Chirurgia i przetwarzanie próbek do obrazowania korelacyjnego mysiej zastawki płucnej

Summary

Tutaj opisujemy korelacyjny przebieg pracy dla wycinania, zwiększania ciśnienia, utrwalania i obrazowania mysiej zastawki płucnej, aby określić konformację ogólną i lokalne struktury macierzy zewnątrzkomórkowej.

Abstract

Podstawowe przyczyny choroby zastawek serca (HVD) są nieuchwytne. Mysie modele zwierzęce stanowią doskonałe narzędzie do badania HVD, jednak wiedza chirurgiczna i instrumentalna wymagana do dokładnego ilościowego określenia struktury i organizacji w wielu skalach długości zahamowała jego postęp. Praca ta zawiera szczegółowy opis sekcji myszy, barwienia en bloc, przetwarzania próbek i procedur obrazowania korelacyjnego w celu zobrazowania zastawki serca w różnych skalach długości. Hydrostatyczne ciśnienie przezzastawkowe zastosowano do kontrolowania niejednorodności czasowej poprzez chemiczne utrwalenie konformacji zastawki serca. Mikrotomografia komputerowa (μCT) została wykorzystana do potwierdzenia geometrii zastawki serca i zapewnienia odniesienia dla dalszego przetwarzania próbki potrzebnej do mikroskopii elektronowej ze skaningiem szeregowym (SBF-SEM). Wykonano i zrekonstruowano seryjne obrazy SEM macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) o wysokiej rozdzielczości, aby zapewnić lokalną reprezentację 3D jej organizacji. Metody obrazowania μCT i SBF-SEM zostały następnie skorelowane, aby przezwyciężyć zmienność przestrzenną w zastawce płucnej. Chociaż zaprezentowana praca dotyczy wyłącznie zastawki płucnej, metodologia ta może zostać przyjęta do opisu hierarchicznej organizacji w systemach biologicznych i ma kluczowe znaczenie dla charakterystyki strukturalnej w wielu skalach długości.

Introduction

Zastawka płucna (PV) służy do zapewnienia jednokierunkowego przepływu krwi między prawą komorą a tętnicą płucną. Malformacje zastawek płucnych są związane z kilkoma postaciami wrodzonych wad serca. Obecne leczenie wrodzonej wady zastawki serca (HVD) polega na naprawie zastawek lub wymianie zastawki, co może wymagać wielu inwazyjnych operacji w ciągu całego życia pacjenta¹. Powszechnie przyjmuje się, że funkcja zastawki serca wywodzi się z jej struktury, często określanej jako korelacja struktura-funkcja. Mówiąc dokładniej, właściwości geometryczne i biomechaniczne serca dyktują jego funkcję. Z kolei właściwości mechaniczne zależą od składu i organizacji ECM. Opracowując metodę określania właściwości biomechanicznych mysich zastawek serca, transgeniczne modele zwierzęce mogą być wykorzystane do zbadania roli ECM w funkcji i dysfunkcji zastawki serca^2,3,4,5.

Mysi model zwierzęcy od dawna uważany jest za standard w badaniach molekularnych, ponieważ modele transgeniczne są łatwiej dostępne u myszy w porównaniu z innymi gatunkami. Mysie modele transgeniczne stanowią wszechstronną platformę do badań nad chorobami związanymi z zastawkami serca⁶. Jednak wiedza chirurgiczna i wymagania dotyczące oprzyrządowania w celu scharakteryzowania zarówno geometrii, jak i organizacji ECM były główną przeszkodą w postępie badań nad HVD. Dane histologiczne w literaturze dostarczają obrazu zawartości macierzy zewnątrzkomórkowej mysiej zastawki serca, ale tylko w postaci obrazów 2D i nie są w stanie opisać jej architektury 3D^7,8. Ponadto zastawka serca jest niejednorodna zarówno przestrzennie, jak i czasowo, co utrudnia wyciąganie wniosków z eksperymentów dotyczących organizacji ECM, jeśli pobieranie próbek i konformacja nie są ustalone. Konwencjonalne metody charakteryzacji 3D, takie jak rezonans magnetyczny lub echokardiografia 3D, nie zapewniają rozdzielczości niezbędnej do rozpoznania komponentów ECM^9,10.

Ta praca szczegółowo opisuje w pełni korelacyjny przepływ pracy, w którym rozwiązano czasową niejednorodność spowodowaną cyklem pracy serca poprzez ustalenie konformacji mysiego PV za pomocą hydrostatycznego ciśnienia przezzastawkowego. Niejednorodność przestrzenna była precyzyjnie kontrolowana poprzez pobieranie próbek z obszarów zainteresowania i rejestrowanie zestawów danych z różnych modalności obrazowania, w szczególności μCT i mikroskopii elektronowej ze skaningiem bloku szeregowego, w różnych skalach długości. Ta metoda rozpoznania za pomocą μCT w celu kierowania dalszym pobieraniem próbek została zaproponowana wcześniej, ale ponieważ zastawka płucna wykazuje zmienność czasową, potrzebny był dodatkowy poziom kontroli na poziomie chirurgicznym¹¹.

Badania in vivo opisujące biomechanikę mysich zastawek serca są rzadkie i zamiast tego opierają się na modelach obliczeniowych podczas opisywania zachowania deformacji. Niezwykle ważne jest, aby lokalne dane zewnątrzkomórkowe w skali długości nanometrowej były powiązane z geometrią i lokalizacją zastawki serca. To z kolei zapewnia policzalne, przestrzennie odwzorowane rozkłady białek ECM współdziałających mechanicznie, które można wykorzystać do wzmocnienia istniejących modeli biomechanicznych zastawek serca^12,13,14.

Protocol

Wykorzystanie zwierząt w tym badaniu było zgodne z Ogólnokrajowym Szpitalem Dziecięcym instytucjonalnym komitetem ds. opieki i wykorzystania zwierząt zgodnie z protokołem AR13-00030.

1. Wycięcie zastawki płucnej

1. Autoklaw niezbędnych narzędzi potrzebnych do sekcji myszy. Obejmuje to cienkie nożyczki, mikrokleszki, zaciski do mikronaczyń krwionośnych, kleszcze do nakładania zacisków, uchwyty do mikroigieł, nożyczki sprężynowe i zwijacze.
2. Aklimatyzować wszystkie myszy przez minimum 2 tygodnie przed operacją. Wyjmij myszy C57BL/6 w wieku około 1 roku z klatek i zważ, a następnie poddaj eutanazji za pomocą koktajlu ketamina/ksylazyna (3:1 ketamina:ksylazyna, 0,01 ml na g) w przypadku przedawkowania.
3. Umieść mysz w pozycji leżącej grzbietowej na tacy i zabezpiecz jej kończyny taśmą. Po zabezpieczeniu wykonaj torakotomię.
   1. Odsłoń serce, usuwając nadmiar tkanki tłuszczowej i powięzi.
   2. Usunąć prawy przedsionek i przelać przez lewą komorę roztworem soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej (0,9% NaCl). Perfuzja powinna trwać około 20 ml w ciągu 30 s. Powoduje to wykrwawienie myszy.
4. Usuń całe serce, przecinając żyłę główną górną, żyłę główną dolną, tętnicę płucną i aortę. Szczególną ostrożność należy zachować w przypadku tętnicy płucnej. Wyciąć około 2 mm powyżej połączenia komorowo-tętniczego, ponieważ będzie ono służyć jako przewód do zwiększania ciśnienia.
5. Usuń lewą i prawą komorę, aby wystawić komory na ciśnienie atmosferyczne. Upewnij się, że struktura pnia płucnego nie powinna zostać naruszona przez usunięcie komór.

2. Stabilizacja ciśnienia w zastawce płucnej

1. Rurka do pomiaru ciśnienia w zespoleniu z tętnicą płucną, pozostawiając około 1 mm odległości między połączeniem sinusoidalno-rurkowym a końcem rurki, aby dostosować się do dużych ruchów płatków i pnia płucnego.
2. Podnieś zbiornik do analogicznego ciśnienia fizjologicznego i napełnij go roztworem soli fizjologicznej. Przetestuj system przepływowy, aby upewnić się, że nie ma zatorów ani pęcherzyków powietrza.
3. Podłączyć kran do zespolenia zastawki płucnej i zapewnić odpowiedni przepływ przez rurkę (tj. brak pęcherzyków powietrza) poprzez przełączenie przewodu odpływowego. Gdy przepływ jest odpowiedni, przełączyć odpływ do zespolenia zastawki płucnej i zapewnić ciśnienie w pniu płucnym. Identyfikuje się to po wzdęciu tułowia płucnego.
4. Po potwierdzeniu wzrostu ciśnienia w pniu płucnym należy stopniowo wprowadzać pierwotny roztwór utrwalający (1,25% aldehydu glutarowego, 1,0% paraformaldehydu w 0,15 M kakodylatu), aż roztwór soli zostanie usunięty. Odbywa się to poprzez usunięcie części, około 25% pojemności zbiornika, roztworu soli fizjologicznej i zastąpienie go głównym utrwalaczem.
   UWAGA: Stosowane utrwalacze (paraformaldehyd i aldehyd glutarowy) są wysoce toksyczne i w celu zapewnienia bezpieczeństwa należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).
5. Umieść gazę nasączoną utrwalaczem na próbce tkanki, aby zapobiec wysuszeniu.
6. Utrwalacz perfować przez 3 godziny, uzupełniając zbiornik w razie potrzeby, aby utrzymać stałe ciśnienie. Podczas stabilizacji nierzadko zdarza się, że zastawka płucna kurczy się z powodu utrwalenia chemicznego. W takim przypadku należy stale uzupełniać zbiornik pierwotnym utrwalaczem, aby utrzymać ciśnienie fizjologiczne.
7. Przechowywać zastawkę serca w roztworze utrwalającym w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Próbki przechowywano przez okres do 1 tygodnia bez zauważalnej różnicy.

3. Barwienie i osadzanie próbek en bloc ^15,16

UWAGA: Odczynniki barwiące używane w tej sekcji (żelazocyjanek potasu, tetratlenek osmu, tiokarbohydrazyd, asparaginian ołowiu i octan uranylu) są wysoce toksyczne i powinny być traktowane z najwyższą ostrożnością. Zaleca się stosowanie dygestorium i odpowiednich środków ochrony osobistej.

1. Barwienia
   1. Próbkę nieruchomej zastawki serca przemywać przez 5 minut zimnym 0,15 M buforem kakodylowym. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
   2. Całkowicie zanurz zastawkę serca w roztworze 1,5% żelazocyjanku potasu, 0,15 M kakodylanu, 2 mM chlorku wapnia i 2% tetratlenku osmu na lodzie na 1 godzinę.
   3. Podczas inkubacji próbki przygotować roztwór tiokarbohydrazydu (TCH), rozpuszczając 0,1 g TCH w 10 ml_ddH2O. Umieścić roztwór w suszarce o temperaturze 60 °C na 1 godzinę. Delikatnie mieszać od czasu do czasu, aby upewnić się, że TCH całkowicie się rozpuścił. Bezpośrednio przed użyciem przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
   4. Przemyć próbki w temperaturze pokojowej ddH₂O, umieszczając je w probówce z ddH₂O na 5 minut i lekko wymieszać, potrząsając pojemnikiem. Powtórz ten proces trzy razy.
   5. Umieść go w przefiltrowanym roztworze TCH na 20 minut w temperaturze pokojowej. Wykonać etap prania trzy razy (po 5 minut każdy) w temperaturze pokojowej ddH₂O, jak opisano w kroku 3.1.4.
   6. Po zakończeniu umieść próbkę w 2% tetratlenku osmu na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj go ponownie, w sumie trzy razy przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej ddH₂O.
   7. Inkubować próbkę w 1% octanie uranylu przez noc w temperaturze 4 °C.
   8. W tym czasie przygotuj roztwór 0,066 g azotanu ołowiu w 10 ml roztworu podstawowego kwasu asparaginowego. Doprowadzić pH do 5,5 za pomocą 1 N KOH. Umieścić roztwór w piekarniku o temperaturze 60 °C, aby rozpuścić azotan ołowiu.
   9. Po inkubacji przez noc przeprowadzić etap płukania zgodnie z opisem w kroku 3.1.4. Powtórz trzy razy. Następnie inkubować tkankę zastawki serca w roztworze asparaginianu ołowiu z kroku 3.1.8 w piecu o temperaturze 60 °C przez 30 minut.
2. odwodnienie
   1. Myj chusteczki przez 5 minut w temperaturze pokojowej z ddH₂O. Powtórz trzy razy.
   2. Przygotować świeże roztwory 20%, 50%, 70%, 90% i 100% etanolu w ddH₂O. Przechowywać na lodzie do czasu użycia.
   3. Aby odwodnić tkankę zastawki serca. Wykonuj kolejne zabiegi etanolu 20%, 50%, 70% i 90% na lodzie przez 5 minut każdy. Następnie wykonaj dwa kolejne zabiegi 100% etanolu na lodzie przez 5 min.
   4. Przenieś chusteczkę do lodowatego acetonu na 10 minut. Następnie umieść w świeżym acetonie w temperaturze pokojowej na 10 minut.
3. Osadzanie
   1. Przygotować mieszaninę żywicy (patrz tabela materiałów) zgodnie ze specyfikacją producenta: 11,4 g składnika A, 10 g składnika B, 0,3 g składnika C i 0,05-0,1 g składnika D. Początkowo wymieszać składniki A i B, podgrzewając każdy ze składników do temperatury 60 °C przed dodaniem składników C i D. Mieszanina zmieni kolor na bursztynowy po dodaniu składników C i D. Będzie jednolity po odpowiednim wymieszaniu.
   2. Sporządzać mieszaniny o proporcjach objętościowych 25:75, 50:50 i 75:25 żywica:aceton. Dokładnie wymieszaj.
   3. Tkanki należy umieszczać w kolejnych zabiegach mieszaniny żywicy i acetonu 25:75, 50:50 i 75:25 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   4. Umieść chusteczki w 100% żywicy na noc w temperaturze pokojowej.
   5. Następnego dnia umieść chusteczki w świeżej 100% żywicy na 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   6. Przenieś tkanki zastawki serca do kapsułki do zatapiania, zastąp ją świeżą 100% żywicą i umieść w piekarniku o temperaturze 60 °C na 48 godzin do utwardzenia.
4. Wykonaj obrazowanie korelacyjne, jak pokazano poniżej.

4. Obrazowanie metodą mikrotomografii komputerowej

1. Zamontuj blok próbki żywicy na uchwycie próbki μCT za pomocą kleju (dobrze sprawdza się klej lub taśma dwustronna).
2. Umieść uchwyt w komorze μCT i zamocuj go na stoliku, przykręcając tuleję zaciskową tak, aby nie było ruchu uchwytu. Ruch próbki podczas skanowania obniży jakość obrazu.
3. Otwórz interfejs użytkownika μCT, klikając dwukrotnie ikonę. Dodaj projekt, wybierając znak + obok opcji Projekty i wypełnij niezbędne pola.
4. Po utworzeniu znajdź utworzony projekt i wybierz go, klikając go. Spowoduje to otwarcie drugiej kolumny Przejęcia. Wybierz + obok opcji Przejęcia i wypełnij niezbędne pola.
5. Zamknij drzwiczki komory i uzbrój system, naciskając przycisk uzbrajania na panelu przednim lub μCT. Rozgrzej promieniowanie rentgenowskie z interfejsu użytkownika, wybierając przycisk wskazujący Rozgrzewka.
   UWAGA: System automatycznie wyłączy promieniowanie rentgenowskie po udanej procedurze rozgrzewania. Włącz promienie rentgenowskie, wybierając przycisk.
6. Dostosuj obrót stolika w taki sposób, aby środek obrotu próbki nie odchylał się od środka monitora (tj. próbka znajdowała się w polu view dla całego skanowania). W przypadku systemu użytego w tym eksperymencie wiąże się to z dostosowaniem etapu obszaru zainteresowania (ROI) na karcie rozwijanej, jak opisano poniżej.
   1. Ustaw regulację stopnia zwrotu z inwestycji, ustawiając kąt obrotu na 0° i zaznaczając krawędź próbki. Próbka jest następnie obracana do 180° i ponownie oznaczana jest krawędź próbki.
   2. Dostosuj położenie osi x etapu ROI w taki sposób, aby krawędź próbki znajdowała się między tymi dwoma skrajnościami. Powtórz ten proces dla kątów obrotu 90° i 270° dla pozycji y.
   3. W przypadku, gdy obrót próbki powoduje, że krawędzie wychodzą poza pole widzenia, należy zmniejszyć powiększenie potrzebne μCT, aż krawędzie próbki będą widoczne pod powyższymi ustawionymi kątami i będzie można dokonać zgrubnej regulacji stopnia zwrotu z inwestycji.
   4. Po wyregulowaniu przy dolnym powiększeniu przesuń próbkę lub detektor, aby zwiększyć powiększenie, a pozycje ROI można precyzyjnie regulować.
      UWAGA: Może być konieczne powtórzenie tego procesu, aby zapewnić wyrównanie. Prawidłowe wyrównanie powoduje, że próbka wykazuje niewielki lub żaden ruch poziomy we wszystkich kątach obrotu próbki.
7. Dostosuj μCT do żądanych parametrów skanowania za pomocą oprogramowania producenta. Parametry te obejmują potencjał lampy, prąd lampy, odległość detektora, odległość próbki, czas ekspozycji, trajektorię i liczbę projekcji (patrz tabela S1 dla parametrów akwizycji μCT użytych w tym badaniu).
   UWAGA: Parametry kalibracji, takie jak skanowanie w czystym i ciemnym polu, powinny być zgodne ze specyfikacjami producenta, chyba że zaznaczono inaczej. Na przykład, jeśli próbka jest zbyt duża i system nie może przesunąć próbki poza pole view, próbka musi zostać usunięta, aby wykonać wyraźne skany kalibracji w terenie.
8. Po ustawieniu parametrów przybliżony czas trwania skanowania można zobaczyć, naciskając przycisk Oszacowanie czasu. Wybierz przycisk Start, aby rozpocząć skanowanie.
9. Po zakończeniu skanowania upewnij się, że promienie rentgenowskie są wyłączone, odkręć tuleję zaciskową i ostrożnie wyjmij próbkę z komory μCT.

5. Przetwarzanie próbek i korelacja obrazów

1. Zrekonstruować projekcje μCT przy użyciu algorytmu projekcji wstecznej z filtrem za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta (patrz tabela materiałów).
   1. Wybierz kartę Zwiad u góry ekranu. Wybierz kartę Projekt i nabycie.
   2. Wybierz szablon zwiadowczy powiązany z filtrowaną projekcją wsteczną. Naciśnij przycisk Rozpocznij zwiad.
2. Zidentyfikuj i podziel zastawkę płucną na segmenty za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu. Wymaga to wcześniejszej znajomości anatomii zastawki płucnej¹⁷. Przy podwyższonym ciśnieniu tętniczym płatki zatykają się i blokują światło zastawki płucnej.
3. Zidentyfikuj orientację krojenia w odniesieniu do kierunku skanowania i próbki. Zmień orientację próbki tak, aby kierunek krojenia był wyrównany z żądaną osią.
4. Zidentyfikuj obszary zainteresowania dla obrazowania w wysokiej rozdzielczości. W tym eksperymencie wybrano brzuch (środek) ulotki i połączenie tętniczo-zastawkowe.
5. Usuń nadmiar żywicy i próbkę za pomocą żyletki lub szlifowania w przypadku dużych kawałków materiału lub mikrotomu w przypadku drobniejszych kawałków.
6. Po dotarciu do interesującego Cię miejsca porównaj fizyczną próbkę z wirtualnymi wycinkami μCT, aby potwierdzić lokalizację. Dokonano tego poprzez porównanie cech anatomicznych w przekroju poprzecznym.

6. Mikroskopia elektronowa ze skanowaniem twarzy bloku szeregowego¹⁸

1. Zmniejsz przekrój próbki, aby pomieścić SBF-SEM, około 2,0 x 1,5 x 1,8 mm.
2. Zamontuj przyciętą próbkę na aluminiowym króćcu SBF-SEM za pomocą żywicy epoksydowej.
3. Pokryj blok próbki złotem o długości fali 35 nm. Zakręć próbkę na platformie, aby nałożyć równą warstwę powłoki.
4. Odwietrz komorę SBF-SEM i dostosuj wysokość ostrza noża do wysokości eucentrycznej mikroskopu.
5. Włóż próbkę i wypoziomuj króciec próbki.
6. Obraz w warunkach niskiej próżni w celu zapobieżenia ładowaniu i z detektorem rozproszenia wstecznego (patrz tabela S2 dla parametrów akwizycji SBF-SEM).
7. Obrazuj i łącz wiele obszarów zainteresowania przy różnych powiększeniach za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania (patrz tabela materiałów).

Results

Zespolenie tętnicy płucnej z rurką ciśnieniową jest pokazane w Rysunek 1A. Po zastosowaniu ciśnienia hydrostatycznego pień płucny rozszerza się promieniowo (Rysunek 1B), co wskazuje, że płatki zastawki płucnej są w konfiguracji zamkniętej. Konformację zastawki płucnej potwierdzono za pomocą μCT. W tym przypadku ulotki były zamknięte, a pierścień był okrągły (Rysunek 2A). Rysunek 2B,C pokazuje różne stopnie niewystar...

Discussion

Usunięcie komór służy dwóm celom. Po pierwsze, wystawienie strony komorowej na ciśnienie atmosferyczne, dzięki czemu wystarczy zastosować ciśnienie przezzastawkowe od strony tętniczej zastawki płucnej, aby się zamknąć, a po drugie, zapewnienie stabilnej podstawy, aby zapobiec skręceniu pnia płucnego. Podczas zwiększania ciśnienia pień płucny rozszerza się promieniowo i dolnie, co sprawia, że jest podatny na skręcanie, powodując zapadanie się pnia płucnego. Wstępne obciążenie zastawki płucnej roztworem soli fizjologicznej...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% aldehyd glutarowy (aq)	EMS	16210	Podstawowy składnik utrwalający
0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Strzykawka 1 ml	BD	309659
Strzykawka 10 ml	BD	309604
200 proof etanolu	EMS	15055
Igła 22G	BD	305156
3 mL strzykawka	BD	309657
3-kierunkowy kran	Smiths Medical ASD, Inc.
4% tetratlenek osmu	EMS	19150	Składnik barwiący
4% paraformaldehyd (aq)	EMS	157-4-100	Podstawowy składnik utrwalający
Wchłanialny hemostat	Ethicon	1961
Aceton	EMS	10012
poliamidowy szew monofilamentowy, 10-0	AROSurgical instruments Corporation
szew monofilamentowy poliamidowy, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 myszy	Jackson Laboratories	664	Około 1 rok
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Kleszcz kleszczowy	FST	00072-14
Aplikatory z końcówką bawełnianą	Fisher Naukowy	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Kleszcz Dumont #5	FST	11251-20
Kleszcze Dumont #5/45	FST	11251-35
Dumont #7 kleszcz drobnoziarnisty	FST	11274-20
Żywica Durcupan ACM	EMS	14040	Do zatapiania
Cienkie nożyczki	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
Chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwań	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Kwas L-asparaginowy	Sigma-Aldrich	56-84-8	Składnik barwiący
Azotan ołowiu	EMS	17900	Komponent barwiący
niskopróżniowy detektor rozproszenia wstecznego	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM detektor rozpraszania wstecznego
Kleszcz do mikroasynów	FST	11018-12
Filtr Millex-GP, 0,22 um, PES 33mm, niesterylne	EMD Millipore	SLGP033NS
Włókniny	McKesson Corp.	94442000
Trójwodzian heksacyjanożelazianu(II) potasu	Sigma-Aldrich	14459-95-1	Składnik barwiący
Wodorotlenek potasu	Sigma-Aldrich	1310-58-3
Linia do pomiaru ciśnienia	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
Roztwór soli fizjologicznej (sterylny 0,9% chlorek sodu)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Rozmiar 3 Kapsuła BEEM	EMS	69910-01	Pojemnik do zatapiania
Kakodylan sodu trójwodny	Sigma-Aldrich	6131-99-3	Bufor
Retraktory Solibri	FST	17000-04
Napylarka do napylania, węgla i wiązki elektronicznej	Leica	EM ACE600	Powłoka do złota
Mikroskop chirurgiczny	Leica	M80
Tiokarbohydrazyd (TCH)	EMS	21900	Składnik barwiący
Uchwyt na igłę/kleszcze Tish	Micrins	MI1540
Trymer	Wahl	9854-500
Octan uranylu	EMS	22400	Składnik barwiący
Woltoskopowy skaningowy mikroskop elektronowy	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	Mikroskop elektronowy ze skanowaniem twarzy z blokiem szeregowym
Sterylny roztwór ksylazyny	Akorn Inc.	NADA# 139-236