W obecnym protokole pokazujemy, jak wizualizować dwuniciową resekcję końca DNA podczas fazy S/G2 cyklu komórkowego przy użyciu metody opartej na immunofluorescencji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR) to złożona i istotna dziedzina, która stała się jeszcze ważniejsza dzięki zastosowaniu leków ukierunkowanych na DDR w leczeniu raka. Tymi celami są polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP), które inicjują różne formy naprawy DNA. Hamowanie tych enzymów za pomocą inhibitorów PARP (PARPi) osiąga syntetyczną śmiertelność poprzez nadanie wrażliwości terapeutycznej komórkom z niedoborem rekombinacji homologicznej (HR) z powodu mutacji w raku piersi typu 1 (BRCA1), BRCA2 lub partnerze i lokalizatorze BRCA2 (PALB2).
Komórki leczone PARPi akumulują dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB). Pęknięcia te są przetwarzane przez maszynerię resekcji końca DNA, co prowadzi do powstania jednoniciowego (ss) DNA i późniejszej naprawy DNA. W kontekście niedoboru BRCA1 ożywienie resekcji DNA poprzez mutacje w inhibitorach resekcji DNA, takich jak 53BP1 i DYNLL1, powoduje oporność na PARPI. W związku z tym możliwość monitorowania resekcji DNA w celulo ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia szlaków naprawy DNA i opracowania nowych strategii przezwyciężenia oporności na PARPi. Techniki oparte na immunofluorescencji (IF) pozwalają na monitorowanie globalnej resekcji DNA po uszkodzeniu DNA. Strategia ta wymaga znakowania genomowego DNA o długich impulsach za pomocą 5-bromo-2′-deoksyurydyny (BrdU). Po uszkodzeniu DNA i resekcji końca DNA, powstałe jednoniciowe DNA jest specyficznie wykrywane przez przeciwciało anty-BrdU w warunkach natywnych. Co więcej, resekcję DNA można również badać przy użyciu markerów cyklu komórkowego w celu różnicowania różnych faz cyklu komórkowego. Komórki w fazie S/G2 pozwalają na badanie resekcji końców w HR, podczas gdy komórki G1 mogą być wykorzystywane do badania niehomologicznego łączenia końców (NHEJ). Szczegółowy protokół dla tej metody IF sprzężonej z dyskryminacją cyklu komórkowego opisano w tym artykule.
Wprowadzenie
Modulacja czynników naprawy DNA jest ciągle rozwijającą się metodą terapii raka, szczególnie w środowiskach nowotworowych z niedoborem naprawy DNA DSB. Hamowanie określonych czynników naprawczych jest jedną z genialnych strategii stosowanych w celu uwrażliwienia komórek rakowych na czynniki uszkadzające DNA. Dziesięciolecia badań doprowadziły do zidentyfikowania różnych mutacji genów naprawy DNA jako biomarkerów dla wyboru strategii terapeutycznej1. W związku z tym dziedzina naprawy DNA stała się centrum opracowywania leków, aby zapewnić szeroki zakres zabiegów, wzmacniając koncepcję medycyny spersonalizowanej.
DSB ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla komórkowa, zabiegi i przygotowanie szkiełek nakrywkowych
UWAGA: Wszystkie operacje powlekania komórek, transfekcji i zabiegów, z wyjątkiem napromieniania, powinny odbywać się pod sterylnym kapturem do hodowli komórek.
- Dzień 1
- Na płytce 6-dołkowej umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdym dołku na tyle warunków, ile potrzeba. Płytka ~150 000 komórek HeLa do transfekcji lub leczenia farmakologicznego, zgodnie z życzeniem.
UWAGA: W przypadku transfekcji zaleca się wykonanie transfekcji odwrotnej w czasie powlekania lub możliwe jest wykonanie transfekcji do przodu kilka godzin po posiewaniu, aby u....
- Na płytce 6-dołkowej umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdym dołku na tyle warunków, ile potrzeba. Płytka ~150 000 komórek HeLa do transfekcji lub leczenia farmakologicznego, zgodnie z życzeniem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszym protokole zastosowano test oparty na bromodeoksyurydynie (BrdU) w celu ilościowego pomiaru odpowiedzi resekcyjnej komórek HeLa na uszkodzenia wywołane napromieniowaniem. Powstałe ślady ssDNA są wizualizowane jako wyraźne ogniska (foci) po barwieniu immunofluorescencyjnym (Rycina 1A). Zidentyfikowane ogniska zostały następnie skwantyfikowane i wyrażone jako całkowita zintegrowana intensywność barwienia BrdU w jądrach komórkowych (Rycina 1B, R.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule opisano metodę wykorzystującą barwienie IF do pomiaru zmian w resekcji DNA w celuli. Obecnym standardem obserwacji wpływu na resekcję DNA jest barwienie RPA; jednak jest to metoda pośrednia, na którą może mieć wpływ replikacja DNA. Wcześniej opisano inną technikę resekcji IF DNA opartą na inkorporacji BrdU w celu sklasyfikowania wynikającej intensywności w komórkach BrdU-dodatnich i BrdU-ujemnych. Metoda ta pozwoliła na zaliczenie komórek, które nie są poddawane HR, jako dodatnich ze względu na barwie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Marie-Christine Caron za doskonałe porady techniczne. Prace te są wspierane przez fundusze z Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. jest kierownikiem Tier 1 Canada Research Chair w dziedzinie naprawy DNA i terapii raka. J.O'S jest doktorantem FRQS, a S.Y.M jest stypendystą podoktoranckim FRQS.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alexa 568 koza anty-królik | Sondy molekularne | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 koza anty-mysie | Sondy molekularne | A11001 | 1:800 |
| Anty PARP1 (F1-23) | Domowej roboty | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anty-Alpha tubulina (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anty-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Stacjonarna komórka naświetlacza rentgenowskiego | Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoksyurydyna (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Profilometr komórek | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratoryjna folia do owijania 4 cale / 250 stóp | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM wysoki poziom glukozy | Fisher | 10063542 | |
| naukowy EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Płód Surowica bydlęca | Gibco | 12483-020 | |
| Okulary nakrywkowe Fisherbrand: Kwadraty 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Leica | DMI6000B | 63-krotny obiektyw zanurzeniowy |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I INKUBATOR CO2 CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Igła | |||
| PBS 1x | Bisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| kontrola siRNA | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Deoksycholcan sodu | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sacharoza | BioShop Kanada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | |||
Bibliografia
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-path....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
