Cyfrowa kropelkowa reakcja PCR w celu wykrycia mutacji indeli w genetycznie zmodyfikowanych populacjach komarów Anopheline

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia kroki od ekstrakcji DNA do eksperymentalnego przygotowania do cyfrowego PCR kropelkowego (ddPCR), w tym analizę do identyfikacji i kwantyfikacji zdarzeń niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w miejscach docelowych po indukowanym przez gRNA rozszczepieniu Cas9 i naprawie DNA. Inne zastosowania tej metody obejmują takie zastosowania, jak wykrywanie polimorfizmu i weryfikacja wariantów edycji genów.

Streszczenie

Ostatnie postępy w genomice komarów i technologiach inżynierii genetycznej zwiększyły zapotrzebowanie na szybkie i skuteczne metody wykrywania docelowych zmian sekwencji DNA na dużą skalę. W szczególności wykrywanie insercji i delecji (indeli) w miejscach edytowanych genów generowanych przez przewodnik CRISPR RNA (gRNA) / niehomologiczne łączenie końców za pośrednictwem Cas9 jest ważne dla oceny wierności mutagenezy i częstotliwości niezamierzonych zmian. Opisujemy tutaj protokół cyfrowego kropelkowego PCR (ddPCR), który doskonale nadaje się do wysokoprzepustowej analizy NHEJ. Chociaż metoda ta nie generuje danych, które identyfikują pojedynczą zmienność sekwencji, zapewnia ilościowe oszacowanie zmienności sekwencji w populacji. Dodatkowo, przy odpowiednich zasobach, protokół ten może być wdrożony w warunkach laboratoryjnych w terenie łatwiej niż sekwencjonowanie nowej generacji lub sekwencjonowanie Sangera. ddPCR ma również szybszy czas oczekiwania na wyniki niż którakolwiek z tych metod, co pozwala na szybszą i pełniejszą analizę zmienności genetycznej w dzikich populacjach podczas prób terenowych organizmów modyfikowanych genetycznie.

Wprowadzenie

Napędy genowe mają ogromny potencjał do kontrolowania populacji owadów o znaczeniu medycznym i rolniczym^1,2,3,4,5. Na przykład systemy napędu genowego oparte na nukleazach Cas CRISPR i przewodnikowych RNA (gRNA) mogą być używane do modyfikowania populacji komarów-wektorów poprzez wprowadzenie cech, które nadają oporność pasożytom malarii, co prowadzi do zmniejszenia transmisji i zmniejszenia liczby chorób^1,4,5. System gen-napęd kopiuje siebie i związaną z nim cechę z jednego homologicznego chromosomu do drugiego w premejotycznych komórkach rozrodczych, a to zapewnia, że większość potomstwa dziedziczy popęd i tworzy potencjał do długotrwałej i zrównoważonej modyfikacji populacji w terenie. Jednak jedną z wad metod opartych na Cas/gRNA jest możliwość generowania mutacji insercji i delecji (indel) poprzez naprawę DNA niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), co skutkuje generowaniem alleli opornych na napędy, które po zgromadzeniu do wystarczająco wysokiej częstotliwości w populacji mogą powstrzymać rozprzestrzenianie się układu napędowego^1,2,3,4. Protokół ten szczegółowo opisuje wysokoprzepustową i niezawodną metodę, która może określić częstość występowania i względną ilość mutacji indel, zarówno na poziomie populacji, jak i indywidualnym, podczas napędu genowego opartego na Cas / gRNA.

Metody sekwencjonowania nowej generacji (NGS) zapewniają niezrównaną rozdzielczość sekwencjonowania. Jednak koszty i wymagania techniczne związane z NGS zabraniają rutynowych testów i ograniczają jego stosowanie jako metody o wysokiej przepustowości do oceny indels^6,7,8. Tradycyjne metody kwantyfikacji PCR są od dawna stosowane jako standardowa procedura oceny indeli genomowych; Metody te są jednak pracochłonne, pozyskiwanie danych zajmuje dużo czasu i charakteryzują się wysokim stopniem zmienności. Udowodniono, że Digital-Droplet PCR (ddPCR) jest bardziej czuły w wykrywaniu mutacji niż sekwencjonowanie Sangera w niektórych zastosowaniach i ma niższą granicę wykrywalności niż NGS w innych^6,7,8,9. Co więcej, koszt oceny zestawu próbek i czas oczekiwania na uzyskanie wyników jest odpowiednio niższy i szybszy w przypadku ddPCR niż sekwencjonowanie Sangera lub NGS⁹. Korzystając z systemu podwójnej sondy, test Drop-Off identyfikuje allele NHEJ na podstawie braku sekwencji typu dzikiego (WT) w docelowym miejscu cięcia Cas9 skierowanym na gRNA. W tym teście krótki amplikon zawierający przewidywane miejsce cięcia systemu opartego na Cas / gRNA jest amplifikowany określoną parą starterów. Jedna sonda fluorescencyjna jest zaprojektowana tak, aby wiązać się z konserwatywnym obszarem amplikonu, a inna sonda fluorescencyjna rozpoznaje sekwencję WT w miejscu cięcia. W obecności allelu NHEJ, ten ostatni nie wiąże się z amplikonem.

Użycie ddPCR daje możliwość projektowania starterów do celowania w delecje, różnice między pojedynczymi parami zasad i insercje, co pozwoli na profilowanie NHEJ w analizach populacji komarów⁹. Biorąc pod uwagę te atrakcyjne cechy, stworzyliśmy protokół ddPCR do wysokoprzepustowego wykrywania indeli generowanych przez system napędu genów oparty na Cas/gRNA u komarów.

Protokół

1. Ekstrakcja DNA

1. Przygotować bufor do lizy EDTA/jąder (EDTA/NLS) w proporcji 500 μl NLS i 120 μL EDTA na próbkę. Skalowanie w górę dla wielu próbek. Schłodzić mieszaninę na lodzie.
   UWAGA: Roztwór stanie się mętny w ciągu 2-5 minut po schłodzeniu, w zależności od objętości.
2. Homogenizować próbkę komara za pomocą homogenizatora mechanicznego przez 10-15 s w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wypełnionej 600 μl schłodzonego EDTA/NLS; dokładnie wymieszać.
3. Dodaj 17,5 μl 20 mg/ml proteinazy K do probówki i dokładnie wymieszaj.
4. Inkubować przez noc w temperaturze 55 °C. Alternatywnie, inkubować próbkę w temperaturze 55 °C przez 3 godziny z wytrząsaniem i wirować próbkę co 1 godzinę.
5. Dodać 200 μl roztworu do wytrącania białek do próbki o temperaturze pokojowej i energicznie wirować przez 20 sekund.
6. Schładzać próbkę przez 5 minut na lodzie.
7. Odwirować próbkę w celu osadzenia białek w temperaturze 15 890 RCF przez 4 minuty.
8. Ostrożnie odessać supernatant zawierający DNA i przenieść go do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 600 μl izopropanolu.
9. Delikatnie wymieszaj roztwór, odwracając probówkę 5-10 razy. Wirować przez 1 minutę przy 15 890 RCF. Ostrożnie zdekantować supernatant, zachowując osad DNA.
10. Dodać 600 μl 70% etanolu o temperaturze pokojowej. Umyj granulowane DNA, delikatnie odwracając probówkę.
11. Wirować przez 1 minutę przy 15 890 RCF. Ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację za pomocą szklanej końcówki do pipety.
12. Odwróć probówkę na czysty papier chłonny i susz granulkę na powietrzu przez 10-15 minut.
13. Ponownie zawiesić DNA wodą klasy PCR. Użyj 20 μl na pojedynczą próbkę komara lub 100 μl na 10 komarów w puli.
    UWAGA: Metody ekstrakcji DNA próbek komarów przy użyciu dostępnego na rynku zestawu (patrz tabela materiałów) są zaadaptowane z protokołu producenta dotyczącego izolowania genomowego DNA z komórek kultury tkankowej i tkanek zwierzęcych.

2. reakcje ddPCR i przygotowanie do generowania kropel

1. Określ ilościowo DNA za pomocą fluorometru.
   UWAGA: Do testu drop-off zaleca się użycie zakresu 3 000-30 000 haploidalnych kopii genomu na reakcję, który jest przeznaczony do wykrywania zdarzeń NHEJ za pomocą sondy znakującej HEX, która wiąże się z sekwencją WT w docelowym miejscu cięcia i nie ulega wyżarzaniu (odpadaniu), jeśli w miejscu docelowym nastąpi delecja lub insercja, wskazujące na obecność wariantu NHEJ.
2. Oblicz liczbę kopii, używając haploidalnego genomu, masy i stężenia DNA w ekstrakcie. Odbywa się to poprzez pomnożenie stężenia wyekstrahowanego DNA przez objętość użytą do uzyskania całkowitej masy DNA, a następnie podzielenie go przez masę haploidalnego genomu. Upewnij się, że dodana objętość mieści się w przedziale 1-10 μl. Rozcieńczyć w razie potrzeby, aby znaleźć się w zalecanym zakresie kopii haploidalnego genomu.
   UWAGA: Szacuje się, że jeden haploidalny genom Anopheles gambiae wynosi 0,27 pg na dorosłego komara¹⁰.
3. Projektowanie podkładów i sond. Zaprojektuj startery oligonukleotydowe do przodu i do tyłu o temperaturze topnienia startera (Tm) w zakresie 55-60 °C, które otaczają końce 5' i 3' miejsca docelowego gRNA, wytwarzając amplikon 150-400 pz.
   1. Sonda znakowana HEX (heksachlorofluoresceiną) do wykrywania NHEJ: Zaprojektuj oligonukleotyd o długości ~ 15-20 pz komplementarny do miejsca docelowego i dodaj sondę HEX do końca 5' i BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) do końca 3'. Tm sondy hydrolizy powinno być o 3-10 °C wyższe niż Tm starterów.
   2. Sonda znakowana FAM (6-karboksyfluoresceiną) w celach informacyjnych WT: Zaprojektuj oligonukleotyd o długości ~ 15-20 pz komplementarny do konserwatywnego miejsca genomu odległego (około 25 pz) od miejsca docelowego i dodaj sondę FAM do końca 5' i BHQ1 do końca 3'. Tm sondy hydrolizy powinno być o 3-10 °C wyższe niż Tm starterów.

3. Przygotowanie reakcji PCR

1. Przygotować 25 μl mieszanki próbek ddPCR z następującymi składnikami: ddPCR supermix dla sond (bez UTP): 12,5 μL, startery do przodu i do tyłu (10 μM): 1 μL każda, sondy HEX/FAM (10 μM): 0,625 μL każda, DNA: 1-5 μL (3 750-37 500 kopii haploidalnego genomu) i woda: do 25 μL.
2. Dokładnie wymieszaj reakcje, pipetując wirowo lub zwrotnie (góra i dół) (20x).
   UWAGA: Jeśli reakcje zachodzą na 96-dołkowej płytce, pipetuj całą objętość w górę i w dół 20 razy, zamiast wirować, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
3. Krótko odwirować próbki, aby osadzić mieszaninę na dnie probówki lub studzienki.
   UWAGA: Upewnij się, że reakcje zachodzą w temperaturze pokojowej dla wytwarzania kropel. Przygotuj 1x mieszanki ddPCR dla dodatkowych/niewykorzystanych dołków w każdym kartridżu (każdy wkład ma 8 dołków).

4. Generowanie kropel

1. Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 50 μl załaduj 20 μl mieszanki próbek ddPCR do środkowego rzędu wkładu (Rysunek 1A, góra).
2. Załaduj 70 μl oleju do dolnego rzędu. Załaduj 20 μL 1x ddPCR supermix do nieużywanych studzienek.
   UWAGA: Nie wprowadzaj bąbelków.
3. Umieść uszczelkę dotykając tylko krawędzi, unikając środkowego wklęsłego obszaru (Rysunek 1B).
4. Umieść płytkę bezpiecznie w generatorze kropel i zamknij pokrywę, aby rozpocząć bieg.
5. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 40 μl mieszanki emersyjnej z górnego rzędu wkładu (Rysunek 1A, na dole) do płytki 96-dołkowej.
   1. Pobieraj ciecz przez 3-5 s pod kątem 45-30°. Mieszaninę należy wypychać powoli przez ponad 3 sekundy pod kątem 45° na bok studzienki, pozwalając jej spłynąć po boku. Można przejść do drugiego zatrzymania (całkowitego wydalenia) pipety, aby usunąć cały płyn.
6. Za pomocą foliowych zgrzewaczy termicznych zgrzewać płyty przez 5 s w temperaturze 180 °C.

5. PCR

1. Umieść zapieczętowaną płytkę w termocyklerze (Rysunek 1C) i ustaw zalecane warunki PCR, jeśli postępujesz zgodnie z wytycznymi NHEJ dotyczącymi zrzutu, jak następuje:
   1. Wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 10 min.
   2. Ustaw 40 cykli po 94 °C na 30 s na denaturację, 55 °C na 1 minutę na wyżarzanie i 60 °C na 2 minuty na przedłużenie.
   3. Przechowywać w temperaturze 98 °C przez 10 minut.
   4. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Temperaturę wyżarzania dla określonych podkładów i zestawów sond można zoptymalizować za pomocą gradientu termicznego. Stosuj szybkość narastania 2 °C/s dla wszystkich etapów. Warunki PCR powinny być dostosowane w zależności od każdego projektu i konfiguracji eksperymentu.

6. Odczyt kropli

1. Umieść płytkę bezpiecznie w czytniku kropel z dołkiem A-1 w lewym górnym rogu (wygładzony róg, pozostałe trzy są obramowane) (Rysunek 1D).
2. Ustaw płytkę w programie: Wyznaczanie FAM jako znanego kanału referencyjnego i HEX jako nieznanego (Rysunek 2A).
3. Przeprowadź eksperyment z czytaniem kropelkowym jako bezpośrednią kwantyfikację. Po zakończeniu przebiegu zmień typ eksperymentu na Drop-Off (DOF) dla analizy (Rysunek 2A).

7. Analiza

1. Wyznacz prawidłowe parametry eksperymentalne (Rysunek 2A): Informacje o próbce, SuperMix, nazwa celu (WT lub NHEJ), typ celu (ref lub nieznany), sygnał Ch1 (HEX lub FAM), sygnał Ch2 (HEX lub FAM) i ręcznie ustaw próg liczby kropel (zaleca się powyżej 10 000 dla wiarygodnych wyników). Oprogramowanie wykona większość analizy z wyznaczonym parametrem.
2. Sprawdź liczbę kropel w zakładce Droplet; upewnij się, że wszystkie mają powyżej 10 000 (Rysunek 2B).
3. Sprawdź amplitudę 1 D, aby uzyskać skuteczną separację sygnału od negatywów.
4. W Edytorze blach podświetl całą płytę i ustaw Typ eksperymentu na Drop-off.
5. Ustaw cel WT jako odniesienie, wyznaczając kanał pierwszy dla FAM i kanał drugi dla HEX.
6. Ustaw cel NHEJ jako nieznany, oznaczając kanał pierwszy jako FAM i kanał drugi jako brak.
7. Na karcie Amplituda 2D ustaw progi klastra za pomocą narzędzi wykresu dla każdej próbki. Weźmy pod uwagę ogon związany z gromadą WT; jest to normalne dla testów NHEJ (Rysunek 3A).
   UWAGA: Na karcie Współczynnik kliknij ikonę koła zębatego w prawym górnym rogu wykresu. Wybierz Obfitość ułamkowa. Wykres będzie teraz wykreślał punkt odpowiadający procentowi zdarzeń NHEJ (Rysunek 3B).

Wyniki

Zastosowanie tej procedury opisano w pracy Carballar-Lejarazú i wsp.⁹. Analiza ddPCR typu Drop-off wykorzystuje dwie sondy fluorescencyjne do rozróżnienia sekwencji WT i indel: sonda FAM wiąże się z konserwatywną sekwencją w obrębie amplikonu, natomiast sonda HEX jest skierowana przeciwko sekwencji WT w docelowym miejscu (Rysunek 4A). W obecności indel sonda HEX nie zwiąże się z DNA. Reprezentatywne wyniki znajdują się na Rysunku 2, w Tabeli 1 oraz Tabeli 2 pracy Carballar-Lejarazú i wsp.⁹. Wykazano, że przy zastosowaniu tego protokołu metoda ddPCR pozwala wykryć szeroką gamę zdarzeń NHEJ indukowanych przez CRISPR-Cas9 oraz określić częstotliwość NHEJ w pojedynczej próbce lub próbce zbiorczej. Piętnaście różnych próbek zbiorczych, każda zawierająca 10 komarów, zawierało różne allele NHEJ (Tabela 2 pracy Carballar-Lejarazú i wsp.⁹). Zostały one przeanalizowane metodą ddPCR zgodnie z protokołem i parametrami przedstawionymi w niniejszym opracowaniu. Wyniki z Tabeli 1⁹ wskazują, że we wszystkich 15 próbkach stwierdzono 100% alleli indel, co zidentyfikowano w analizie Drop-off (Rysunek 4B). W innym eksperymencie, przy użyciu tego protokołu ddPCR, zbadano 11 próbek zbiorczych komarów WT oraz komarów NHEJ o różnym procencie NHEJ (0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% i 100%), a wyniki (Rysunek 2; Carballar- Lejarazú i wsp.⁹) wykazały, że zidentyfikowany procent jest zbliżony do wartości uzyskanych za pomocą porównawczej techniki wykrywania indeli poprzez analizę amplikonów (Rysunek 4C).

Rysunek 1: Układ i procedura eksperymentalna. (A) Przygotowanie wkładu do generowania kropelek. (Góra) Próbki są wypełniane w środkowym rzędzie wkładu, natomiast olej jest wypełniany w rzędzie dolnym. (Dół) Górny rząd wypełniony zemulgowanymi kropelkami po procesie generowania kropelek. (B) Generator kropelek z wkładem wypełnionym próbką i założoną uszczelką. (C) Płytka 96-dołkowa przykryta folią uszczelniającą w termocyklerze. (D) Czytnik kropelek z umieszczoną płytką 96-dołkową, zabezpieczoną metalową pokrywą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Odczyt kropel. (A) Interfejs oprogramowania do odczytu kropel. Pomarańczowe pola wskazują studzienki z próbkami. Szare pola to studzienki puste. Parametry eksperymentalne są konfigurowane w panelu Edit Tools (po prawej stronie). Każdą próbkę można edytować, klikając w odpowiednie pole próbki. Dla Experimental Type wybierz Drop Off (DOF). W informacjach o próbce wpisz odpowiednie dane dla Name (nazwy) i Type (typu) próbki, a także SuperMix. W sekcji Assay Information wybierz Basic Drop-Off. Dla próbki WT wybierz WT jako Target Name, Ref jako Target Type oraz odpowiednio FAM i HEX dla Signal Ch1 i Ch2. Dla próbek NHEJ wpisz odpowiednią nazwę w polu Target Name, wybierz Unknown dla Target Type oraz FAM dla Signal Ch1. Pozostaw Signal Ch2 jako None. (B) Wyniki liczby kropel dla wielu próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Analiza testu Drop-Off. (A) Wykres klastrów 2D dla liczby kropel alleli WT i NHEJ. W zakładce 2D Amplitude wszystkie krople są domyślnie niezaklasyfikowane. Na tym rysunku kolory zostały przypisane ręcznie w celu odróżnienia grup. Pomarańczowe kropki stanowią liczbę alleli WT uzyskaną poprzez wiązanie sond FAM i HEX odpowiednio w sekwencji referencyjnej i sekwencji miejsca docelowego. Niebieskie kropki reprezentują wyniki kropel, w których nastąpiło wiązanie FAM do sekwencji referencyjnej, ale brak wiązania HEX w sekwencji miejsca docelowego (stąd tzw. drop-off sondy HEX). Szare kropki to puste krople, w których nie wystąpiło wiązanie ani FAM, ani HEX. (B) Wykresy stosunku/obfitości zdarzeń NHEJ. W zakładce Ratio należy wybrać Fractional Abundance, aby uzyskać wykres z odpowiadającym procentem zdarzeń NHEJ. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zastosowanie testu Drop-Off z wykorzystaniem ddPCR do identyfikacji i ilościowego oznaczenia niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w transgenicznej linii Anopheles stephensi, AsMCRkh1. (A) Schematyczny przedstawienie testu ddPCR Drop-Off służącego do wykrywania mutacji w docelowym miejscu DNA z wykorzystaniem systemu podwójnych sond. Amplikon o długości 150-400 bp jest amplifikowany za pomocą primerów forward i reverse. Sonda znakowana FAM jest zaprojektowana tak, aby wiązać się z konserwowaną sekwencją amplikonu, natomiast sonda znakowana HEX wiąże się z docelowym miejscem gRNA typu WT. (B) Wykrywanie różnych typów indeli za pomocą ddPCR. Piętna grupy po 10 komarów AsMCRkh1, zawierające różne typy indeli, w tym insercje, delecje i substytucje, zostały przeanalizowane testem ddPCR Drop-Off. Szczegóły dotyczące mutacji i sekwencji znajdują się w Tabeli 2 oraz Tabeli S3 pracy Carballar et al.⁹. (C) Ilościowe oznaczenie NHEJ w mieszanych próbkach komarów AsMCRkh1 i WT w różnych stosunkach (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 oraz 0:10) przy użyciu ddPCR oraz porównawczej techniki wykrywania indeli poprzez analizę amplikonów⁹. Obrazy zaadaptowane z Carballar-Lejarazú et al. Biotechniques. 68(4):172-179 (2020)⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Starter/Sonda	Sekwencja (5’ » 3’)
Starter przedni ddPCR	ATGATCAAATGTCGACCG
Starter odwrotny ddPCR	ACCGTACTGGTTGAACA
Sonda ddPCR HEX (BHQ1)	[HEX]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1]
Sonda ddPCR FAM (BHQ1)	[6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1]
HEX: heksachlorofluoresceina, FAM: 6-karboksyfluoresceina, BHQ: Black Hole Quencher

Tabela 1: Sekwencje starterów i sond.

Dyskusja

Digital-droplet PCR jest skuteczną metodą określania obecności alleli indel wynikających ze zdarzeń NHEJ w systemie napędu genowego opartym na Cas/gRNA i pozwala na ilościowe określenie częstości występowania tych alleli u osób lub populacji. Niektóre kroki protokołu muszą być przestrzegane ze szczególną ostrożnością, aby osiągnąć wiarygodne wyniki. Po pierwsze, ekstrakcja genomowego DNA musi być przeprowadzona ostrożnie, aby zapewnić wysoką jakość i wystarczającą ilość. Dobra ekstrakcja pozwoli na dokładne określenie haploidalnych kopii genomu na reakcję. Z naszego doświadczenia wynika, że dostępny na rynku zestaw (patrz tabela materiałów) zapewniał niezmiennie wysoką jakość ekstrakcji DNA. Jednak ekstrakcje pojedynczych komarów mogą okazać się szczególnie trudne, ponieważ osad DNA staje się trudny do wizualizacji i może być łatwo zassany przez supernatant, jeśli nie będzie ostrożny. Po drugie, startery i sondy muszą być starannie zaprojektowane. Przed zakończeniem eksperymentu ddPCR upewnij się, że zaprojektowane startery dają pojedynczy produkt PCR, wykonując najpierw tradycyjny PCR i wizualizując pojedynczy produkt za pomocą elektroforezy żelowej. Referencyjna sonda FAM musi być również zaprojektowana w taki sposób, aby była komplementarna z wysoce konserwatywną sekwencją. Zapewni to dokładne wykrywanie alleli WT w całej zróżnicowanej populacji. Kombinacje startera/sondy dla każdego unikalnego eksperymentu będą miały różne warunki termocyklera i zaleca się optymalizację tych warunków za pomocą gradientu termicznego.

Istnieją inne metody identyfikacji indeli, takie jak sekwencjonowanie Sangera lub NGS. Sekwencjonowanie Sangera jest ograniczone, ponieważ ma dolną granicę wykrywalności i niską zdolność wykrywania do identyfikacji nowych wariantów. Sekwencjonowanie Sangera jest również pracochłonne i nie jest wysokoprzepustowe. W porównaniu z sekwencjonowaniem Sangera, NGS nie ma takich samych ograniczeń związanych z niską czułością, mocą wykrywania i przepustowością. Kolejną zaletą NGS jest jego zdolność do wykrywania różnych mutacji, od polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) po rearanżacje. Jednak NGS jest bardziej kosztowną i czasochłonną metodą w zastosowaniu do oznaczania indeli związanych z Cas9 / gRNA, ponieważ istnieje tylko jeden region docelowy zainteresowania i najlepiej nadaje się do większych analiz całego genomu. W porównaniu z wyżej wymienionymi metodami, ddPCR charakteryzuje się wysoką przepustowością i krótkim czasem realizacji. Jeśli materiały i instrumenty ddPCR są dostępne we własnym zakresie, 96 próbek można przetworzyć w ciągu 1-2 dni, co sprawia, że dobrze nadaje się do szybkiej analizy dużych prób organizmów modyfikowanych Cas9/gRNA.

Chociaż istnieje wiele korzyści płynących z ddPCR, istnieją również ograniczenia. Po pierwsze, sprzęt do ddPCR nie jest często dostępny w niezależnym środowisku laboratoryjnym. Sprzęt ddPCR może być dostępny wspólnie w większych instytucjach badawczych, ale nie pozwala to na łatwe generowanie i analizę danych poza instytucją. Po drugie, w przeciwieństwie do alternatyw, ddPCR nie zapewnia indywidualnych unikalnych sekwencji zidentyfikowanych mutacji indel. Digital-droplet PCR dostarczy częstotliwości mutacji indel w populacji, ale bez sekwencji nie można określić, czy obecne indele są bardziej skłonne do zachowania, czy zahamowania funkcji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Metoda ddPCR jest prawdopodobnie najlepiej przystosowana do analizy dzikich populacji po próbie uwolnienia w terenie organizmu napędowego opartego na Cas9 / gRNA, ponieważ może skutecznie określić częstotliwość wprowadzania transgenu do rodzimej populacji i generowania indeli w populacji w czasie zbliżonym do rzeczywistego. Ze względu na szybki czas realizacji ddPCR, możliwe byłoby cotygodniowe pobieranie próbek i analizowanie populacji w regionie prób terenowych, gdyby materiały były dostępne lokalnie. Koszty początkowe związane z zakupem, importem i konfiguracją sprzętu do ddPCR byłyby wysokie w odległych laboratoriach, ale korzyści płynące z możliwości rygorystycznej oceny dzikiej populacji, która jest poddawana modyfikacji za pomocą systemu napędowego, uzasadniałyby koszty.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reodczynniki
ddPCR Super Mix do sond (bez dUTP)	Odczynnik do ekstrakcji DNA Bio-Rad	1863024
(np. Zestaw do oczyszczania genomowego DNA Wizard)	Promega	A1120
EDTA (pH 8,0)	Invitrogen	AM9260G
Etanol, 200 Proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
Izopropanol (certyfikowany ACS)	Thermo Fisher Scientific	A416-500
Roztwór do lizy jąder (NLS) (zestaw do oczyszczania genomowego DNA)	Promega	A1120
Woda			Można użyć dowolnej certyfikowanej wody klasy PCR
Roztwór do wytrącania białek (zestaw do oczyszczania DNA genomowego Wizard)	Promega	A1120
Proteinaza K 20 mg/ml	Thermo Fisher Scientific	AM2546
Materials
ddPCR 96-dołkowa płytka	Bio-Rad	12001925
Generator kropel DG8 Kartridż i uszczelki	Bio-Rad	1864007
Droplet Generation Olej do sond	Bio-Rad	1863005
Fluorescencyjny sondy (np. Sondy FAM/HEX)	Sigma-Aldrich	N/A	są specyficzne dla eksperymentów i można je kupić u dowolnego dostępnego certyfikowanego sprzedawcy.
Startery oligonukleotydowe do przodu i do tyłu	Startery Sigma-Aldrich	N/A	są specyficzne dla eksperymentu i można je kupić u dowolnego dostępnego certyfikowanego sprzedawcy.
< mocny>Sprzęt< / silny>
C1000 Dotykowy termocykler	Bio-Rad	1851148	Może korzystać z innego termocyklera z funkcją gradientu i głęboką studnią

klasy PCR Sondy