Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji mutacji związanych z naprawą wywołanego przez CAS9 pęknięcia podwójnej nici w pobliżu promotora CD4

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62583

⸱

31 marca 2022

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University, 2Kansas State Veterinary Diagnostic Laboratory, Kansas State University, 3Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology, Kansas State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono tutaj endonukleazę sgRNA/CAS9 oraz protokół sekwencjonowania nowej generacji, który może być wykorzystany do identyfikacji mutacji związanych z naprawą pęknięć podwójnej nici w pobliżu promotora CD4.

Streszczenie

Pęknięcia podwójnej nici (DSB) w DNA są najbardziej cytotoksycznym rodzajem uszkodzenia DNA. Ponieważ niezliczone zniewagi mogą powodować te zmiany (np. stres replikacyjny, promieniowanie jonizujące, nienaprawione uszkodzenia UV), DSB występują w większości komórek każdego dnia. Oprócz śmierci komórki, nienaprawione DSB zmniejszają integralność genomu, a wynikające z tego mutacje mogą napędzać nowotworzenie się. Ryzyko to oraz rozpowszechnienie DSB motywują do badań nad mechanizmami, za pomocą których komórki naprawiają te zmiany. Sekwencjonowanie nowej generacji może być połączone z indukcją DSB przez promieniowanie jonizujące, aby zapewnić potężne narzędzie do precyzyjnego definiowania mutacji związanych z defektami naprawy DSB. Jednak takie podejście wymaga wymagającego obliczeniowo i kosztownego sekwencjonowania całego genomu w celu wykrycia naprawy losowo występujących DSB związanych z promieniowaniem jonizującym. Rzadkie endonukleazy tnące, takie jak I-Sce1, zapewniają zdolność do generowania pojedynczego DSB, ale ich miejsca rozpoznawania muszą zostać wprowadzone do genomu będącego przedmiotem zainteresowania. W rezultacie miejsce naprawy jest z natury sztuczne. Ostatnie osiągnięcia pozwalają na skierowanie endonukleazy Cas9 do dowolnego interesującego miejsca genomu. Można to zastosować do badań nad naprawą DSB, dzięki czemu sekwencjonowanie nowej generacji będzie bardziej opłacalne, umożliwiając skupienie się na DNA flankującym DSB indukowany przez Cas9. Celem manuskryptu jest zademonstrowanie wykonalności tego podejścia poprzez przedstawienie protokołu, który może zdefiniować mutacje wynikające z naprawy DSB przed genem CD4. Protokół można dostosować do określenia zmian w potencjale mutagennym DSB związanych z czynnikami egzogennymi, takimi jak inhibitory naprawy, ekspresja białek wirusowych, mutacje i ekspozycje środowiskowe przy stosunkowo ograniczonych wymaganiach obliczeniowych. Po zsekwencjonowaniu genomu organizmu metoda ta może być teoretycznie zastosowana w dowolnym locus genomu i w dowolnym modelu hodowli komórkowej tego organizmu, który może być transfekowany. Podobne adaptacje podejścia mogą umożliwić porównanie wierności naprawy między różnymi loci w tym samym tle genetycznym.

Wprowadzenie

Utrzymanie stabilności genomu jest kluczowe dla wszystkich żywych organizmów. Dokładna replikacja DNA i solidna odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR) są niezbędne do wiernego rozmnażania materiału genetycznego1,2. Uszkodzenia DNA występują regularnie w większości komórek2,3. Kiedy te uszkodzenia są wykrywane, postęp cyklu komórkowego zostaje zatrzymany, a mechanizmy naprawy DNA są aktywowane. Pęknięcia podwójnej nici w DNA lub DSB są najbardziej toksycznym i mutagennym typem uszkodzenia DNA3,4.

Podczas gdy kilka ścieżek sygnałowych DDR może naprawić te uszkodzenia, najdokładniej zbadanymi ścieżkami naprawy DSB są rekombinacja homologiczna (HR) i niehomologiczne łączenie końców (NHEJ). HR jest w dużej mierze bezbłędną ścieżką, która naprawia DSB przy użyciu siostrzanej chromatydy jako homologicznego szablonu. Zwykle dzieje się to w fazie S i fazie G2 cyklu komórkowego5,6,7. NHEJ jest bardziej podatny na błędy, ale może się to zdarzyć przez cały cykl komórkowy8,9. Opracowano różne testy reporterowe do pomiaru skuteczności określonych mechanizmów naprawczych10,11,12. Testy te zwykle opierają się na cytometrii przepływowej w celu uzyskania wysokiej przepustowości pomiaru aktywności szlaku naprawy DSB przy użyciu GFP lub mCherry jako readout11,13. Chociaż są bardzo wydajne, opierają się na kanonicznej naprawie zachodzącej w sztucznie wprowadzonym DSB.

Istnieje wiele innych metod używanych do badania naprawy DSB. Wiele z nich opiera się na mikroskopii immunofluorescencyjnej (IF)1,14. Mikroskopia IF wykrywa dyskretne ogniska jądrowe reprezentatywne dla kompleksów naprawczych po tym, jak DSB są indukowane przez ekspozycję na genotoksyczne chemikalia lub promieniowanie jonizujące15,16. Śledzenie powstawania i rozwiązywania tych ognisk dostarcza wskazówek dotyczących odpowiednio rozpoczęcia i zakończenia naprawy14,17. Jednak te metody indukcji DSB (tj. chemikalia lub promieniowanie jonizujące) nie powodują DSB w określonych miejscach w genomie. Z funkcjonalnego punktu widzenia niemożliwe jest również wykorzystanie ich do konsekwentnego wywoływania tylko niewielkiej liczby (np. 2-4) DSB. W rezultacie, najczęściej stosowane metody indukowania DSB powodują mnogość zmian losowo rozmieszczonych w całym genomie18. Niewielką liczbę DSB można wprowadzić, wstawiając miejsce rozpoznawania rzadkiej endonukleazy tnącej i wyrażając odpowiednią endonukleazę, taką jak I-Sce119. Niestety, wymagana integracja miejsca docelowego uniemożliwia badanie DSB w endogennych loci genomowych.

Ten manuskrypt opisuje metodę wykrywania mutacji związanych z naprawą DSB generowanych w miejscu zdefiniowanym przez użytkownika. Podajemy reprezentatywny przykład podejścia zastosowanego do oceny zdolności białka wirusowego do zwiększania liczby mutacji związanych z DSB. W szczególności manuskrypt ten opisuje zastosowanie pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA) do kierowania endonukleazą CAS9 w celu indukowania DSB w ludzkiej otwartej ramce odczytu CD4 w ludzkich keratynocytach napletka eksprymujących kontrolę wektora (HFK LXSN) i HFK, który wyraża białko E6 wirusa brodawczaka ludzkiego typu 8 (HFK 8E6). Celowane sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) regionu otaczającego pęknięcie pozwala na rygorystyczne zdefiniowanie mutacji związanych z naprawą zmiany. Dane te pokazują, że białko wirusowe powoduje około 20-krotny wzrost mutacji podczas naprawy DSB. Zapewnia również bezstronną charakterystykę mutagennych konsekwencji DSB w pojedynczym locus bez konieczności sekwencjonowania całego genomu. Zasadniczo protokół można łatwo dostosować do porównania względnego ryzyka mutacji między loci genomu lub liniami komórkowymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wysiew komórek

  1. Hodować komórki HFK LXSN i HFK 8E6 na płytkach 10 cm w pożywce do hodowli keratynocytów (10 mL/płytkę) z dodatkiem suplementu wzrostu keratynocytów ludzkich (HKGS) oraz 1% penicyliny/streptomycyny. Hodować komórki do osiągnięcia około 80% konfluencji w temperaturze 37 °C w inkubatorze z koszulą grzewczą przy 5% CO2.
  2. Wymienić pożywkę hodowlaną na 3 mL trypsyny-EDTA (0,05%, kwas etylenodiaminotetraoctowy). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 min. Zneutralizować trypsynę taką samą objętością pożywki uzupełnionej o płodową surowicę bydlęcą (FBS) i przenieść komórki do probówki do wirowania o pojemności 15 mL. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
  3. Resuspendować komórki w 10 mL pożywki do hodowli keratynocytów z HKGS. Określić stężenie komórek za pomocą komory liczydła (hemocytometru).
  4. Wysiać 4 x 105 komórek/płytki 6-cm (dwie płytki dla HFK LXSN i dwie płytki dla HFK 8E6) w 4 mL pożywki do hodowli keratynocytów z HKGS oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Hodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z koszulą grzewczą przy 5% CO2.
    UWAGA: Do tego protokołu wybrano analizę komórek HFK z dwóch powodów. Po pierwsze, HFK jest linią komórkową trudną do transfekcji. Zatem wykazanie, że protokół działa w tej linii, stanowi dowód, że prawdopodobnie będzie on działał w częściej stosowanych i łatwiej poddających się transfekcji komórkach. Po drugie, wcześniej opublikowane dane wykazują, że białko wirusowe (8E6) utrudnia naprawę pęknięć dwuniciowych w DNA20,21,22. Zatem porównanie HFK LXSN i HFK 8E6 pozwala zademonstrować zdolność testu do wykrywania wzrostu liczby mutacji związanych z ograniczeniem komórkowej zdolności naprawczej.

2. Transfekcja

  1. W dniu transfekcji (24 h po wysianiu), zastąpić pożywkę 3 mL suplementowanej pożywki bez antybiotyków. Inkubować przez 2 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z płaszczem grzewczym.
  2. Przeprowadzić transfekcję komórek za pomocą odpowiednich odczynników do transfekcji opartych na lipidach, zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Doprowadzić odczynniki do transfekcji do temperatury pokojowej i delikatnie wymieszać pipetą przed użyciem.
    2. Dla każdej linii komórkowej (HFK LXSN i HFK 8E6) odmierzyć odpowiednią ilość buforu do transfekcji (zgodnie z zaleceniami producenta) do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 1,5 mL (Probówka 1). Przygotować kolejną probówkę z taką samą ilością buforu do transfekcji (transfekcja pozorowana lub Probówka 2).
    3. Do Probówki 1 z kroku 2.2.2 dodać 2 µg plazmidowego DNA kodującego CAS9/sgRNA celującego w ludzkie CD4 (px330-CD4, 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT). Delikatnie wymieszać pipetą do pełnego połączenia. Do Probówki 2 dodać równą objętość sterylnej wody.
    4. Dla każdej linii komórkowej przygotować płytkę kontrolną z samymi odczynnikami do transfekcji (bez plazmidu).
      UWAGA: Druga płytka służy jako kontrola negatywna w eksperymencie, umożliwiając potwierdzenie, że transfekcja CAS9/sgRNA nie jest odpowiedzialna za wystąpienie jakichkolwiek mutacji.
    5. Dodać odpowiednią ilość odczynnika do transfekcji (zgodnie z zaleceniami producenta) do probówki z mieszaniną DNA (Probówka 1) z kroku 2.2.3 oraz do probówki z transfekcją pozorowaną (Probówka 2) z kroku 2.2.2. Delikatnie wymieszać pipetą do pełnego połączenia. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-30 min, aby zapewnić odpowiedni czas na utworzenie kompleksów.
    6. Mieszaninę do transfekcji dodać kroplami na płytkę. Delikatnie kołysać kulturą przez 1 min, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę do transfekcji.
  3. Inkubować przez 48 h po transfekcji, aby umożliwić ekspresję CAS9.
  4. Zebrać komórki poprzez trypsynizację.
    1. Zastąpić pożywkę hodowlaną 1 mL trypsyny-EDTA (0,05%, kwas etylenodiaminotetraoctowy). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 min. Zneutralizować trypsynę równą objętością pożywki suplementowanej FBS.
    2. Dla każdej płytki z komórkami przenieść zawiesinę komórkową do dwóch probówek do mikrowirowania w równych aliquotach. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
    3. Osad komórkowy z jednej probówki z kroku 2.4.2 resuspender w 1 mL soli fizjologicznej z buforem fosfatowym (PBS) do sekwencjonowania. Osad z drugiej probówki z kroku 2.4.2 resuspender w schłodzonym do temperatury lodowej PBS do analizy immunoblot.
  5. Zebrać lizaty z całych komórek do analizy immunoblot.
    1. Wirować probówkę przy 300 x g przez 5 min. Odrzucić nadsącz.
    2. Do probówki dodać 100 µL buforu do analizy radioimmunoprecypitacji (bufor lizujący RIPA) z dodatkiem 1% inhibitora proteaz i 1% inhibitora fosfataz, dokładnie wymieszać pipetą i inkubować przez 10 min na lodzie.
      UWAGA: Bufor lizujący RIPA zawiera 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA; 0,5 mM EGTA; 1% Triton X-100; 0,1% jodku deoksycholanu sodu; 0,1% SDS; 140 mM NaCl oraz wodę dejonizowaną.
    3. Wirować lizaty przy 13 000 x g przez 10 min. Zebrać nadsącze do analizy immunoblot.

3. Pomiar ekspresji CAS9 za pomocą immunoblottingu

  1. Oznaczyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. NaNieść 20 µg białka z każdej próbki do studzienek żelu Tris-octanowego 3%-8% na 150 min, a następnie przeprowadzić transfer półsuchy (10 V przez 30 min, a potem 25 V przez 12 min) na membranę z polifluorku winylidenu.
  3. Po zablokowaniu membrany w 5% beztłustym suchym mleku w PBS z 0,1% tween (PBST) przez 1 h w temperaturze pokojowej, dodać przeciwciała anty-CAS9 (1:1000) i anty-GAPDH (1:1000). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Po przemyciu membrany roztworem PBST, inkubować membranę z przeciwciałem wtórnym w 5% beztłustym suchym mleku w PBST przez 1 h w temperaturze pokojowej.
  5. Wykonać obrazowanie blotu i określić poziom CAS9 metodą densytometrii23. Reprezentatywny blot przedstawiono na Rysunku 1.
    UWAGA: Wykrywanie tworzenia się ognisk fosforylowanego H2AX (S139) za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej może służyć do walidacji aktywności CAS914. Oczekuje się niewielkiej liczby wyraźnych ognisk (zazwyczaj 1-4 ognisk), w zależności od etapu cyklu komórkowego, od tego, czy mutacje w miejscu docelowym CAS9 zapobiegają dalszemu cięciu oraz od liczby kopii miejsca cięcia CAS9 w badanym genomie. Reprezentatywny obraz przedstawiono na Rysunku 2.

4. Ekstrakcja kwasów nukle nowych i generowanie amplikonu

  1. Wyekstrahuj DNA z próbek komórkowych z kroku 2.4.3, korzystając z zestawu do ekstrakcji DNA o wysokiej masie cząsteczkowej, zgodnie z instrukcją producenta.
  2. Rozpuść primery w wskazanym rozpuszczalniku zgodnie z kartą charakterystyki. Rozcieńcz je tym samym odczynnikiem do stężenia 20 µM i połącz primery 20 µM w wskazane pule.
    UWAGA: Pula primerów jest wymieniona w Tabeli uzupełniającej 1.
  3. Przygotuj mieszankę PCR Master mix, używając polimerazy Taq do długiej amplifikacji dla każdej puli primerów 20 µM, zgodnie z Tabelą 1.
    1. Dodaj 21 µL mieszanek mastermix do oddzielnych probówek PCR.
  4. Dodaj 4 µL próbki docelowej (100 ng/µL) z kroku 4.1 do probówek z testem PCR zawierających mastermix i zamknij probówki. Zapewnij oddzielne reakcje dla każdej puli primerów.
    1. Wymieszaj probówki z testem PCR w wortexie, a następnie odwiruj (krótka wirowka), aby usunąć kropelki z nakrętek probówek.
    2. Umieść probówki PCR w konwencjonalnym termocyklerze.
    3. Zaprogramuj termocykler zgodnie z Tabelą 2.
    4. Uruchom program w termocyklerze.

5. Oczyszczanie produktu PCR

  1. Usuń primery z reakcji PCR, korzystając z systemu oczyszczania PCR opartego na kuleczkach magnetycznych.
    1. Wyjmij kuleczki do oczyszczania z lodówki na 30 min przed użyciem.
    2. Dokładnie wymieszaj kuleczki w wortexie przed użyciem, aby upewnić się, że wszystkie zostały resuspenderowane.
    3. Dodaj 30 µL (1,2x) resuspenderowanych kuleczek do każdego dołka płytki głębokodniowej 96-dołkowej.
    4. Dodaj 25 µL reakcji PCR do dołków zawierających kuleczki.
    5. Umieść płytkę na wstrząsarce przy 2000 rpm przez 2 min.
    6. Pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 min po wstrząsaniu.
    7. Umieść płytkę głębokodniową na magnesie do płytek 96-dołkowych i inkubuj przez 2 min.
    8. Odprowadź i usuń supernatant, nie naruszając kuleczek.
    9. Gdy płytka pozostaje na magnesie, dodaj 180 µL 80% etanolu i inkubuj przez 30 s. Odprowadź i usuń supernatant.
    10. Powtórz krok 5.1.9.
    11. Za pomocą pipety 10 µL usuń i odrzuć wszelką pozostałą ciecz z dołków.
    12. Pozostaw kuleczki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    13. Dodaj 20 µL wody wolnej od nukleaz do dołków zawierających kuleczki i zdejmij płytkę z magnesu.
    14. Wstrząsaj płytkę przy 2000 rpm przez 2 min w temperaturze pokojowej.
    15. Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    16. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym i inkubuj przez 2 min w temperaturze pokojowej.
    17. Przenieś supernatant do drugiej, oznakowanej płytki PCR. Zawiera ona oczyszczone DNA.
  2. Zmierz stężenie każdej reakcji za pomocą fluorometru.
    1. Upewnij się, że odczynniki do fluorometru dsDNA znajdują się w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotuj probówki do analizy fluorometrycznej oraz dwie dodatkowe probówki na standardy.
    3. Dodaj 199 µL 1x roztworu roboczego dsDNA do wszystkich probówek z wyjątkiem dwóch. Do dwóch ostatnich probówek dodaj 190 µL roztworu roboczego.
    4. Dodaj 10 µL dwóch standardów (wymienionych w tabeli materiałów) do oddzielnych probówek analitycznych.
    5. Dodaj 1 µL każdej reakcji PCR do probówek z mastermixem fluorometrycznym.
    6. Wymieszaj zawartość probówek w wortexie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 min.
    7. Na ekranie głównym fluorometru wybierz przycisk z używanym zestawem analitycznym (1x dsDNA), a następnie wybierz Read Standards and Run Samples.
    8. Włóż probówkę ze standardem 1, wybierz przycisk Read, a następnie powtórz czynność dla standardu 2.
    9. Po kroku 5.2.6 powtórz procedurę dla jednej próbki, wybierz objętość próbki 1 µL, a urządzenie poda wynikowe stężenie.
    10. Powtórz krok 5.2.7 dla pozostałych próbek.
  3. Oblicz przewidywaną molarność wszystkich reakcji i połącz równe stężenia reakcji z każdej indywidualnej próbki osobno (jedna końcowa pula na próbkę), korzystając z poniższego wzoru.
    Wzór na ilościowe oznaczenie DNA: Pikomole/µL = stężenie DNA/0,66×wielkość DNA (bp=1000).
    1. Powtórz kroki od 5.2.1 do 5.2.7, aby uzyskać stężenie końcowej puli.
  4. Sprawdź pulę amplikonów na urządzeniu do elektroforezy kapilarnej lub żelu agarozy zgodnie z instrukcją producenta.
    1. Przygotuj probówki do elektroforezy kapilarnej dla odpowiedniej liczby próbek. Dodaj 7 µL buforu do DNA zgodnie z instrukcją producenta.
    2. Dodaj 4 µL puli amplikonów do probówki zawierającej bufor do DNA.
    3. Umieść probówki w urządzeniu do elektroforezy i uruchom urządzenie zgodnie z instrukcją producenta dla dsDNA.
    4. Obejrzyj obrazy z elektroforezy żelowej, upewniając się, że prążki lokalizują się na poziomie ~5 kb (wielkość amplikonów).
  5. Oblicz przewidywaną molarność wszystkich reakcji i połącz równe stężenia reakcji z każdej indywidualnej próbki osobno (jedna końcowa pula na próbkę), korzystając z poniższego wzoru.
    Wzór na ilościowe oznaczenie DNA: Pikomole/µL = stężenie DNA/0,66×wielkość DNA (bp=1000).

6. Przygotowanie biblioteki

  1. Rozcieńczyć pule próbek z kroku 5.3.1 do stężenia 0,2 ng/µL w celu przygotowania biblioteki.
    1. Używając zestawu do przygotowania bibliotek o niskim wkładzie (low-input), kompatybilnego z krótkimi sekwencjami (300bp), przygotować biblioteki przy użyciu unikalnych kombinacji indeksów dla każdej puli próbek utworzonej w kroku 5.3, zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Postępować zgodnie z instrukcjami producenta w celu wyboru sekwencji indeksów. Wszystkie indeksy obsługiwane przez zestaw do przygotowania biblioteki będą odpowiednie dla próbek.
    2. Po przygotowaniu bibliotek połączyć wszystkie próbki w jedną pulę zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Przed utworzeniem puli bibliotek obliczyć liczbę odczytów niezbędną do uzyskania 250-krotnego pokrycia (250x coverage) sekwencji docelowej i upewnić się, że wybrany kartridż do sekwencjonowania zapewni odpowiednie pokrycie dla każdej dołączonej próbki. Dla całkowitej wielkości 0,5Mb będzie to odpowiadać 1M odczytów.
  2. Przygotować pulę bibliotek do sekwencjonowania.
    1. Rozmrozić i przygotować kartridż 300-cyklowy oraz odczynniki do sekwencjonowania.
    2. Zdenaturować i rozcieńczyć pulę sekwencyjną utworzoną w kroku 5.1.1 zgodnie z instrukcjami producenta sekwenatora.
    3. Dodać zdenaturowaną i rozcieńczoną pulę bibliotek do odczynników do sekwencjonowania i uruchomić sekwenator zgodnie z wytycznymi producenta.
      UWAGA: Rozwiązywanie problemów znajduje się w dołączonej Tabeli 3.

7. Analiza danych

UWAGA: Wszystkie etapy analizy danych są wykonywane w oprogramowaniu do analizy danych genomicznych. Nawiasy oznaczają dane wprowadzane przez użytkownika. Znak większości wskazuje kolejność kliknięć myszą w danym kroku (np. 1st kliknięcie myszą>2nd kliknięcie myszą)

  1. Zaimportuj odczyty, klikając Open Software > Import > Illumina > Select Files > Next > Select location to Save > Finish. Odczyty pojawią się teraz w oprogramowaniu.
  2. Przytnij i przefiltruj odczyty.
    1. W oprogramowaniu do analizy danych sekwencjonowania głębokiego przytnij surowe odczyty przy użyciu domyślnych parametrów.
    2. Zaznacz odczyty i kliknij Toolbox > Prepare Sequencing Data > Trim Reads > Next > Next > Next > Next > Save > Next > (wybierz miejsce zapisu) > Finish
  3. Zmapuj przycięte odczyty do sekwencji referencyjnej.
    1. Zmapuj przycięte odczyty do sekwencji referencyjnej użytej w kroku 4.1, stosując wartość dopasowania (match score) wynoszącą 2, koszt niedopasowania (mismatch cost) wynoszący 3 oraz koszt insercji/delecji wynoszący 2. Upewnij się, że ułamek długości (length fraction) jest powyżej 0,7, a ułamek podobieństwa (similarity fraction) wynosi 0,8 lub więcej.
    2. Zaznacz plik z przyciętymi odczytami i kliknij Toolbox > Resequencing Analysis > Map Reads to Reference > Next > (wybierz sekwencję referencyjną) > Next > (upewnij się, że parametry są ustawione jak powyżej) > Next > Save > (wybierz miejsce zapisu) > Finish.
  4. Wyodrębnij warianty i indele.
    1. Używając odpowiedniego narzędzia do wykrywania indeli (indel caller), wyodrębnij indele, stosując próg wartości p wynoszący 0,005 lub mniej oraz maksymalną liczbę niedopasowań równą 3.
    2. Zaznacz plik z zmapowanymi odczytami i kliknij Toolbox > Resequencing Analysis > Variant detection > Indels and Structural Variants > Next > (wprowadź wymaganą istotność) > Next > Save > (wybierz miejsce zapisu) > Finish.
    3. Używając odpowiedniego narzędzia do wykrywania wariantów (variant caller), zidentyfikuj warianty z mapowania odczytów, stosując istotność na poziomie 5%.
    4. Zaznacz plik z zmapowanymi odczytami i kliknij Toolbox > Resequencing Analysis > Variant Detection > Low frequency variant detection > Next > (wprowadź wymaganą istotność) > Next > Next > Save > (wybierz miejsce zapisu) > Finish.
      UWAGA: Pamiętaj o uwzględnieniu ploidalności genomu gospodarza w narzędziach do wykrywania indeli i wariantów. Nie wyodrębniaj mutantów poniżej 5%. Próg ten uwzględnia błędy PCR i sekwencjonowania związane z analizą. Normalizację (na podstawie detekcji CAS9 metodą immunoblot) należy przeprowadzić poprzez dostosowanie pokrycia sekwencjonowania. Na przykład, jeśli próbka A ma dwukrotnie wyższą wydajność transfekcji niż próbka B, do analizy należy wykorzystać 50% odczytów z próbki A. Powinno to zostać wykonane poprzez losowe próbkowanie, tak aby pokrycie dla żadnej z próbek nie spadło poniżej 100x.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dla niniejszego protokołu przedstawiono trzy reprezentatywne wyniki. Rysunek 1 przedstawia immunoblot potwierdzający ekspresję CAS9 w kontrolnych komórkach HFK (LXSN) oraz komórkach HFK wykazujących ekspresję beta-HPV 8E6 (8E6). 48 h po transfekcji pobrano lizaty całych komórek, a następnie poddano je analizie z użyciem przeciwciała anty-CAS9 (lub przeciwciała anty-GAPDH jako kontroli załadunku). Wynik pokazuje, że HFK LXSN i HFK 8E6 wykazują podobny poziom e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Oprócz głębi dostarczanych informacji metoda ta ma kilka zalet. Po pierwsze, naprawa DSB, w teorii, może być oceniana w dowolnym loci genomowym bez modyfikowania genomu komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Po drugie, dostęp do analizy naprawy NGS jest zwiększony dzięki zmniejszonym kosztom i wysiłkowi obliczeniowemu wynikającemu z wykonania i analizy pojedynczego DSB ukierunkowanego na zdefiniowany obszar. Wreszcie, biorąc pod uwagę, że genomy dodatkowych organizmów stają się rutynowo dostępne, a liczne publikacj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania opisane w tym manuskrypcie były wspierane przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW i RP); Narodowy Instytut Raka Narodowych Instytutów Zdrowia (NCI R15 CA242057 01A1); Centrum Badań nad Rakiem im. Johnsona na Uniwersytecie Stanowym Kansas; oraz Departament Obrony Stanów Zjednoczonych (CMDRP, PRCRP CA160224 (NAW)). Dziękujemy KSU-CVM Confocal Core i Joelowi Sannemanowi za naszą mikroskopię immunofluorescencyjną. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy tych agencji finansujących.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-dołkowa płytka do hodowli tkanekCelltreat229106Płytka do hodowli komórkowych
Zestaw BCAVWR89167-794Zestaw do oznaczania BCA
Wirówka 5910 REppendorf2231000772Wirówka stołowa
CLC Genomic WorkbenchQiagen832001oprogramowanie do głębokiej analizy danych sekwencyjnych / indel caller / variant caller
Cyfrowa mikropłytka Genie pulseScientific industriesSI-400AWytrząsarka płytkowa
DYKDDDDK Etykietka Przeciwciało monoklonalne (FG4R)ThermoFisher ScientificMA191878Przeciwciało anty-FLAG
Zestaw Epilife CF ThermoFisherScientificMEPICF500Pożywki i suplementy komórkowe
Surowica bydlęca płodu (FBS)VWR89510-194Suplement do hodowli komórkowych
Kozia anty-królicza IgGThermoFisher ScientificA-11012Przeciwciało wtórne
HighPrep PCR Cleanup System MagBioAC-60005Zestaw do czyszczenia PCR na bazie koralików
Zestaw do PCR KAPA HiFi HotStart ReadyMix Zestaw PCRKAPA BiosystemsKK2600Test PCR mastermix/PCR
Zestaw DNA MagAttract HMWQiagen67563Zestaw do ekstrakcji DNA o wysokiej masie cząsteczkowej
Stojak magnetyczny-96Thermo Fisher Scientific AM1002796-dołkowy stojak magnetyczny
MiniAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA37834Termocykler
MiseqIlluminaSY-410-1003Sekwencer
Miseq v2 Zestaw odczynników do 300 cykliIlluminaMS-102-2002300-cyklowe odczynniki do kartridża/sekwencjonowania
Nextera XT Zestaw przygotowawczy do biblioteki DNAIlluminaFC-131-1024Zestaw do przygotowania biblioteki
Nextera XT Kit v2 Zestaw AIndeksyIllumina
20027215 Nunc 96-dołkowe polipropylenowe płytki DeepWell StroageThermo Fisher Scientific260251Deep Well 96-dołkowe płytki
penicyliny-streptomycyny (100X)Calsson LabsPSL02-6X100MLAntybiotyki do hodowli komórkowych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Bio BasicPD8117PBS
px330-CD4Addgen136938plazmidy SgRNA/CAS9 ukierunkowane na 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT
QIAxcel Zaawansowany systemQiagen9001941maszyna do elektroferii kapilarnej
Zestaw do badań przesiewowych DNA Qiagen929004Bufor DNA / kapilarne probówki do elektroferzy
Qubit 1x ds Zestaw do oznaczania HSThermoFisher ScientificQ23851Odczynniki fluorometryczne / 1x roztwór dsDNA
Fluorometr Qubit 4ThermoFisher ScientificQ33238
Probówki do oznaczania fluorometrów ThermoFisher ScientificQ32856Probówki do fluorometru
Bufor do lizy RIPAVWRVWRVN653-100MLBufor do lizy do ekstrakcji białek
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwieńfenolowaThermoFisher Scientific25300054Trypsin
Vortex-Genie 2Branże naukoweSI-0236Odczynnik
do transfekcji Vortex Xfect Odczynnik do transfekcjiTakara Bio 631318Oprogramowanie
analizy danych genomowychQIAGENCLC Workbench v21.0.Oprogramowanie do analizy danych
Roztwór do

Bibliografia

  1. Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
  2. Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745(2011).
  3. Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
  4. vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
  5. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
  6. Daley, J. M., Sung, P. 53B. P. 1 BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
  7. Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
  8. Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (0), 194-205 (2015).
  9. Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
  10. Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
  11. Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
  12. Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
  13. Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
  14. Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653(2018).
  15. Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  16. Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327 (0), 48-60 (2012).
  17. Kuo, L. J., Yang, L. -X. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
  18. Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178(2020).
  19. Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
  20. Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687(2015).
  21. Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356(2020).
  22. Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275(2022).
  23. Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821(2019).
  24. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  25. Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
  26. Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

pęknięcia obu nicimutacje indukowane przez Cas9mechanizmy naprawy DNApojedyncze przewodzące RNAniestabilność genomowamikroskopia immunofluorescencyjnawydajność transfekcjidetekcja mutacji
Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji mutacji związanych z naprawą wywołanego przez CAS9 pęknięcia podwójnej nici w pobliżu promotora CD4
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.