Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae

Summary

Techniki mikroiniekcji są niezbędne do wprowadzenia egzogennych genów do genomów komarów. Protokół ten wyjaśnia metodę stosowaną przez laboratorium Jamesa do mikrowstrzykiwania konstruktów DNA do embrionów Anopheles gambiae w celu wygenerowania przekształconych komarów.

Abstract

Techniki mikroiniekcji zarodków są niezbędne dla wielu badań molekularnych i genetycznych gatunków owadów. Zapewniają one środki do wprowadzania egzogennych fragmentów DNA kodujących interesujące geny, a także korzystne cechy do linii zarodkowej owadów w stabilny i dziedziczny sposób. Powstałe w ten sposób szczepy transgeniczne mogą być badane pod kątem zmian fenotypowych wynikających z ekspresji zintegrowanego DNA, aby odpowiedzieć na podstawowe pytania lub wykorzystać w praktycznych zastosowaniach. Chociaż technologia jest prosta, wymaga od badacza cierpliwości i praktyki, aby osiągnąć poziom umiejętności, który maksymalizuje wydajność. Pokazana jest metoda mikroiniekcji zarodków afrykańskiego komara malarii, Anopheles gambiae. Celem jest dostarczenie egzogennego DNA do zarodka za pomocą mikroiniekcji, tak aby mogło ono zostać pobrane w rozwijających się komórkach linii rozrodczej (biegunowej). Ekspresja z wstrzykniętego DNA transpozaz, integraz, rekombinaz lub innych nukleaz (na przykład białek związanych z CRISPR, Cas) może wywołać zdarzenia, które prowadzą do jego kowalencyjnej insercji do chromosomów. Transgeniczne An. gambiae powstałe w wyniku tych technologii zostały wykorzystane do podstawowych badań składników układu odpornościowego, genów zaangażowanych w odżywianie krwi oraz elementów układu węchowego. Ponadto techniki te zostały wykorzystane do produkcji szczepów An. gambiae o cechach, które mogą pomóc w kontrolowaniu przenoszenia pasożytów malarii.

Introduction

Techniki mikroiniekcji były używane do eksperymentalnego manipulowania organizmami od początku XX wieku¹. Mikroiniekcja została wykorzystana do zbadania zarówno podstawowych funkcji biologicznych, jak i / lub wprowadzenia ważnych zmian w biologii pożądanego organizmu. Technika mikroiniekcji jest szczególnie interesująca dla biologów wektorowych i jest szeroko stosowana do manipulowania genomami wektorów^2-11. Eksperymenty transgenezy na wektorach stawonogów często mają na celu zmniejszenie wydajności wektorów w przenoszeniu patogenów poprzez wprowadzanie zmian, które zmniejszają przystosowanie wektora lub zwiększają ogniotrwałość przenoszonych patogenów. Komary przenoszą różne ludzkie patogeny i mają znaczący wpływ na zachorowalność i śmiertelność na całym świecie. Komary z rodzaju Anopheles przenoszą ludzkie patogeny pasożytnicze malarii, Plasmodium spp. Eksperymenty inżynierii genetycznej z udziałem Anopheles miały na celu lepsze zrozumienie biologii i zmniejszenie zdolności wektorowej tych komarów w celu opracowania nowych strategii eliminacji malarii.

Wektory komarów, które przyczyniają się do największej liczby infekcji malarią na świecie, znajdują się w kompleksie gatunków Anopheles gambiae. Jednak większość udanych eksperymentów z transgenezą przeprowadzono na nosicielu malarii z subkontynentu indyjskiego, Anopheles stephensi. Chociaż istnieje wiele zaadaptowanych laboratoryjnie szczepów Anopheles gambiae, liczba transgenicznych linii Anopheles gambiae spp. opisana w literaturze nie może się równać z liczbą Anopheles stephensi. Uważa się, że zarodek Anopheles gambiae jest trudniejszy do wstrzyknięcia i osiągnięcia udanej transgenezy niż Anopheles stephensi, chociaż przyczyny tych różnic są nieznane. Protokół ten opisuje metodę, która okazała się niezmiennie skuteczna w osiąganiu transgenezy zarodków Anopheles gambiae poprzez mikroiniekcję. Protokół opiera się na metodzie opracowanej wcześniej przez Hervé Bossina i Marka Benedicta¹² z kilkoma dodatkowymi szczegółami i dodanymi zmianami, które zostały uznane za zwiększające efektywność transgenezy.

Protocol

1. Przygotowanie komarów do mikroiniekcji

1. Zasiej klatkę < sup class="xref">13 (~5000 cm³) ~100 samcami i 200-300 samicami 1-2 dniowymi dorosłymi komarami po eklozji i pozwól im łączyć się w pary przez 2 dni.
2. Po okresie godowym należy dostarczyć komarom posiłek z krwi, używając 2 ml krwi za pomocą sztucznego urządzenia do karmienia lub żywych znieczulonych zwierząt, w zależności od praktyk owadobójczych¹⁴. Następnego dnia zapewnij komarom drugi posiłek z krwi, aby upewnić się, że wszystkie kryte samice miały możliwość żerowania i że częściowo odżywione komary stały się w pełni nabrzmiałe.
3. Wykorzystaj komary do pobrania zarodków 2-4 dni po drugim posiłku z krwi.
   UWAGA: Odżywianie larw jest ważne dla odporności dorosłych osobników i sprawności reprodukcyjnej. Zobacz Benedict et al. (2020), aby uzyskać informacje o tym, jak hodować zdrowe owady¹⁴. Nie zaobserwowano istotnych różnic w składaniu jaj, gdy komary są karmione sztucznym karmnikiem lub żywymi znieczulonymi zwierzętami. Użyj dowolnej metody, która jest rutynowo stosowana w przypadku Anopheles gambiae u owadów.

2. Przygotowanie zarodków

1. Użyj aspiratora, aby umieścić 20-30 samic w przezroczystej stożkowej rurce o pojemności 50 ml, która została przycięta (piłą taśmową) tak, aby była otwarta na obu końcach i pokryta lateksową folią dentystyczną na jednym końcu oraz nylonową siatką i bibułą filtracyjną na drugim (Rysunek 1).
   UWAGA: Komary złożą jaja na bibule filtracyjnej, a nylonowa siatka utrzyma bibułę filtracyjną bezpiecznie na miejscu. Jaja komarów mają kształt cylindryczny, ~500 μm długości, ~200 μm średnicy w najszerszym miejscu i zwężają się na przednim i tylnym końcu (Ryc. 2).
2. Umieść probówkę wypełnioną komarami na małej (60 mm x 15 mm) szalce Petriego wypełnionej wodą podwójnie destylowaną (ddH₂O). Umieść probówkę i naczynie w inkubatorze w temperaturze 28 °C na 45 minut (Rysunek 3).
3. Wyjąć probówkę z inkubatora i włożyć ją do pustej klatki. Delikatnie postukaj w rurkę, aby komary mogły wylecieć i wyjmij rurkę z klatki, gdy wszystkie komary wylecą.
4. Gdy rurka jest wolna od komarów, odkręć dolny pierścień, zdejmij nylon i za pomocą kleszczy ostrożnie wyjmij bibułę filtracyjną z jajami z probówki. Umieścić bibułę filtracyjną na plastikowej szalce Petriego (100 mm x 15 mm) zawierającej warstwę bibuły filtracyjnej zwilżonej_ddH2O.
5. Obserwuj jaja. Jaja, które zestarzały się do punktu, w którym mają jasnoszary kolor (Rysunek 4) są gotowe do wyrównania.
   1. Jeśli jaja są nadal białe, należy je umieścić z powrotem w inkubatorze i sprawdzać kolor co 5 minut. Białe jaja są kruche, łatwo pękają i nie przeżywają dobrze po procesie wstrzykiwania, co skutkuje niskim wylęgiem.
   2. Jaja, które są ciemnoszare lub czarne, za bardzo się zestarzały. Nie używaj ich.

3. Wyrównanie zarodka

1. Wytnij kawałek nylonowej membrany bibułkowej (2 cm x 1 cm) żyletką, upewniając się, że krawędź jest starannie przycięta.
   UWAGA: Jeśli krawędź nie jest prosta, jaja nie pozostaną prawidłowo przymocowane do błony podczas procesu wstrzykiwania.
2. Umieść membranę na szkiełku podstawowym i przykryj membranę kawałkiem bibuły filtracyjnej (2 cm x 2 cm), pozostawiając ~1 mm filtra membranowego odkrytego (Rysunek 5).
   UWAGA: Przed użyciem upewnij się, że szkiełka mikroskopowe są czyste i użyj czystych kleszczyków do manipulowania filtrem membranowym.
3. Zwilż bibułę filtracyjną dejonizowanym_H2O, ponieważ jaja umrą, jeśli będą suszone przez dłuższy czas.
   UWAGA: Nie nalewaj zbyt dużo wody na papier, ponieważ zarodki będą się poruszać podczas procesu wstrzykiwania, ale upewnij się, że jest wystarczająco dużo, aby zapobiec wysuszeniu zarodka (Rysunek 6A, B). Nadmiar wody można usunąć, wchłaniając go kawałkiem bibuły filtracyjnej.
4. Delikatnie przenieś 30-50 zarodków na krawędź błony za pomocą pędzla (rozmiar #0). Użyj szczoteczki, aby wyrównać jaja pionowo wzdłuż błony, delikatnie przetaczając je na szkiełku tak, aby strona brzuszna (wypukła) była skierowana do góry.
5. Ustaw wszystkie jaja w tym samym kierunku, tak aby podczas obserwacji jaj pod mikroskopem mikroiniekcyjnym, tylny koniec (bardziej spiczasty, Rysunek 6A, B) znajdował się w dolnej pozycji i tworzył kąt ~ 15 ° z igłą ( Rysunek 6C). Wyłóż całą krawędź błony jajami (30-50) i umieść szkiełko pod mikroskopem do wstrzykiwań.
   UWAGA: Jajka dobieraj ostrożnie. Odrzuć te, które są białe (zbyt młode lub nierozwinięte) lub ciemnoszare (zbyt stare i złamią igłę), a także nienormalne (Rysunek 7). Upewnij się, że bibuła filtracyjna pozostaje wilgotna przez cały czas.

4. Przygotowanie DNA

1. Oczyść plazmidowe DNA do wstrzyknięcia, co najmniej, za pomocą zestawu maxiprep plazmidu DNA wolnego od endotoksyn zgodnie z protokołami producenta.
2. Zawiesić DNA w wodzie o czystości PCR i odwirować przy 17 100 x g w wirówce z chłodzeniem przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Następnie przenieść supernatant do nowej, czystej probówki stożkowej o pojemności 1,5 ml. Ostrożnie pipetować mikropipetą, aby uniknąć przenoszenia niepożądanych cząstek stałych z kolumny.
3. Wykonaj drugie wytrącanie DNA, używając jednej dziesiątej objętości octanu sodu 3M i podwójnej objętości 100% etanolu.
4. Ponownie zawiesić DNA w 300-500 μl wody klasy PCR, aby uzyskać końcowe stężenie plazmidu 1000 ng / μL. Wymieszaj koktajl plazmidowy w buforze do wstrzykiwań dla końcowego stężenia plazmidu 300-400 ng / μL i przygotuj 10-20 μl podwielokrotności.
   UWAGA: DNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C. Podwielokrotności DNA do mikroiniekcji mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub w temperaturze -80 °C w przypadku stosowania składników RNA. Nie należy przekraczać 800 ng/μl DNA w mieszance iniekcyjnej, ponieważ lepkość spowoduje zatkanie igieł.

5. Przygotowanie igły

1. Wykonaj igły, ciągnąc 10 cm kapilary kwarcowe za pomocą programowalnego ściągacza do mikropipet.
2. Zbadaj igłę pod mikroskopem, aby upewnić się, że końcówka jest dobrze uformowana. Upewnij się, że ustawienie igły na programowalnym ściągaczu daje końcówkę, która zaczyna zwężać się ~0,5 mm od końca końcówki i kończy się drobnym punktem (patrz Rysunek 6). Igły, które łatwo się łamią, mają zwykle zbyt długi stożek.
   UWAGA: Warunki mogą się różnić w zależności od ściągacza igłowego (Autorzy udostępnią na żądanie ustawienia używanego przez nich ściągacza programowalnego. Restrykcje dotyczące czasopism uniemożliwiają nam cytowanie konkretnej marki). Igły można ciągnąć ręcznie, ale wymaga to zestawu umiejętności niedostępnych w większości laboratoriów.

6. Mikroiniekcja zarodka

1. Użyj końcówki do mikroładowarki, aby napełnić igły 2 μl mieszaniny DNA. Włóż igłę do uchwytu igły i podłącz rurkę automatycznej pompy ciśnieniowej (Rysunek 8).
2. Ważne: Ustaw igłę tak, aby tworzyła kąt 15° z płaszczyzną szkiełka (Rysunek 8).
3. Otworzyć końcówkę igły, ostrożnie dotykając pierwszego jaja i wstrzyknąć ją, wkładając końcówkę igły ≤ 10 μm w tylny biegun. Udane wstrzyknięcie doprowadzi do niewielkiego ruchu cytoplazmy w komórce jajowej.
4. Użyj elementów sterujących współosiowym stolikiem mikroskopu, aby przejść do następnego jaja i kontynuować wstrzykiwanie.
   1. Aby upewnić się, że końcówka igły pozostaje otwarta i nie jest zatkana, należy nacisnąć przycisk Wstrzyknięcie przed wejściem do innego zarodka i uwidocznić małą kropelkę przy otworze igły.
   2. Jeśli igła zostanie zatkana, naciśnij przycisk Wyczyść, aby wyczyścić igłę i powtórz test wizualizacji kropel. Dostosuj ciśnienie w razie potrzeby, jeśli otwór końcówki igły nieco się powiększy, aby upewnić się, że rozmiar kropli pozostaje mały.
   3. Wstrzyknij ~40-50 jaj za pomocą jednej igły.
      UWAGA: Upewnij się, że bibuła filtracyjna pozostaje wilgotna przez cały czas. Utrzymać wystarczający nacisk wsteczny na igłę, aby utrzymać ją w czystości. Igłę, której nie można odblokować, należy wymienić na nową. Umieszczanie zarodków, wprowadzanie igły i wstrzykiwanie są łatwiejsze dzięki mikroskopom, które mają współosiowe sterowanie poziomym ruchem etapu (Rysunek 9).
5. Po zakończeniu wstrzyknięć spłucz jaja do szklanego pojemnika wyłożonego bibułą filtracyjną i wypełnionego 50 ml dejonizowanego H₂O (Rysunek 10).
   UWAGA: Zarodki zaczynają się wykluwać 2 dni po wstrzyknięciu i mogą trwać nawet 3-5 dni. Wyklute larwy w pierwszym stadium rozwojowym należy natychmiast przenieść (sprawdzać 2 razy dziennie) do czystego pojemnika z wodą i pokarmem.

Results

Reprezentatywny przykład zastosowania opisanego protokołu mikroiniekcji można znaleźć w Carballar-Lejarazú et al⁵. Intencją było wprowadzenie autonomicznego systemu napędu genowego do linii zarodkowej laboratoryjnego szczepu G3 z An. gambiae. System został zaprojektowany tak, aby celować w główny locus ortologa (Agcd) na trzecim chromosomie u tego gatunku, który koduje peroksydazę hemową, która katalizuje konwersję 3-hydroksykinureniny do ksantommatyny, ostatni etap bios...

Discussion

Dzięki zwiększonej dostępności precyzyjnych i elastycznych technologii inżynierii genetycznej, takich jak CRISPR/Cas9, organizmy transgeniczne mogą być opracowywane w prostszy i bardziej stabilny sposób niż było to wcześniej możliwe. Narzędzia te pozwoliły naukowcom stworzyć transgeniczne szczepy wektorów komarów, które są bardzo bliskie osiągnięcia pożądanych właściwości odporności na patogeny (modyfikacja populacji) lub dziedzicznej bezpłodności (supresja populacji). Jednak, aby opracować możliwie najbezpieczniejsze i ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Bufor do mikroiniekcji	-		1 mM bufor NaHPO4, pH 6,8, 50 mM KCl Blotting
membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)	Bio-Rad		Starannie i prosto pokrojone na kawałek 2x1 cm
Probówki stożkowe 50 ml (jednorazowa probówka wirówkowa, polipropylen)	Marka Fisher		Końcówki cięte
Woda dejonizowana lub podwójnie destylowana (ddH20)	Mili-Q		W butelce do mycia
Mikroskop preparacyjny	Leica	Leica MZ12	Kleszcze do wyrównywania zarodków
			Nr 5 rozmiar
Szklany pojemnik	Pyrex	No. 3140	125 x 65
Zjeżdżalnia szklana	Fisher Brand	No. 12-549-3	75x26 mm
Inkubator	Barnsted Lab-line	Model nr 150	28 ° C
KCl			50 mM
Lateksowa folia dentystyczna	Crosstex International	No. 19302
Mikrowtryskiwacz	Sutter Instrument		XenoWorks Cyfrowy mikrowtryskiwacz
Końcówki do pipet z mikroładowarką	Eppendorf		20 &mikro; L mikroładowarka epT.I.P.S.
Mikromanipulator	Sutter Instrument XenoWorks		Mikropipeta mikromanipulatora
	Deszcz		20 &mikro; L
Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument	Sutter P-2000 ściągacz
Mikroskop	Leica	DM 1000 LED lub M165 FC	Do mikroiniekcji
Minimalna bibuła filtracyjna z włókna	Fisher Brand	No. 05-714-4	Bibuła chromatograficzna, gruba
Komary	MR4, BEI Resources		Anopheles gambiae, kryte dorosłe samice, karmione krwią 4-5 dni po eklozji
bufor NaHPO4			1 mM, ph 6,8
Siatka
Pędzel Blick		nr 05831-7040	Drobny, rozmiar 4/0
Szalka			Tworzywo sztuczne, (60x15 mm, 90x15 mm)
Octan
Kapilary ze szkła kwarcowego 3M	Nr instrumentu Sutter	QF100-70-10	Z żarnikiem, 1 mm OD,  ID 0,7 Klasa Water PCR o długości 10 cm
	Roche	nr 03315843001