Wprowadzamy protokół do pomiaru w czasie rzeczywistym reakcji komórek przerzutowych raka piersi do mózgu na leki i promieniowanie w organotypowym modelu wycinka mózgu. Metody te zapewniają test ilościowy w celu zbadania efektów terapeutycznych różnych metod leczenia przerzutów raka piersi do mózgu w sposób ex vivo w obrębie interfejsu mikrośrodowiska mózgu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model wycinka mózgu ex vivo do badania i celowania we wzrost guza z przerzutami do mózgu raka piersi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przerzuty do mózgu są poważną konsekwencją raka piersi dla kobiet, ponieważ te nowotwory są trudne do leczenia i wiążą się ze słabymi wynikami klinicznymi. Przedkliniczne mysie modele wzrostu raka piersi z przerzutami do mózgu (BCBM) są przydatne, ale są drogie i trudno jest śledzić żywe komórki i inwazję komórek nowotworowych w miąższu mózgu. Przedstawiono tutaj protokół dla kultur ex vivo wycinków mózgu od myszy ksenoprzeszczepionych zawierających wstrzykiwane doczaszkowo podlinie klonalne raka piersi poszukujące mózgu. MDA-MB-231BR komórki oznaczone lucyferazyą zostały wstrzyknięte wewnątrzczaszkowo do mózgów samic myszy Nu/Nu, a po powstaniu nowotworu, mózgi zostały wyizolowane, pokrojone i hodowane ex vivo. Wycinki guza zobrazowano w celu identyfikacji komórek nowotworowych wyrażających lucyferazy oraz monitorowania ich proliferacji i inwazji w miąższu mózgu przez okres do 10 dni. Ponadto protokół opisuje zastosowanie mikroskopii poklatkowej do obrazowania wzrostu i inwazyjnego zachowania komórek nowotworowych po leczeniu promieniowaniem jonizującym lub chemioterapią. Odpowiedź komórek nowotworowych na leczenie można zobrazować za pomocą mikroskopii obrazowania na żywo, pomiaru intensywności bioluminescencji i wykonywania histologii na wycinku mózgu zawierającym komórki BCBM. W związku z tym ten model warstwowy ex vivo może być użyteczną platformą do szybkiego testowania nowych środków terapeutycznych samodzielnie lub w połączeniu z promieniowaniem w celu identyfikacji leków spersonalizowanych w celu celowania w przerzutowy wzrost mózgu raka piersi u danej pacjentki w mikrośrodowisku mózgu.
Wprowadzenie
Przerzuty raka piersi do mózgu (BCBM) rozwijają się, gdy komórki rozprzestrzeniają się z pierwotnego guza piersi do mózgu. Rak piersi jest drugą najczęstszą przyczyną przerzutów do mózgu po raku płuc, przy czym przerzuty występują u 10-16% pacjentów1. Niestety, przerzuty do mózgu pozostają nieuleczalne, ponieważ >80% pacjentów umiera w ciągu roku od diagnozy przerzutów do mózgu, a jakość ich życia jest pogorszona z powodu dysfunkcji neurologicznych2. Istnieje pilna potrzeba określenia skuteczniejszych opcji leczenia. Jednowarstwowe, dwuwymiarowe lub trójwymiarowe modele hodowli są najczęściej stosowanymi metodami w testo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół został zatwierdzony i jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami przez Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). W tym badaniu wykorzystano samice myszy atymiczne Nu/Nu (w wieku 6-8 tygodni).
1. Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie komórek nowotworowych
- Sterylizuj cały sprzęt (pęsetę, nożyczki, nożyczki do szycia, wiertarkę ręczną) w suchym cyklu autoklawu do 45 minut w woreczkach sterylizacyjnych, w tym ze wskaźnikiem sterylizacji. W przypadku przeprowadzania operacji na wielu zwierzętach, sterylizuj narzędzia między zwierzętami za pomocą podgrzewanego st....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Komórki MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase wstrzyknięto dokranialnie do prawej półkuli mózgu myszy Nu/Nu w wieku 4-6 tygodni, zgodnie z powyższym opisem (Rycina 1A), i pozostawiono do wzrostu na 12-14 dni, podczas których wzrost guza monitorowano za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (Rycina 1B). Zgodnie z doniesieniami innych grup19, dokranialnie wstrzyknięto 100 000 komórek nowotworowych, choć możliwe jest wstrzyknięcie nawet 20 000 komór.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badanie to ustanawia nowatorską metodę hodowli mózgu ex vivo dla eksplantowanych ksenoprzeszczepów guzów mózgu. Pokazujemy, że komórki BCBM Komórki MDA-MB-231BR wstrzyknięte wewnątrzczaszkowo do mózgu myszy mogą przetrwać i rosnąć w wycinkach mózgu ex vivo . W badaniu przetestowano również komórki glejaka wielopostaciowego U87MG (GBM) wstrzyknięte doczaszkowo, a także stwierdzono, że te komórki rakowe przeżywają i rosną w wycinkach mózgu (dane nie pokazane). Uważamy, że model ten można rozszerzyć poza B.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów finansowych.
Podziękowania
Chcemy podziękować Julii Farnan, Kayli Green i Tizianie DeAngelis za ich pomoc techniczną. Praca ta była częściowo wspierana przez Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) i W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Strzykawka 1 ml, końcówka wsuwana | BD | 309659 | |
| 30 Igły G1/2 | BD | 305106 | |
| płytki 6-dołkowe | Genessee | 25-105 | |
| Mikroskop automatyczny i oprogramowanie LUMAVIEW | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Zlewka 50 ml | Fisher | 10-210-685 | |
| pędzel sobolowy, rozmiar #5/0 | Mikroskopia elektronowa Nauki | 66100-50 | |
| Wosk kostny | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Strzykawka do wstrzykiwań mózgu | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Rozszczepiona kaspaza 3 | Sygnalizacja komórkowa | przeciwciała 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Sól potasowa | Perkin Elmer | 122799 | |
| Żyletka z podwójnym ostrzem | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Bibuła filtracyjna , kółka ilościowe, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Drobny pędzel sobolowy #2/0 | Mikroskopia elektronowa Sciences | 66100-20 | |
| Kleszcze | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Przeciwciało Gamma-H2AX | Millipore | 05-636 | |
| Przeciwciało GFAP | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| Przeciwciało GFP | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glukoza | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamina (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-CL | |
| H& E i KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Zestaw wierteł ręcznych z wiertłami krętymi Micro Mini | YCQ2851920086082DJ | ||
| HEPES, wolny kwas | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Tylko dla myszy Stereotaktyczny aparat | ramowy Harvard (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Duże nożyczki chirurgiczne | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| Komórki MDA-MB-231BR | Uprzejmie dostarczone przez dr Patricię Steeg | Nr ref. 14 | |
| MgCl2· 6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Urządzenie do obrazowania myszy | System Perkin Elmer | IVIS 200 | |
| Oprogramowanie do obrazowania myszy | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | do żywego obrazu | |
| Czytnik mikropłytek Tecan | Spark | ||
| Rozwiązanie montażowe | Odczynnik Invitrogen | P36935 | |
| MTS | Promega CellTiter 96 Roztwór wodny | (Cat: G3582) | |
| Suplement N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobaseal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Myszy atymiczne Nu/Nu | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyd | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Szew polipropylenowy | Medex supply | ETH-8556H | |
| Patyczki do wacików z jodonem powidonu | Dostawa USA Nr | kat.: 689286X | |
| Ostrze skalpela #11 (opakowanie 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Rękojeść skalpela #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Pirogronian sodu | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Szpatułka/sonda | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Niepowlekane żyletki z podwójną krawędzią (amerykańska maszynka do golenia co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sacharoza | Amresco | 57-50-1 | |
| Skalpel chirurgiczny | Exelint International | D29702 | |
| Rozdrabniacz tkanek | Brinkman | (typ McIlwaina) | |
| Wkładki do hodowli tkanek | Millipore | PICMORG50 lub PICM03050 | |
| Aparat rentgenowski | Precyzja 250 kVp |
Bibliografia
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), Basel. (2021).
- Niikura, N., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
