Artykuł metodologiczny

Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

DOI:

10.3791/62553

⸱

28 kwietnia 2021

 ,  ,  , 
1Oncology Division, Genome Stability Laboratory, CHU de Québec Research Center, HDQ Pavilion, 2Department of Molecular Biology, Medical Biochemistry, and Pathology, Laval University Cancer Research Center, 3Oncology Division, CHU de Québec Research Center, CHUL Pavilion

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnym protokole pokazujemy, jak wizualizować dwuniciową resekcję końca DNA podczas fazy S/G2 cyklu komórkowego przy użyciu metody opartej na immunofluorescencji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR) to złożona i istotna dziedzina, która stała się jeszcze ważniejsza dzięki zastosowaniu leków ukierunkowanych na DDR w leczeniu raka. Tymi celami są polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP), które inicjują różne formy naprawy DNA. Hamowanie tych enzymów za pomocą inhibitorów PARP (PARPi) osiąga syntetyczną śmiertelność poprzez nadanie wrażliwości terapeutycznej komórkom z niedoborem rekombinacji homologicznej (HR) z powodu mutacji w raku piersi typu 1 (BRCA1), BRCA2 lub partnerze i lokalizatorze BRCA2 (PALB2).

Komórki leczone PARPi akumulują dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB). Pęknięcia te są przetwarzane przez maszynerię resekcji końca DNA, co prowadzi do powstania jednoniciowego (ss) DNA i późniejszej naprawy DNA. W kontekście niedoboru BRCA1 ożywienie resekcji DNA poprzez mutacje w inhibitorach resekcji DNA, takich jak 53BP1 i DYNLL1, powoduje oporność na PARPI. W związku z tym możliwość monitorowania resekcji DNA w celulo ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia szlaków naprawy DNA i opracowania nowych strategii przezwyciężenia oporności na PARPi. Techniki oparte na immunofluorescencji (IF) pozwalają na monitorowanie globalnej resekcji DNA po uszkodzeniu DNA. Strategia ta wymaga znakowania genomowego DNA o długich impulsach za pomocą 5-bromo-2′-deoksyurydyny (BrdU). Po uszkodzeniu DNA i resekcji końca DNA, powstałe jednoniciowe DNA jest specyficznie wykrywane przez przeciwciało anty-BrdU w warunkach natywnych. Co więcej, resekcję DNA można również badać przy użyciu markerów cyklu komórkowego w celu różnicowania różnych faz cyklu komórkowego. Komórki w fazie S/G2 pozwalają na badanie resekcji końców w HR, podczas gdy komórki G1 mogą być wykorzystywane do badania niehomologicznego łączenia końców (NHEJ). Szczegółowy protokół dla tej metody IF sprzężonej z dyskryminacją cyklu komórkowego opisano w tym artykule.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modulacja czynników naprawy DNA jest ciągle rozwijającą się metodą terapii raka, szczególnie w środowiskach nowotworowych z niedoborem naprawy DNA DSB. Hamowanie określonych czynników naprawczych jest jedną z genialnych strategii stosowanych w celu uwrażliwienia komórek rakowych na czynniki uszkadzające DNA. Dziesięciolecia badań doprowadziły do zidentyfikowania różnych mutacji genów naprawy DNA jako biomarkerów dla wyboru strategii terapeutycznej1. W związku z tym dziedzina naprawy DNA stała się centrum opracowywania leków, aby zapewnić szeroki zakres zabiegów, wzmacniając koncepcję medycyny spersonalizowanej.

DSB są naprawiane przez dwie główne ścieżki: NHEJ i HR2. Szlak NHEJ jest podatny na błędy, szybko liguje dwa końce DNA przy niewielkim lub zerowym przetwarzaniu końca DNA i obejmuje kinazę białkową (DNA-PKcs), kompleks Ku70/80, 53BP1 i białka RIF13. W przeciwieństwie do tego, HR jest wiernym mechanizmem zainicjowanym przez BRCA14. Niezbędnym krokiem w naprawie HR jest proces resekcji końca DNA, który polega na degradacji złamanych końców prowadzącej do jednoniciowego (ss) DNA z końcami 3'-OH. BRCA1 ułatwia rekrutację dalszych białek, które tworzą resektosom MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, które są zaangażowane w resekcję DNA od 5' do 3'5.

Początkowa resekcja końcowa jest realizowana poprzez aktywność endonukleazy MRE11, co pozwala na dalsze przetwarzanie przez nukleazy DNA2 i EXO1. Wygenerowane zwisy ssDNA są szybko powlekane białkiem replikacyjnym A (RPA) w celu ochrony przed dalszym przetwarzaniem. Następnie BRCA2, PALB2 i BRCA1 angażują się, aby pośredniczyć w przemieszczeniu RPA i montażu nukleofilamentu RAD51 wymaganym do mechanizmu naprawy ukierunkowanego na homologię. Delikatna równowaga między wykorzystaniem NHEJ i HR jest niezbędna do optymalnego utrzymania integralności genomu. Wybór ścieżki zależy od fazy cyklu komórkowego. HR jest preferencyjnie stosowany w fazach od S do G2, w których resekcja DNA jest na najwyższym poziomie, a chromatydy siostrzane są dostępne w celu zapewnienia prawidłowej naprawy.

Polimeraza 1 (ADP-ryboza) jest jednym z najwcześniejszych białek zrekrutowanych do DSB. Reguluje zarówno aktywność resekcyjną, jak i montaż dalszych efektorów zaangażowanych w NHEJ5,6. PARP-1 jest również wymagany do naprawy jednoniciowych pęknięć DNA podczas replikacji7,8. Ze względu na ważną rolę w naprawie DNA, inhibitory PARP (PARPi) są stosowane w terapiach przeciwnowotworowych. W kilku nowotworach z niedoborem HR leczenie PARPi prowadzi do syntetycznej odpowiedzi śmiertelnej z powodu niezdolności komórek z niedoborem HR do naprawy nagromadzonych uszkodzeń za pomocą alternatywnej ścieżki9,10. Obecnie istnieją cztery zatwierdzone przez FDA PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib i Talazoparib (zwany również BMN 673), które są stosowane w różnych metodach leczenia raka piersi i jajnika11. Jednak oporność na PARPi jest powszechna, a jedną z potencjalnych przyczyn jest ponowne zdobycie biegłości HR12. Utrata lub zahamowanie PARP-1 w obecności napromieniowania rozregulowuje maszynerię resektosomyczną, prowadząc do akumulacji dłuższych odcinków ssDNA13. W związku z tym dogłębne badanie resekcji DNA in vivo ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia szlaków naprawy DNA i późniejszego opracowania nowych strategii leczenia raka i przezwyciężenia oporności na PARPi.

Zastosowano kilka metod wykrywania zdarzeń resekcji DNA5. Jedną z takich metod jest klasyczna technika oparta na IF, pozwalająca na pośrednie barwienie i wizualizację wyciętego DNA po wywołanym stresem DSB za pomocą przeciwciała anty-RPA. Znakowanie genomowego DNA za pomocą 5-bromo-2′-deoksyurydyny (BrdU) i wykrywanie tylko ssDNA jest bezpośrednim pomiarem zdarzeń resekcji DNA. Omija monitorowanie RPA, które bierze udział w wielu procesach komórkowych, takich jak replikacja DNA. W opisanej tutaj metodzie komórki inkubowane z BrdU przez pojedynczy cykl komórkowy pozwalają na włączenie BrdU do jednej nici replikującego się komórkowego DNA. Po resekcji barwienie IF przeprowadza się w warunkach pozwalających na wykrycie BrdU tylko w postaci ssDNA, przy użyciu przeciwciała anty-BrdU. Przeciwciało to ma dostęp tylko do odsłoniętych nukleotydów BrdU i nie wykryje tych zintegrowanych z dwuniciowym DNA. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej wycięte DNA można uwidocznić w postaci punktowych ognisk BrdU/ssDNA. Intensywność jądrowa tych ognisk może być wykorzystana jako odczyt do ilościowego określenia resekcji po uszkodzeniu DNA. W artykule opisano krok po kroku procesy tej metody, które można zastosować do większości linii komórkowych ssaków. Metoda ta powinna mieć szerokie zastosowanie jako prosty sposób monitorowania resekcji końcowej DNA w celulo, jako dowód słuszności koncepcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa, zabiegi i przygotowanie szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Wszystkie operacje powlekania komórek, transfekcji i zabiegów, z wyjątkiem napromieniania, powinny odbywać się pod sterylnym kapturem do hodowli komórek.

  1. Dzień 1
    1. Na płytce 6-dołkowej umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdym dołku na tyle warunków, ile potrzeba. Płytka ~150 000 komórek HeLa do transfekcji lub leczenia farmakologicznego, zgodnie z życzeniem.
      UWAGA: W przypadku transfekcji zaleca się wykonanie transfekcji odwrotnej w czasie powlekania lub możliwe jest wykonanie transfekcji do przodu kilka godzin po posiewaniu, aby umożliwić przyleganie. Odwrotną transfekcję przeprowadza się poprzez dodanie mieszanki transfekcyjnej do szkiełka nakrywkowego przed dodaniem komórek; W ten sposób transfekcja rozpoczyna się, zanim komórki zaczną przylegać. Z kolei transfekcja do przodu polega na dodaniu mieszanki transfekcyjnej po przyklejeniu się do powierzchni, zwykle następnego dnia. Można to jednak zrobić tego samego dnia, pod warunkiem, że zapewni się wystarczająco dużo czasu, aby komórki się przykleiły.
    2. Do tej metody użyj 4 dołków: Studnia 1: kontrola siRNA (określana jako siCTRL); Studnia 2: siRNA przeciwko PARP-1 (siPARP-1); Studnia 3: nieleczona; Studnia 4: Komórki, które należy poddać działaniu 5 μM BMN673 1 godzinę przed napromienianiem.
      UWAGA: W niniejszym protokole wszystkie badania przeprowadzono w warunkach napromieniowania (patrz punkt 1.3).
    3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 przez noc, chociaż protokół transfekcji dopuszcza inkubację do 3 dni. Czas inkubacji przed podaniem zabiegu BrdU będzie zależał od skuteczności transfekcji siRNA. Jeśli nie ma transfekcji, inkubacja przez 16 godzin jest wystarczająca, aby umożliwić przyleganie do szkiełka nakrywkowego i pewien wzrost komórek.
      UWAGA: Warunki w inkubatorze można zmieniać w zależności od używanej linii komórkowej.
  2. Dzień 2
    1. Dodać BrdU w końcowym stężeniu 10 μM do odpowiednich pożywek hodowlanych i inkubować przez 16 godzin (jeden cykl komórkowy).
      UWAGA: Roztwór BrdU przygotowuje się w dimetylosulfotlenku; użyty roztwór podstawowy ma 10 mM i jest przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
  3. Dzień 3
    1. Naświetlić płytki całkowitą dawką 5 Gy promieniowania rentgenowskiego (należy zmieniać dawkę promieniowania w zależności od typu naświetlacza, na przykład naświetlacze dla małych zwierząt vs. naświetlacze stołowe). Zobacz tabelę materiałów dla marki i modelu zastosowanego promiennika.
    2. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze i uwalniać komórki przez 3 godziny.
    3. Podczas 3-godzinnego okresu inkubacji przygotować dwa, A i B, oraz 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
      UWAGA: A i B oraz sacharoza powinny być przygotowane świeże w dniu utrwalenia, przy użyciu świeżego roztworu sacharozy, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
      1. Przygotować bufor A (bufor do ekstrakcji wstępnej), zgodnie z kolejnością (30 ml) opisaną w tabeli 1.
        UWAGA: Sacharoza 1M powinna być przygotowana w dniu użycia, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
      2. Przygotować bufor B (bufor do usuwania cytoszkieletu) zgodnie z kolejnością opisaną w tabeli 1 (30 ml).
        UWAGA: Bufor B musi być przygotowany w podanej kolejności, aby zapobiec wytrącaniu się Tween-20 i roztworu deoksycholanu sodu.
      3. Przygotuj 4% PFA, 2 ml na stan (10 ml), pod kapturem chemicznym (Tabela 1).

2. Wstępna ekstrakcja i utrwalanie

UWAGA: Wszystkie wstępne ekstrakcje i utrwalanie są wykonywane z szkiełkami nakrywkowymi pozostającymi na płytce do hodowli tkankowej na lodzie lub w temperaturze 4 °C; szkiełko nakrywkowe jest podnoszone dopiero w ostatnim kroku montażu (zobacz dyskusję).

  1. Ekstrakcja wstępna
    1. Odessać pożywkę, ostrożnie umyć komórki dwukrotnie 1x PBS i usunąć PBS. Dodać 2 ml buforu A do ekstrakcji wstępnej i natychmiast inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 min.
      UWAGA: Ważne jest, aby czas inkubacji w buforze A nie uległ wydłużeniu. Przedłużona inkubacja w przed ekstrakcją spowoduje zwiększenie liczby oderwanych komórek od szkiełka nakrywkowego. Alternatywnie, zamiast inkubacji w temperaturze 4°C, inkubację można przeprowadzić na lodzie.
    2. Usuń bufor A za pomocą aspiration.
      UWAGA: Nie myj szkiełek nakrywkowych po usunięciu buforu A. Przejdź do następnego kroku.
    3. Dodać 2 ml buforu B do usuwania cytoszkieletu i natychmiast inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Ostrożnie odessać bufor B i ostrożnie umyć komórki raz 1x PBS. Ostrożnie zassać 1x PBS.
  2. Utrwalenie
    1. Napraw komórki, dodając 2 ml 4% PFA pod maską chemiczną.
      UWAGA: PFA jest toksyczny i musi być manipulowany pod maską chemiczną.
    2. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Umyć szkiełka nakrywkowe dwukrotnie 1x PBS i odessać nadmiar.
    3. Przykryj szkiełka nakrywkowe 100% zimnym metanolem i inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze -20 °C przez 5 minut. Przemyć dwukrotnie 1x PBS.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w temperaturze 4 °C w 1x PBS, a w razie potrzeby płytę zawinąć w folię aluminiową. Komórki nie powinny być przechowywane dłużej niż 5 dni przed kontynuacją protokołu IF.

3. Przepuszczalność

  1. Inkubować komórki z 2 ml 1x PBS zawierającego 0,5% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Umyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 2 ml 1x PBS.

4. Barwienie immunologiczne

  1. Krok blokujący
    1. Przygotuj wystarczającą ilość świeżego buforu blokującego (3% BSA w 1x PBS), aby użyć 2 ml na szkiełko nakrywkowe.
      UWAGA: Przygotuj dodatkowe 5 ml buforu blokującego, aby przygotować roztwory przeciwciał.
    2. Dodać 2 ml buforu blokującego do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  2. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
    1. Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała w świeżym buforze blokującym: BrdU RPN202 1:1000 i antygen jądrowy komórek proliferujących (PCNA) 1:500, 100 μL na szkiełko nakrywkowe.
      UWAGA: Aby zachować przeciwciało, można użyć mniejszej objętości, 75-100 μl dla szkiełka nakrywkowego 22 x 22 mm, 50-75 μl dla szkiełka nakrywkowego 18 x 18 mm.
    2. Na każde szkiełko nakrywkowe dodać 100 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych. Przykryj szkiełka nakrywkowe kwadratem parafilmu za pomocą pęsety i ostrożnie ustaw parafilm, aby nie tworzyć pęcherzyków.
    3. Przykryć płytkę folią aluminiową i inkubować przeciwciało pierwszorzędowe przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.
    4. Usuń kwadraty parafilmu i umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 2 ml sterylnego 1x PBS.
  3. Inkubacja przeciwciał wtórnych
    1. Przygotować wystarczającą ilość roztworu przeciwciała drugorzędowego w świeżym buforze blokującym: anty-mysi 488 fluorescencyjny wtórny A11011 (dla BrdU) rozcieńczenie 1:800 i anty-królik 568 fluorescencyjny wtórny A11011 (dla PCNA) rozcieńczenie 1:800,
      UWAGA: Użyte kolory można zmienić w celu dopasowania do potrzeb eksperymentu. Konkretną użytą markę można znaleźć w Tabeli Materiałów.
    2. Dodać na każde szkiełko nakrywkowe 100 μl roztworu przeciwciał wtórnych, przykryć szkiełka nakrywkowe kwadratem parafilmu za pomocą pęsety i ostrożnie ustawić parafilm bez pęcherzyków.
    3. Inkubować przeciwciało drugorzędowe w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z płytką pokrytą folią aluminiową.
    4. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy 2 ml 1x PBS.
  4. Barwienie jądrowe
    1. Przygotować objętość 2 ml na szkiełko nakrywkowe 1x PBS zawierającej 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) w końcowym stężeniu 1 μg/ml (1:1000).
    2. Dodać na każde szkiełko nakrywkowe 2 ml roztworu DAPI. Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 10 minut z płytką pokrytą folią aluminiową. Umyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie 1x PBS.
    3. Przykryj szkiełka nakrywkowe 1x PBS i użyj igły lub cienkiej pęsety, aby podnieść szkiełko nakrywkowe z dna studzienki. Ostrożnie zetrzyj nadmiar płynu, delikatnie stukając jedną krawędzią w ręcznik papierowy.
      UWAGA: Uważaj, aby nie upuścić szkiełka ani nie pozwolić, aby płaska powierzchnia z przylegającymi komórkami dotykała papieru.
    4. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą 10-20 μl nośników montażowych specyficznych dla IF.

5. Akwizycja i analiza obrazu

UWAGA: Akwizycja obrazu może być wykonana na kilku typach mikroskopów fluorescencyjnych. Użyto mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywem olejowym o powiększeniu 63x; zobacz tabelę materiałów dla marki i modelu. Stosy Z nie są wymagane, chociaż mogą być przydatne w zależności od linii komórkowej i poziomu barwienia mitochondriów.

  1. Analiza obrazu
    1. Dla każdego obrazu utwórz wiele plików TIFF; scal wszystkie płaszczyzny, ale kanały kolorów powinny być oddzielone. Zaimportuj te pliki do programu Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) i przeanalizuj je za pomocą potoku zliczania plamek (dodatkowe wideo 1).
    2. Prześlij obrazy (rysunek uzupełniający S1A).
      1. Aby rozpocząć tworzenie projektu, załaduj potok zliczania plamek do programu, a obrazy do analizy znajdują się w podanym obszarze.
      2. Użyj modułu NamesAndTypes, aby przypisać zrozumiałą nazwę do każdego obrazu, za pomocą której inne moduły będą się do niego odwoływać-C01: Reprezentujący kanał BrdU; C02: Reprezentujący kanał PCNA; C03: Reprezentujący kanał DAPI.
        UWAGA: Te identyfikatory będą zależeć od mikroskopu; W nazwie pliku powinien znajdować się identyfikator, aby odróżnić kanały.
    3. Określ, który plik zostanie użyty do identyfikacji jąder i nazwij go (zmień tę nazwę w razie potrzeby) (patrz rysunek uzupełniający S1B i rysunek uzupełniający S1C).
      1. Wybierz średnicę obiektu z zakresu od 50 do 300 jednostek pikseli, co jest dopuszczalnym zakresem rozmiarów jąder, ale zmień wartość, aby dopasować jądra do obrazu.
        UWAGA: Może się zdarzyć, że 50 jest zbyt dużą wartością i uniemożliwia identyfikację mniejszych jąder; Podobnie, liczba 300 może pozwolić na zaliczenie dużych grup jąder jako 1.
      2. Odrzuć obiekty spoza zakresu średnic, aby upewnić się, że zostaną policzone tylko te, które spełniają kryteria.
      3. Odrzuć obiekty dotykające obramowania, aby usunąć komórki, które mogą znajdować się tylko częściowo w polu.
      4. Zastosuj próg, aby dopasować go do określonych obrazów. Zwróć uwagę na następujące ustawienia jako przykład. Zmień współczynnik korekcji progowania w zależności od tego, jak rygorystyczna będzie strategia progowania. Inne ustawienia obejmują strategię progową: Globalna; metoda progowania: Otsu; progi dwuklasowe lub trzyklasowe: dwuklasowe; skala wygładzania progów: 1; współczynnik wygładzania progu: 1; dolna i górna granica progu: 0,0 i 1,0; metoda rozróżniania zbitych obiektów: Kształt; oraz metoda rysowania linii podziału między zbitymi obiektami: Propagate.
        UWAGA: Dla każdego parametru profiler komórek podaje uzupełniające definicje i dostępne możliwości ustawienia zmiennej.
    4. Zidentyfikuj główny obiekt, aby zidentyfikować ogniska (rysunek uzupełniający S2A).
      1. Użyj następujących ustawień: wybierz obraz wejściowy: Maskedgreen; nazwij główny obiekt, który ma być zidentyfikowany: BrdUFoci; typowa średnica obiektu: 1-15; odrzuć obiekt spoza zakresu średnic: Tak; odrzuć obiekt dotykający granicy obrazu: Nie; strategia progowa: Adaptacyjna; metoda progowania: Otsu; progowanie dwuklasowe lub trzyklasowe: Trzy klasy; skala wygładzania progu: 1; współczynnik wygładzania progu: 3; i rozmiar filtra wygładzającego: 4.
    5. Zmierz intensywność (rysunek uzupełniający S2B).
      1. Wybierz obraz, który ma być mierzony: OrigGreen.
      2. Kliknij Dodaj kolejny obraz. Wybierz obraz, który ma być mierzony: PCNA. Wybierz obiekty do pomiaru: Nuclei.
        UWAGA: Zostanie to wykorzystane do pomiaru intensywności BrdU i PCNA - ostatecznych danych, które zostaną przedstawione na wykresie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, test oparty na bromodeoksyurydynie (BrdU) został użyty do ilościowego zmierzenia odpowiedzi resekcyjnej komórek HeLa na uszkodzenia wywołane napromieniowaniem. Wygenerowane ślady ssDNA są wizualizowane jako odrębne ogniska po barwieniu immunofluorescencyjnym (Rysunek 1A). Zidentyfikowane ogniska zostały następnie określone ilościowo i wyrażone jako całkowita zintegrowana intensywność barwienia BrdU w jądrach (Rysunek 1B, Rysunek uzupełniający S1, Rysunek uz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano metodę wykorzystującą barwienie IF do pomiaru zmian w resekcji DNA w celuli. Obecnym standardem obserwacji wpływu na resekcję DNA jest barwienie RPA; jednak jest to metoda pośrednia, na którą może mieć wpływ replikacja DNA. Wcześniej opisano inną technikę resekcji IF DNA opartą na inkorporacji BrdU w celu sklasyfikowania wynikającej intensywności w komórkach BrdU-dodatnich i BrdU-ujemnych. Metoda ta pozwoliła na zaliczenie komórek, które nie są poddawane HR, jako dodatnich ze względu na barwie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Marie-Christine Caron za doskonałe porady techniczne. Prace te są wspierane przez fundusze z Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. jest kierownikiem Tier 1 Canada Research Chair w dziedzinie naprawy DNA i terapii raka. J.O'S jest doktorantem FRQS, a S.Y.M jest stypendystą podoktoranckim FRQS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa 568 koza anty-królikSondy molekularneA110111:800
Alexa Fluor 488 koza anty-mysieSondy molekularneA110011:800
Anty PARP1 (F1-23)Domowej roboty1:2500
Anti PCNA (SY12-07)NovusNBP2-673901:500
Anty-Alpha tubulina (DM1A)AbcamAb72911:100000
anty-BrdUGE HealthcareRPN2021:1000
Stacjonarna komórka naświetlacza rentgenowskiegoRad
BMN673MedChem ExpressHY-16106
Bromodeoksyurydyna (BrdU)SigmaB5002
BSASigmaA7906
Profilometr komórekBroad InstituteV 3.19https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratoryjna folia do owijania 4 cale / 250 stópFisher scientific13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)Invitrogen Life TechnologyD1306
DMEM wysoki poziom glukozyFisher10063542
naukowy EGTASigma-AldrichE3889
Płód Surowica bydlęcaGibco12483-020
Okulary nakrywkowe Fisherbrand: Kwadraty 22 x 22Fisher scientific12 541B
Mikroskop fluorescencyjnyLeicaDMI6000B63-krotny obiektyw zanurzeniowy
HeLaATCCCCL-2
HERACELL 160I INKUBATOR CO2 CU 1-21 TC 120VVWR5103040837% CO2
MgCl2BioShop CanadaMAG520.500
NaClBioShop CanadaSOD002.10
Igła
PBS 1xBisent Bio Products311-010-CS
PFA 16%Cedarlane Labs15710-S(EM)
PIPESSigma-AldrichP6757-100G
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogen Life TechnologyP-36930
RNAiMAXInvitrogen13778-075
siPARPiDharmaconAAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
kontrola siRNADharmaconUUCGAACGUGUCACGUCAA
Deoksycholcan soduSigma-AldrichD6750-100G
SacharozaBioShop KanadaSUC507.5
Tris-baseBioShop CanadaTRS001.5
Trition X-100Millipore SigmaT8787-250ML
Tween20
Pęseta do BP337500 naukowej Fisher

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
  2. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
  3. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
  4. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  5. Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
  6. Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
  7. Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
  8. Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
  9. Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  10. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
  11. Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
  12. Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
  13. Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954(2019).
  14. Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19(2014).
  15. Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
  16. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  17. Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
  18. Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Resekcja ko c w DNAznakowanie BrdUodpowied na uszkodzenia DNArekombinacja homologicznainhibitory PARPobrazowanie immunofluorescencyjnejednoniciowy DNAbarwienie PCNAzliczanie plamek

Powiązane artykuły