A) Kaniula iniekcyjna. Każda część kaniuli jest wskazana. Wstawka w prawym dolnym rogu: powiększone zdjęcie końcówki kaniuli, pasek skali: 500 μm. (B) Konfiguracja chirurgiczna dla znieczulonych małp. Małpa jest umieszczana w stereotaktycznej ramie pod obłożeniem chirurgicznym. Do małpy podłączony jest respirator (V), przewód dożylny (IV), ciśnieniomierz (BP) i monitor saturacji tlenem (_O2). Kaniulę iniekcyjną wprowadza się do obszaru docelowego za pomocą stereotaktycznego mikromanipulatora. Roztwór wektorowy jest wstrzykiwany przez elektryczną pompę powietrza (lewa dolna wstawka, brązowa) sprzężoną ze sprężarką powietrza (dolna lewa wstawka, niebieska). Plastikowa linijka (górna wstawka) jest przyklejona do rurki PTFE w celu zmierzenia ruchu menisku między kolorowym olejem (górna wkładka, czerwona) a roztworem wektorowym (górna wstawka, przezroczysta) podczas wstrzykiwania. (C) Konfiguracja do ładowania roztworu wektorowego do kaniuli. (D) Małpa podczas wstrzykiwania roztworu wektora w kabinie doświadczalnej. Głowa zwierzęcia jest utrzymywana na miejscu przez trzy słupki stabilizujące, a pozycja oczu jest rejestrowana przez system cewki do przeszukiwania twardówki. Kaniula iniekcyjna jest przytrzymywana i doprowadzana do docelowej głębokości za pomocą uchwytu/sterownika mikroelektrody. Wtrysk jest kontrolowany poprzez monitorowanie menisku między kolorowym olejem a roztworem wektorowym za pomocą kamery USB (zdjęcie wstawkowe). (E) Wtrysk dwulufowej rury prowadzącej. Dwucylindrowy uchwyt/sterownik rurki prowadzącej zawiera kaniulę iniekcyjną i mikroelektrodę (patrz wkładka). (F) Wtryskiwany. Metal na końcu kaniuli, odsłonięty przez zeskrobanie powłoki epoksydowej, zapewnia dostęp elektryczny do neuronów (wkładka, podziałka: 500 μm). (G) Konfiguracja stymulacji laserowej. Dwulufowy uchwyt/sterownik rurki prowadzącej mieści zarówno światłowód, jak i mikroelektrodę (patrz wkładka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat miejsc wstrzyknięć AAV. (A) Strzałkowy przekrój mózgu MR obraz pokazujący miejsca wstrzyknięć w pierwszorzędowej korze ruchowej i pierwszorzędowej korze wzrokowej Macaca nemestrina. (B) Widok z powierzchni grzbietowej na odpowiedniej płycie Atlasu pokazujący umiejscowienie kaniuli względem bruzdy centralnej (pierwszorzędowej kory ruchowej) i pierwszorzędowej kory wzrokowej. (C) Zapis jednostkowy przez wstrzyknięcie w wzgórek górny. Jednostka, która została wyizolowana przed wstrzyknięciem (prawy u góry), zniknęła po wstrzyknięciu (po prawej u dołu). (D) Ścieżka wtrysku (białe strzałki). Podziałka skali: 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przetwarzanie tkanki mózgowej do histologii

1. Odczekaj 6-8 tygodni po wstrzyknięciu, aby zmaksymalizować ekspresję transgenu.
   UWAGA: Optymalny czas trwania zależy od dokładnego wektora wirusowego użytego w eksperymencie.
2. Przetwarzaj mózg przy użyciu konwencjonalnych technik histologicznych, aby ocenić wydajność i selektywność transdukcji^5,6,7.

Wyniki

Aby zademonstrować ekspresję transgenu poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie in vivo do mózgu NHP za pomocą opisanej tutaj metody chirurgicznego iniekcji, wybrano dwa wektory, które zawierały wzmacniacze napędzające ekspresję super żółtego białka fluorescencyjnego-2 (SYFP2) w różnych typach neuronów8^,9. Wektory wirusowe umieszczono w PHP.eB capsid¹⁰, oczyszczono przez wirowanie jodiksanolu, a następnie zagęszczono do wysokiego miana (>1E13 genomów wirusa/ml), mierzonego metodą qPCR. Objętość 0,5 μl wstrzyknięto na każdej z dziesięciu głębokości wzdłuż dziesięciu ścieżek przez korę, co daje całkowitą objętość wstrzyknięcia 5 μl / ścieżkę. Rysunek 3A-C pokazuje ekspresję SYFP2 poprzez barwienie immunologiczne anty-GFP 113 dni po wstrzyknięciu specyficznego dla podklasy PVALB wektora AAV, CN2045, do pierwszorzędowej kory wzrokowej dorosłego samca Macaca nemestrina. Transgen SYFP2 jest solidnie wykrywany w licznych neuronach niepiramidowych rozsianych po głębokości kory mózgowej, a większość neuronów eksprymujących SYFP2 była również immunoreaktywna dla PVALB⁷. Rysunek 3D pokazuje natywną ekspresję SYFP2 w głównej korze ruchowej 64 dni po wstrzyknięciu wektora AAV specyficznego dla podklasy neuronów L5, CN2251. Wszystkie neurony znakowane SYFP2 mają wyraźną morfologię piramidalną z somatami ograniczonymi do warstwy 5 i charakterystycznymi grubymi dendrytami wierzchołkowymi. Dane te jednoznacznie wskazują na precyzyjną kontrolę ekspresji transgenów w wybranych populacjach neuronów kory nowej w mózgu NHP poprzez stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów AAV ukierunkowanych na typ komórki.

Rysunek 3: Przykład specyficznej dla typu komórki ekspresji SYFP2 za pośrednictwem wektorów AAV wstrzykniętych do mózgu NHP. (A) Mikrofotografia epifluorescencji stałego przekroju z pierwszorzędowej kory wzrokowej makaka 113 dni po wstrzyknięciu specyficznego dla podklasy PVALB wektora AAV. Podziałka skali: 1 mm. (B,C) Obraz w ramce o większym powiększeniu pokazany w A. (B) Sygnał anty-GFP. (C) Sygnał anty-PVALB. Paski skali: 250 μm. (D) Mikrofotografia epifluorescencyjna natywnej fluorescencji SYFP2 w stałym przekroju z pierwotnej kory ruchowej makaków 64 dni po wstrzyknięciu wektora AAV specyficznego dla podklasy pozamózgowiowej warstwy 5. Podziałka skali: 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby zademonstrować użyteczność tej techniki iniekcyjnej dla neurofizjologicznych i behawioralnych manipulacji optogenetycznych, przeprowadzono trzy eksperymenty, każdy na innej małpie (Macaca mulatta). W pierwszym eksperymencie (Ryc. 4A-D), wektory AAV przenoszące transgen rodopsyny-2 (AAV1-hSyn1-ChR2-mCherry) wstrzyknięto do lewego górnego wzgórka (SC). Wektor wstrzykiwano co 250 μm na 19 głębokości, co daje łącznie 12 μl. W drugim eksperymencie (Ryc. 4E-G), 3 μL roztworu AAV1-hSyn-ArchT-EYFP wstrzyknięto do jądra reticularis tegmenti pontis (NRTP). W trzecim eksperymencie (Ryc. 4H-K), 24 μl roztworu AAV9-L7-ChR2-mCherry wstrzyknięto do kory móżdżku⁶. Sześć do ośmiu tygodni po każdym wstrzyknięciu światłowód i elektroda wolframowa były wprowadzane do mózgu przez dwulufową rurkę prowadzącą (Rysunek 1G).

Rysunek 4B pokazuje reakcję neuronu SC na niebieskie światło (450 nm). Światło ciągłe (1,2 s) o mocy 40 mW wytwarzało serię następujących po sobie potencjałów czynnościowych (Rysunek 4B, góra). Impulsy świetlne o czasie trwania 1 ms nie wywołały potencjałów czynnościowych przy 40 mW (Rysunek 4B, środek), ale niezawodnie wywołały potencjały czynnościowe przy 160 mW, jedynym innym testowanym poziomie mocy, z opóźnieniem 2,7 ± 0,6 ms ( Rysunek 4B, na dole). Ciąg impulsów (160 mW, częstotliwość: 300 Hz, cykl pracy: 15%, czas trwania: 300 ms) wywoływał sakkady konsekwentnie ze średnim opóźnieniem 97 ± 32 ms, średnią amplitudą 10,4° i średnim kątem 47° (w górę i w prawo; Rysunek 4C).

Zgodne z badaniami, które modyfikowały wzmocnienie sakkad za pomocą podprogowej stymulacji elektrycznej klasy SC^11,12, optyczna stymulacja SC po 15°, 18° i 20° sakkadach w lewo i w dół (225°) stopniowo zmniejszała przyrost sakkad (Rysunek 4D). Ten spadek wzmocnienia wymagał ~250 prób (zielone kółka), aby powrócić do wzmocnienia sprzed adaptacji (czarne kółka), potwierdzając jego podstawę w długoterminowej plastyczności.

W drugim eksperymencie (Ryc. 4E), projekcja włókien omszałych od NRTP do robaka okoruchowego (OMV) kory móżdżku (zraziki VIc i VII) została optycznie stłumiona. Rysunek 4F pokazuje fluorescencyjnie oznaczone omszałe włókna i rozety w OMV (wstawce). Żółte światło laserowe (589 nm) zostało dostarczone do OMV za pośrednictwem światłowodu, a pobliska elektroda wolframowa została użyta do zarejestrowania aktywności komórek Purkinjego. Rysunek 4G pokazuje prostą aktywność skokową przed (szary) i po (pomarańczowy) optogenetycznym dezaktywowaniu projekcji NRTP (Rysunek 4G, góra). Przed inaktywacją komórka Purkinjego wykazywała wzór podwójnego impulsu dla sakkad 12° w prawo (Rysunek 4G, środek, szary). Podczas dezaktywacji szybkostrzelność zmniejszyła się i zmieniła się w wzorzec pauzy w serii (Rysunek 4G, środek, pomarańczowy). Porównanie tych dwóch wzorców odpowiedzi sugeruje, że omszałe włókno wejściowe do komórek Purkinjego wpływa na fazę zwalniania sakkady, napędzając drugi wybuch (Rysunek 4G, środek, zielony). Zmienność sakkad skierowanych w prawo została zmniejszona podczas inaktywacji optogenetycznej, co jest zgodne z ideą, że część zmienności między próbami w metrykach sakkad wynika ze zmienności sygnałów przenoszonych przez włókna mchu (Rysunek 4G, dół, pomarańczowy).

W trzecim eksperymencie (Rysunek 4H), komórki Purkinjego OMV były stymulowane optogenetycznie (Figura 4I). Ciąg krótkich impulsów świetlnych (impulsy 1,5 ms, 65 mW, 50 Hz) zwiększył prostą aktywność impulsową izolowanej komórki Purkinjego (Rysunek 4J, góra). Pojedyncze impulsy świetlne 1,5 ms często wywoływały >1 prosty skok (Rysunek 4J, dół). Optogenetyczna prosta aktywacja kolca, zaplanowana tak, aby wystąpiła podczas sakkady (impuls świetlny 10 ms, 60 mW), zwiększyła amplitudę sakkady (Ryc. 4K), potwierdzając dezhibiącą rolę komórek Purkinjego w generatorze impulsów okoruchowych.

Rysunek 4: Podsumowanie trzech eksperymentów optogenetycznych przeprowadzonych na obudzonych małpach. (A-D) Eksperyment 1, pobudzenie panneuronalne: wstrzyknięcie wirusa, stymulacja laserowa i rejestracja jednostek zostały przeprowadzone w górnym wzgórku (A). (B) Reprezentatywna aktywność jednostki wywołana przez stymulację laserową. (C), poziome (góra) i pionowe (środek) składowe ruchów gałek ocznych oraz rastrowy wykres aktywności jednostek (na dole) wywołany stymulacją laserową. (D) Reprezentatywna sesja adaptacji sakkad indukowanej stymulacją laserową. Stymulacja (100 impulsów laserowych o długości 0,5 ms) była podawana 80 ms po każdej sakkadzie (wstawce). Przyrost sakkad (amplituda sakad / amplituda docelowa) zmniejszał się stopniowo we wszystkich próbach. (E-G) Eksperyment 2, hamowanie specyficzne dla szlaku: wektor wirusowy wstrzyknięto do jądra reticularis tegmenti pontis, a stymulację laserową i rejestrację jednostek przeprowadzono w robaku okoruchowym (E). (F) Przekrój histologiczny robaka okoruchowego z zaznaczonymi włóknami omszałymi (podziałka skali: 1 mm) i ich rozety (wstawka, podziałka: 100 μm). (G) Aktywność komórek Purkiniego (u góry: raster, w środku: średnia szybkość wypalania) i trajektorie wizualnie sterowanych sakkad (na dole) ze stymulacją laserową i bez niej. Szary: próby wyłączone laserem, pomarańczowy: laser włączony próby, zielony: różnica między szarym a pomarańczowym. (H-K) Eksperyment 3, aktywacja specyficzna dla typu komórki: wstrzyknięcie wirusa, stymulacja laserowa i rejestracja jednostek przeprowadzono w robaku okoruchowym (H). (I) Przekrój histologiczny robaka okoruchowego pokazujący znakowane komórki Purkinjego. Pasek skali: 100 μm. (J) Prosta aktywność skokowa komórki Purkinjego wywołana przez stymulację laserową. U góry: wykres rastrowy z 14 prób. U dołu: ślad napięcia z pojedynczej reprezentatywnej próby. (K) Trajektorie sakkad kierowanych wzrokowo ze stymulacją laserową i bez stymulacji laserowej. Impuls świetlny o długości 10 ms podczas sakkad zwiększa amplitudę sakkady. Indywidualne trajektorie sakkad (cyjan) i ich średnia (niebieska) w próbach laserowych. Indywidualne trajektorie sakkad (jasnoszary) i ich średnia (ciemnoszary) w próbach laserowych. Długość fali światła wynosiła 450 nm w eksperymentach 1 i 3 oraz 589 nm w eksperymencie 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Postępy w optogenetyce NHP stworzyły zapotrzebowanie na dokładne i niezawodne metody iniekcji wewnątrzczaszkowej. Zaletą metody opisanej w tym raporcie jest to, że jest niedroga, wykorzystuje sterylizowalne i jednorazowe składniki oraz ma możliwość celowania w różne obszary mózgu o dowolnej głębokości. Umożliwia również sterowanie prędkością i objętością wtrysku ze względu na prędkość, z jaką można sterować zaworem powietrza. Ciśnienie powietrza można przejściowo zwiększyć, aby usunąć zator, a następnie szybko zmniejszyć, aby uniknąć późniejszego nadmiernego wtrysku, który byłby wytwarzany przez ciągłe ciśnienie. Składniki jednorazowego użytku zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego między miejscami wstrzyknięcia.

Kluczowe kroki w tym protokole iniekcji obejmują konstruowanie wysokiej jakości kaniul, ładowanie ich bez wprowadzania pęcherzyków i wybór miejsc wstrzyknięć, które nie są zbyt blisko siebie. Wstrzyknięcia w odległości ≥1 cm od siebie zwykle powodują transdukcję nienakładających się regionów, ale ta heurystyka zależy od serotypu wirusa, miana, promotora, objętości, celu i metody wykrywania. Wybór miejsc wstrzyknięcia, które nie są bezpośrednio połączone, pozwala uniknąć potencjalnych zakłóceń spowodowanych transportem opsyny wzdłuż aksonów i skłonności niektórych serotypów AAV do transdukcji wstecznej.

Metoda może być stosowana do wstrzykiwania NHP w znieczuleniu i w ramce stereotaktycznej (ryc. 3) lub czujnej i unieruchomionej na głowie (ryc. 4). Pierwsza z nich ma tę zaletę, że pozwala na celowanie w zastrzyki we współrzędnych stereotaktycznych i umożliwia wizualne potwierdzenie penetracji kaniuli przez ostrą durrotomię (nacięcie opony twardej u przytomnej małpy poprzez przewlekłą kraniotomię zwiększa ryzyko infekcji). To ostatnie podejście ma tę zaletę, że zmniejsza liczbę operacji przetrwania, a tym samym stres zwierzęcia, jest zgodne z zapisami elektrofizjologicznymi podczas zachowania i wykorzystuje ten sam układ współrzędnych i oprzyrządowanie, które są używane do wprowadzania światłowodów do eksperymentów po wstrzyknięciu. Technika wstrzykiwania u obudzonych małp może być jeszcze bardziej ulepszona poprzez wykonywanie zastrzyków przez sztuczną oponę twardą 13,14,15. Zapewniłoby to dodatkowe korzyści wynikające z bezpośredniej wizualizacji miejsc wstrzyknięcia i fluorescencji tkanek, która wskazuje na udaną transdukcję.

W NHP zastosowano kilka innych technik wstrzykiwania AAV. Niedawno opracowano wielokanałowe urządzenie do wstrzykiwań, aby równomiernie dostarczać wektory AAV do dużych obszarów kory NHP¹⁶. Podobne wyniki można uzyskać, stosując dostarczanie wspomagane konwekcją^17,18. Metody te mają na celu maksymalizację rozprzestrzeniania się transdukcji, co jest ważnym celem, ale różni się od precyzji przestrzennej, którą ma na celu osiągnąć nasza metoda.

Inną alternatywną metodą jest wstrzyknięcie wektorów AAV przez rurkę borokrzemianową, która jest ścięta do ostrej końcówki na jednym końcu i przymocowana do strzykawki Hamiltona z drugiej ^5,6. Metoda ta ma wiele wspólnego z metodą opisaną w niniejszym artykule. Wektor wirusowy jest utrzymywany w rurce na odcinku, przestrzeń w rurce za wirusem jest wypełniona barwionym olejem, a przepływ wektora jest monitorowany poprzez ruch menisku olejowo-wektorowego. Ta alternatywna technika wymaga mniej sprzętu i przygotowania, ale wymaga zasysania oleju do rurki borokrzemianowej przez ściętą końcówkę za pomocą podciśnienia, a następnie załadowania wektora tą samą trasą. To nieuchronnie prowadzi do śladowych ilości oleju dostarczanych do mózgu. Dodatkowo, z naszego doświadczenia, rurka borokrzemianowa musi mieć średnicę ~350 μm, aby penetrować oponę twardą nawet po ukosowaniu, a zatem powoduje większe uszkodzenia mechaniczne niż cieńsza metalowa kaniula opisana w tym artykule (rysunek 2D). Rurka 30 G została użyta, ponieważ jej krytyczne obciążenie wyboczeniowe jest wystarczająco wysokie, aby pośredniczyć w penetracji opony twardej pomimo długości 1-10 cm, ponieważ ściśle przylega do rurki PTFE i rzadko ulega zatkaniu. Rurka 33 G łatwiej się zapycha i wygina oraz jest trudniejsza do połączenia z rurką PTFE. Rurka 36 G nie jest wystarczająco sztywna, aby przebić oponę twardą NHP.

Inną alternatywną techniką wstrzykiwania jest połączenie wyjścia pompy powietrza z tylną częścią ładowanej wektorowo pipety¹⁹ ze szkła ciągnionego. Wektor jest wypychany z końcówki pipety przez bezpośrednie, przerywane ciśnienie powietrza z pompy, co eliminuje potrzebę stosowania oleju. Podobnie jak w przypadku opisanej powyżej metody jednorurkowej, brak jakichkolwiek połączeń materiałowych między łąkotką a końcówką kaniuli zmniejsza ryzyko przecieków. Jednak ostry stożek i delikatne końcówki szklanych pipet zapobiegają ich przenikaniu przez oponę twardą NHP lub celowaniu w głębokie struktury.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sprzęt: Zestaw
Pozycja< / mocny>
klucze imbusowe	BONDHUS	10936	STERRAD
Uchwyt do kaniuli	KOPF	1770	STERRAD
Nośnik (manipulator)	KOPF	1404	STERRAD
Platforma	nośnaKOPF	1430	NA
Statyw nośny	KOPF	1449	STERRAD
Osłony oczu, uszu, ust	KOPF	1430	NA
Baza stereotaktyczna	KOPF	1210	NA
mocna>Sprzęt: Kaniula
Pozycja
1 mL Strzykawki Luer-lock	BD	309628	NA (opakowanie sterylizowane)
Kaniule*	(domowej roboty - patrz poniżej)	NA	(autoklaw)
Kolorowy olej**	(domowej roboty - patrz poniżej)	NA	NA
Winda (do stojaka na tuby)	Cole-Parmer	UX-08057-10	STERRAD
Końcówka filtra	Genesee Scientific	23-404	NA (opakowanie sterylizowane)
Fluorescencyjny mikrokulki	Lumafluor	R170	NA
P20 pipetman	Gilson	FA10003M	NA
Probówki PCR	Olympus Plastics	22-161	STERRAD
Zawór odcinający	Cole-Parmer	3060004	STERRAD
Stojak na rurki	domowej roboty	NA	STERRAD
Rozwiązanie wektorowe	(domowej roboty)	NA	NA
< mocny>Sprzęt: < / mocny> Zestaw
< mocny>Pozycja< / mocny>
Elektryczna pompa powietrza	World Precision Instruments	PV830	NA
Pedał nożny	World Precision Instruments	3260	NA
Osłona rurki	EZ Drape	A400-1000	NA (pakiet sterylizowany)
< mocny>Sprzęt: Narzędzia
ogólnej< mocny>Pozycja< / mocny>
Zlewka	MEDLINE	azlon	STERRAD
Frezy	STRYKER	277-10-235	STERRAD
Dwuzębny szpikulec do tkanek	Fine Science Tools	18067-11	STERRAD
Serwety	MEDLINE	DYNJP3004	NA (opakowanie sterylizowane)
Kleszczyki opatrunkowe	Miltex	6-118	STERRAD
Wiertło	STRYKER	Q9R-5400	NA
Wiertła	STRYKER	277-82-87	STERRAD
Gaza	MEDLINE	NON26334	NA (opakowanie sterylizowane)
Kleszczyki hemostatyczne do komarów	Miltex	7-2, 7-4	STERRAD
Uchwyty lekkie	SKYTRON	Stellar XL	STERRAD
Igła hodler	Miltex	8-2	STERRAD
Winda okostna	Miltex	18-1968	STERRAD
Rongeurs	Miltex	17-4800	STERRAD
Saline	BAXTER	2F7122	STERRAD
Skalpel	Bard-Parker	372610	STERRAD
Nożyczki	Miltex	5-12, 5-114	STERRAD
Zwijacze Senn	Miltex	28065	STERRAD Sterylne
rękawice	MEDLINE	Triumph Micro	NA (opakowanie sterylizowane)
Ssanie	medela	200-4869	NA
Końcówka ssąca	MEDLINE	DYNDFR12S	NA (opakowanie sterylizowane)
Rurka ssąca	COVIDEN	8888301614	NA (pakiet sterylizowany)
Fartuchy chirurgiczne	MEDLINE	DYNJP2002S	NA (opakowanie sterylizowane)
Długopisy chirurgiczne i linijka	MEDLINE	DYNJSM03	NA (opakowanie sterylizowane)
Szew	COVIDEN	SL-635	NA (pakiet sterylizowany)
Kleszczyki do tkanek	Miltex	6-114	STERRAD
Zaciski do ręczników	Miltex	7-504	STERRAD
Waciki do drewna	MEDLINE	MDS202095	NA (pakiet sterylizowany)
< mocny>Sprzęt: < / mocny> * kaniule
Pozycja
Igła podskórna	EXELINT INTERNATIONAL	26437	NA (pakiet sterylizowany)
Rura ze stali nierdzewnej	K-TUBE	K30R	NA
PTFE rura	ZEUS	216200	NA
strong>Sprzęt: **kolorowy olej
Pozycja
Płynny koncentrat barwnika do świec	PremiumCraft	Czerwony/Różowy	NA
Olej mineralny	Vi-Jon	S0883	NA
	STERRAD: niskotemperaturowa plazma gazowa