Method Article

Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji mutacji związanych z naprawą wywołanego przez CAS9 pęknięcia podwójnej nici w pobliżu promotora CD4

DOI:

10.3791/62583

⸱

March 31st, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University, 2Kansas State Veterinary Diagnostic Laboratory, Kansas State University, 3Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology, Kansas State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono tutaj endonukleazę sgRNA/CAS9 oraz protokół sekwencjonowania nowej generacji, który może być wykorzystany do identyfikacji mutacji związanych z naprawą pęknięć podwójnej nici w pobliżu promotora CD4.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęknięcia podwójnej nici (DSB) w DNA są najbardziej cytotoksycznym rodzajem uszkodzenia DNA. Ponieważ niezliczone zniewagi mogą powodować te zmiany (np. stres replikacyjny, promieniowanie jonizujące, nienaprawione uszkodzenia UV), DSB występują w większości komórek każdego dnia. Oprócz śmierci komórki, nienaprawione DSB zmniejszają integralność genomu, a wynikające z tego mutacje mogą napędzać nowotworzenie się. Ryzyko to oraz rozpowszechnienie DSB motywują do badań nad mechanizmami, za pomocą których komórki naprawiają te zmiany. Sekwencjonowanie nowej generacji może być połączone z indukcją DSB przez promieniowanie jonizujące, aby zapewnić potężne narzędzie do precyzyjnego definiowania mutacji związanych z defektami naprawy DSB. Jednak takie podejście wymaga wymagającego obliczeniowo i kosztownego sekwencjonowania całego genomu w celu wykrycia naprawy losowo występujących DSB związanych z promieniowaniem jonizującym. Rzadkie endonukleazy tnące, takie jak I-Sce1, zapewniają zdolność do generowania pojedynczego DSB, ale ich miejsca rozpoznawania muszą zostać wprowadzone do genomu będącego przedmiotem zainteresowania. W rezultacie miejsce naprawy jest z natury sztuczne. Ostatnie osiągnięcia pozwalają na skierowanie endonukleazy Cas9 do dowolnego interesującego miejsca genomu. Można to zastosować do badań nad naprawą DSB, dzięki czemu sekwencjonowanie nowej generacji będzie bardziej opłacalne, umożliwiając skupienie się na DNA flankującym DSB indukowany przez Cas9. Celem manuskryptu jest zademonstrowanie wykonalności tego podejścia poprzez przedstawienie protokołu, który może zdefiniować mutacje wynikające z naprawy DSB przed genem CD4. Protokół można dostosować do określenia zmian w potencjale mutagennym DSB związanych z czynnikami egzogennymi, takimi jak inhibitory naprawy, ekspresja białek wirusowych, mutacje i ekspozycje środowiskowe przy stosunkowo ograniczonych wymaganiach obliczeniowych. Po zsekwencjonowaniu genomu organizmu metoda ta może być teoretycznie zastosowana w dowolnym locus genomu i w dowolnym modelu hodowli komórkowej tego organizmu, który może być transfekowany. Podobne adaptacje podejścia mogą umożliwić porównanie wierności naprawy między różnymi loci w tym samym tle genetycznym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrzymanie stabilności genomu jest kluczowe dla wszystkich żywych organizmów. Dokładna replikacja DNA i solidna odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR) są niezbędne do wiernego rozmnażania materiału genetycznego1,2. Uszkodzenia DNA występują regularnie w większości komórek2,3. Kiedy te uszkodzenia są wykrywane, postęp cyklu komórkowego zostaje zatrzymany, a mechanizmy naprawy DNA są aktywowane. Pęknięcia podwójnej nici w DNA lub DSB są najbardziej toksycznym i mutagennym typem uszkodzenia DNA3,4.

Podczas gdy kilka ścieżek sygnałowych DDR może naprawić te uszkodzenia, najdokładniej zbadanymi ścieżkami naprawy DSB są rekombinacja homologiczna (HR) i niehomologiczne łączenie końców (NHEJ). HR jest w dużej mierze bezbłędną ścieżką, która naprawia DSB przy użyciu siostrzanej chromatydy jako homologicznego szablonu. Zwykle dzieje się to w fazie S i fazie G2 cyklu komórkowego5,6,7. NHEJ jest bardziej podatny na błędy, ale może się to zdarzyć przez cały cykl komórkowy8,9. Opracowano różne testy reporterowe do pomiaru skuteczności określonych mechanizmów naprawczych10,11,12. Testy te zwykle opierają się na cytometrii przepływowej w celu uzyskania wysokiej przepustowości pomiaru aktywności szlaku naprawy DSB przy użyciu GFP lub mCherry jako readout11,13. Chociaż są bardzo wydajne, opierają się na kanonicznej naprawie zachodzącej w sztucznie wprowadzonym DSB.

Istnieje wiele innych metod używanych do badania naprawy DSB. Wiele z nich opiera się na mikroskopii immunofluorescencyjnej (IF)1,14. Mikroskopia IF wykrywa dyskretne ogniska jądrowe reprezentatywne dla kompleksów naprawczych po tym, jak DSB są indukowane przez ekspozycję na genotoksyczne chemikalia lub promieniowanie jonizujące15,16. Śledzenie powstawania i rozwiązywania tych ognisk dostarcza wskazówek dotyczących odpowiednio rozpoczęcia i zakończenia naprawy14,17. Jednak te metody indukcji DSB (tj. chemikalia lub promieniowanie jonizujące) nie powodują DSB w określonych miejscach w genomie. Z funkcjonalnego punktu widzenia niemożliwe jest również wykorzystanie ich do konsekwentnego wywoływania tylko niewielkiej liczby (np. 2-4) DSB. W rezultacie, najczęściej stosowane metody indukowania DSB powodują mnogość zmian losowo rozmieszczonych w całym genomie18. Niewielką liczbę DSB można wprowadzić, wstawiając miejsce rozpoznawania rzadkiej endonukleazy tnącej i wyrażając odpowiednią endonukleazę, taką jak I-Sce119. Niestety, wymagana integracja miejsca docelowego uniemożliwia badanie DSB w endogennych loci genomowych.

Ten manuskrypt opisuje metodę wykrywania mutacji związanych z naprawą DSB generowanych w miejscu zdefiniowanym przez użytkownika. Podajemy reprezentatywny przykład podejścia zastosowanego do oceny zdolności białka wirusowego do zwiększania liczby mutacji związanych z DSB. W szczególności manuskrypt ten opisuje zastosowanie pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA) do kierowania endonukleazą CAS9 w celu indukowania DSB w ludzkiej otwartej ramce odczytu CD4 w ludzkich keratynocytach napletka eksprymujących kontrolę wektora (HFK LXSN) i HFK, który wyraża białko E6 wirusa brodawczaka ludzkiego typu 8 (HFK 8E6). Celowane sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) regionu otaczającego pęknięcie pozwala na rygorystyczne zdefiniowanie mutacji związanych z naprawą zmiany. Dane te pokazują, że białko wirusowe powoduje około 20-krotny wzrost mutacji podczas naprawy DSB. Zapewnia również bezstronną charakterystykę mutagennych konsekwencji DSB w pojedynczym locus bez konieczności sekwencjonowania całego genomu. Zasadniczo protokół można łatwo dostosować do porównania względnego ryzyka mutacji między loci genomu lub liniami komórkowymi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Poszycie komórek

  1. Hoduj komórki HFK LXSN i HFK 8E6 na 10-centymetrowych płytkach w pożywkach do hodowli keratynocytów (10 ml / płytkę) z ludzkim suplementem wzrostu keratynocytów (HKGS) i 1% penicyliny / streptomycyny. Hoduj komórki do około 80% konfluencji w temperaturze 37 °C w inkubatorze z płaszczem z 5% CO2 .
  2. Zastąp pożywkę hodowlaną 3 ml trypsyny-EDTA (0,05%, kwas etylenodiaminotetraoctowy). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Zneutralizować trypsynę za pomocą równej objętości pożywki uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą (FBS) i przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
  3. Zawiesić komórki za pomocą 10 ml pożywki do hodowli keratynocytów za pomocą HKGS. Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru.
  4. Płytka: 4 x 10,5 komórek/6-centymetrowe płytki (dwie płytki nasienne dla HFK LXSN i dwie płytki dla HFK 8E6) w 4 ml pożywki hodowlanej keratynocytów z HKGS i 1% penicyliną i streptomycyną. Rosnąć w temperaturze 37 °C w inkubatorze z płaszczem o zawartości 5% CO2,
    UWAGA: Analiza komórek HFK została wybrana do tego protokołu z dwóch powodów. Po pierwsze, HFK jest trudną do transfekcji linią komórkową. Tak więc, wykazując, że protokół działa w tej linii komórkowej, dostarcza się dowodów na to, że prawdopodobnie będzie on działał w częściej używanych i łatwiej transfekowanych komórkach. Po drugie, wcześniej opublikowane dane pokazują, że białko wirusowe (8E6) utrudnia naprawę pęknięć podwójnej nici w DNA20,21,22. Tak więc porównanie HFK LXSN i HFK 8E6 pozwala nam wykazać zdolność testu do wykrywania wzrostu mutacji związanego ze zmniejszeniem zdolności naprawczej komórek.

2. Transfekcja

  1. W dniu transfekcji (24 godziny po posiewie) należy zastąpić pożywkę 3 ml pożywki uzupełniającej bez antybiotyków. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z płaszczem.
  2. Komórki transfekcyjne należy przetaczać odpowiednimi odczynnikami do transfekcji na bazie lipidów zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Podgrzej odczynniki do transfekcji do temperatury pokojowej i delikatnie odpipetuj przed użyciem.
    2. Dla każdej linii komórkowej (HFK LXSN i HFK 8E6) należy umieścić odpowiednią ilość buforu transfekcyjnego (zgodnie z zaleceniami producenta) w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml (probówka 1). Dołącz kolejną probówkę z taką samą ilością buforu do transfekcji (symulowana transfekcja lub probówka 2).
    3. Dodać 2 μg plazmidowego DNA eksprymującego CAS9 / sgRNA ukierunkowanego na ludzki CD4 (px330-CD4, 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT) do probówki 1 z kroku 2.2.2. Delikatnie odpipetować, aby całkowicie wymieszać. Dodać równą objętość sterylnej wody do probówki 2.
    4. Dołącz płytkę kontrolną z samymi odczynnikami do transfekcji (bez plazmidu) dla każdej linii komórkowej.
      UWAGA: Druga płytka służy jako kontrola negatywna w eksperymencie, pozwalając użytkownikowi potwierdzić, że transfekcja z CAS9/sgRNA nie jest odpowiedzialna za żadne mutacje.
    5. Dodać odpowiednią ilość odczynnika do transfekcji (zgodnie z zaleceniami producenta) do probówki z mieszaniną DNA (probówka 1) z kroku 2.2.3 i próbnego transfekcji (probówka 2) z kroku 2.2.2. Delikatnie odpipetować, aby całkowicie wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut, aby dać wystarczająco dużo czasu na utworzenie się kompleksów.
    6. Dodawać mieszaninę transfekcji kroplami do płytki. Delikatnie kołysz kulturą przez 1 minutę, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę transfekcji.
  3. Inkubować przez 48 godzin po transfekcji, aby umożliwić ekspresję CAS9.
  4. Zbieraj komórki przez trypsynizację.
    1. Zastąp pożywkę hodowlaną 1 ml trypsyny-EDTA (0,05%, kwas etylenodiaminotetraoctowy). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Zneutralizuj trypsynę równą objętością pożywki uzupełnionej FBS.
    2. Dla każdej płytki komórkowej przenieść zawiesinę komórek do dwóch probówek mikrowirówek o równych podwielokrotnościach. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
    3. Zawiesić osad komórkowy z jednej probówki w kroku 2.4.2 w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do sekwencjonowania. Zawiesić drugą probówkę z kroku 2.4.2 z lodowatym PBS dla immunoblot.
  5. Zbierz lizaty całych komórek na immunoblot.
    1. Odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
    2. Dodać do probówki 100 μl buforu do oznaczania radioimmunoprecypitacji (bufor do lizy RIPA) zmieszanego z 1 % inhibitorem proteazy i 1 % inhibitorem fosfatazy, dokładnie wymieszać pipetą i inkubować przez 10 minut na lodzie.
      UWAGA: Bufor do lizy RIPA zawiera 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA; 0,5 mM EGTA; 1% Triton X-100; 0,1% deoksycholan sodu; 0,1% SDS; 140 mM NaCl i woda dejonizowana.
    3. Odwirować lizaty przy 13 000 x g przez 10 min. Zebrać supernatanty do immunoblotu.

3. Pomiar ekspresji CAS9 za pomocą immunoblot

  1. Oznaczyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Wprowadzić 20 μg białka z każdej próbki do studzienek żelu tris-octanowego o stężeniu 3%-8% przez 150 minut i przenieść na półsucho (10 V przez 30 minut, a następnie 25 V przez 12 minut) do membrany z polifluorku winylidenu.
  3. Po zablokowaniu błony w 5% odtłuszczonym mleku w proszku w PBS z 0,1% tween (PBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, dodać przeciwciała anty-CAS9 (1:1000) i anty-GAPDH (1:1000). Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  4. Po umyciu membrany PBST, inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym w 5% odtłuszczonym mleku w proszku w PBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Zobrazuj plamę i określ poziom CAS9 za pomocą densytometrii23. Zobacz Rysunek 1 dla reprezentatywnego blot.
    UWAGA: Wykrywanie tworzenia się fosforylowanych ognisk H2AX (S139) za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej może być wykorzystane do walidacji aktywności CAS9 14. Oczekuje się niewielkiej liczby wyraźnych ognisk (zwykle 1-4 ognisk) w zależności od pozycji cyklu komórkowego, tego, czy mutacje w miejscu docelowym CAS9 uniemożliwiają dalsze cięcie i ile kopii miejsca cięcia CAS9 istnieje w genomie będącym przedmiotem zainteresowania. Reprezentatywny obraz jest pokazany w Rysunek 2.

4. Ekstrakcja kwasów nukleinowych i generowanie amplikonów

  1. Ekstrahować DNA z próbek komórkowych z etapu 2.4.3 przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA o dużej masie cząsteczkowej, zgodnie ze specyfikacją producenta.
  2. Ponownie zawiesić podkłady ze wskazanym rozpuszczalnikiem zgodnie z kartą katalogową. Rozcieńczyć tym samym odczynnikiem do 20 μM i połączyć 20 μM starterów we wskazane pule.
    UWAGA: Pula podkładu jest wymieniona w tabeli uzupełniającej 1.
  3. Utworzyć mieszaninę wzorcową PCR przy użyciu polimerazy Taq z długą amplifikacją dla każdej puli starterów o wielkości 20 μM, jak określono w tabeli 1.
    1. Dodać 21 μl mastermixów do oddzielnych probówek PCR.
  4. Dodać 4 μl próbki docelowej (100 ng/μl) z kroku 4.1 do probówek do testów PCR zawierających probówki z mieszanką wzorcową i kapslem. Zapewnij oddzielne reakcje dla każdej puli starterów.
    1. Wir do mieszania probówek do PCR i wirówki (szybkie wirowanie) w celu usunięcia kropelek z pokrywek probówek.
    2. Umieść probówki PCR na konwencjonalnej maszynie termocyklera.
    3. Zaprogramować maszynę do PCR zgodnie z tabelą 2.
    4. Uruchom program na termocyklerze.

5. Czyszczenie PCR

  1. Usuń startery z reakcji PCR za pomocą systemu czyszczenia PCR opartego na kulkach.
    1. Wyjmij koraliki czyszczące z lodówki 30 minut przed użyciem.
    2. Dobrze wymieszaj koraliki przed użyciem i upewnij się, że wszystkie koraliki są ponownie zawieszone.
    3. Dodaj 30 μl (1,2x) zawieszonych kulek do każdego dołka płytki z 96 dołkami głębokiej studni.
    4. Dodać 25 μl reakcji PCR do studzienek zawierających kulki.
    5. Umieść płytkę na wytrząsarce płytowej z prędkością 2000 obr./min na 2 minuty.
    6. Pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na 5 minut po wstrząśnięciu.
    7. Umieść płytkę z głęboką studzienką na 96-dołkowym magnesie płytkowym i inkubuj przez 2 minuty.
    8. Usunąć i wyrzucić supernatant bez przeszkadzających kulek.
    9. Podczas gdy płytka pozostaje na magnesie, dodaj 180 μl 80% etanolu i inkubuj przez 30 sekund. Usuń i wyrzuć supernatant.
    10. Powtórz krok 5.1.9.
    11. Za pomocą pipety o pojemności 10 μl usuń i wyrzuć pozostałą ciecz z dołków.
    12. Pozostaw kulki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 10 minut.
    13. Dodaj 20 μl wody wolnej od nukleaz do studzienek zawierających kulki i wyjmij płytkę z magnesu.
    14. Potrząsaj płytką z prędkością 2000 obr./min przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    15. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    16. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    17. Usunąć supernatant na drugą, oznakowaną płytkę do PCR. Zawiera on oczyszczone DNA.
  2. Zmierz stężenie każdej reakcji za pomocą fluorometru.
    1. Upewnij się, że odczynniki do fluorometru dsDNA mają temperaturę pokojową.
    2. Skonfiguruj probówki do testów fluorometrycznych oraz dwie dodatkowe probówki do wzorców.
    3. Dodać 199 μl 1x roztworu roboczego dsDNA do wszystkich probówek z wyjątkiem dwóch. Dodać 190 μl roztworu roboczego do dwóch ostatnich probówek.
    4. Dodać 10 μl dwóch wzorców (zawartych w tabeli materiałów) w celu rozdzielenia probówek do oznaczania.
    5. Dodać 1 μl każdej reakcji PCR do probówek z mieszankami głównymi fluorometru.
    6. Rurki wirowe mieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    7. Na ekranie głównym fluorometru wybierz przycisk z użyciem zestawu testowego (1x dsDNA), a następnie wybierz opcję Odczyt wzorców i Uruchom próbki.
    8. Włóż standardową rurkę 1, wybierz przycisk Odczyt, a następnie powtórz dla wzorca 2.
    9. Po wykonaniu kroku 5.2.6 powtórzyć czynności dla jednej próbki, wybrać próbkę o objętości 1 μl, a otrzymane stężenie zostanie dostarczone.
    10. Powtórzyć krok 5.2.7 dla pozostałych próbek.
  3. Obliczyć rzutowaną molowość wszystkich reakcji i zebrać równe stężenia reakcji z każdej pojedynczej próbki oddzielnie (jedna końcowa pula na próbkę), korzystając z poniższego równania.
    figure-protocol-1
    1. Powtórzyć kroki 5.2.1-5.2.7 w celu uzyskania końcowego stężenia w puli.
  4. Sprawdź pulę amplikonów na maszynie do elektroforezy kapilarnej/żelu agarozowym zgodnie ze specyfikacją producenta.
    1. Przygotować kapilarne probówki do elektroforezy na odpowiednią liczbę próbek. Dodać 7 μl buforu DNA zgodnie ze specyfikacją producenta.
    2. Dodać 4 μl puli amplikonów do probówki zawierającej bufor DNA.
    3. Umieść probówki na maszynie do elektroforezy i uruchom maszynę zgodnie ze specyfikacją producenta dla dsDNA.
    4. Zobacz zdjęcia żelu do elektroforezy, upewniając się, że pasma lokalizują się do ~5 kb (rozmiar amplikonów).
  5. Obliczyć rzutowaną molowość wszystkich reakcji i zebrać równe stężenia reakcji z każdej pojedynczej próbki oddzielnie (jedna końcowa pula na próbkę), korzystając z poniższego równania.
    figure-protocol-2

6. Przygotowanie biblioteki

  1. Rozcieńczyć pule próbek od kroku 5.3.1 do 0,2 ng/μl w celu przygotowania biblioteki.
    1. Korzystając z zestawu do przygotowywania bibliotek o niskim nakładzie pracy, zgodnego z krótkimi sekwencjami (300 bp), przygotuj biblioteki przy użyciu unikalnych kombinacji indeksów dla każdej puli próbek utworzonej w kroku 5.3, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wybrać sekwencje indeksów. Wszystkie indeksy zgodne z zestawem do przygotowania biblioteki będą działać dla próbek.
    2. Po przygotowaniu biblioteki należy zebrać wszystkie próbki zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Przed utworzeniem puli bibliotek oblicz liczbę odczytów niezbędną do 250-krotnego pokrycia sekwencji docelowej i upewnij się, że wybrana kaseta sekwencjonowania może zapewnić odpowiednie pokrycie dla każdej dołączonej próbki. W przypadku łącznej wielkości 0,5 MB będzie to równoznaczne z 1 milionem odczytów.
  2. Przygotuj pulę bibliotek do sekwencjonowania.
    1. Rozmrozić i przygotować 300-cyklowy wkład oraz odczynniki do sekwencjonowania.
    2. Denaturować i rozcieńczyć pulę sekwencjonowania utworzoną w kroku 5.1.1 zgodnie z instrukcjami producenta sekwencera.
    3. Dodaj zdenaturowaną i rozcieńczoną pulę biblioteczną do odczynników do sekwencjonowania i uruchom maszynę do sekwencjonowania zgodnie z zaleceniami producenta.
      UWAGA: Patrz załączona tabela 3, aby zapoznać się z rozwiązywaniem problemów.

7. Analiza danych

UWAGA: Wszystkie kroki związane z danymi są wykonywane w oprogramowaniu do analizy danych genomicznych. Nawiasy wskazują dane wejściowe użytkownika. Znak "większe niż" wskazuje kolejność kliknięć myszą dla danego kroku (np. 1. kliknięcie myszą >2. kliknięcie myszą)

  1. Zaimportuj odczyty, klikając Otwórz oprogramowanie > Importuj > Illumina > Wybierz Pliki > Dalej > Wybierz lokalizację do zapisania > zakończenia. Odczyty pojawią się teraz w oprogramowaniu.
  2. Przycinanie i filtrowanie odczytów.
    1. W oprogramowaniu do głębokiej analizy danych sekwencyjnych przytnij nieprzetworzone odczyty parametrów domyślnych.
    2. Zaznacz odczyty i kliknij Przybornik> Przygotuj dane sekwencjonowania > Przytnij odczyty > Następny > Następny > Następny > Następny > Zapisz > Następny > (Wybierz lokalizację do zapisania) > Zakończ
  3. Zamapuj przycięte odczyty na odwołanie.
    1. Przycięta mapa odczytuje sekwencję referencyjną używaną w kroku 4.1 przy użyciu wyniku dopasowania 2, kosztu niezgodności 3 i kosztu wstawiania/usuwania 2. Upewnij się, że ułamek długości jest większy niż 0,7, a ułamek podobieństwa jest równy lub większy niż 0,8.
    2. Podświetl przycięty odczytany plik i kliknij Przybornik > Analiza > Mapuj odczyty do odniesienia > Następny > (Wybierz sekwencję odniesienia) > Następny > (Upewnij się, że parametry są wskazane jak powyżej) > Następny > Zapisz > (Wybierz lokalizację do zapisania) > Zakończ.
  4. Warianty ekstraktów i indele.
    1. Używając odpowiedniego obiektu wywołującego indel, wyodrębnij indel, używając progu wartości p 0,005 lub niższego i maksymalnej liczby niezgodności 3.
    2. Podświetl zmapowany plik odczytu i kliknij Przybornik > Analiza ponownego sekwencjonowania > Wykrywanie wariantów > Warianty > Następne > (Upewnij się, że wymagane znaczenie jest wprowadzane > Następny > Zapisz > (Wybierz lokalizację do zapisania) > Zakończ.
    3. Korzystając z odpowiedniego wariantu wywołującego, wywołaj warianty z mapowania odczytu przy użyciu istotności 5%.
    4. Podświetl zmapowany plik odczytu i kliknij Przybornik > Analiza > Ponowne sekwencjonowanie Wykrywanie wariantów > Wykrywanie wariantów o niskiej częstotliwości > Następny > (Upewnij się, że wymagane znaczenie jest wprowadzane > Następny > Następny > Zapisz > (Wybierz lokalizację do zapisania) > Zakończ.
      UWAGA: Upewnij się, że uwzględniłeś ploidalność genomu gospodarza w wywołaniach indel i variant. Nie ekstrahować mutantów poniżej 5%. Próg ten uwzględnia błędy PCR i sekwencjonowania związane z testem. Normalizacja (w oparciu o wykrywanie CAS9 metodą immunoblot) powinna być przeprowadzona poprzez dostosowanie pokrycia sekwencjonowania. Na przykład, jeśli próbka A ma dwukrotnie większą skuteczność transfekcji niż próbka B, wówczas do analizy należy użyć 50% odczytów z próbki A. Należy to zrobić poprzez losowe pobieranie próbek i nie zmniejszać pokrycia dla żadnej próbki poniżej 100x.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono trzy reprezentatywne wyniki dla tego protokołu. Rysunek 1 to immunoblot potwierdzający ekspresję CAS9 w kontroli HFK (LXSN) i HFK wyrażającą beta-HPV 8E6 (8E6). 48 godzin po transfekcji pobrano lizaty całych komórek, a następnie zbadano je przeciwciałem anty-CAS9 (lub GAPDH jako kontrolą obciążenia). Wynik pokazuje, że HFK LXSN i HFK 8E6 wyrażają podobną ilość CAS9, co wskazuje, że wydajność transfekcji jest podobna między dwiema liniami komórkowymi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oprócz głębi dostarczanych informacji metoda ta ma kilka zalet. Po pierwsze, naprawa DSB, w teorii, może być oceniana w dowolnym loci genomowym bez modyfikowania genomu komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Po drugie, dostęp do analizy naprawy NGS jest zwiększony dzięki zmniejszonym kosztom i wysiłkowi obliczeniowemu wynikającemu z wykonania i analizy pojedynczego DSB ukierunkowanego na zdefiniowany obszar. Wreszcie, biorąc pod uwagę, że genomy dodatkowych organizmów stają się rutynowo dostępne, a liczne publikacj...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w tym manuskrypcie były wspierane przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW i RP); Narodowy Instytut Raka Narodowych Instytutów Zdrowia (NCI R15 CA242057 01A1); Centrum Badań nad Rakiem im. Johnsona na Uniwersytecie Stanowym Kansas; oraz Departament Obrony Stanów Zjednoczonych (CMDRP, PRCRP CA160224 (NAW)). Dziękujemy KSU-CVM Confocal Core i Joelowi Sannemanowi za naszą mikroskopię immunofluorescencyjną. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy tych agencji finansujących.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6-dołkowa płytka do hodowli tkanekCelltreat229106Płytka do hodowli komórkowych
Zestaw BCAVWR89167-794Zestaw do oznaczania BCA
Wirówka 5910 REppendorf2231000772Wirówka stołowa
CLC Genomic WorkbenchQiagen832001oprogramowanie do głębokiej analizy danych sekwencyjnych / indel caller / variant caller
Cyfrowa mikropłytka Genie pulseScientific industriesSI-400AWytrząsarka płytkowa
DYKDDDDK Etykietka Przeciwciało monoklonalne (FG4R)ThermoFisher ScientificMA191878Przeciwciało anty-FLAG
Zestaw Epilife CF ThermoFisherScientificMEPICF500Pożywki i suplementy komórkowe
Surowica bydlęca płodu (FBS)VWR89510-194Suplement do hodowli komórkowych
Kozia anty-królicza IgGThermoFisher ScientificA-11012Przeciwciało wtórne
HighPrep PCR Cleanup System MagBioAC-60005Zestaw do czyszczenia PCR na bazie koralików
Zestaw do PCR KAPA HiFi HotStart ReadyMix Zestaw PCRKAPA BiosystemsKK2600Test PCR mastermix/PCR
Zestaw DNA MagAttract HMWQiagen67563Zestaw do ekstrakcji DNA o wysokiej masie cząsteczkowej
Stojak magnetyczny-96Thermo Fisher Scientific AM1002796-dołkowy stojak magnetyczny
MiniAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA37834Termocykler
MiseqIlluminaSY-410-1003Sekwencer
Miseq v2 Zestaw odczynników do 300 cykliIlluminaMS-102-2002300-cyklowe odczynniki do kartridża/sekwencjonowania
Nextera XT Zestaw przygotowawczy do biblioteki DNAIlluminaFC-131-1024Zestaw do przygotowania biblioteki
Nextera XT Kit v2 Zestaw AIndeksyIllumina
20027215 Nunc 96-dołkowe polipropylenowe płytki DeepWell StroageThermo Fisher Scientific260251Deep Well 96-dołkowe płytki
penicyliny-streptomycyny (100X)Calsson LabsPSL02-6X100MLAntybiotyki do hodowli komórkowych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Bio BasicPD8117PBS
px330-CD4Addgen136938plazmidy SgRNA/CAS9 ukierunkowane na 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT
QIAxcel Zaawansowany systemQiagen9001941maszyna do elektroferii kapilarnej
Zestaw do badań przesiewowych DNA Qiagen929004Bufor DNA / kapilarne probówki do elektroferzy
Qubit 1x ds Zestaw do oznaczania HSThermoFisher ScientificQ23851Odczynniki fluorometryczne / 1x roztwór dsDNA
Fluorometr Qubit 4ThermoFisher ScientificQ33238
Probówki do oznaczania fluorometrów ThermoFisher ScientificQ32856Probówki do fluorometru
Bufor do lizy RIPAVWRVWRVN653-100MLBufor do lizy do ekstrakcji białek
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwieńfenolowaThermoFisher Scientific25300054Trypsin
Vortex-Genie 2Branże naukoweSI-0236Odczynnik
do transfekcji Vortex Xfect Odczynnik do transfekcjiTakara Bio 631318Oprogramowanie
analizy danych genomowychQIAGENCLC Workbench v21.0.Oprogramowanie do analizy danych
Roztwór do

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
  2. Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745(2011).
  3. Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
  4. vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
  5. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
  6. Daley, J. M., Sung, P. 53B. P. 1 BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
  7. Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
  8. Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (0), 194-205 (2015).
  9. Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
  10. Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
  11. Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
  12. Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
  13. Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
  14. Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653(2018).
  15. Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  16. Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327 (0), 48-60 (2012).
  17. Kuo, L. J., Yang, L. -X. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
  18. Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178(2020).
  19. Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
  20. Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687(2015).
  21. Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356(2020).
  22. Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275(2022).
  23. Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821(2019).
  24. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  25. Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
  26. Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Next Generation SequencingDouble Strand BreaksCas9 Induced MutationsCD4 PromoterDNA Repair MechanismsSingle Guide RNAGenomic InstabilityImmunofluorescence MicroscopyTransfection EfficiencyMutation Detection

Related Articles