Przygotowanie próbki do bioinformatycznej analizy metylacji DNA: strategia asocjacyjna dla otyłości i powiązane badania cech

Podsumowanie

Niniejsze badanie opisuje proces zarządzania danymi metylacji DNA uzyskanymi za pomocą technologii mikromacierzy. Protokół przedstawia kroki od przygotowania próbki do analizy danych. Wszystkie procedury są szczegółowo opisane, a film pokazuje istotne kroki.

Streszczenie

Otyłość jest bezpośrednio związana ze stylem życia i została związana ze zmianami metylacji DNA, które mogą powodować zmiany w procesie adipogenezy i magazynowania lipidów, przyczyniając się do rozwoju choroby. Pokazujemy kompletny protokół od selekcji do analizy danych epigenetycznych pacjentów z otyłością i bez otyłości. Wszystkie kroki protokołu zostały przetestowane i zatwierdzone w badaniu pilotażowym. W badaniu wzięły udział 32 kobiety, w którym 15 osób sklasyfikowano z otyłością według wskaźnika masy ciała (BMI) (45,1 ± 5,4 kg/^m2); a 17 osób sklasyfikowano bez otyłości według BMI (22,6 ± 1,8 kg/^m2). W grupie z otyłością za pomocą analizy regresji liniowej zidentyfikowano 564 miejsca CpG związane z masą tłuszczową. Zakłady CpG znajdowały się w regionach promotorów. Analiza różnicowa wykazała 470 miejsc hipometylowanych i 94 hipermetylowanych CpG u osób z otyłością. Najbardziej hipometylowane, wzbogacone szlaki znajdowały się w RUNX, sygnalizacji WNT i odpowiedzi na niedotlenienie. Szlaki hipermetylacji były związane z wydzielaniem insuliny, sygnalizacją glukagonu i Ca²⁺. Dochodzimy do wniosku, że protokół skutecznie zidentyfikował wzorce metylacji DNA i metylację DNA związaną z cechą. Wzorce te mogą być związane ze zmienioną ekspresją genów, wpływającą na adipogenezę i magazynowanie lipidów. Nasze wyniki potwierdziły, że otyły styl życia może sprzyjać zmianom epigenetycznym w ludzkim DNA.

Wprowadzenie

Technologie omiczne na dużą skalę są coraz częściej wykorzystywane w badaniach nad chorobami przewlekłymi. Ciekawą cechą tych metod jest dostępność dużej ilości generowanych danych dla społeczności naukowej. W związku z tym pojawiło się zapotrzebowanie na standaryzację protokołów, aby umożliwić techniczne porównanie między badaniami. Niniejsze badanie sugeruje standaryzację protokołu uzyskiwania i analizowania danych dotyczących metylacji DNA, wykorzystując badanie pilotażowe jako przykład.

Negatywny wydatek energetyczny dominuje we współczesnym stylu życia człowieka, prowadząc do nadmiernego gromadzenia tkanki tłuszczowej i w konsekwencji do rozwoju otyłości¹. Wiele czynników zwiększyło wskaźniki otyłości, takich jak siedzący tryb życia, wysokokaloryczne diety i stresujące rutyny. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) oszacowała, że w 2016 roku 1,9 miliarda dorosłych było otyłych, co oznacza, że ponad 20% światowej populacji ma ponad 30 kg/^m2 BMI². Najnowsza aktualizacja z 2018 r. ujawniła, że rozpowszechnienie otyłości w Stanach Zjednoczonych Ameryki (USA) było wyższe niż 42%³.

Epigenetyka to strukturalna adaptacja regionów chromosomowych do rejestrowania, sygnalizowania lub utrwalania zmienionych stanów aktywności⁴. Metylacja DNA jest odwracalną zmianą chemiczną w miejscach dinukleotydów cytozyny-guanozyny (miejsca CpG), tworząc 5-metylocytozynę-pG (5mCpG). Może modulować ekspresję genów poprzez regulację dostępu maszynerii transkrypcyjnej do DNA^5,6,7,8. W tym kontekście ważne jest, aby zrozumieć, które strony CpG są powiązane z cechami związanymi z otyłością⁹. Wiele czynników może wspierać lub zapobiegać metylacji DNA specyficznej dla danego miejsca. Enzymy niezbędne do tego procesu, takie jak metylotransferazy DNA¹⁰ (DNTM) i translokacje ten-eleven (TE), mogą promować metylację lub demetylację DNA w warunkach środowiskowych¹¹.

Biorąc pod uwagę rosnące zainteresowanie badaniami metylacji DNA w ostatnich latach, wybór najodpowiedniejszej strategii analizy, aby precyzyjnie odpowiedzieć na każde pytanie, był głównym zmartwieniem badaczy^12,13,14. Macierz metylacji DNA 450K jest najpopularniejszą metodą, stosowaną w ponad 360 publikacjach¹⁴ do określania profilu metylacji DNA. Może określić metylację do 485 000 CpG zlokalizowanych w 99% znanych genów¹⁵. Jednak ta tablica została wycofana i zastąpiona przez EPIC, obejmującą 850 000 witryn CpG. Obecny protokół może być stosowany zarówno dla 450K, jak i EPIC^16,17,18.

Protokół jest przedstawiony krok po kroku w Rysunek 1 i składa się z następujących kroków: selekcja populacji, pobieranie próbek, przygotowanie eksperymentu, rurociąg metylacji DNA i analiza bioinformatyczna. Badanie pilotażowe przeprowadzone w naszym laboratorium zostało zademonstrowane w celu zilustrowania etapów proponowanego protokołu.

Rysunek 1: Schemat prezentowanego protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

Komisja bioetyki Szpitala Uniwersyteckiego Uniwersytetu w São Paulo (HCRP-USP) zatwierdziła badanie (CAAE:14275319.7.0000.5440). Uczestnicy podpisali formularz zgody, a wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską.

1. Populacja i pobieranie próbek

1. Do badania należy zrekrutować uczestników z BMI >30 kg/^m2. Do niniejszego badania zrekrutowano 32 kobiety z populacji domieszek¹⁹ w wieku od 18 do 60 lat.
   UWAGA: W HCP-USP wyższe wskaźniki otyłości zaobserwowano głównie u kobiet²⁰. Uczestnicy z otyłością, z BMI ≥30 kg/^m2 (n = 15), zostali zrekrutowani z poradni chorób metabolicznych w HCRP-USP. Uczestnicy bez otyłości, z BMI między 18,5 kg/^m2 a 24,9 kg/^m2 (n = 17), zostali zrekrutowani z innych klinik i nie mieli poważnych chorób; Dane kliniczne przedstawiono w Tabeli 1.
2. Wyklucz kobiety w ciąży, matki karmiące, palacze i spożywające alkohol.

2. Antropometria i skład ciała

1. Zmierz wagę uczestników za pomocą cyfrowej wagi antropometrycznej o wadze 200 kg. Upewnij się, że zdjąłeś buty i nadmiar odzieży.
2. Oceń wysokość za pomocą stadiometru z podziałką 0,5 cm. Uczestnicy zostali poinstruowani, aby stać boso, stopy razem, z rękami po bokach²¹.
3. Zbierz informacje o masie tłuszczowej (FM) za pomocą bioimpedancji elektrycznej. Po 12 godzinach postu oceń pusty pęcherz moczowy. Ułóż uczestników w pozycji leżącej, z rozstawionymi nogami i rękami równolegle, nie dotykając ciała. Poinstruuj uczestników, aby usunęli wszystkie metalowe akcesoria²².
4. Obwód w pasie (WC) obliczyć za pomocą nierozciągliwej miarki mierniczej z podziałką 0,1 mm. Taśma została umieszczona poziomo wokół środkowej talii, tuż nad kośćmi biodrowymi. Pomiar nastąpił tuż po wydechu. Według Centers for Diseases Control and Prevention (CDC) granica WC dla kobiet wynosi 88 cm²³.

Tabela 1: Charakterystyka populacji. Wszystkie zmienne były parametryczne (p > 0,05, Shapiro Wilk), a różnice oceniano za pomocą niezależnego testu t, w którym p < 0,05 uznano za istotne. *p < 0,0001. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. Zbiór materiału biologicznego

1. Krew obwodową należy pobrać po 12 godzinach postu, zgodnie z wcześniejszym opisem²⁴.
2. Zebrać 4 ml próbek krwi pełnej w probówkach z antykoagulantem (np. EDTA) i przechowywać je na lodzie do transportu.

4. Ekstrakcja DNA

1. Odwirować każdą probówkę zawierającą krew o stężeniu 2 000 x g przez 10 minut. Zebrać około 300 μl kożucha (biała interfaza).
2. Ekstrahować DNA z krwi obwodowej za pomocą dostępnego na rynku instrumentu (patrz Tabela Materiałów), jak opisano wcześniej²⁵. Eluować DNA w 480 μl ultraczystego_H2O.
3. Oceń stężenie i jakość DNA za pomocą fluorometru. Integralność oceniono za pomocą 1% analizy w żelu agarozowym²⁵. Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.

5. Przygotowanie przed analizą metylacji

1. Upewnij się, że próbki mają minimalne stężenie DNA (500 ng jest idealnym początkowym wejściem do rozpoczęcia), ale rozcieńczenie może się różnić w zależności od próbki na tym etapie.
2. Niektóre odczynniki nie są zawarte w zestawie do mikromacierzy²⁶, więc kup je osobno²⁷.
3. Sprawdź, czy w zestawie znajdują się wszystkie odczynniki użyte podczas zabiegu, są one niezastąpione. Sprawdź datę ważności wszystkich odczynników. Upewnij się, że dostępne są również inne odczynniki i roztwory, które nie są dostarczone w zestawie (95% formamidu/1 mM EDTA, 0,1 N NaOH, etanol absolutny, 2-propanol).
   UWAGA: Formamid jest odczynnikiem lotnym; Jakość wyników można poprawić, jeśli produkt jest świeży. Integralność i jakość formamidu i absolutnego etanolu są uważane za krytyczne, ponieważ mogą wpływać na proces barwienia proponowany przez producenta. Wybrane alkohole muszą być ultraczystymi produktami specyficznymi dla analizy biologii molekularnej.
4. Po nabyciu zestawu mikromacierzy pobierz mapy dekodowania chipów (DMAP). Pliki te są dostępne na stronie producenta 24-48 godzin po wysłaniu zestawu i są wyłączone w dniu wygaśnięcia²⁸. Aby pobrać wymienione pliki, wykonaj poniższe czynności.
   1. Upewnij się, że dostępny jest komputer z dostępem do Internetu. Wykonaj pobieranie za pomocą klienta pliku dekodowania oprogramowania.
   2. Przed zainstalowaniem programu upewnij się, że komputer ma dostęp wychodzący i przychodzący przyznany przez instytucję; klient Decode File nie ma ograniczeń bezpieczeństwa.
   3. Zaloguj się do oprogramowania Decode File Client za pomocą opcji Access by BeadChip. Logowanie odbywa się przy użyciu identyfikatora użytkownika i hasła MyIllumina. Rejestracja na tej stronie jest wymagana²⁸.
   4. Po zalogowaniu się do klienta Decode File należy wprowadzić poniższe informacje w odpowiednich polach na stronie głównej oprogramowania²⁸: Lista kodów kreskowych; Wykaz identyfikatorów skrzynek; Numer zamówienia zakupu (PO); i numer zamówienia sprzedaży (pamiętaj, aby nie umieszczać liter następujących po cyfrach).
   5. Wybierz pakiety DMAP do pobrania zgodnie z numerem kodu kreskowego w polu zakupu i określ miejsce docelowe w oknie dialogowym, aby zapisać pakiety DMAP.
   6. Kliknij przycisk, aby rozpocząć pobieranie.
      UWAGA: Pod koniec pobierania upewnij się, że pobrane foldery nie są puste i przechowuj pliki w bezpieczny sposób, ponieważ będą one niezbędne w ostatnim kroku konwersji eksperymentów na pliki danych o intensywności (pliki IDAT). Po upływie tego terminu Illumina może usunąć dane DMAP ze swojej internetowej bazy danych.

6. Rurociąg metylacji DNA

UWAGA: Eksperyment metylacji DNA jest podzielony na 4 dni (Rysunek 1). Postępuj zgodnie z zaleceniami i specyfikacjami producenta, aby uzyskać dokładne wyniki.

1. Dzień 1: Leczenie wodorosiarczynem
   1. Zacznij od denaturacji 500 ng genomowego DNA, a następnie dodaj odczynniki konwersyjne. Aby wykonać ten krok, postępuj zgodnie z zaleceniami zestawów wodorosiarczynowych i mikromacierzy²⁹.
   2. Poddać zdenaturowane DNA działaniu 130 μl odczynnika konwersyjnego wodorosiarczynu o standardowym stężeniu dostarczonym przez producenta.
   3. Inkubować probówkę w termocyklerze przez 16 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s i w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę. Zmniejszyć temperaturę termocyklera do 4 °C na 10 minut.
   4. Etap płukania należy wykonać dodając 100 μl buforu myjącego, a następnie odwirować z pełną prędkością przez 30 sekund. Stężenie nie jest podane w instrukcji obsługi, a producent standaryzuje objętości.
      UWAGA: Ten odczynnik jest dostarczany z zestawem i nie musi być rozcieńczany ani przygotowywany.
2. Dzień 2: Amplifikacja - test metylacji, protokół ręczny
   1. Rozgrzej piec do hybrydyzacji do 37 °C i pozwól temperaturze się wyrównać.
   2. Nałóż etykietę z kodem kreskowym na mikropłytkę o pojemności 0,8 ml.
   3. Rozmrozić odczynniki do amplifikacji (Multi-Sample Amplification Mix 1, Random Primer Mix i Multi-Sample Amp Master Mix) w temperaturze pokojowej (odczynniki te są dostarczane z zestawem i nie trzeba ich rozcieńczać ani przygotowywać). Następnie wykonaj delikatną inwersję co najmniej 10 razy, aż cała zawartość probówek zostanie wymieszana.
   4. Dozować 20 μl Multi-Sample Amplification Mix 1 (MA1) do dołków płytki.
   5. Przenieść 4 μl próbki DNA z płytki przekształconej w wodorosiarczyn do odpowiednich studzienek na płytce o pojemności 0,8 ml. W tym momencie zapisz identyfikator oryginalnej próbki DNA na laboratoryjnym formularzu śledzenia odpowiadającym studzienkom płytkowym.
   6. Dozować 4 μl 0,1 N NaOH do każdej studzienki płytki zawierającej wielopróbkową mieszankę amplifikacyjną 1 (MA1) i próbkę DNA.
   7. Uszczelnij płytę plastikową uszczelką.
   8. Wirować płytkę, aby wymieszać odczynniki z próbkami z prędkością 1 600 obr./min przez 1 min. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć uszczelkę.
   9. Odpipetować 68 μl mieszanki starterów losowych (RPM) do każdego dołka płytki. Odpipetować 75 μl Multi-Sample Amp Master Mix (MSM) do każdego dołka płytki (bez usuwania poprzedniego roztworu). Użyj nowej uszczelki, aby zakryć płytę.
      UWAGA: Uważaj, aby połączyć dołki z płytą i prawidłowo ją ustawić.
   10. Obracać szczelnie zamkniętą płytkę przy 1 600 obr./min przez 1 min. Inkubować w piecu do hybrydyzacji przez 20-24 godziny w temperaturze 37 °C.
3. Dzień 3: Hybrydyzacja - test metylacji, protokół ręczny
   1. Rozgrzej blok do 37 °C.
   2. Rozmrozić zawartość probówki w temperaturze pokojowej. Ostrożnie i delikatnie odwróć probówki z roztworem do fragmentacji (FMS) co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać zawartość.
   3. Ostrożnie wyjmij płytkę z pieca do hybrydyzacji. Odwirować pulsacyjnie płytkę o masie 280 x g.
   4. Teraz usuń uszczelkę z płyty. Do każdego dołka płytki zawierającej próbkę dodać 50 μl roztworu do rozdrobnienia (FMS) i ponownie zamknąć płytkę. Obracać płytkę z prędkością 1 600 obr./min przez 1 min.
   5. Odwirować płytkę o sile 280 x g przez kilka sekund (przeprowadzić wirowanie impulsowe). Następnie umieścić szczelnie zamkniętą płytę na bloku grzewczym w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
   6. Jeśli zdecydowano się przerwać eksperyment i zamrozić płytkę, rozmrozić ją w temperaturze pokojowej i odwirować przy 280 x g. Jeśli nie jest zamrożony, pomiń ten krok i przejdź do kroku 6.3.7.
   7. Pozostawić blok grzewczy do wstępnego rozgrzania do 37 °C.
   8. Pozostaw bufor do prania do rozmrożenia w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu odwróć go co najmniej 10x, aby wymieszać zawartość.
   9. Usuń uszczelkę z płyty.
   10. Dodać 100 μl roztworu strącającego (PM1) do każdego dołka płytki zawierającej próbki.
   11. Ponownie uszczelnij płytkę uszczelką.
   12. Obracać płytkę z prędkością 1 600 obr./min przez 1 min.
   13. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   14. Następnie umieścić w wirówce pulsacyjnej na 280 x g na 1 min.
       UWAGA: Ustaw wirówkę na 4 °C, aby przejść do następnego kroku.
   15. Ostrożnie zdejmij uszczelkę z płyty i wyrzuć ją.
   16. Dodać 300 μl 2-propanolu (100%) do każdej studzienki zawierającej próbkę.
   17. Uszczelnij płytkę z najwyższą ostrożnością za pomocą nowej uszczelki. Uważaj, aby nie potrząsnąć talerzem.
   18. Odwróć płytkę co najmniej 10x, mieszając całą zawartość.
   19. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
   20. Wirować przy 3.000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min.
       UWAGA: Na końcu kroku 6.3.20 natychmiast wyjmij płytkę wirówkową.
   21. Usuń uszczelkę z płytki i wyrzuć ją.
   22. Szybko odwróć płytkę i spuść płyn na podkładkę, aby wyrzucić supernatant. Następnie uderz talerzem w suche miejsce o ręcznik papierowy, aby spuścić płyn.
   23. Stuknij mocno kilka razy przez 1 minutę lub do momentu, gdy wszystkie studzienki będą wolne od płynu.
   24. Pozostaw płytkę odwróconą i odkrytą na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
       UWAGA: Oczekuje się, że na dnie studni pojawią się niebieskie granulki.
   25. Rozgrzej piec do hybrydyzacji do 48 °C.
   26. Włącz blok grzewczy, aby podgrzać. Odczekaj 20 minut na ten proces.
   27. Rozmrozić Ponowne zawieszenie, hybrydyzację i roztwór do przemywania w temperaturze pokojowej. Odwróć co najmniej 10x. Sprawdź, czy w roztworze nie wytrąciła się sól.
   28. Dodać 46 μl roztworu do ponownego zawieszenia, hybrydyzacji i przemywania (RA1) do każdego dołka płytki.
       UWAGA: Wszelkie pozostałe odczynniki muszą być zarezerwowane dla etapów barwienia i hybrydyzacji.
   29. Nałóż uszczelkę na płytę. Użyj aluminiowej uszczelki, aby zakryć płytę. Trzymaj mocno, aby równomiernie wykonać uszczelnienie.
   30. Sprawdź, czy wszystkie studzienki są bezpiecznie zamknięte, aby uniknąć parowania.
   31. Ostrożnie umieścić nowo uszczelnioną płytkę w piecu do hybrydyzacji i inkubować w temperaturze 48 °C przez 1 godzinę.
   32. Obracać płytkę z prędkością 1 800 obr./min przez 1 min.
   33. Wirówka impulsowa o sile 280 x g.
   34. Przenieść płytkę do bloku grzewczego w temperaturze 95 °C na 1 godzinę.
   35. Przygotuj komory hybrydyzacji (Hyb), umieszczając je razem. Dozować 400 μl buforu nawilżającego (PB2) do zbiorników komór Hyb. Natychmiast załóż pokrywkę.
   36. Załaduj każdą próbkę z płytki do otworu wejściowego próbki w mikroukładzie.
   37. Załaduj wkładki Hyb Chamber zawierające mikromatryce do Hyb Chamber. Zamknij komorę Hyb na krzyż, aby uniknąć możliwego przesunięcia komory Hyb.
       UWAGA: Komory Hyb muszą być inkubowane w temperaturze 48 °C przez co najmniej 16 godzin, ale nie dłużej niż 24 godziny.
4. Dzień 4: Barwienie - test metylacji, protokół ręczny
   1. Zawiesić roztwór barwiący 4 z 330 ml 100% EtOH, uzyskując końcową objętość 350 ml. Energicznie wstrząsnąć butelką z roztworem do barwienia 4, aby zapewnić całkowite wymieszanie. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Roztwór barwiący 4 można przechowywać do 2 tygodni w temperaturze od 2 °C do 8 °C.
   2. Wyjmij komory z pieca do hybrydyzacji i pozwól im ostygnąć na stole przez 30 minut przed otwarciem.
   3. Podczas gdy komora Hyb stygnie, napełnij dwa pojemniki myjące buforem do mycia (200 ml na pojemnik do mycia). Pamiętaj, aby oznaczyć każdy pojemnik jako "Bufor do mycia" (PB1 i PB2).
   4. Napełnij akcesoria do wyrównywania mikromacierzy 150 ml buforu do mycia.
   5. Oddziel plastikowe przekładki i, jeśli to konieczne, wyczyść szkło.
   6. Aby umyć szkiełka z mikromacierzem, przymocuj drucianą pętlę do siatki i zanurz sprzęt do kapania w pojemnikach z 200 ml buforu do płukania, w sumie 10 razy.
   7. Usuń wszystkie wkładki z komory hybrydyzacyjnej i wyjmij każdą matrycę z wkładek. Usuń uszczelkę.
      UWAGA: Podczas wyjmowania nie dotykaj odsłoniętych matryc.
   8. Podczas wyjmowania szkiełek mikromacierzy z komory hybrydyzacyjnej należy uważać, aby niczego nie rozlać.
   9. Umyj mikromacierze w roztworze buforu płuczącego (PB1) powoli i lekko, przesuwając się 10x w górę i w dół. Przenieś do świeżego roztworu PB1 i przeprowadź płukanie, powoli przesuwając mikromacierze 10x w górę i w dół w roztworze.
   10. Wyjąć mikromacierz z pojemnika i potwierdzić brak pozostałości.
   11. Użyj przezroczystego elementu dystansowego w górnej części każdej mikromacierzy i poprowadź przekładki do odpowiednich pozycji.
       UWAGA: Uważaj, aby używać tylko przezroczystych przekładek, a nie białych.
   12. Ustaw pasek wyrównywania na akcesorium do wyrównywania.
   13. Umieść szklaną tylną płytę na górze przezroczystej przekładki; uważaj, aby pokryć całą mikromatrycę. Następnie przymocuj metalowe zaciski do komór przepływowych. W razie potrzeby użyj nożyczek, aby przyciąć końce przekładek komory przepływowej.
   14. Natychmiast umyj zbiorniki komory hybrydyzacji za pomocą ddH₂O i wyszoruj małą szczoteczką do czyszczenia. Nie pozwól, aby bufor nawilżający pozostał w zbiorniku.
   15. Przejdź do następnego kroku, który jest odpowiedzialny za rozszerzanie i barwienie mikrotablicy.
       UWAGA: Pozostaw wszystkie komory przepływowe zamontowane poziomo na stole laboratoryjnym. Dotykaj ich ponownie dopiero wtedy, gdy cały etap barwienia jest gotowy. Podgrzać roztwór do zawieszania, hybrydyzacji i przemywania do temperatury między 20 °C a 25 °C. Delikatnie mieszać, aż w roztworze nie będzie widać kryształu.
   16. Umieść odczynniki w stojaku po kolei. Jeśli jakieś są zamrożone, pozostaw je w temperaturze pokojowej, a następnie odwróć je co najmniej 10 razy, aby wymieszać roztwory.
   17. Napełnij cyrkulator wody do odpowiedniego poziomu.
   18. Włącz pompę i ustaw temperaturę na 44 °C.
   19. Usuń wszelkie bąbelki, które są przymocowane do stojaka komory.
   20. Wykonaj testy na stojaku studzienki za pomocą sondy temperatury. Wszystkie badane miejsca muszą mieć temperaturę od 44 °C ± 0,5 °C.
       UWAGA: Poniższe kroki należy wykonywać bez przerwy.
   21. Gdy stojak osiągnie temperaturę 44 °C, szybko umieść każdy zestaw w komorze przepływowej.
       UWAGA: Aby wykonać poniższe czynności, odpipetuj wszystkie odczynniki do tylnej szklanej płytki.
   22. Odpipetować 150 μl roztworu do refuzji, hybrydyzacji i przemywania (RA1). Następnie inkubować przez 30 minut. Powtórz ten krok w sumie 5 razy.
   23. Odpipetować 450 μl roztworu barwiącego 1 (XC1) i inkubować przez 10 minut.
   24. Pobrać pipetą 450 μl roztworu barwiącego 2 (XC2) i inkubować przez 10 minut.
   25. Odpipetować 200 μl Two-Color Extension Master Mix (TEM) i inkubować przez 15 minut.
   26. Odpipetować 450 μl 95% formamidu/1 mM EDTA i inkubować przez 1 minutę. Powtórzyć dwukrotnie.
   27. Inkubować przez 5 minut.
   28. Zmniejsz temperaturę stojaka komory do 32 °C (wskazanej na Superior Two-Color Master Mix).
   29. Odpipetować 450 μl roztworu barwienia 3 (XC3) i inkubować przez 1 min. Powtórzyć 1x.
   30. Poczekaj, aż stojak w komorze osiągnie odpowiednią temperaturę.
       UWAGA: Aby odczytać obraz z mikromacierzy bezpośrednio po procesie kolorowania, włącz skaner na tym etapie.
   31. Teraz dozuj 250 μl Superior Two-Color Master Mix (STM), a następnie wykonaj 10-minutową inkubację.
   32. Następnie dozować 450 μl roztworu barwienia 3 (XC3), a następnie inkubować przez 1 minutę. Powtórz 1x.
   33. Odczekaj 5 minut, a następnie dodaj 250 μl Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) i inkubuj przez 10 minut.
   34. Teraz dozuj 250 μl Superior Two-Color Master Mix (STM), a następnie wykonaj 10-minutową inkubację.
   35. Następnie dozować 450 μl roztworu barwienia 3 (XC3), a następnie inkubować przez 1 minutę. Powtórz 1x.
   36. Poczekaj 5 minut.
   37. Dodać 250 μl Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) i inkubować przez 10 minut.
   38. Dodać 450 μl roztworu do barwienia Microarray Solution 3 (XC3) i inkubować przez 1 minutę, a następnie powtórzyć ponownie.
   39. Poczekaj 5 min.
       UWAGA: Wykonaj następujący schemat powtórzeń: Krok 6.4.34., Krok 6.4.35. i kroku 6.4.36.; Krok 6.4.37., 6.4.38. i Krok 6.4.39.; Krok 6.4.34., Krok 6.4.35 i Krok 6.4.36.
   40. Teraz natychmiast wyjmij komory przepływowe ze stojaka i ostrożnie umieść je poziomo na stole laboratoryjnym. Upewnij się, że temperatura jest otoczenia.
   41. 6.4.41. Umieścić 310 ml roztworu do przemywania (PB1) dla każdej mikromacierzy w pojemniku do mycia.
   42. Usuń metalowe zaciski i szkło, a na koniec mikromacierz.
   43. Umieść mikromacierze na ruszcie do barwienia i umieść je w pojemniku do mycia zawierającym 10x roztwór PB1. Upewnij się, że kody kreskowe są skierowane w stronę przeciwną do osoby, która się nimi zajmuje, a wszystkie mikromacierze są zanurzone.
   44. Poruszaj się powoli i lekko, wykonując ruchy w górę iw dół 10x. Mikromacierz powinna zostać całkowicie usunięta z roztworu przed ponownym zanurzeniem. Następnie pozostaw go zanurzonego na 5 minut.
   45. Energicznie wstrząsnąć odczynnikiem Stain Solution 4 (XC4), aby zapewnić całkowite ponowne wymieszanie. Umieść 310 ml XC4 w pojemniku do mycia.
       UWAGA: Nie pozwól, aby roztwór pozostawał w pojemniku do mycia dłużej niż 10 minut.
   46. Lekko przenieś podstawkę do barwienia do drugiego pojemnika z XC4.
   47. Poruszaj się powoli i lekko, wykonując ruchy w górę i w dół 10x. Upewnij się, że mikromacierz została całkowicie usunięta z roztworu przed ponownym zanurzeniem.
   48. Następnie pozostaw mikromacierz zanurzoną na 5 minut.
   49. Wyjmij podstawkę barwiącą z roztworu i umieść ją w uchwycie probówki kodami kreskowymi skierowanymi do góry.
   50. Ostrożnie wyjmij mikromacierz za pomocą kleszczy blokujących i umieść ją na półce do wyschnięcia.
   51. Suszyć je za pomocą eksykatora próżniowego przez 50-55 minut przy 675 mm Hg (0,9 bara).
   52. Oczyść tylną część każdej mikromacierzy za pomocą EtOH.
       UWAGA: Unikaj dotykania pasków i nie pozwól, aby EtOH w jakikolwiek sposób kapał na paski.
   53. Przejdź do obrazowania mikromacierzy.
   54. Ostrożnie przechowuj mikromacierz w pudełku do przechowywania w temperaturze pokojowej.
       UWAGA: Obrazy mikromacierzy muszą zostać wykonane w ciągu 72 godzin.

7. Analiza bioinformatyczna

UWAGA: Konieczna jest zmiana niektórych atrybutów rodzaju mikrotablicy (np. arraytype = "450k" powinno zostać zastąpione przez arraytype = "EPIC"). Autor pipeline'u ChAMP szczegółowo opisuje wszystkie pola, które powinny zostać zmodyfikowane do analizy tablic na stronie Bioconductor w package³⁰.

1. Przykładowy arkusz
   1. Przenieś pliki IDAT do komputera, aby kontynuować analizę bioinformatyczną³¹. Utwórz przykładowy arkusz, aby przeprowadzić analizę danych³¹.
      UWAGA: W tym pliku arkusza kalkulacyjnego niezbędne są trzy kolumny. Pierwszym z nich jest Sample_name. Kolumna ta musi zawierać nazwy lub kody używane do identyfikacji próbek. Drugi to Sentrix_position. W tej kolumnie umieszcza się odpowiedni R01C01 próbek, przy czym R01 jest odpowiedzialny za rząd wiórów, a kolumna jest określana jako C01. Trzecią istotną kolumną jest Sentrix_ID, która odpowiada za odbiór numeru identyfikującego mikrotablicę. Upewnij się, że wpisujesz poprawne liczby. Możliwe jest dodanie innych informacji na arkuszu próbki jako wartości zmiennych. W niniejszym eksperymencie uwzględniono dane z analizy metali.
2. Potok ChAMP
   1. Zainstaluj program RStudio (wersja 4.0.2) na komputerze, aby przeprowadzić analizę³⁰.
      UWAGA: Upewnij się, że komputer ma co najmniej 8 GB pamięci RAM. Analiza danych będzie miała problemy lub ulegnie awarii przy mniejszej ilości pamięci RAM.
   2. Po instalacji otwórz program RStudio i zainstaluj pakiet ChAMP Bioconductor³⁰ za pomocą odpowiedniego wiersza poleceń (patrz Materiały dodatkowe 1).
      UWAGA: Jeśli na końcu instalacji wystąpi jakikolwiek błąd, zainstaluj wymagane biblioteki ChAMP ręcznie, jedna po drugiej²⁶.
   3. Teraz zaimportuj surowe dane i przeprowadź analizę. Patrz materiał uzupełniający 1.
      champ.load() importuje surowe dane i przeprowadza proces filtrowania, wykluczając sondy o niskiej wykrywalności pval, miejsca wielu trafień, sondy inne niż CG, lokalizacje CpG w pobliżu SNP i CpG zlokalizowane w chromosomach płciowych.
      champ.impute() domyślnie wykonuje imputację KNN.
      Champ. QC pobiera wykresy jakości danych (np. wykres gęstości).
      Champ. SVD ocenia efekty wsadowe na podstawie metadanych dostarczonych w arkuszu próbki.
      champ.refbase() wykonuje oszacowanie i korektę typu komórki.
      Champ. DMP( ) pobiera zróżnicowane pozycje metylacji i powiązania cech, takie jak masa tłuszczu, w celu sprawdzenia metylacji DNA między grupami i zmiany parametrów, jak pokazano w Materiał uzupełniający 1.
3. Wzbogacanie (ciąg DB)
   UWAGA: Wzbogacenie funkcjonalne służy do wnioskowania o biologicznych funkcjach zestawu genów.
   1. Aby wzbogacić dane w ciągu, wybierz listę obiektów docelowych do wzbogacenia i użyj jako danych wejściowych z: https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
   2. Jako organizm wybierz homo sapiens i naciśnij przycisk Szukaj.
   3. Aby poruszać się po wzbogaceniu, kliknij przycisk Analiza.
4. Zgłoszenie GEO
   1. Zdeponuj dane w publicznym repozytorium, takim jak GEO NCBI. W tym celu zarejestruj się na konto osoby przesyłającej.
      UWAGA: Wypełnij zgłoszenie GEO (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/), pobierając arkusz metadanych z informacjami opisowymi i protokołami dla całego eksperymentu i poszczególnych próbek. Zgłoszenia archiwalne GEO można tworzyć w dowolnym oprogramowaniu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Po drugie, dodaj do katalogu plik danych pierwotnych wygenerowany ze skryptu cell-ranger count dla wszystkich bibliotek. IDAT i skojarzone pliki lub arkusz macierzy zawierają nieznormalizowane dane. Trzeci folder to przetworzone pliki danych. Tabela macierzy jest arkuszem kalkulacyjnym zawierającym końcowe, znormalizowane wartości porównywalne w wierszach i próbkach, najlepiej przetworzone zgodnie z opisem w dołączonym manuskrypcie.
   2. Umieść przetworzone pliki danych wygenerowane ze skryptu cell-ranger count dla wszystkich bibliotek w katalogu. Użyj danych uwierzytelniających serwera FTP osoby przesyłającej GEO, aby przenieść katalog zawierający wszystkie trzy komponenty.

Wyniki

Po użyciu potoku ChAMP, 409 887 sond zostało uwzględnionych w analizie po wszystkich filtrach (niekwalifikowane CpG, sondy nie-CG, CpG w pobliżu SNP, strony multihit i CpG związane z XY); schemat jest reprezentowany w Rysunek 2.

Rysunek 2: Przebieg analizy bioinformatycznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ponadto, wykres gęstości ujawnił, że wszystkie próbki miały podobne gęstości rozkładu beta związane z etapami kontroli jakości. Analiza ta ocenia rozkład wartości beta i wskazuje, czy istnieją jakieś próbki, które należy wykluczyć. Z tej partii nie wykluczono żadnych próbek na podstawie tej analizy.

Rysunek 3: Wykres gęstości wartości beta uzyskany za pomocą pakietu ChAMP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza dekompozycji wartości osobliwych (SVD) została wykorzystana do weryfikacji głównych składników, które znacząco wpłynęły na zmienność danych dotyczących metylacji DNA. Dane ujawniły, że BMI, WC (p < 1e10-5) i FM (p < 0,05) miały znaczący wpływ na zmienność danych (Rysunek 4).

Rysunek 4: Analiza dekompozycji wartości osobliwych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oszacowanie typu komórek wykazało, że zarówno komórki NK jak i limfocyty B były wyższe u otyłych kobiet (Rysunek 5).

Rysunek 5: Frakcje komórek oszacowane metodą Housemana. Gran: granulocyt. CD4T: limfocyt T pomocniczy, limfocyty. CD8T: cytotoksyczne limfocyty T, limfocyty. Mono: monocyt. Komórka B: limfocyt B. NK: komórki NK (ang. natural nk), limfocyty. *p < 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Poziomy metylacji DNA między kobietami otyłymi i nieotyłymi różniły się przed i po korekcie typu komórki. Przed korektą danych metylacji DNA dla typów komórek zaobserwowano 43 463 pozycje zróżnicowanej metylacji (DMP), a 3 329 CpG pozostało istotnych po. 445 miejsc CpG znajdowało się w regionach międzygenowych (IGR), a 2 884 w regionach genowych, przy czym większość w regionie promotora (n = 1 438). Dystrybucja we wszystkich regionach była TSS1500 (n = 612), TSS200 (n = 826), 5'UTR (n = 390), pierwszy ekson (n = 273), ciało (n = 724) i 3'UTR (n = 59). Biorąc pod uwagę wartości Δβ <-0,05 i >0,05, 162 CpG było hipometylowanych, a 576 było hipermetylowanych u osób otyłych w porównaniu z osobami nieotyłymi (Rysunek 6). Dane są dostępne w bazie danych GEO pod kodem rejestracyjnym GSE166611.

Rysunek 6: Pozycje zróżnicowanie metylowane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Możliwe jest oszacowanie różnic w metylacji między grupami i znalezienie miejsc CpG związanych z określonymi cechami w badaniach metylacji. W badaniach nad masą tłuszczową znaleziono 13 222 miejsc CpG. 6,159 CpG w regionie promotora było związanych z masą tłuszczową, z 470 hipermetylowanymi i 94 hipometylowanymi (Ryc. 7), a odpowiednie geny zostały wzbogacone (Tabela 2).

Rysunek 7: Regiony promotorowe genów hipometylowanych i hipermetylowanych, niezależnie związanych z masą tłuszczową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 2: Funkcjonalne wzbogacenie genów z różnie metylowanych miejsc CpG. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Materiał uzupełniający 1: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Macierze metylacji DNA są najczęściej stosowanymi metodami dostępu do metylacji DNA ze względu na ich stosunek kosztów do korzyści¹⁴. W niniejszym badaniu opisano szczegółowy protokół wykorzystujący komercyjnie dostępną platformę mikromacierzy do oceny metylacji DNA w badaniu pilotażowym przeprowadzonym w kohorcie brazylijskiej. Uzyskane wyniki badania pilotażowego potwierdziły skuteczność protokołu. Rysunek 3 przedstawia porównywalność próbki i pełną konwersję wodorosiarczynu³².

Jako etap kontroli jakości algorytm ChAMP zalecił wykluczenie witryn CpG podczas procesu filtrowania. Celem wykluczenia sond jest poprawa analizy danych i wyeliminowanie stronniczości. Niskiej jakości CpG (wartości p niższe niż 0,05) zostały usunięte w celu wyeliminowania eksperymentalnego szumu w zbiorze danych. Cele pozostały zaliczone w analizie wykresu gęstości. Zhou³³ opisał znaczenie filtrowania CpG w pobliżu SNP w celu uniknięcia niezgodności, błędnej interpretacji metylacji cytozyn polimorficznych i powodowania koloru przełącznika w projekcie sondy typu I³⁴. Ponadto, ponieważ imprinting w różny sposób wpływa na chromosomy XY, Heiss i Just³⁵ podkreślili znaczenie filtrowania tych sond, ponieważ u kobiet problemy z hybrydyzacją mogą być czynnikami zakłócającymi³⁵.

Data ważności DMAPs, data otwarcia formamidu, jakość analityczna absolutnego etanolu i całkowita liczba leukocytów są uważane za krytyczne etapy protokołu.

Ponadto, zgodnie z naszymi obserwacjami, oszacowanie typu komórki jest niezbędne do przeprowadzenia analizy bioinformatycznej. Metoda Housemana przeprowadza oszacowanie typu komórki zgodnie z opisem w badaniu Tiana³⁰. Metoda ta opiera się na 473 specyficznych miejscach CpG, które mogą przewidywać procentową zawartość procentową najważniejszych typów komórek, takich jak granulocyty, monocyty, limfocyty B i limfocyty T³⁶. Użyliśmy zalecanej funkcji "myRefbase" z pakietu ChAMP. Po oszacowaniu algorytm ChAMP dostosowuje wartości beta i eliminuje to odchylenie ze zbioru danych. Ten krok ma kluczowe znaczenie w badaniach skoncentrowanych na otyłości, ponieważ ta populacja ma znaczną różnicę w białych krwinkach ze względu na ich przewlekły stan zapalny.

Zmieniliśmy tylko oryginalną mapę nasadki dla wspólnej pieczęci PCR w odniesieniu do modyfikacji metody i rozwiązywania problemów. Po każdym procesie wirowania uszczelka była wymieniana na nową. Nie mogliśmy użyć standardowego zgrzewania i dostosowaliśmy je za pomocą folii aluminiowej wokół płyty.

Chociaż testy komercyjne zostały uznane za złoty standard w badaniach epigenetycznych, jednym z ograniczeń protokołu może być specyfika odczynników i sprzętu unikalnej marki 37,38,39,40. Kolejnym ograniczeniem jest brak wskaźników pozwalających na identyfikację prawidłowego przebiegu eksperymentu⁴¹.

Standaryzacja obecnego protokołu stanowi doskonały przewodnik dla badań epigenetycznych, zmniejszając liczbę błędów ludzkich podczas procesu i umożliwiając udaną analizę danych i porównywalność między różnymi badaniami.

Zgodnie z naszymi wynikami, eksperymenty metylacji DNA są odpowiednie dla badań porównujących osoby z otyłością i bez otyłości⁴³. Ponadto proponowana analiza bioinformatyczna dostarczyła wysokiej jakości danych, które mogą być uwzględnione w badaniach na dużą skalę.

Korzystając z analizy SVD, stwierdziliśmy, że cechy związane z otyłością (BMI, WC i FM) wpłynęły na zmienność danych dotyczących metylacji DNA. W znaczący wynik, oszacowanie typu komórki wskazuje, że zarówno komórki NK (NK), jak i limfocyty B były wyższe u kobiet z otyłością niż u kobiet bez otyłości (ryc. 5). Wyższą liczbę tych komórek można wytłumaczyć stanem zapalnym o niskim stopniu nasilenia u tych osób⁴⁴. Zaobserwowaliśmy, że pacjenci z otyłością mają hipo- i hipermetylowane CpG w regionach promotorowych genów związanych z masą tłuszczową. Większość miejsc była hipometylowana, co może być związane z naturalnym wzrostem poziomu reaktywnych form tlenu (ROS) u tych osób. Ten stan stresu oksydacyjnego może sprzyjać perurbancji guaniny w miejscu dinukleotydu, tworząc 8-hydroksy-2'-deoksyguanozynę (8-OHdG), co skutkuje miejscem dinukleotydu 5mCp-8-OHdG i powoduje rekrutację enzymów TET. Wszystkie te zdarzenia mogą być odpowiedzialne za promowanie hipometylacji i hipermetylacji DNA przez różne mechanizmy działania⁴⁵.

Ponadto tempo adipogenezy wydaje się wzrastać u osób z otyłością, przy czym około 10% nowych komórek przechodzi w stare komórki^46,47. Wkład epigenetyczny, podkreślający środowisko otyłości, może zmieniać tempo proliferacji i różnicowania komórek, sprzyjając rozwojowi masy tłuszczowej⁴⁸. Zmiany epigenetyczne mogą również wpływać na programy adipogenne, ułatwiając lub ograniczając ich rozwój. Pierwotne czynniki transkrypcyjne (PPARγ lub C / EBPα) lub zespół kompleksów wielobiałkowych, umieszczony w dalszych regionach promotorowych obsługiwanych przez włączenie lub wykluczenie epigenetycznych enzymów modyfikujących, regulują ekspresję genów poprzez hiper- lub hipometylację⁴⁵. Szlak PPARγ został wcześniej opisany jako zmieniający szlak WNT, który miał geny wzbogacone w tym badaniu. Chociaż nadal nie wiadomo, w jaki sposób sygnalizacja WNT zachodzi podczas adipogenezy, ostatnie badania wykazały, że może ona odgrywać istotną rolę w metabolizmie adipocytów, szczególnie w warunkach otyłości⁴⁹.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Etanol absolutny	J.T. Baker	B5924-03
Żel agarozowy	Kasvi	K9-9100
Bioimpedancja elektryczna	Quantum BIA 450 Q - RJL System
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Corning	46-000-CI
EZ DNA Metylacja-Złoty zestaw	ZymoResearch, Irvine, CA, USA	D5001
Formamid	Sigma	F9037
FMS— Roztwór do fragmentacji	Illumina	11203428	Dostarczone odczynniki
HumanMethylation450 BeadChip	Illumina
Maxwell Instrument	Promega, Brazylia	AS4500
MA1— Amplifikacja wielu próbek 1 Mix	Illumina	11202880	Dostarczone odczynniki
MicroAmp Optyczna folia samoprzylepna	Thermo Fisher Scientific	201703982
MSM— Multi-Sample Amplification Master Mix	Illumina	11203410	Dostarczone odczynniki
NaOH	F. MAIA	114700
PB1— Odczynnik używany do przygotowania BeadChips do hybrydyzacji	Illumina	11291245	Dostarczone odczynniki
PB2— Bufor nawilżający stosowany podczas hybrydyzacji	Illumina	11191130	Dostarczone odczynniki
2-propanol	Emsure	10,96,34,01,000
RA1— Roztwór do mieszania, hybrydyzacji i przemywania	Illumina	11292441	Dostarczone odczynniki
RPM— Losowa mieszanka	podkładowa Illumina	15010230	dołączone odczynniki
STM— Superior Two-Color Master Mix	Illumina	11288046	dołączone odczynniki
TEM— Dwukolorowe rozszerzenie Master Mix	Illumina	11208309	Dostarczone odczynniki
Ultrapure EDTA	Invitrogen	155576-028
96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym (0,1 ml)	ByoSystems	4346906
96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym (0,8 ml)	Thermo Fisher Scientific	AB-0859
XC1— Roztwór XStain BeadChip 1	Illumina	11208288	Dostarczone odczynniki
XC2— XStain BeadChip solution 2	Illumina	11208296	Dostarczone odczynniki
XC3— XStain BeadChip solution 3	Illumina	11208392	Dostarczone odczynniki
XC4— Roztwór XStain BeadChip 4	Illumina	11208430	Dostarczone odczynniki