Artykuł metodologiczny

Preparat błony plazmatycznej na małą skalę do analizy Candida albicans Cdr1-mGFPHis

DOI:

10.3791/62592

⸱

13 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia protokół izolacji błony plazmatycznej na małą skalę w celu scharakteryzowania białka Cdr1 Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), którego nadekspresja występuje w Saccharomyces cerevisiae. Podwójny znacznik c-końcowy mGFPHis z rozszczepialnym proteazą z łącznikiem 16 reszt między Cdr1 a znacznikiem został zaprojektowany w celu ułatwienia oczyszczania i przesiewania detergentem Cdr1.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udana biochemiczna i biofizyczna charakterystyka transporterów ABC zależy w dużej mierze od wyboru heterologicznego systemu ekspresji. W ciągu ostatnich dwóch dekad opracowaliśmy platformę ekspresji białek błonowych drożdży, która została wykorzystana do badania wielu ważnych białek błonowych grzybów. Gospodarz ekspresji Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ jest usunięty w siedmiu głównych endogennych transporterach ABC i zawiera czynnik transkrypcyjny Pdr1-3 z mutacją wzmacniającą funkcję, która umożliwia konstytutywną nadekspresję heterologicznych genów białek błonowych stabilnie zintegrowanych jako pojedyncze kopie w genomowym PDR5 Locus. Stworzenie wszechstronnych wektorów plazmidowych i optymalizacja jednoetapowych strategii klonowania umożliwia szybkie i dokładne klonowanie, mutagenezę i ekspresję heterologicznych transporterów ABC. W tym miejscu opisujemy rozwój i zastosowanie nowego podwójnego znacznika mGFPHis rozszczepialnego proteazą (tj. monomerycznego białka zielonej fluorescencji yEGFP3 wzmocnionego drożdżami połączonego ze znacznikiem oczyszczającym o powinowactwie do sześciu histydyn), który został zaprojektowany w celu uniknięcia możliwej interferencji znacznika z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania i zwiększenia skuteczności wiązania znacznika He z żywicami o powinowactwie do niklu. Fuzja mGFPHis z białkiem błonowym ORF (otwarta ramka odczytu) umożliwia łatwą ocenę ilościową białka poprzez kontrolę żeli poliakrylamidowych i wykrywanie produktów degradacji zachowujących znacznik mGFPHis. Pokazujemy, w jaki sposób ta funkcja ułatwia przesiewanie detergentów pod kątem rozpuszczalności białek błonowych. Przedstawiono protokół wydajnej, szybkiej i niezawodnej izolacji preparatów błony plazmatycznej na małą skalę znakowanego C-końcowo znakowanego wielolekowego transportera wypływu Candida albicans Cdr1 z nadekspresją w S. cerevisiae ADΔΔ. Ten protokół izolacji błon plazmatycznych na małą skalę pozwala na uzyskanie wysokiej jakości błon plazmatycznych w ciągu jednego dnia roboczego. Preparaty błony plazmatycznej można wykorzystać do określenia aktywności enzymatycznej wariantów Cdr1 i Cdr1.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstrakcja integralnych białek błonowych z ich rodzimego środowiska lipidowego może znacząco wpłynąć na ich strukturę i funkcję1,2,3,4. Złożony skład lipidowy błon biologicznych5 zapewnia, że mogą zachodzić krytycznie ważne interakcje białko-lipid6. Lipidy utrzymują integralność strukturalną białek błonowych, umożliwiając im w ten sposób prawidłowe funkcjonowanie w miejscu docelowym przedziału błonowego7,8. Dlatego krytycznym pierwszym krokiem w oczyszczaniu białka błonowego jest ekstrakcja białka z jego rodzimego środowiska bez wpływu na jego strukturę i/lub funkcję.

Istnieje wiele przeszkód w scharakteryzowaniu struktury białek błonowych, z których większość jest związana z ich hydrofobową naturą, oraz trudności w wyrażaniu prawidłowo pofałdowanych i funkcjonalnych białek błonowych w ilościach wymaganych do krystalografii rentgenowskiej lub mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM)9,10,11,12. Istnieją trzy typy systemów ekspresji białek błonowych: homologous9, heterologous13,14,15 oraz systemy ekspresji in vitro16,17. Często niskie poziomy ekspresji lub zaporowe koszty wielu systemów ekspresji pozostawiają tylko kilku gospodarzy jako preferowaną opcję do produkcji białek błonowych. Należą do nich gospodarz bakteryjny, Escherichia coli, drożdże S. cerevisiae i Pichia pastoris oraz wyższe eukarionty, takie jak komórki owadów Sf9 lub linie komórkowe ssaków18. Wszystkie technologie ekspresji białek błonowych mają zalety i wady; jednak S. cerevisiae jest prawdopodobnie najlepiej zbadanym eukariotycznym organizmem modelowym nadającym się do produkcji białek błonowych. Jest bardzo wszechstronny dzięki zastosowaniom w inżynierii genetycznej, odkrywaniu leków, biologii syntetycznej i ekspresji eukariotycznych białek błonowych14,19,20,21.

W tym badaniu opatentowana technologia ekspresji białek błonowych S. cerevisiae21, z S. cerevisiae ADΔ14 i ADΔΔ22 jako preferowanymi gospodarzami (Rysunek 1A), do nadekspresji i badania głównej wielolekowej pompy wypływowej Cdr1 albicans. Oba szczepy S. cerevisiae są pochodnymi AD1-8u- 23, które mają usunięte geny ura3 (ADΔ) lub oba geny ura3 (ADΔΔ) w celu wyeliminowania wszelkich fałszywie dodatnich transformantów prototrofów uracylu lub histydyny powstających w wyniku niepożądanej integracji w loci genomu URA3 lub HIS1. Usunięcie 7 głównych wielolekowych pomp wypływowych 23, wskazanych w Rysunek 1A, sprawia, że ADΔΔ jest wyjątkowo wrażliwy na większość ksenobiotyków. Zmutowany czynnik transkrypcyjny Pdr1-3 powoduje konstytutywną nadekspresję heterologicznych białek błonowych, takich jak Cdr1 (czerwone ośmiokąty w Figura 1A) po integracji heterologicznej kasety transformacyjnej zawierającej ORF ( Figura 1A) w genomowym locus PDR5 (niebieski prostokąt w Figura 1A) za pomocą dwóch homologicznych zdarzeń rekombinacji. Właściwa lokalizacja błony plazmatycznej C-końcowych białek znakowanych mGFPHis może być potwierdzona za pomocą mikroskopii konfokalnej (Figura 1A), a znacznik He może być używany do oczyszczania powinowactwa do niklu znakowanego białka. Klonowanie niektórych transporterów ABC grzybów (np. Candida krusei ABC1) do plazmidów pochodzących z pABC3 nie było jednak możliwe, ponieważ nie można było ich rozmnażać w Escherichia coli ze względu na toksyczność komórek. To skłoniło do opracowania jednoetapowego klonowania białek błonowych14,24 oznaczone na swoim N- lub C-końcu z różnymi znacznikami powinowactwa, epitopami lub reporterami bezpośrednio do S. cerevisiae ADΔΔ (Rysunek 1C). S. cerevisiae (S. cerevisiae) Szczepy ADΔΔ z nadekspresją różnych mutantów CDR1 mogą być również skutecznie tworzone w ten sposób, używając do pięciu pojedynczych fragmentów PCR, które nakładają się na siebie o 25 pz (Rysunek 1C). Korzystając z tego protokołu, wiele interesujących ORF-ów można sklonować, wyrazić i scharakteryzować przy niskich kosztach i wysokiej wydajności w bardzo krótkim czasie. Wydajność przemiany zmniejsza się tylko ~2-krotnie z każdym dodatkowym fragmentem PCR.

Jeśli jest to pożądane, poziomy wyrażeń mogą być również łatwo manipulowane przez projektowanie elementarza, aby przewidywalnie obniżyć poziomy wyrażeń do dowolnego miejsca między 0,1%-50% zwykle wysokich, konstytutywnych poziomów wyrażeń25. Zoptymalizowany, wielofunkcyjny wektor klonowania pochodnych pABC314, pABC3-XLmGFPHis26 (Rysunek 1B) zawiera miejsce cięcia proteazy HRV-3C (X; LEVLFQ|GP), proteaza, która działa lepiej w temperaturze 4 °C niż często stosowana proteaza wirusa wytrawiania tytoniu (TEV)27. L jest łącznikiem pięciu aminokwasów (GSGGS), mGFP jest monomerycznym mutantem (A206K)28,29 wersja wariantu białka zielonej fluorescencji wzmocnionego drożdżami yEGFP330, a His to łącznik trzech aminokwasów (GGS), po którym następuje znacznik oczyszczania białka o powinowactwie do niklu o sześcio-histydynowym (HHHHHH).

Ta technologia ekspresji została z powodzeniem wykorzystana w odkrywaniu leków i badaniu białek błonowych. Pierwsza struktura docelowego leku azolowego na grzyby, S. cerevisiae Erg1131, została rozwiązana przy użyciu tej technologii. Umożliwiło to również szczegółową charakterystykę Cdr132,33,34 oraz stworzenie cząsteczki Cdr1 z niedoborem cysteiny35 nadającej się do badań sieciowania cysteiny w celu weryfikacji wszelkich przyszłych struktur o wysokiej rozdzielczości. Wiele innych transporterów ABC głównych patogenów grzybowych u ludzi (tj. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei i kompleks gatunków Fusarium solani) również zostało szczegółowo przebadanych przy użyciu tego wyrażenia platforma24,36,37,38,39. Umożliwiło to wygenerowanie panelu pomp wypływowych szczepów S. cerevisiae z nadekspresją<, który został wykorzystany w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych w celu odkrycia nowego podłoża fluorescencyjnej pompy wypływowej Nile red40 i specific41 i sup class="xref">14,33,42,43,44inhibitory pompy wypływowej. Zastosowanie tego systemu umożliwiło również odkrycie clorgyliny jako pierwszego w swoim rodzaju wielolekowego inhibitora pompy wypływowej o szerokim spektrum działania42.

Całkowita solubilizacja białek błonowych i stworzenie jednorodnego preparatu białkowo-micelowego pozbawionego endogennych lipidów, wymaga wysokich stężeń detergentów45. Niestety, to również często dezaktywuje białko błonowe5,8,45,46. Na właściwości monomerów detergentowych i ich agregację w roztworze mają wpływ właściwości fizyczne ogona hydrofobowego, długość i rozgałęzienie łańcucha alkilowego, obecność jądra aromatycznego lub fluoroalkilowego łańcucha bocznego lub liczba jednostek polioksyetylenowych. Dlatego przesiewanie detergentów jest ważnym pierwszym krokiem do określenia najbardziej odpowiedniego detergentu do solubilizacji i oczyszczania białek membranowych.

C. albicans jest głównym ludzkim patogenem grzybiczym u osób z obniżoną odpornością, który może powodować poważne, zagrażające życiu infekcje inwazyjne47, i może stać się odporny na azolowe leki przeciwgrzybicze48,49. Jednym z głównych mechanizmów wielolekowości C. albicans jest nadekspresja Cdr150, który jest transporterem kasety wiążącej ATP (ABC) typu II51 podrodziny ABCG zlokalizowanej w błonie plazmatycznej. Pełnowymiarowe transportery ABCG grzybów (składające się z dwóch domen wiążących nukleotydy [NBD] i dwóch domen transbłonowych [TMD]) są bardziej znane jako transportery plejotropowej oporności na leki (PDR) i charakteryzują się unikalną topologią odwróconej domeny [NBD-TMD]2. Transportery PDR znajdują się tylko w plants52,53 i fungi54. Pomimo ich znaczenia, nie ma żadnych struktur dla transporterów PDR, chociaż ostatnio rozwiązano struktury dla ludzkich transporterów ABCG o połowie rozmiaru, co pomogło stworzyć pierwszy wstępny model dla Cdr133. Nasze ostatnie dowody eksperymentalne sugerują jednak, że ten model jest wadliwy, prawdopodobnie dlatego, że transportery PDR grzybów mają charakterystyczne asymetryczne NBD, co prawdopodobnie skutkuje unikalnym mechanizmem transportu. Struktura Cdr1 o wysokiej rozdzielczości jest zatem niezbędna zarówno do racjonalnego projektowania nowych inhibitorów pompy wypływowej, które mogą pomóc w przezwyciężeniu oporności na leki za pośrednictwem wypływu, jak i do zapewnienia wglądu w mechanizm działania tej ważnej rodziny transporterów ABC.

Celem tego badania było opracowanie wiarygodnych protokołów ekspresji, solubilizacji i oczyszczania Cdr1 w genetycznie zmodyfikowanym gospodarzu ekspresji S. cerevisiae, z ostatecznym celem uzyskania struktury o wysokiej rozdzielczości dla Cdr1. W ramach tego procesu zaprojektowano podwójny znacznik mGFPHis rozszczepialny proteazą (Figura 1B) z 16-resztkowym łącznikiem oddzielającym znacznik od C-końca Cdr1, co poprawiło wiązanie dołączonego 6-krotnego znacznika powinowactwa His z żywicą o powinowactwie do niklu i umożliwiło monitorowanie poziomów ekspresji Cdr1 w żywych komórkach i podczas całego procesu oczyszczania. Opracowano również powtarzalny protokół dla preparatów białek błony komórkowej drożdży zawierających około 10% Cdr1 (zgodnie z oszacowaniem za pomocą barwienia Coomassie po SDS-PAGE), który można wykorzystać do biochemicznej charakterystyki Cdr1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie świeżych lub mrożonych zapasów komórek ADΔ i ADΔΔ kompetentnych do transformacji

  1. Zaszczepić 25 ml 2x YPCD [tj. 2x YPD; 2% (w/v) ekstraktu drożdżowego, 2% (w/v) peptonu, 4% (w/v) dekstrozy), 0,079% (w/v) CSM (kompletna mieszanina suplementów)]35 pojedynczą kolonią drożdży i inkubować przez noc (o/n) przez 16 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem z prędkością 200 obrotów na minutę (rpm).
  2. Zaszczepić 225 ml pożywki 2x YPCD za pomocą 25 ml kultury o / n i sprawdzić gęstość optyczną komórki przy 600 nm (OD600); OD600 wynosi zwykle ~ 0,5-1,0,
    UWAGA: Na tym etapie upewnij się, że wszystkie materiały wymagane do następnego eksperymentu transformacji są łatwo dostępne.
  3. Hodować kulturę w temperaturze 30 °C przez kolejne ~6-8 godzin, wytrząsając z prędkością 200 obr./min, aż gęstość komórek osiągnie OD600 ~6-8,
    UWAGA: Poniższe czynności są wykonywane w temperaturze pokojowej (RT), chyba że zaznaczono inaczej.
  4. Zebrać te komórki o fazie logarytmicznej przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 3 minuty.
  5. Ponownie zawiesić komórki i umyć je dwukrotnie sterylną wodą podwójnie destylowaną (ddH2O; tj. 200 ml, a następnie 20 ml).
  6. Zbieraj komórki w temperaturze 3 000 x g przez 3 minuty.
  7. Powoli (tj. dodawać 30 równych porcji roztworu zamrożonych kompetentnych komórek (FCC) co minutę przez 30 minut) ponownie zawiesić osad komórkowy w X ml FCC [5% (w/v) glicerolu, 10% (v/v) dimetylosulfotlenku (DMSO)] na lodzie (gdzie X = OD600; np. jeśli OD600 = 6 ponownie zawiesić w 6 ml lub jeśli OD600 = 3 ponownie zawiesić w 3 ml).
    UWAGA: Prawidłowy skład FCC ma kluczowe znaczenie dla powodzenia transformacji.
  8. Przechowywać komórki na lodzie przez 2 godziny przed przekształceniem lub przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą potrzebne.
    UWAGA: Komórki ADΔ i ADΔΔ są bardzo wrażliwe na zamrażanie. W związku z tym komórki należy powoli schładzać do temperatury -80 °C: lodowate probówki do mikrowirówek zawierające 50-600 μl porcji komórek umieścić w plastikowym pojemniku do przechowywania (RT). Umieść pudełko w większym pojemniku styropianowym (RT) i zamknij pojemnik dopasowaną pokrywką z polistyrenu. Następnie włóż pojemnik do zamrażarki -80 °C.
    UWAGA: Powolne zamrażanie ma kluczowe znaczenie dla przeżycia komórek.

2. Transformacja ADΔ i ADΔΔ za pomocą CaCDR1-XLmGFPHis i potwierdzenie poprawności transformantów przez PCR kolonii i sekwencjonowanie DNA

UWAGA: Plazmid pABC3-CDR1-mGFPHis został stworzony przy użyciu konwencjonalnych strategii klonowania opisanych szczegółowo w Lamping et al., 201055 i jest zilustrowany w Rysunek 1B. C. albicans cr1 typu dzikiego wyizolowano jako fragment PacI/NotI z plazmidu pABC3-CaCDR1A-GFP14 i sklonowano do pABC3-XLmGFPHis26.

  1. PCR amplifikuje całą kasetę transformacyjną CDR1 za pomocą polimerazy DNA o wysokiej wierności i pary starterów PDR5-pro/PDR5-ter35 przy użyciu 1-10 ng pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis jako matrycy DNA lub, alternatywnie, trawi 2 μg pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis do zakończenia za pomocą enzymu restrykcyjnego 10 U AscI w temperaturze 37 °C (Rysunek 1A,B).
    UWAGA: Kaseta transformacji CDR1 (Rysunek 1A) składa się z promotora PDR5 - CaCDR1-mGFPHis - terminatora PGK1 - znacznika wyboru URA3 - regionu podrzędnego PDR5.
  2. Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym i wyekstrahuj żel z kasety transformacyjnej ~8 kb.
    UWAGA: Oczyszczanie żelem kasety transformacyjnej CaCDR1 ~8 kb usuwa wszelkie możliwe niestrawione DNA plazmidu, co może prowadzić do nieprawidłowych transformantów, które mają cały plazmid, a nie kasetę transformacji liniowej, zintegrowaną w genomowym locus PDR5.
  3. Denaturować wymaganą ilość DNA nośnika nasienia łososia (2 mg/ml; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7,5) przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej i przechowywać na lodzie. Do gotowania DNA plemników łososia używaj zakręcanych probówek, aby uniknąć otwarcia pokrywy.
  4. Zmieszaj 50 μl zdenaturowanego DNA plemników łososia z 14 μl kasety transformacyjnej (500-2 000 ng) i trzymaj 64 μl mieszaniny DNA na lodzie do dalszego użycia.
    UWAGA: Użyj 10 ng plazmidu wahadłowego drożdży E. coli (np. pYES2) jako kontroli pozytywnej transformacji (Rysunek 2B).
  5. Świeże lub zamrożone, szybko rozmrożone kompetentne komórki zawiesić na 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C i podzielić je na porcje o objętości 50 μl w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  6. Zbieraj komórki przez wirowanie przez 1 minutę w mikrofugach z maksymalną prędkością (18 000 x g).
  7. Usunąć supernatant i utrzymać osad komórkowy na poziomie suchej smości.
  8. Dla każdej przemiany zmieszać 296 μl kombinacji (RT) 260 μl 50% (w/v) glikolu polietylenowego (PEG 3350) i 36 μl 1 M octanu litu (LiAc), powtarzając pipetowanie, z odpowiednimi 64 μl lodowatych mieszanin DNA.
  9. Natychmiast dodać odpowiednią mieszaninę do 50 μl kompetentnej podwielokrotności komórek.
  10. Zawiesić osad komórkowy w 360 μl mieszaniny PEG-LiAc-DNA, dokładnie wirując przez około 30 s.
  11. Inkubować mieszaninę komórek w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C przez 1 h.
    UWAGA: Komórki ADΔ i ADΔΔ przekształcają się lepiej w temperaturze 30 °C niż w temperaturze 42 °C35.
  12. Zebrać komórki w temperaturze 18 000 x g przez 10 s. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 80 μl ddH2O.
  13. Rozłóż komórki na płytce agarowej CSM-URA35 [tj. 0,67% (w/v) drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 0,077% (w/v) CSM minus uracyl, 2% (w/v) glukozy i 2% (w/v) agar
    14. ].
  14. Inkubować płytki przez 2-3 dni w temperaturze 30 °C, aż do momentu, gdy transformanty prototrofów uracylu będą wyraźnie widoczne.
    UWAGA: Spodziewaj się ~100 transformantów na μg liniowej ~8 kb kasety transformacyjnej CaCDR1 i ~4 x 104 transformantów na μg pYES2.
  15. Wybierz pięć niezależnych transformantów i rozprowadź je na świeżej płytce CSM-URA, aby oddzielić transformanty prototrofów uracylu od resztek nieprzekształconych komórek gospodarza.
  16. Usuń wszelkie możliwe drobne mutanty, hodując transformanty na płytkach agarowych YPG [1% (w/v) ekstraktu drożdżowego, 2% (w/v) peptonu, 2% (v/v) glicerolu i 2% (w/v) agaru] (Rysunek 2D).
    UWAGA: Drobne mutanty mają wadliwe mitochondria i dlatego nie mogą rosnąć na niefermentujących źródłach węgla. Są one dość powszechne w S. cerevisiae56. S. cerevisiae (S. cerevisiae) ADΔ i ADΔΔ są szczególnie podatne na nabywanie drobnego fenotypu.
  17. Wykonaj PCR kolonii drożdży i potwierdź, że co najmniej trzy niezależne transformanty są prawidłowo zintegrowane z genomowym locus PDR5 (Rysunek 1C) poprzez amplifikację całej kasety transformacyjnej CaCDR1 ~ 8 kb specyficzną polimerazą DNA, która jest zoptymalizowana pod kątem amplifikacji produktów PCR z zanieczyszczonych źródeł matryc DNA. Użyj zestawu starterów, które wiążą się tuż poza miejscem integracji i 1 μl podwielokrotności zawiesin komórkowych (w ddH2O) pochodzących z pojedynczych kolonii jako matryc DNA.
    UWAGA: Ta konkretna polimeraza DNA niezawodnie amplifikuje ~ 8 kb fragmentów PCR z nienaruszonych komórek drożdży. Jednak dla niezawodnej amplifikacji wymagane jest 45 cykli PCR, a komórki drożdży muszą być ponownie zawieszone w OD600 1-10 w ddH2O.
  18. Potwierdź prawidłowy produkt do amplifikacji PCR ~8 kb za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym DNA 1 μL porcji reakcji PCR.
  19. Usunąć nadmiar starterów amplifikacyjnych z 10 μl porcji reakcji PCR za pomocą mieszaniny enzymatycznej jednoniciowego egzonukleazy DNA i fosfatazy zgodnie z instrukcjami producenta przed sekwencjonowaniem całego ORF przy użyciu części próbki DNA poddanej działaniu substancji z odpowiednimi starterami.

3. Protokół izolacji błony komórkowej drożdży na małą skalę

  1. Hodowla komórek drożdży
    1. Wstępną hodowlę pojedynczej kolonii drożdży w 10 ml YPD w temperaturze 30 °C przez ~ 7-8 godzin z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    2. Zaszczepić 40 ml pożywki YPD 10 ml kultury wstępnej i inkubować komórki w temperaturze 30 °C o/n (~16 h) z wytrząsaniem przy 200 obr./min, aż gęstość komórek osiągnie OD600 1-3.
  2. Zbieranie komórek drożdży
    1. Zebrać 40 jednostek OD (ODU; np. 1 ml przy OD600 1 = 1 ODU) komórek o fazie logarytmicznej w temperaturze 4 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Zawiesić i przemyć komórki dwukrotnie lodowatym sterylnym ddH2O (tj. 40 ml, a następnie 1 ml; zbierać komórki między etapami przez odwirowanie w temperaturze 4 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C).
    3. Zawiesić osad w 1 ml lodowato zimnego sterylnego ddH2O i przenieść zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej (na lodzie) probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    4. Zbierać komórki w temperaturze 3 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
    5. Odessać supernatant.
    6. Zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml buforu homogenizującego [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20% (v/v) glicerol; pH 7,5] świeżo uzupełnionym 1 mM fluorkiem fenylometylosulfonylu (PMSF).
      UWAGA: Zawsze dodawaj PMSF na świeżo, ponieważ PMSF szybko się dezaktywuje po wystawieniu na działanie wody.
      UWAGA: PMSF jest inhibitorem proteazy seryny, który jest niezwykle i destrukcyjny dla tkanek. Może to spowodować nieodwracalne uszkodzenie oczu.
    7. Zawiesinę komórkową należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast zużyć.
  3. Izolacja błon plazmatycznych
    1. W przypadku zamrożenia komórki rozmrażaj na lodzie przez ~1 godzinę.
    2. Dodaj lodowate kulki krzemionkowe o średnicy 0,5 mm do zawiesiny komórek o pojemności 0,5 ml, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml.
    3. Rozbij komórki za pomocą 6 cykli wirowania z maksymalną intensywnością wstrząsania przez 1 minutę przeplataną 3-minutowymi okresami chłodzenia na lodzie.
    4. Zrób cienki otwór na dnie rurki za pomocą rozgrzanego ostrza skalpela.
    5. Zbierz homogenat z rozbitych komórek przez dno probówki włożonej do innej lodowatej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z wirowaniem 10 s przy niskiej prędkości (~200 obr./min).
      UWAGA: Gwarantuje to, że kulki krzemionki pozostaną w oryginalnej tubie.
    6. Odwirować homogenat komórkowy w temperaturze 5,156 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek, nieuszkodzonych komórek i jąder.
    7. Przenieść 450 μl supernatantu do lodowatej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać dodatkowy 1 ml lodowatego HB uzupełnionego świeżym PMSF (1 mM).
      UWAGA: Ten etap rozcieńczania ma kluczowe znaczenie dla wysokiej jakości odzyskiwania białek błony plazmatycznej.
    8. Zebrać błony plazmatyczne w temperaturze 17 968 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad błony plazmatycznej, przez wielokrotne pipetowanie, w 100 μl HB świeżo uzupełnionego 1 mM PMSF. Aby zapewnić prawidłową homogenizację błony komórkowej, należy poluzować osad komórkowy, mieszając go końcówką do pipety o pojemności 100 μl, a następnie wypuścić 100 μl HB i pipetować w górę iw dół.
    9. Zmierzyć stężenie białka w preparacie błony plazmatycznej za pomocą zestawu do oznaczania białek, który jest kompatybilny z zawierającymi środek redukujący i detergent.
    10. Błony plazmatyczne należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub przechowywać na lodzie do natychmiastowego użycia.

4. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE)

  1. Zmontuj aparaturę do przygotowania żeli poliakrylamidowych.
  2. W przypadku dwóch żeli separujących (7% poliakrylamidu) wymieszaj 2,1 ml 40% akrylamidu/bis-akrylamidu, 3 ml 4x buforu rozdzielającego (1,5 M Tris, 0,4% dodecylosiarczanu sodu [SDS] (w/v); pH 8,8) i 6,9 ml ddH2O. Dodać 8 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i 60 μl 10% nadsiarczanu amonu (APS), aby zainicjować polimeryzację akrylamidu.
    UWAGA: Akrylamid/bis-akryloamid jest bardzo toksyczny. Powoduje podrażnienie skóry, neuropatię obwodową i jest rakotwórczy. TEMED jest szkodliwy w przypadku połknięcia lub wdychania. APS jest szkodliwy w przypadku połknięcia. Powoduje poważne podrażnienia oczu i skóry.
  3. Wlej ~4-5 ml tej mieszaniny do zmontowanego aparatu żelowego, do ~2 cm od góry.
  4. Ostrożnie ułóż ~ 1-2 ml 0,1% SDS na wierzchu, aby utworzyć płaski menisk.
  5. Pozostaw poliakrylamid do zastygnięcia na ~60 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Przygotuj mieszaninę żelu do układania w stos dla dwóch żeli, mieszając 0,5 ml 40% akrylamidu/bis-akrylamidu, 1 ml 4x buforu do układania w stos (0,5 M Tris, 0,4% SDS (w/v); pH 6,8) i 6,9 ml ddH2O. Dodaj 2 μl TEMED i 30 μl 10% APS, aby zainicjować polimeryzację akrylamidu.
  7. Usunąć warstwę 0,1% SDS ze spolimeryzowanego żelu separującego i spłukać ddH2O, aby usunąć ślady SDS.
  8. Wlej mieszankę żelu do układania w stos na żel separacyjny.
  9. Umieść grzebień w żelu do układania w stos i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z okolic grzebienia.
  10. Pozostaw żel do układania na ~60 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Zdejmij grzebień i spłucz szczeliny na żel wodą. Wlej żel do zbiornika żelu i napełnij zbiornik żelu do góry 1x buforem do biegania (24,8 mM Tris, 190 mM glicyny, 0,1% SDS).
    UWAGA: Przygotuj 1x bufor biegowy z 10x zapasu buforowego (248 mM Tris, 1,9 M glicyny, 1% SDS (w/v) w ddH2O) przechowywanego w RT.
  12. Wymieszaj 5-10 μl próbek błony plazmatycznej (tj. 10-20 μg białka) z równymi objętościami 2x barwnika ładującego białko [120 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20% glicerolu, 0,02% błękitu bromofenolowego, 4% SDS, 200 mM ditiotreitolu (DTT)] i natychmiast załaduj do poszczególnych szczelin żelowych zanurzonych w działającym buforze.
    UWAGA: Naziemna telewizja cyfrowa jest szkodliwa w przypadku połknięcia. Powoduje poważne podrażnienia oczu i skóry.
    UWAGA: Przygotuj 10 ml zapasu 2x barwnika ładującego białko, podwielokrotność i przechowuj w temperaturze -20 °C. Nie podgrzewaj zmieszanych próbek, ale natychmiast załaduj je do poszczególnych szczelin żelowych, aby znacznik GFP nie uległ denaturacji i można było wykryć sygnały fluorescencji w żelu.
  13. Załaduj markery masy cząsteczkowej białka (zakres 10-245 kDa) do osobnego gniazda, aby umożliwić oszacowanie wielkości poszczególnych fragmentów białka.
  14. Wykonaj elektroforezę żelową pod napięciem 200 V, aż niebieski barwnik dotrze do dna żelu (zwykle 45-55 min).
  15. Zbadaj żel pod kątem fluorescencji w żelu GFP za pomocą systemu obrazowania żelowego (długości fal wzbudzenia i emisji wynoszą odpowiednio 475-485 nm i 520 nm).
  16. Po obrazowaniu fluorescencyjnym w żelu utrwal białka poprzez delikatne mieszanie żelu w ~10-20 ml roztworu utrwalającego żel białkowy (40% etanolu, 10% kwasu octowego) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  17. Płukać żel dwukrotnie przez 10 minut 10 ml ddH2O i uwidocznić pasma białkowe, umieszczając żel w 10 ml koloidalnego roztworu barwienia Coomassie z delikatnym wstrząsaniem przez ~1 h w temperaturze pokojowej.
  18. Aby uzyskać lepszą wizualizację prążków białkowych, odbarwić żel raz lub dwa razy w ~20 ml ddH2O przez ~1 godzinę przed zarejestrowaniem obrazów za pomocą systemu obrazowania żelu.

5. Określanie aktywności ATPazy Cdr1 57

  1. Rozcieńczyć próbki błony plazmatycznej >2,2 mg/ml do 1-2 mg/ml w HB.
  2. Zrównoważyć koktajl testowy ATPazy (75 mM MES-Tris, 75 mM azotanu potasu, 0,3 mM molibdenianu amonu, 7,5 mM azydku sodu; pH 7,5) i Mg-ATP (28,8 mM ATP sól disodowa ATP, 28,8 mM MgCl2; pH 7,0) do 30 °C w inkubatorze w temperaturze 30 °C.
    UWAGA: Azydek sodu jest wysoce toksyczny.
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie zapasy buforowe i butelki są wolne od fosforanów; tj. umyć naczynia szklane 1% (obj./obj.) HCl i kilkakrotnie spłukać je ddH2O. Trzymaj go również oddzielnie od innych wyrobów szklanych, które prawdopodobnie zawierają śladowe ilości fosforanów powszechnie obecnych w detergentach używanych do mycia naczyń szklanych.
  3. Dodać 90 μl koktajlu testowego z inhibitorem Cdr1-ATPazy lub bez niego (20 μM oligomycyny) do pojedynczych dołków 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej.
    UWAGA: Test przeprowadza się w trzech egzemplarzach.
  4. Dodać 5 μl izolowanych błon plazmatycznych (~5-10 μg białka) lub wzorców fosforanowych (0-100 nmoli Pi) do odpowiednich studzienek płytki mikromiareczkowej.
    UWAGA: Zachowaj pierwszą i ostatnią kolumnę dla dwóch oddzielnych zestawów wzorców fosforanowych.
  5. Rozpocząć test od dodania 25 μl wstępnie podgrzanego 28,8 mM Mg-ATP (6 mM stężenie końcowe) za pomocą wielokanałowej pipety do poszczególnych studzienek i inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 min.
  6. Zatrzymaj reakcję, dodając 130 μl odczynnika do wywoływania (1,6% L-askorbinianu sodu, 1% SDS, 12% molibdenianu amonu w 6 M kwasie siarkowym).
    UWAGA: Stężony kwas siarkowy gwałtownie reaguje z wodą. Jest i może powodować uszkodzenie skóry i płuc.
  7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  8. Odczytać absorbancję dołków płytki do mikromiareczkowania przy długości fali 750 nm za pomocą czytnika płytek do mikromiareczkowania.
    UWAGA: Przestrzeganie 10-minutowego czasu inkubacji w celu rozwoju niebieskiego barwnika (tj. zredukowanego kompleksu fosforowo-molibdenowego) ma kluczowe znaczenie dla dokładności testu, ponieważ rozwój niebieskiego barwnika trwa w czasie.
  9. Uzyskaj aktywność ATPazy specyficzną dla Cdr1 (tj. aktywność ATPazy wrażliwej na oligomycynę), odejmując aktywność ATPazy w obecności oligomycyny od całkowitej aktywności ATPazy przy braku oligomycyny.

6. Ekran detergentu na małą skalę

  1. Połączyć preparaty błony plazmatycznej (tj. 2,5 mg białka błony plazmatycznej) komórek z nadekspresją Cdr1-mGFPHis z buforem GTED-20 [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20 % (w/v) glicerolu; pH 7,5; świeżo uzupełnione 1 mM PMSF] zawierającym 5 mg badanego detergentu, aby osiągnąć całkowitą objętość 0,5 ml uzupełnionego 1% (w/v) detergentu.
  2. Obracać mieszaninę w temperaturze 4-8 °C przez 2 godziny za pomocą urządzenia obrotowego.
  3. Odwirować mieszaninę w temperaturze 141 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
  4. Przenieść supernatant zawierający rozpuszczony materiał do świeżej probówki do mikrowirówki.
  5. Dodać 0,5 ml buforu GTED-20 uzupełnionego 2% (w/v) SDS do nierozpuszczalnej frakcji osadów i inkubować w temperaturze 30 °C o/n w inkubatorze wstrząsającym w celu ekstrakcji wszystkich nierozpuszczalnych w detergentach białek błonowych.
  6. Analizuj i porównuj supernatant i rozpuszczone frakcje osadów za pomocą SDS-PAGE.
  7. Sfotografuj żele zawierające białka znakowane GFP do fluorescencji GFP w żelu przed barwieniem Coomassie i określ ilościowo poziomy ekspresji za pomocą systemu obrazowania.
  8. Użyj rozpuszczalnej frakcji białka błonowego do dalszych zastosowań, takich jak chromatografia wykluczania wielkości fluorescencji (FSEC)58, aby zidentyfikować odpowiedni detergent(y).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysoka częstotliwość transformacji S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformanty/μg) została osiągnięta przy pYES2 (Rysunek 2B). Zgodnie z oczekiwaniami, kontrola bez DNA (tj. tylko ddH2O) nie dała żadnych transformantów, a 1 μg liniowej kasety transformacyjnej CDR1-mGFPHis (Rysunek 1A) dała ~ 50 transformantów (Rysunek 2C) ze zoptymalizowanym protokołem transformacji ADΔΔ. Transformanty CDR1-mGFPHis zostały...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo ostatnich postępów w analizie strukturalnej białek błonowych, obecnie nie jest dostępna żadna struktura 3D dla Cdr1 ani żadnego innego transportera PDR. Tak więc zdobycie wiedzy na temat struktury Cdr1 i jej cech biochemicznych jest ważne, ponieważ nie tylko zapewni wgląd w racjonalne projektowanie nowych leków w celu przezwyciężenia oporności na leki za pośrednictwem wypływu, ale także w mechanizm działania ważnej podrodziny białek ABC.

Jednym z głównych wymagań dotyczących charakterys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za finansowanie z Nowozelandzkiego Funduszu Marsdena (Grant UOO1305), oraz grant blokowy z Wydziału Medycyny Uniwersytetu Chulalongkorn, Bangkok, Tajlandia (M. Niimi). Pragną podziękować Uniwersytetowi Otago za zapewnienie G. Madani stypendium doktoranckiego. Autorzy pragną również wyrazić wdzięczność profesorowi Stefanowi Raunserowi i jego współpracownikom, dr Amirowi Apelbaumowi i dr Deivanayagabarathy Vinayagam, za ich wsparcie i nadzór podczas 6-miesięcznej wizyty G. Madani w Instytucie Fizjologii Molekularnej im. Maxa Plancka (MPIMP) w Dortmundzie w Niemczech. Autorzy dziękują również Niemieckiemu Centrali Wymiany Akademickiej (DAAD) za udzielenie G. Madani grantu badawczego (57381332) na wizytę w MPIMP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas 2-(N-Morfolino)etano-sulfonowy (MES)Sigma-AldrichM3671
2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol (zasada Tris; ultra-czysta)Merck77-86-1
2,2-didecylopropano-1,3-bis-β-D-maltopyranozydAnatraceNG310SLMNG
2,2-diheksylopropano-1,3-bis-β-D-glukopiranozydAnatraceNG311SOGNG (MNG-OG)
2,2-dioktylopropano-1,3-bis-β-D-maltopyranozydAnatraceNG322SDMNG
4-Trans-(4-trans-propylocykloheksyl)-cykloheksyl &alfa;-D-maltopyranozydGlycon Biochemicals GmbHD99019-CPCC-α-M
40% Akrylamid/Bis-akryloamid (37,5:1)Bio-Rad1610148
Kwas octowy (lodowaty)Merck64-19-7
AgarFormedium  009002-18-0
Molibdenian amonuSigma-Aldrich13106-76-8
Nadsiarczan amonu (APS)Bio-Rad1610700
ATP sól disodowasigma-AldrichA-6419
Błękit bromofenolowySERVA Electrophoresis GmbH34725-61-6
CHAPSAnatraceC316S
CHAPSOAnatraceC317S
CSMFormediumDCS0019
CSM minus uracylFormediumDCS0161
Cykloheksylo-1-butylo-β-D-maltopyranozydAnatraceC324SCYMAL-4
Cykloheksylo-1-heptyl-β-D-maltopyranozydAnatraceC327SCYMAL-7
Cykloheksylo-metylo-β- D-maltopiranozydAnatraceC321SCYMAL-1
DigitoninaSigma-Aldrich11024-24-1
Ditiothreitol (DTT)Roche Diagnostics10197785103
DMSOMerck67-68-5
EtanolMerck459836
Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA; Titriplex III)Merck6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Odczynnik do czyszczenia produktuZastosowane Biosystems78205Mieszanina egzonukleazy i fosfatazy
GlukozaFormedium50-99-7
GlicerolMerck56-81-5
GlicynaMerckG8898
HEPESFormedium7365-45-9
Kwas solnyMerck1003172510
KOD Fx NeoTOYOBO CoKFX-201Służy do niezawodnego
octanu litu (LiAc)Sigma-Aldrich546-89-4
Chlorek magnezu sześciowodnysigma-AldrichM2393
MESFormedium145224-94-8
n-dekanoilo-N-hydroksyetylo-glukamidAnatraceH110SHEGA-10
n-dekanoilo-N-metylo-glukamidAnatraceM320SMEGA-10
n-decylo-fosfocholinaAnatraceF304SFos-cholina-10
n-decylo-β-D-maltopyranozydAnatraceD322SDM
n-dodecylo-N,N-dimetylo-3-amonio-1-propanosulfonianAnatraceAZ312SAnzergent 3-12
n-dodecyl-N,N-dimetyloamino-tlenekAnatraceD360SLDAO
n-dodecyl-&alfa;-D-maltopiranozydAnatraceD310HAα-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranozydAnatraceD310Sβ-DDM
n-nonyl-β-D-glukopiranozydAnatraceN324SNG
n-nonylo-β-D-maltopyranozydAnatraceN330SNM
n-oktadecylo-N,N-dimetylo-3-amonio-1-propanosulfonianAnatraceAZ318SAnzergent 3-18
n-oktylo-N,N-dimetylo-3-amonio-1-propanosulfonianAnatraceAZ308SAnzergent 3-8
n-oktylo-fosfocholinaAnatraceF300SFos-cholina-8
n-oktylo-β-D-glukopiranozydAnatraceO311SOG
n-tetradecylo-fosfocholinaAnatraceF312SFos-cholina-14
n-tetradecylo-β-D-maltopiranozydAnatraceT315STDM
n-tridecylo-fosfocholinaAnatraceF310SFos-cholina-13
n-tridecyl-β- D-maltopyranozydAnatraceT323S-n-undecyl
-β-D-maltopyranozydAnatraceU300SUM (UDM)
N,N,N',N'-tetrametylo-etylenodiamina (TEMED)Sigma-AldrichT9281
OktylofenoksypolietylenSigma-Aldrich9002-93-1TRITON X-100
OligomycynaSigma-Aldrich75351
PeptoneFormedium3049-73-7
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Roche Diagnostics329-98-6
Phusion  Hot Start Flex DNA PolymerazaNew England BiolabsM0535Spolimerazy DNA o wysokiej wierności
(PEG 3350)Sigma-Aldrich25322-68-3
Sigma-Aldrich9005-65-6TWEEN 80
Azotan potasuSigma-AldrichP8394
Zestaw do oznaczania białekBio-Rad5000122Zestaw do oznaczania białek RC DC II
QC Koloidalny barwnik CoomassieBio-Rad1610803
Prism Ultra Drabinka białkowa (10-245 kDa)AbcamAB116028
Azydek soduSigma-Aldrich71289
Dodecylosiarczan soduSigma-Aldrich151-21-3SDS
L-askorbinian sodu BioXtraSigma-Aldrich11140
Monododekanian sacharozyAnatraceS350SDDS
Kwas siarkowySigma-Aldrich339741
Ekstrakt drożdżowyFormedium008013-01-2
Drożdżowa zasada azotowa bez aminokwasówFormediumCYN0402
  Sprzęt (typ)
Wirówka  (Eppendorf 5804)Wirówka Eppendorf
(Beckman Ultra)Beckman
(Sorvall RC6)Aparatura Sorvall
FSEC (system do chromatografii średniociśnieniowej NGC wyposażony w detektor fluorescencji, autosampler, frakcjonator)Obrazowanie żelowe Bio-Rad
(GelDoc EZ Imager)Bio-Rad
Czytnik mikropłytek (Synergy 2 Multi-Detection)BioTek Instruments
(C1000 Touch)Zasilacz Bio-Rad
(PowerPac)Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)Bio-Rad
(Multitron)Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life SciencesGE17-5172-01
Spektrofotometr UV/Visible (Ultraspec 6300 pro)Amersham BioSciences UK Ltd
do PCR (LiAc) Glikol polietylenowy Monooleinian polioksyetylenoesorbitanu Wirówka Termocykler PCR Inkubator z wytrząsaniem

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86(2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , Cambridge University Press. Ch. 4 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins--a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , 8728797 NZ 513755, AU 2002330796, US 8728797 patent NZ 513755, AU 2002330796 (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genetics. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5' proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74(2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436(2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, Pt 8 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, Pt 2 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146(2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231(2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D. Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. Prasad, R. , Chapter 18 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153(2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23(2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191(2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspresja bia ek b onowychSaccharomyces cerevisiaetransportery ABCznacznik mGFPHisscreening detergent wchromatografia wykluczania cz steczkowegoelektroforeza w elusolubilizacja bia ek

Powiązane artykuły