Artykuł metodologiczny

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

DOI:

10.3791/62554

⸱

11 maja 2021

 ,  ,  , 
1Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Department of Internal Medicine (Nephrology), Leiden University Medical Center, 2Institute Physics for Medicine Paris, INSERM U1273, ESPCI Paris, CNRS FRE 2031, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and PSL Research University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie postępy w indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSC) i technologiach edycji genów umożliwiają rozwój nowych modeli chorób opartych na komórkach ludzkich dla programów odkrywania leków fenotypowych (PDD). Chociaż te nowatorskie urządzenia mogą dokładniej przewidywać bezpieczeństwo i skuteczność badanych leków u ludzi, ich opracowanie do celów klinicznych nadal w dużym stopniu opiera się na danych dotyczących ssaków, w szczególności na wykorzystaniu mysich modeli chorób. Równolegle z ludzkimi organoidami lub modelami chorób typu organoid na chipie, opracowanie odpowiednich modeli mysich in vitro stanowi zatem niezaspokojoną potrzebę oceny bezpośrednich porównań skuteczności i bezpieczeństwa leków między gatunkami oraz w warunkach in vivo i in vitro. W tym miejscu opisano test kiełkowania naczyń krwionośnych, który wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała zarodkowe (EB). Unaczynione EB hodowane na żelu kolagenowym 3D rozwijają nowe naczynia krwionośne, które rozszerzają się w procesie zwanym angiogenezą kiełkowania. Model ten podsumowuje kluczowe cechy angiogenezy kiełkowania in vivo - tworzenia naczyń krwionośnych z wcześniej istniejącej sieci naczyniowej - w tym selekcję komórek końcówki śródbłonka, migrację i proliferację komórek śródbłonka, prowadzenie komórek, tworzenie rurki i rekrutację komórek ściennych. Jest podatny na badania przesiewowe pod kątem leków i genów modulujących angiogenezę i wykazuje podobieństwa do niedawno opisanych trójwymiarowych (3D) testów naczyniowych opartych na technologiach ludzkiego iPSC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich trzech dekad, odkrywanie leków na podstawie celów (TDD) było szeroko stosowane w odkrywaniu leków przez przemysł farmaceutyczny. TDD obejmuje zdefiniowany cel molekularny odgrywający ważną rolę w chorobie i opiera się na rozwoju stosunkowo prostych systemów hodowli komórkowych i odczytów do badań przesiewowych leków1. Najbardziej typowe modele chorób stosowane w programach TDD obejmują tradycyjne metody hodowli komórek, takie jak komórki nowotworowe lub unieśmiertelnione linie komórkowe hodowane w sztucznych środowiskach i niefizjologicznych podłożach. Chociaż wiele z tych modeli dostarczyło realnych narzędzi do identyfikacji skutecznych kandydatów na leki, stosowanie takich systemów może być wątpliwe ze względu na ich słabe znaczenie dla choroby2.

Dla większości chorób, mechanizmy leżące u podstaw są rzeczywiście złożone, a różne typy komórek, niezależne szlaki sygnałowe i wiele zestawów genów często przyczyniają się do określonego fenotypu choroby. Dotyczy to również chorób dziedzicznych, których główną przyczyną jest mutacja w jednym genie. Wraz z niedawnym pojawieniem się technologii indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i narzędzi do edycji genów, możliwe jest teraz generowanie organoidów 3D i modeli chorób narządów na chipach, które mogą lepiej podsumować ludzką złożoność in vivo3,4. Rozwój takich technologii wiąże się z odrodzeniem zainteresowania programami odkrywania leków fenotypowych (PDD)1. PDD można porównać do empirycznych badań przesiewowych, ponieważ nie opierają się one na wiedzy na temat tożsamości konkretnego celu leku ani hipotezie na temat jego roli w chorobie. Obecnie coraz częściej uznaje się, że podejście PDD w znacznym stopniu przyczynia się do odkrycia pierwszych w swojej klasie leków5. Ponieważ rozwój technologii organoidów ludzkich i organów na chipach jest wciąż w powijakach, oczekuje się, że modele iPSC (uzupełnione o innowacyjne narzędzia do obrazowania i uczenia maszynowego6,7) dostarczą w najbliższej przyszłości wielu nowatorskich, złożonych modeli chorób opartych na komórkach do badań przesiewowych leków i powiązanych programów PDD, aby przezwyciężyć niską produktywność podejścia TDD8, 9.

Podczas gdy modele ludzkich organoidów i organów na chipach mogą dostarczyć ważnych informacji na temat złożoności choroby i identyfikacji nowych leków, wprowadzanie leków do nowej praktyki klinicznej również opiera się na danych z modeli zwierzęcych w celu oceny ich skuteczności i bezpieczeństwa. Wśród nich myszy modyfikowane genetycznie są z pewnością najbardziej preferowanymi modelami ssaków. Mają wiele zalet, ponieważ mają stosunkowo krótki czas generacji jak na ssaki, mają wiele fenotypów podobnych do chorób ludzkich i można nimi łatwo manipulować genetycznie. Z tego powodu są one szeroko stosowane w programach do odkrywania leków10. Jednak wypełnienie luki między myszami a ludźmi pozostaje ważnym wyzwaniem11. Opracowanie mysich modeli in vitro równoważnych ludzkim modelom organoidowym i modelom narządów na chipie mogłoby przynajmniej częściowo wypełnić tę lukę, ponieważ umożliwi bezpośrednie porównanie skuteczności i bezpieczeństwa leków między danymi in vivo na myszach i in vitro na ludziach.

Tutaj opisany jest test kiełkowania naczyń krwionośnych w ciałach embrionalnych myszy (EBs). Naczynia krwionośne składają się z komórek śródbłonka (wewnętrzna wyściółka ścian naczyń), komórek ściennych (komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych i perycytów)12. Protokół ten opiera się na różnicowaniu mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC) w unaczynione EB za pomocą wiszących kropel, które podsumowują komórki śródbłonka de novo i różnicowanie komórek muralowych13,14. Mysie ESC można łatwo ustalić w hodowli z izolowanych blastocyst myszy dnia 3.5 o różnym pochodzeniu genetycznym15. Dają one również możliwości analizy klonalnej, śledzenia linii i mogą być łatwo manipulowane genetycznie w celu generowania modeli chorób13,16.

Ponieważ naczynia krwionośne odżywiają wszystkie narządy, nie jest zaskakujące, że wiele chorób, jeśli nie wszystkie, jest związanych ze zmianami w mikrokrążeniu. W stanach patologicznych komórki śródbłonka mogą przyjąć stan aktywowany lub mogą stać się dysfunkcyjne, co prowadzi do śmierci komórek ściennych lub migracji z naczyń krwionośnych. Mogą one powodować nadmierną angiogenezę lub rozrzedzenie naczyń, mogą indukować nieprawidłowy przepływ krwi i wadliwą barierę naczyń krwionośnych, co prowadzi do wynaczynienia komórek odpornościowych i stanu zapalnego12,17,18,19. Badania nad lekami modulującymi naczynia krwionośne są zatem wysokie, a wiele czynników molekularnych i koncepcji zostało już zidentyfikowanych w celu ukierunkowania terapeutycznego. W tym kontekście opisany protokół jest szczególnie przydatny do budowania modeli chorób i testowania leków, ponieważ podsumowuje kluczowe cechy angiogenezy kiełkowania in vivo, w tym selekcję komórek wierzchołka śródbłonka i łodygi, migrację i proliferację komórek śródbłonka, prowadzenie komórek śródbłonka, tworzenie rurki i rekrutację komórek ściennych. Wykazuje również podobieństwa do niedawno opisanych testów naczyniowych 3D opartych na technologiach ludzkiego iPSC20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywki i hodowla mESC

  1. Przygotuj kondycjonowaną pożywkę +/- (CM+/-) za pomocą suplementu 1x Pożywka Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) z 10% (obj./obj.) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 0,05 mM β-merkaptoetanolu, 1x aminokwasy endogenne (NEAA 1x), 2 mM L-glutaminy i 1 mM pirogronianu sodu.
  2. Przygotować kondycjonowaną pożywkę +/+ (CM+/+) przy użyciu suplementu CM+/- pożywki z czynnikiem hamującym białaczkę (LIF) (1,500 U/ml) i 0,1 mM β-merkaptoetanolu.
  3. Przygotować kondycjonowaną pożywkę +/+ w obecności dwóch inhibitorów (CM+/+ 2i) przy użyciu pożywki z suplementem CM+/+ o stężeniu 1 μM PD0325901 i 3 μM CHIR99021.
  4. Przygotować 0,1% roztwór żelatyny, mieszając 25 ml wstępnie podgrzanego 2% roztworu żelatyny w 500 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami bez wapnia i magnezu (DPBS).
  5. Przygotować 10x bufor Trypsyna Fosforanu Versene (TVP 10x) mieszając trypsynę (2,5%) z TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% surowicy kurczaka, 0,01% trypsyny (2,5%) w H2O) (stosunek 1:10, obj. / obj.).
    UWAGA: Przefiltruj wszystkie roztwory przez filtr porowy 0,22 μm. Pożywkę hodowlaną należy przechowywać przez długi czas w temperaturze -20 °C, a pozostałe odczynniki przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni (patrz tabela materiałów).
  6. Pokryć dwie 12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych 0,1% roztworem żelatyny (500 μl na studzienkę) i inkubować je przez 30 minut w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2, wilgotna atmosfera).
  7. Umyć płytki pokryte żelatyną PBS i dodać 500 μl pożywki CM+/-.
  8. Rozmrozić dwie fiolki z 1 x 106 kriokonserwowanymi, napromieniowanymi mysimi fibroblastami zarodkowymi (MEF) w temperaturze 37 °C i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki z 5 ml pożywki CM+/-.
  9. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odessać pożywkę i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 12 ml pożywki CM+/- o stężeniu 1,67 x 105 komórek na ml.
  10. Wysiać 500 μl zawiesiny MEF na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej (2,4 x 10,5 komórek nacm2) i inkubować płytkę przez noc (o/n) w inkubatorzeCO2
    11. .
  11. Rozmrozić jedną fiolkę z kriokonserwowanymi mESC (1 x 106) w pożywce CM+/+ 2i.
  12. Wysiać zawiesinę mESC na wstępnie umytej 12-dołkowej płytce z MEF w 1 ml pożywki CM+/+2i i przenieść płytkę do inkubatoraCO2. Odświeżaj podłoże codziennie.
  13. Przy 70% konfluencji przemyj kolonie mESC DPBS. Dodać 150 μl ciepłego 10x buforu TVP i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, aby zainicjować dysocjację enzymatyczną.
  14. Ostrożnie usunąć bufor TVP, ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki CM+/+ 2i i rozdzielić kolonie na pojedyncze komórki za pomocą delikatnego pipetowania.
  15. Pasażuj komórki, przenosząc je na nową 12-dołkową płytkę do hodowli komórkowej z MEF (stosunek podziału: 1:3-1:5). Delikatnie wymieszać, aby rozprowadzić komórki i inkubować w inkubatorze CO2 .
  16. Odśwież pożywkę hodowlaną (2-3 ml) i codziennie obserwuj wzrost/morfologię komórek. Powtarzaj przejście seryjne przy zbieganiu 70% co 2 dni. Przełącz się na pożywkę CM+/+ na dwa pasaże przed zainicjowaniem różnicowania komórek.

2. Formacja EB w wiszącej kropli

  1. Przygotować świeżą pożywkę do różnicowania mezodermy, uzupełniając pożywkę CM+/- zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF) (50 ng·mL-1) i białkiem morfogenetycznym kości 4 (BMP-4) (5 ng·mL-1) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  2. Pokryj jedno zagłębienie 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej 500 μl 0,1% roztworu żelatyny i umieść je w inkubatorze CO2 na 30 minut.
  3. Umyć płytki pokryte żelatyną PBS i dodać 500 μl pożywki CM+/-.
  4. Aby uzyskać czystą populację mESC, trypsynizuj płytkę kultury komórkowej za pomocą 10x buforu TVP przez 30 s w temperaturze pokojowej, ponownie zawieś komórki w 1 ml pożywki różnicującej mezodermę, a następnie przenieś je na pokrytą żelatyną płytkę 6-dołkową na 30 minut, umożliwiając MEF przyłączenie, podczas gdy mESC pozostają w zawiesinie.
  5. Zebrać zawiesinę komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i policzyć komórki za pomocą hemocytometru Neubauera i niebieskiego barwnika trypanowego w celu wykluczenia żywych/martwych komórek.
  6. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce do różnicowania mezodermy, aż do uzyskania 4,55 x 104 komórek na ml.
  7. Napełnij dno naczyń polistyrenowych o średnicy 94 mm z niskim mocowaniem 15 ml sterylnej wody.
    UWAGA: Cztery szalki zawierające wiszące krople (1,6 x 105 komórek w 3,52 ml pożywki) będą wymagane do przetestowania jednego konkretnego stanu za pomocą testu angiogenezy kiełkowania 3D.
  8. Przenieść zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika z tworzywa sztucznego i załadować w czterech pozycjach pipety wielokanałowej 22 μl zawiesiny komórek na kanał (1 x 10,3 komórki na kroplę 22 μl).
  9. Podnieś i odwróć pokrywę naczynia 94 mm i umieść ją na czystej powierzchni komory przepływowej wewnętrzną stroną skierowaną do góry.
  10. Umieść 40 kropli zawiesiny komórek na wewnętrznej powierzchni każdej pokrywy. Ostrożnie odwróć pokrywkę bez zakłóceń i umieść ją z powrotem na naczyniu, tak aby krople były skierowane w stronę wody.
  11. Inkubować naczynia w inkubatorzeCO2 . Potraktuj to jako dzień różnicowania 0. Utrzymuj płytki przez 4 dni, aby utworzyły EB.

3. Test konkurencji dla pozycji komórki końcówki

  1. Hodowla jednej fluorescencyjnej i jednej niefluorescencyjnej linii mESC, jak opisano wcześniej13. Na przykład stosuje się mESC 7ACS/EYFP oznaczone kolorem żółtym i mESC R1.
  2. Przygotować mozaikę EB, mieszając równe ilości dwóch linii mESC (stosunek 1:1) i inkubować wiszące naczynia kroplowe w inkubatorze CO2 zgodnie z opisem w kroku 2.

4. Pływająca hodowla EBs do różnicowania naczyń krwionośnych

  1. Przed zebraniem EB z wiszących kropli przygotuj następujące elementy.
    1. Przygotować 5% roztwór agaru wH2Oi wysterylizować go w autoklawie (20 min w temperaturze 120 °C).
    2. Użyj ciepłego 5% roztworu agaru do przygotowania pożywki G-MEM BHK-21 zawierającej 1% agaru i szybko wlej 3 ml do jednego z naczyń polistyrenowych o średnicy 60 mm. Pozostawić agar do zastygnięcia przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przechowywać naczynia w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  2. Przygotuj świeżą pożywkę 2x do różnicowania naczyń krwionośnych, uzupełniając pożywkę CM+/- o bFGF (100 ng·mL-1) i VEGF-A (50 ng·mL-1). Przechowywać pożywkę w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  3. Zebrać wiszące krople w stożkowej probówce o pojemności 15 ml za pomocą pipety P1000 i usunąć supernatant po kilku minutach sedymentacji EB.
  4. Ponownie zawiesić EB w 3 ml 2x pożywki do różnicowania naczyń krwionośnych, przenieść zawiesinę EB do jednego naczynia pokrytego agarem i rozprowadzić EB jednorodnie, aby uniknąć agregacji.
  5. Inkubować naczynia w inkubatorze CO2 i odświeżać pożywkę co 2 dni do 9 dnia przy użyciu 1x pożywki do różnicowania naczyń w obecności bFGF (50 ng·mL-1) i VEGF-A (25 ng·mL-1).
  6. Alternatywnie, dodaj płytkowy czynnik wzrostu-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 w 4 dniu i 5 ng·mL-1 w dniu 6 i dniu 8) do pożywki różnicującej naczynia krwionośne, aby promować różnicowanie komórek ściennych.

5. Analiza cytometrii przepływowej

  1. Zbierz 9-dniowe EB do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety P1000 i umyj je raz ciepłym PBS.
  2. Dodać 1 ml pożywki G-MEM BHK-21 zawierającej 0,2 mg·mL-1 kolagenazy A i inkubować komórki w inkubatorze CO2 przez 5 minut.
  3. Oddziel EBs, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety P1000.
  4. Zatrzymaj aktywność kolagenazy, dodając 1 ml zimnego podłoża G-MEM BHK-21 z 10% FBS.
  5. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS z 2% FBS.
  7. Policz komórki za pomocą hemocytometru Neubauera.
  8. Ponownie zawiesić 400 000 komórek w 100 μl PBS z 2% FBS na warunek barwienia.
  9. Inkubować komórki przez 45 minut w temperaturze 4 °C z następującymi przeciwciałami: sprzężonym z APC szczurzym przeciwciałem przeciwko myszom PECAM-1 (klon MEC13.3) i sprzężonym ze szczurem CD45 (klon 30-F11) lub przeciwciałami kontrolnymi izotypu.
  10. Umyj komórki dwukrotnie 1 ml PBS zawierającego 2% FBS.
  11. Ponownie zawiesić komórki, aby osiągnąć końcowe stężenie 5 x 106 komórek na ml.
  12. Przefiltruj komórki za pomocą probówki z polistyrenu o okrągłym dnie, z zatrzaskiem z sitkiem do komórek.
  13. Przeanalizuj 20 000 zdarzeń PECAM-1 (+) za pomocą cytometrii przepływowej.

6. 3D test angiogenezy kiełkowania i barwienie immunofluorescencyjne

  1. W dniu 9 przygotuj pożywkę do kiełkowania, dodając 10% FBS (obj./obj.), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), ludzką rekombinowaną erytropoetynę (hEPO) (20 ng·mL-1), ludzką interleukinę-6 (IL-6) (10 ng·mL-1), 0,05 mM β-merkaptoetanolu, NEAA (1x), L-glutaminę (1x), pirogronian sodu (1x), kolagen z ogona szczura typu I (1,25 mg·mL-1), i NaOH (3,1 mM) do pożywki GMEM BHK-1.
  2. Aby uniknąć żelowania kolagenu, utrzymuj kiełkujące podłoże na lodzie do momentu użycia.
  3. Aby ocenić działanie cząsteczek pro/antyangiogennych, dodaj wybrany lek lub nośnik do pożywki kiełkującej w wybranym stężeniu.
  4. Zebrać 9-dniowe EB z jednej płytki agarowej o średnicy 60 mm w stożkowej probówce o pojemności 15 ml (odpowiednik jednego warunku) i usunąć supernatant po kilku minutach sedymentacji.
  5. Przykryć dno naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm 1 ml pożywki do kiełkowania i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w celu wywołania żelowania.
  6. Ponownie zawiesić EB w 2 ml zimnego podłoża do kiełkowania.
  7. Przenieść zawiesinę do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm pokrytego pierwszą warstwą pożywki do kiełkowania.
  8. Rozłóż EB na całej płycie i upewnij się, że znajdują się w równej odległości od siebie. Inkubować naczynie w inkubatorze CO2 . Pierwsze formowanie się kiełków następuje w ciągu 24-48 godzin.
  9. W 12 dniu żel kolagenowy zawierający EB jest ostrożnie przenoszony na szkiełko podstawowe (75 x 26 mm) za pomocą szpatułki.
  10. Usuń nadmiar płynu za pomocą pipety (P1000) i odwodnij żel, umieszczając na żelu arkusz gazy z nylonowego lnu i chłonne karty filtracyjne (bibuła żelowa). Wywieraj nacisk, umieszczając ciężarek (250 g) na 2 minuty. Ostrożnie usuń nylon/bibułę filtracyjną i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Umyj szkiełka trzykrotnie za pomocą PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Utrwalić EB za pomocą roztworu (patrz Tabela Materiałów) o/n w temperaturze 4 °C. Alternatywnie, utrwalić mozaikowe fluorescencyjne EB za pomocą paraformaldehydu (PFA) (4%) o/n w temperaturze 4 °C w ciemności.
  13. Usuń utrwalacz. Umyj szkiełka pięć razy za pomocą PBS przez 5 minut w temperaturze RT.
  14. Przepuszczalność EB w PBS zawierającym 0,1% Triton-X100 przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  15. Usuń roztwór przepuszczalny. Umyć szkiełka pięciokrotnie PBS przez 5 minut.
  16. Inkubować EB w buforze blokującym (PBS z 2% albuminą surowicy bydlęcej, BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  17. Do barwienia kiełków śródbłonka należy użyć szczurzego przeciwciała pierwszorzędowego anty-mysiego anty-PECAM-1 (rozcieńczenie 1:100) w buforze blokującym o/n w temperaturze 4 °C.
  18. Umyć szkiełka pięciokrotnie PBS przez 5 minut.
  19. Inkubować szkiełka z kozim przeciwciałem drugorzędowym anty-szczurzym Alexa 555 w buforze blokującym (rozcieńczenie 1:250) i, w razie potrzeby, z przeciwciałem anty-α-SMA sprzężonym z FITC w buforze blokującym (rozcieńczenie 1:250) w celu barwienia komórek ściennych przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
  20. Umyj szkiełka trzy razy PBS przez 5 minut i jeden raz za pomocą H20 przed ich zamontowaniem.

7. Obrazowanie konfokalne, analiza morfometryczna i ilościowa pędów śródbłonka EB

  1. Uzyskaj obrazy o wysokiej rozdzielczości wybarwionych immunologicznie EB poprzez łączenie płaszczyzny ogniskowej (z-stacking) przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Użyj obiektywu z 10-krotnym powiększeniem, aby zobrazować całe EB.
  2. Przeanalizuj obrazy uzyskane za pomocą ImageJ, aby ocenić morfologię i określić ilościowo cechy dodatnich kiełków śródbłonka PECAM-1 zgodnie z ustalonymi metodami kwantyfikacji13,14,21.
    1. Oblicz średnią liczbę kiełków śródbłonka na EB, ręcznie licząc całkowitą liczbę kiełków na poszczególne EB.
    2. Zmierz długość poszczególnych kiełków za pomocą narzędzia do rysowania ImageJ. Zdefiniuj podstawę kiełka śródbłonka, zaczynając od obszaru rdzenia EB i ręcznie narysuj linię, aż koniec końcówki kiełka.
    3. Oblicz średnią liczbę komórek końcówki na kiełek, ręcznie licząc liczbę komórek końcówki na pojedynczy kiełek, a następnie oblicz średnią na EB.
    4. Oblicz orientację filopodiów, ręcznie określając oś kiełka macierzystego i zmierz kąt ostry między nimi za pomocą narzędzia kątowego oprogramowania ImageJ. Oblicz liczbę kiełków o orientacji >50° i podziel ją przez całkowitą liczbę kiełków interesującego nas EB.
      UWAGA: Kąty zawsze mieściły się w zakresie od 0° do 90°.
  3. Uzyskaj obrazy o wysokiej rozdzielczości wybarwionych immunologicznie EB za pomocą mikroskopu konfokalnego. Użyj obiektywu o 40-krotnym powiększeniu, aby uzyskać obrazy w wysokiej rozdzielczości pojedynczych pędów śródbłonka.
  4. Określ ilościowo pokrycie naczyń kiełkami EC z dodatnim wynikiem PECAM-1 otoczonymi dodatnimi MC α-SMA za pomocą oprogramowania ImageJ.
    1. Podziel scalone obrazy na osobne kanały czerwony i zielony.
    2. Przekształć obrazy do ich formy binarnej.
    3. Zmierz całkowitą powierzchnię komórkową kiełka zajmowaną oddzielnie przez PECAM-1 (komórki śródbłonka oznaczone na czerwono) i przez α-SMA (komórki ścienne oznaczone na zielono) komórki.
    4. Wygeneruj scalony obraz za pomocą funkcji kalkulatora obrazów i operatora AND. Zmierz całkowity obszar komórkowy obrazu. Aby obliczyć pokrycie, należy podzielić obszar kolokalizowanego obrazu przez obszar obrazu binarnego PECAM-1.
  5. Aby przeanalizować konkurencję komórek o położenie końcówki śródbłonka / łodygi kiełków rozwiniętych przez mozaikę EB, ręcznie należy ocenić liczbę komórek wierzchołkowych i oznaczyć ich pochodzenie genotypowe na podstawie sygnału fluorescencyjnego. Oblicz średnie wartości na EB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd protokołu testu kiełkowania naczyń krwionośnych jest pokazany w Rysunek 1. Dziewięciodniowe EB pochodzące z trzech niezależnych linii mESC 129/Ola (Z / Red, R1 i E14) zostały enzymatycznie zdysocjowane na pojedyncze komórki za pomocą kolagenazy A. Komórki wybarwiono pod kątem PECAM-1 i przeanalizowano za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) zgodnie z opisem. Wszystkie linie komórkowe wykazywały silne różnicowanie śródbłonka i nie zaobserwowano różnic w ich zdo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje bezstronny, solidny i powtarzalny test kiełkowania naczyń krwionośnych oparty na EB 3D, który można poddać badaniom przesiewowym pod kątem leków i genów modulujących angiogenezę. Metoda ta ma przewagę nad wieloma szeroko stosowanymi testami dwuwymiarowymi (2D) wykorzystującymi hodowle komórek śródbłonka, takimi jak ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) do monitorowania migracji (test bocznego zadrapania lub test z komorą Boydena)22,23...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND, oraz przez Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolMilipore, Merck805740Zagrożenie biologiczne: podczas obchodzenia się
Agar NobleDifco, BD Pharmigen214220
Alexa Fluo 555 kozie przeciwciało przeciw szczurom IgGLife technologiesA21434
APC sprzężone szczurze przeciwciało anty-mysie PECAM-1 (klon MEC13.3)BD Biosciences551262
APC Szczur IgG2a κ Kontrola izotypu (Klon  R35-95)BD Biosciences553932
Mikroskop do hodowli tkankowych z kontrastem w odwróconej fazie Axiovert 25
Peprotech450-33
, Allegra X-15RBeckman Coulter392932
BioVanguard (zielona linia)Telstar133H401001
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA9418
Komora do zliczania komórek, Buerker, 0,100 mmMarienfeld640211
Szalki do hodowli komórkowych 60 x 15 mmCorning353802
Szalki do hodowli komórkowych, 35 x 10 mmCorning353801
Płytki do hodowli komórkowych 12-dołkoweCorning3512
CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBiorad1855196
Surowica kurczakaSigma-AldrichC5405
CHIR-99021 (CT99021) HClSelleckchemS2924
Kolagen I, wysokie stężenie, ogon szczura, 100 mgCorning354249
Kolagenaza ARoche10103586001
Konfokalne skanowanie laserowe Mikroskop, TCS SP5Leica
Okulary nakrywkowe, 24 &razy; 50 mmVwr631-0146
DAPT γ? inhibitor sekretazySigma AldrichD5942
DC101 anty mysi VEGFR-2 CloneBioXcellBP0060
DC101 izotyp szczura IgG1BioXcellBP0290
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2438-5XZagrożenie biologiczne: podczas obchodzenia się
DPBS (10x) należy przestrzegać odpowiednich instrukcji bezpieczeństwa, bez wapnia, bez magnezuGibco, Thermofisher scientific14200067
EDTA 40 mMGibco, Thermofisher scientific15575-038
Embrionalne komórki macierzyste Płodowa surowica bydlęcaGibco, Thermofisher scientific16141-079Powinny być testowane pod kątem maksymalnej żywotności i wzrostu komórek ES. Inaktywacja ciepła przy 60& C i przechowywać w − 20 &stopni; C przez okres do 1 roku
Mikrowirówka Eppendorf 5415REppendorf AG 
Erytropoetyna, ludzka (hEPO), 250 j. (2,5 &mikro; g) (1 mL)Roche11120166001
ESGRO Rekombinowane mysie białko LIF (10? jednostek    1 mL)Milipore, MerckESG1107
Falcon probówki 15 mlGreiner Bio-One188271
Falcon probówki 50 mlGreiner Bio-0ne227270
Końcówka filtra, przezroczysta, sterylna F.Gilson, P-200Greiner Bio-One739288
Końcówka filtra, przezroczysta, sterylna F.Gilson, P10Greiner Bio-One771288
Końcówka filtra, przezroczysta, sterylny F.Gilson, P1000Greiner Bio-One740288
FITC sprzężony anty-&alfa; Aktyna mięśni gładkich (SMA) (klon 1A4)Sigma AldrichF3777
FITC sprzężony szczur anty-mysz CD45 (klon 30-F11)Biolegend103107
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Przeciwciało (klon RTK4530)Biolegend400605
Fluorescencyjne media montażoweDAKOS3023
Kompres gazowyCutisoft45846
Gaza Cutisoft 10 x 10 cmBsn Medical45844_00
Bibuła żelowa, klasa GB003WhatmanWHA10547922
Roztwór żelatyny, typ BSigma-AldrichG1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM)Gibco, Thermofisher naukowy21710082
IHC UtrwalaczPharmigen550523
IncuSafe Inkubator CO2PHCBiMCO-170AICUV-PE
Interleukina-6, ludzka (hIL-6)Roche11138600001
L-Glutamina 200 mMGibco, Thermofisher scientific25030-024
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)Gibco, Thermofisher scientific11140035
Pudełko na szkiełka mikroskopoweKartell Labware278
, szkło StarfrostKnittelVS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG Test Primer QuantiTectQiagenQT00110467
Mm_Eng_1_SG Test Primer QuantiTectQiagenQT00148981
Mm_Epha4_1_SG Test Primer QuantiTectQiagenQT00093576
Mm_Ephb2_1_SG Test Primer QuantiTectQiagenQT00154014
Mm_Flt1_1_SG Test Primer QuantiTectQiagenQT00096292 Mm_Flt4_1_SG
Primer QuantiTectQiagen
Mm_Gapdh_3_SG Test gruntujący QuantiTectQiagenQT01658692
Mm_Kdr_1_SG Test gruntu QuantiTectQiagenQT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG Test gruntujący QuantiTectQiagenQT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT01052044
Mm_Tek_1_SG Test startera QuantiTectQiagenQT00114576
Inaktywowane fibroblasty embrionalne myszy (ICR)  (2 mln)Gibco, Thermofisher scientificA24903Przechowywać fiolki w ciekłym azocie (195,79 ° C) w nieskończoność
Linia embrionalnych komórek macierzystych myszy 7AC5 / EYFP (ATCC SCRC-1033)ATCCSCRC-1033Wygenerowana przez dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Kanada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanizmy rozwoju. 76 (1– 2), 79– 90 (1998)].
Linie embrionalnych komórek macierzystych myszy Acvrl1 +/- i Acvrl1 +/+Wygenerowane w Centrum Medycznym Uniwersytetu w Lejdzie [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698– 2712 (2018)].
Linia embrionalnych komórek macierzystych myszy E14Dostarczona przez laboratorium M Letarte i wygenerowana zgodnie z Cho, SK i wsp. Krew. 98 (13), 3635– 3642 (2001).
Linia embrionalnych komórek macierzystych myszy R1 (ATCC SCRC-1011)ATCCSCRC-1011Wygenerowana przez dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Kanada. [Nagy, A., et al. Procedury Narodowej Akademii Nauk Stanów Zjednoczonych Ameryki. 90 (18), 8424– 8428 (1993)].
Embrionalne komórki macierzyste myszy linii Z/Red (szczep 129/Ola)Wygenerowane przez Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Kanada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241– 246 (2004)].
Spektrofotometr UV/VIS NanoDrop 1000Thermo Fischer ScientificND-1000
PD0325901SelleckchemS1036
PDGF-BB, Rekombinowane ludzkiePeprotech100-14B
Pecam-1, Szczurzy anty-myszBD Biosciences550274
Penicylina-streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco, Thermofisher scientific
szalka Petriego, PS, 94/16 mm, standardowa, z otworami wentylacyjnymi, sterylnaGreiner Bio-One633181
Pipetboy acu 2Integra-Biosciences155 019
Pipetman G Multichannel P8 x 200GGilsonF144072
Pipetman G Zestaw startowy, zestaw 4 pipet, P2G, P20G, P200G, P1000GGilsonF167360
Rekombinowany ludzki BMP-4 BiałkoR& D Systems314-BP
RNeasy Plus mini KitQIAGEN74134
Pipety serologiczne, 10 mlGreiner Bio-One607 180
Pipety serologiczne, 25 mlGreiner Bio-One760 180
Pipety serologiczne, 5 mlGreiner Bio-One606 180
Wodorotlenek sodu (NaOH)Merck106498
Pirogronian sodu 100 mMGibco, Thermofisher scientific11360039
Probówki 5ml okrągłodenne z nakrętką z sitkiemCorning352235
Termocykler, T100Biorad1861096
Triton X-100 (BioXtra)Sigma AldrichT9284
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Gibco, Thermofisher scientific
Trypsyna (2,5%)Gibco, Thermofisher scientific15090046
System filtrów próżniowych/butelek do przechowywania, 500 mlCorning430758
VEGFA165 , rekombinowana mysiaPeprotech450-32
, sterylnaFresenius-KabiB230531
, Lab-Line DigitalThermo Fischer Scientific18052A
z Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów-2 (bFGF) Wirówka stołowa Komora bezpieczeństwa biologicznego z Z605212 BD Test QT00099064 przeciwciało 1514012215250061 woda kąpiel wodna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
  2. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  3. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).
  4. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  5. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
  6. Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
  7. Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
  8. Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
  9. Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215(2016).
  10. Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
  11. Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
  12. Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).
  13. Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
  14. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
  15. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  16. Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
  17. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
  18. Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
  19. Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
  20. van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678(2019).
  21. Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
  22. Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
  23. Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
  24. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  25. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
  26. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
  27. Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
  28. Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
  29. Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
  30. Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
  31. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  32. Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, Clifton, N.J. 325-344 (2017).
  33. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
  34. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  35. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).
  36. Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
  37. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671(2018).
  38. Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147(2020).
  39. Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002(2019).
  40. Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioengineering. 7 (1), Basel, Switzerland. 17(2020).
  41. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sprouting AngiogenesisThree Dimensional AssayEmbryoid BodiesCollagen Gel CultureEndothelial Tip CellsDrug Testing AssayGenetic ScreeningMural Cell Recruitment

Powiązane artykuły