Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model wycinka mózgu ex vivo do badania i celowania we wzrost guza z przerzutami do mózgu raka piersi

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62617

⸱

22 września 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Drexel University College of Medicine, 2Department of Pharmacology and Physiology, Drexel University College of Medicine, 3Department of Radiation Oncology, Thomas Jefferson University, 4Sidney Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University

W tym artykule

Podsumowanie

Wprowadzamy protokół do pomiaru w czasie rzeczywistym reakcji komórek przerzutowych raka piersi do mózgu na leki i promieniowanie w organotypowym modelu wycinka mózgu. Metody te zapewniają test ilościowy w celu zbadania efektów terapeutycznych różnych metod leczenia przerzutów raka piersi do mózgu w sposób ex vivo w obrębie interfejsu mikrośrodowiska mózgu.

Streszczenie

Przerzuty do mózgu są poważną konsekwencją raka piersi dla kobiet, ponieważ te nowotwory są trudne do leczenia i wiążą się ze słabymi wynikami klinicznymi. Przedkliniczne mysie modele wzrostu raka piersi z przerzutami do mózgu (BCBM) są przydatne, ale są drogie i trudno jest śledzić żywe komórki i inwazję komórek nowotworowych w miąższu mózgu. Przedstawiono tutaj protokół dla kultur ex vivo wycinków mózgu od myszy ksenoprzeszczepionych zawierających wstrzykiwane doczaszkowo podlinie klonalne raka piersi poszukujące mózgu. MDA-MB-231BR komórki oznaczone lucyferazyą zostały wstrzyknięte wewnątrzczaszkowo do mózgów samic myszy Nu/Nu, a po powstaniu nowotworu, mózgi zostały wyizolowane, pokrojone i hodowane ex vivo. Wycinki guza zobrazowano w celu identyfikacji komórek nowotworowych wyrażających lucyferazy oraz monitorowania ich proliferacji i inwazji w miąższu mózgu przez okres do 10 dni. Ponadto protokół opisuje zastosowanie mikroskopii poklatkowej do obrazowania wzrostu i inwazyjnego zachowania komórek nowotworowych po leczeniu promieniowaniem jonizującym lub chemioterapią. Odpowiedź komórek nowotworowych na leczenie można zobrazować za pomocą mikroskopii obrazowania na żywo, pomiaru intensywności bioluminescencji i wykonywania histologii na wycinku mózgu zawierającym komórki BCBM. W związku z tym ten model warstwowy ex vivo może być użyteczną platformą do szybkiego testowania nowych środków terapeutycznych samodzielnie lub w połączeniu z promieniowaniem w celu identyfikacji leków spersonalizowanych w celu celowania w przerzutowy wzrost mózgu raka piersi u danej pacjentki w mikrośrodowisku mózgu.

Wprowadzenie

Przerzuty raka piersi do mózgu (BCBM) rozwijają się, gdy komórki rozprzestrzeniają się z pierwotnego guza piersi do mózgu. Rak piersi jest drugą najczęstszą przyczyną przerzutów do mózgu po raku płuc, przy czym przerzuty występują u 10-16% pacjentów1. Niestety, przerzuty do mózgu pozostają nieuleczalne, ponieważ >80% pacjentów umiera w ciągu roku od diagnozy przerzutów do mózgu, a jakość ich życia jest pogorszona z powodu dysfunkcji neurologicznych2. Istnieje pilna potrzeba określenia skuteczniejszych opcji leczenia. Jednowarstwowe, dwuwymiarowe lub trójwymiarowe modele hodowli są najczęściej stosowanymi metodami w testowaniu środków terapeutycznych w laboratorium. Nie naśladują one jednak złożonego mikrośrodowiska BCBM, głównego czynnika wpływającego na fenotyp i wzrost guza. Chociaż modele te są użyteczne, nie obejmują złożonych interakcji guz-zręb, unikalnych wymagań metabolicznych i niejednorodności guzów3. Aby wierniej odtworzyć interakcje guz-zręb i heterogeniczność mikrośrodowiska, nasza grupa i inni zaczęli generować organotypowe hodowle "plasterków" przerzutów do mózgu z komórkami nowotworowymi pochodzącymi od pacjenta (pierwotnymi lub przerzutowymi) lub liniami komórek rakowych4,5,6. W porównaniu z klasycznymi systemami in vitro, ten krótkoterminowy model ex vivo może zapewnić bardziej odpowiednie warunki do badań przesiewowych nowych środków terapeutycznych przed oceną przedkliniczną w dużych kohortach zwierząt.

Modele ex vivo zostały skonstruowane i z powodzeniem używane przede wszystkim do identyfikacji skutecznych metod leczenia różnych nowotworów. Wymagają one kilkudniowej oceny, a dodatkowo mogą być dostosowane do badań przesiewowych leków specyficznych dla pacjenta. Na przykład, ludzkie tkanki raka pęcherza moczowego i prostaty ex vivo wykazały zależną od dawki odpowiedź przeciwnowotworową docetakselu i gemcytabiny7. Podobne tkanki raka jelita grubego ex vivo zostały opracowane do badań przesiewowych leków chemioterapeutycznych Oxaliplatin, Cetuximab i Pembrolizumab8. Ta aplikacja jest szeroko stosowana w raku trzustki, biorąc pod uwagę istotną interakcję między środowiskiem zrębu a genotypowymi i fenotypowymi cechami gruczolakoraka przewodowego trzustki9,10. Ponadto takie modele organotypowe zostały opracowane dla podobnych badań przesiewowych w nowotworach głowy, szyi, żołądka i piersi11,12.

Tutaj generowany jest model ex vivo wycinka mózgu ksenografowanych komórek nowotworowych raka piersi z przerzutami w ich mikrośrodowisku. Myszom wstrzyknięto doczaszkowo raka piersi przerzuty do mózgu troficzne komórki MDA-MB-231BR13 w płacie ciemieniowym kory mózgowej - częstym miejscu przerzutów TNBC 14,15 i pozwolono im rozwinąć nowotwory. Wycinki mózgu zostały wygenerowane z tych ksenoprzeszczepowanych zwierząt i utrzymywane ex vivo jako kultury organotypowe, jak opisano16,17. Ten nowatorski model ex vivo pozwala na analizę wzrostu komórek BCBM w miąższu mózgu i może być wykorzystany do testowania środków terapeutycznych i wpływu promieniowania na komórki nowotworowe w mikrośrodowisku mózgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony i jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami przez Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). W tym badaniu wykorzystano samice myszy atymiczne Nu/Nu (w wieku 6-8 tygodni).

1. Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie komórek nowotworowych

  1. Sterylizuj cały sprzęt (pęsetę, nożyczki, nożyczki do szycia, wiertarkę ręczną) w suchym cyklu autoklawu do 45 minut w woreczkach sterylizacyjnych, w tym ze wskaźnikiem sterylizacji. W przypadku przeprowadzania operacji na wielu zwierzętach, sterylizuj narzędzia między zwierzętami za pomocą podgrzewanego sterylizatora kulek (do 3x).
  2. Znieczulenie myszy należy przeprowadzić zgodnie z protokołem opieki nad zwierzętami (np. izofluranem (4% do indukcji, 1-2% do utrzymania) i podać środek przeciwbólowy (podskórnie, 0,1 ml 0,1 mg/kg buprenorfiny SR-LAB) przed rozpoczęciem operacji. Zapewnij optymalną głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
  3. Umieść myszy w ramie stereotaktycznej i unieruchom głowę za pomocą standardowych listew dousznych (Rysunek 1A). Nałóż maść okulistyczną na oczy.
  4. Wysterylizuj powierzchnię głowy poprzez wielokrotne, naprzemienne nakładanie (3x) wacików jodowych i 70% etanolu przed nacięciem.
  5. Użyj skalpela chirurgicznego, aby wykonać 1-centymetrowe nacięcie w linii środkowej skóry pod lekkim kątem do wyimaginowanej linii, która dzieli mózg myszy na dwie symetryczne połowy, aby odsłonić czaszkę. Przetrzyj krew bawełnianym wacikiem.
  6. Odchylić skórę na boki, aby odsłonić miejsce wstrzyknięcia: 2 mm po prawej stronie, 1 mm do przodu w odniesieniu do bregmy (+2 przyśrodkowo-boczne (+2 ML), +1 rostralne/ogonowe (+1RC).
  7. Użyj wiertła (0,73 mm), aby wbić się w czaszkę +2ML, +1RC do bregmy i wywierć otwór, używając lekkiego nacisku i ruchu skręcającego.
  8. Użyj strzykawki do wstrzykiwania mózgu, aby wstrzyknąć 5 μl 100 000 komórek MDA-MB-231BR (stabilnie eksprymujących GFP-Lucyferazy) roztworu/μL w sterylnym 1x PBS, początkowo wkładając strzykawkę na głębokość 3,5 mm do mózgu.
  9. Pozostawić strzykawkę na 2 minuty, aby osiadała. Pociągnąć ją do góry na około 1 mm, a po 2 minutach powoli wstrzyknąć pierwszą połowę objętości.
  10. Należy odczekać kolejne 2 minuty przed wstrzyknięciem pozostałej części, a następnie powoli wyciągnąć strzykawkę 3 minuty po ostatnim wstrzyknięciu.
    UWAGA: Powolne wstrzykiwanie jest empiryczne, ponieważ pozwala na dobre wchłonięcie objętości przez tkankę mózgową i nie powoduje wycieku po wyciągnięciu strzykawki, co może prowadzić do wzrostu komórek rakowych poza zamierzonym miejscem.
  11. Nałóż wosk kostny na miejsce wstrzyknięcia na czaszce, a następnie użyj szwów polipropylenowych do zszycia tkanki. Myszy wyzdrowieją w ciągu 5 minut po usunięciu znieczulenia.
  12. Monitoruj ich zachowanie zaraz po operacji przez około 10 minut, 3 godziny później i następnego dnia, aby ustalić, czy potrzebne jest specjalne leczenie, w tym wstrzyknięcie soli fizjologicznej, miękkiego jedzenia itp., Aby pomóc w szybkim powrocie do zdrowia.
  13. Monitoruj wzrost guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego w systemie obrazowania.
    1. W tym celu najpierw włącz tlen i izofluran w systemie obrazowania. Pozwól, aby oba zostały rozprowadzone do oddzielnej komory na zewnątrz pudełka do obrazowania.
    2. Następnie włącz oprogramowanie, zainicjuj instrument i wybierz odpowiednią opcję wizualizacji i uchwycenia całego korpusu myszy.
  14. Umieść myszy w oddzielnej komorze z izofluranem i zapewnij optymalną głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 200 μl 30 mg/ml lucyferyny.
  15. Przenieś żołądek myszy do nosa komory obrazowania zaopatrzonego w tlen i izofluran. Zablokuj komorę i wybierz 2-minutowy czas ekspozycji, aby rozpocząć obrazowanie.
  16. Użyj narzędzia ROI (region zainteresowania) oprogramowania, aby określić ilościowo sygnał bioluminescencyjny guza.
  17. Aby przeanalizować rozmiar guza, wybierz narzędzie w kształcie koła, dopasuj je do kształtu i rozmiaru guza. Zmierz zwrot z inwestycji i podaj łączne odczyty.
  18. Pozwól na wzrost guza litego przez 12-14 dni (lub do momentu, gdy lucyferazy osiągnie około 7,0 x10 6 jednostek) (Rysunek 1B) przed wygenerowaniem plasterków mózgu.
    UWAGA: Zwiększenie liczby komórek do wstrzyknięcia doprowadzi do szybszego wzrostu guza; W związku z tym generowanie wycinków mózgu może nastąpić wcześniej niż 12 dni. Z drugiej strony, większy guz doprowadzi do większej liczby plastrów GFP+, jeśli pozwoli się mu rosnąć przez 14 dni. Po 14 dniach zdrowie myszy zaczyna się szybko pogarszać; W związku z tym monitorowanie zdrowia zwierząt powinno zostać zwiększone do jednego dziennie po upływie 10-dniowego punktu czasowego, a wszystkie myszy wykazujące oznaki bólu i/lub dyskomfortu powinny być wykorzystywane do generowania plastrów.

2. Generuj wycinki mózgu

UWAGA: Wykonaj kroki po izolacji mózgu w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym. Zazwyczaj możliwe jest wygenerowanie 35-40 pojedynczych wycinków zawierających komórki nowotworowe (sygnał lucyferazy) z jednej myszy, której wstrzyknięto komórki MDA-MB-231BR (Rysunek 1C).

  1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie. Umieść krajalnicę do tkanek w sterylnym okapie z przepływem laminarnym i wyczyść wszystkie narzędzia i instrumenty 70% etanolem.
  2. Po 12-14 dniach od wewnątrzczaszkowego wstrzyknięcia komórek MDA-MB-231BR należy znieczulić myszy zgodnie z protokołem opieki nad zwierzętami użytkownika, jak opisano w 1.2. Zapewnij optymalną głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
  3. Usunąć i umieścić ich mózgi szybko (w ciągu 45 s) w lodowatej (4 °C) sacharozy-ACSF składającej się z następujących składników: 280 mM sacharozy, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 20 mM glukozy, 10 mM HEPES, 5 mM Na+-askorbinian, 3 mM tiomocznik, 2 mM Na+, 29 mM pirogronianu; pH = 7,3.
  4. Za pomocą ostrego, sterylnego skalpela lub żyletki odetnij nadmiar części mózgu, które nie zawierają guza ze wszystkich stron, w tym dolną część mózgu.
  5. Doprowadź kształt mózgu do nieidealnego sześcianu, aby usiąść płasko na bibule filtracyjnej zwilżonej ACSF na 60 mm pokrywce naczynia, aby ułatwić krojenie.
    UWAGA: Dodatkowa tkanka mózgu, w której guz prawdopodobnie nie wyrósł, jest usuwana przed krojeniem, aby umożliwić wytworzenie plasterków głównie GFP+ i stworzenie kształtu mózgu, który jest stabilny na powierzchni instrumentu i nie będzie zaburzony przez wibracje spowodowane krojeniem.
  6. Umieść kilka arkuszy wstępnie zwilżonych (z ACSF) kółek z bibuły filtracyjnej na platformie tnącej i umieść na niej zablokowaną tkankę.
  7. Ustaw rozmiar cięcia na instrumencie na 2 lub 2.5 jednostki na dołączonej linijce, aby pokroić tkankę na odcinki 200-250 μm.
    UWAGA: Plastry o grubości do 350 μm lub tak cienkie jak 100 μm są żywotne. W przypadku plastrów <200 μm użyj wibratomu lub kompresu.
  8. Za pomocą pędzla (sobolowego) przenieś plastry mózgu do naczynia zawierającego sacharozę ACSF i oddziel plastry pod mikroskopem świetlnym za pomocą igieł o sile 27 G.
  9. Zidentyfikuj plastry GFP dodatnie pod mikroskopem fluorescencyjnym i przenieś je do nowej 60-milimetrowej płytki zawierającej 2-3 ml pożywki dla dorosłych plastrów (podłoże neuropodstawowe A, 2% suplement B12, 1% suplement N2, 1% glutamina, 0,5% glukozy, 10 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) za pomocą sterylnej pipety o pojemności 1 ml (szeroki otwór).
    UWAGA: Wycinki mózgu, które zawierają komórki nowotworowe rosnące na powierzchni mózgu (może być spowodowane wyciekiem komórek iniekcyjnych itp.) są wykluczone.
  10. Przenieś 3-5 plasterków na każdą 30 mm wkładkę do hodowli tkankowej o wielkości porów 0,4 μm na płytkach 6-dołkowych w odległości, która nie pozwala na wrastanie jedna w drugą.
  11. Usuń nadmiar pożywki z powierzchni wkładki za pomocą pipety P1000, dodaj 1 ml pożywki do plastrów dla dorosłych myszy pod każdą wkładkę i wyrównaj pożywkę w inkubatorze przed krojeniem.
  12. Inkubować tkanki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% przez 24 godziny przed obrazowaniem.

3. Obrazowanie IVIS warstw

UWAGA: Wykonaj etapy dodawania lucyferazy i inhibitora w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym.

  1. Odpipetować 5 μl roztworu lucyferyny o stężeniu 30 mg/ml do pożywki znajdującej się pod wkładkami, podnosząc wkładkę za kleszcze i umieszczając ją z powrotem w studzience po dodaniu lucyferyny do pożywki w studzience.
  2. Umieść 6-dołkową płytkę z pokrywką w komorze obrazowania instrumentu poniżej kamery stacjonarnej i zablokuj drzwiczki komory.
  3. Otwórz oprogramowanie i zainicjuj instrument.
  4. Wybierz ustawienia kamery, które umożliwiają wizualizację i uchwycenie tylko jednego dołka na obraz. Przesuń stolik w górę (pole widzenia 5 cm) i umieść studzienkę, która ma być sfotografowana, bezpośrednio pod kamerą.
  5. Ustaw czas obrazowania na najbardziej odpowiedni w zależności od intensywności lucyferazy, którą guz będzie emitował, który może wynosić od 10 s do 5 min. Zacznij od ustawienia go na 10 s, a następnie zwiększaj, jeśli sygnał jest niski, ale utrzymuj go na stałym poziomie dla wszystkich punktów czasowych i warunków do końca eksperymentu (Rysunek 1D).
  6. Użyj narzędzia ROI (narzędzie w kształcie koła), dopasuj je do kształtu i rozmiaru guza, zmierz ROI i podaj całkowite odczyty, aby określić ilościowo sygnał bioluminescencyjny każdego guza na plasterku.
  7. Przynieś płytkę z powrotem do sterylnego okapu z przepływem laminarnym, użyj kleszczyków, aby lekko podnieść wkładkę z dołka.
  8. Odessać pożywkę, zastąpić ją 1 ml świeżej pożywki i umieścić wkładkę z powrotem w studzience.
  9. W przypadku eksperymentów, w których plastry są traktowane różnymi związkami, takimi jak inhibitory, metabolity itp., należy przygotować odpowiednie stężenie odczynnika w 1,2 ml pożywki do wycinków mózgu w probówce o pojemności 1,5 ml, a następnie przenieść 1 ml do studzienki zawierającej plasterek.
  10. Powtarzaj ten proces co 48 godzin przez cały czas trwania badania.

4. Obrazowanie na żywo wzrostu guza w wycinkach mózgu ex vivo

UWAGA: Zaopatrz wkładki w wystarczającą ilość pożywki (1,5 ml), aby wystarczyła na czas trwania eksperymentu, ponieważ nie jest możliwe dodanie dodatkowego podłoża podczas obrazowania na żywo.

  1. Umieścić 6-dołkową płytkę na automatycznym uchwycie płytki mikroskopu wewnątrz inkubatora (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności).
  2. Otwórz oprogramowanie, włącz jasne pole w pierwszym kwadrancie, aby dostosować ekspozycję potrzebną do wyświetlenia plasterków. Aby znaleźć pozycję (współrzędne "xy") przekroju, nawiguj za pomocą "xy" w drugiej ćwiartce, aby kontrolować współrzędne "xyz" mikroskopu.
  3. Wybierz płytkę 6-dołkową jako sprzęt laboratoryjny używany w tym eksperymencie. Wybierz edytor map ROI i zarejestruj tę pozycję, wybierając nowy ROI, dodaj i zapisz ten ROI.
  4. Powtórz te same kroki dla wszystkich innych obszarów zainteresowania w innych odwiertach. Po dodaniu wszystkich ROI zapisz wszystkie ROI.
  5. W obszarze Protocol (Protokół) wybierz opcję Clear Existing (Wyczyść istniejące) i wybierz opcję Time-Lapse (Upływ czasu) w obszarze Acquisition, a następnie wybierz interesujące Cię kanały (w tym przypadku GFP).
  6. Wyłącz autofokus w ustawieniach ostrości i ręcznie dostosuj odpowiednią ostrość dla wszystkich plasterków. Na koniec dostosuj intensywność jasnego pola oraz wzbudzenie kanału fluorescencyjnego i czas ekspozycji do odpowiedniego poziomu.
  7. Ustaw protokół tak, aby pobierał obrazy co 15 minut przez 48 godzin.
  8. Zapisz i uruchom protokół. Po zakończeniu eksperymentu zapisany plik będzie zawierał zarówno obrazy jasnego pola, jak i obrazy GFP przechwycone dla każdego zwrotu z inwestycji.
  9. Aby połączyć obrazy w filmie, zmień nazwę wszystkich interesujących obrazów na tę samą nazwę, a następnie liczbę binarną, aby uporządkować je w kolejności, w jakiej zostały przechwycone (np. ROI1 (1), RO1 (2) ...)
  10. Otwórz ImageJ i zaimportuj obrazy, klikając Plik > Importuj > sekwencji obrazów. Zaznacz nazwy plików, które pojawiają się na liście, a następnie wpisz zawartość nazwy plików w polu Nazwa pliku zawiera, które zostanie wyświetlone, aby zidentyfikować pliki wybrane do filmu.
  11. Zapisz połączone obrazy w obszarze Plik > Zapisz jako > AVI.

5. Test MTS i immunohistochemia tkanki mózgowej ex vivo

  1. TEST MTS
    1. Wyciąć plastry, przecinając błonę hodowli tkankowej pod każdym plasterkiem wzdłuż krawędzi tkanki i przenieść tkankę, nadal przyczepioną do membrany, na płytkę 96-dołkową.
    2. Dodać odczynnik MTS zmieszany w stosunku 1:5 z pożywką hodowlaną i 0,01% trytonem (1x), aby umożliwić penetrację roztworu w tkance, w całkowitej objętości 120 μl do każdego dołka.
    3. Użyj 4% paraformaldehydu (PFA) jako środka, który sprawi, że plastry mózgu staną się niezdatne do życia, a tym samym pozytywna kontrola w tym eksperymencie. Zanurz interesujący Cię wycinek mózgu w 4% PFA na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4 °C przed przystąpieniem do testu MTS.
    4. Pozostawić odczynnik MTS do reakcji z plastrami przez 4 godziny, usunąć plastry z dołków i zmierzyć absorbancję przy 490 nm dla wszystkich warunków, w tym dla pustego dołka bez plastra jako odniesienia.
    5. Raportuj odczyty w funkcji powierzchni wycinka tkanki, mierzonej za pomocą cyfrowej linijki suwmiarki.
  2. Przygotowanie immunohistochemiczne
    1. Zanurzyć plastry mózgu przymocowane do powierzchni wkładki membranowej w 10% formalinie na noc w temperaturze 4 °C.
    2. Wykonaj osadzanie, przetwarzanie, blokowanie i generowanie niezabarwionych slajdów tkanki. Użyj standardowego protokołu barwienia immunohistochemicznego do barwienia H&E, Ki-67, gamma-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI

6. Napromienianie guza w próbkach mózgu ex vivo

  1. Naświetlić guz promieniowaniem rentgenowskim 6 Gy (310 kVp).
    UWAGA: Jednostki wprowadzone w celu uzyskania całkowitej dawki 6 Gy to 3522 jednostki po uwzględnieniu jednostek R (mierzonych za pomocą elektrometru Victoreen) i poprawek dla naparstka, gęstości powietrza i cGy/R zgodnie z wcześniejszym opisem18. Czas naświetlania wynosi 130,9 s.
  2. Użyj filtracji z dodatkiem 0,25 mm Cu +1 mm Al, 50 cm SSD, 125 cGy na minutę.
  3. Wykonaj dozymetrię w komorze jonizacyjnej w wiązce skalibrowanej względem wzorca pierwotnego.
  4. Codziennie wprowadzaj poprawki dotyczące wilgotności, temperatury i ciśnienia atmosferycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase wstrzyknięto dokranialnie do prawej półkuli mózgu myszy Nu/Nu w wieku 4-6 tygodni, zgodnie z powyższym opisem (Rycina 1A), i pozostawiono do wzrostu na 12-14 dni, podczas których wzrost guza monitorowano za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (Rycina 1B). Zgodnie z doniesieniami innych grup19, dokranialnie wstrzyknięto 100 000 komórek nowotworowych, choć możliwe jest wstrzyknięcie nawet 20 000 komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie to ustanawia nowatorską metodę hodowli mózgu ex vivo dla eksplantowanych ksenoprzeszczepów guzów mózgu. Pokazujemy, że komórki BCBM Komórki MDA-MB-231BR wstrzyknięte wewnątrzczaszkowo do mózgu myszy mogą przetrwać i rosnąć w wycinkach mózgu ex vivo . W badaniu przetestowano również komórki glejaka wielopostaciowego U87MG (GBM) wstrzyknięte doczaszkowo, a także stwierdzono, że te komórki rakowe przeżywają i rosną w wycinkach mózgu (dane nie pokazane). Uważamy, że model ten można rozszerzyć poza B...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów finansowych.

Podziękowania

Chcemy podziękować Julii Farnan, Kayli Green i Tizianie DeAngelis za ich pomoc techniczną. Praca ta była częściowo wspierana przez Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) i W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 ml, końcówka wsuwanaBD309659
30 Igły G1/2BD305106
płytki 6-dołkoweGenessee25-105
Mikroskop automatyczny i oprogramowanie LUMAVIEWEtalumaLS720
B27 (GEM21)Gemini Bio-Products400-160
Zlewka 50 mlFisher10-210-685
pędzel sobolowy, rozmiar #5/0Mikroskopia elektronowa Nauki66100-50
Wosk kostnyModoMedDYNJBW25
Strzykawka do wstrzykiwań mózguHamilton Company80430
CaCl2Fisher ScientificBP510-250
Rozszczepiona kaspaza 3Sygnalizacja komórkowaprzeciwciała 14220S
DAPIInvitrogenP36935
D-Luciferin Sól potasowaPerkin Elmer122799
Żyletka z podwójnym ostrzemVWR55411-060(95-0043)
Bibuła filtracyjna , kółka ilościowe, 4.25 cmFisher09-805a (1001-042)
Drobny pędzel sobolowy #2/0Mikroskopia elektronowa Sciences66100-20
KleszczeFine Science Tools11251-20
Przeciwciało Gamma-H2AXMillipore05-636
Przeciwciało GFAPThermo Fisher13-0300
Przeciwciało GFPSanta CruzSC-9996
GlukozaSigma AldrichG8270
Glutamina (200 mM)Corning cellgrow25-005-CL
H& E i KI-67Jefferson Core Facility Pathology staining
Zestaw wierteł ręcznych z wiertłami krętymi Micro MiniYCQ2851920086082DJ
HEPES, wolny kwasFisher ScientificBP299-1
Tylko dla myszy Stereotaktyczny aparatramowy Harvard (Holliston, MA, USA).72-6049, 72-6044
KClFisher ScientificS271-10
Duże nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14001-18
Komórki MDA-MB-231BRUprzejmie dostarczone przez dr Patricię SteegNr ref. 14
MgCl2· 6H2OFisher ScientificM33-500
Urządzenie do obrazowania myszySystem Perkin ElmerIVIS 200
Oprogramowanie do obrazowania myszyCaliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).do żywego obrazu
Czytnik mikropłytek TecanSpark
Rozwiązanie montażoweOdczynnik InvitrogenP36935
MTSPromega CellTiter 96 Roztwór wodny(Cat: G3582)
Suplement N2Life Technologies17502-048
Neurobaseal mediumLife Technologies21103049
Myszy atymiczne Nu/NuCharles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)
ParaformaldehydAffymetrix19943
Pen/StrepLife Technologies145140-122
Szew polipropylenowyMedex supplyETH-8556H
Patyczki do wacików z jodonem powidonuDostawa USA Nrkat.: 689286X
Ostrze skalpela #11 (opakowanie 100)Fine Science Tools10011-00
Rękojeść skalpela #3Fine Science Tools10003-12
Pirogronian soduSigma AldrichS8636
Szpatułka/sondaFine Science Tools10090-13
SS Niepowlekane żyletki z podwójną krawędzią (amerykańska maszynka do golenia co (95-0043))VWR55411-060
SacharozaAmresco57-50-1
Skalpel chirurgicznyExelint InternationalD29702
Rozdrabniacz tkanekBrinkman(typ McIlwaina)
Wkładki do hodowli tkanekMilliporePICMORG50 lub PICM03050
Aparat rentgenowskiPrecyzja 250 kVp
Amazon Oprogramowanie

Bibliografia

  1. Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), Basel. (2021).
  2. Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
  3. Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
  4. Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557(2017).
  5. Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881(2013).
  6. Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
  7. van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400(2018).
  8. Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030(2019).
  9. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
  10. Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
  11. Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
  12. Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
  13. Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).
  14. Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542(2017).
  15. Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
  16. Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
  17. Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94(2020).
  18. Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377(2009).
  19. Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406(2020).
  20. Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
  21. Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
  22. Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  23. Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
  24. Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017(2012).
  25. Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metastaza raka piersihodowla ex vivoinwazja komórek nowotworowychobrazowanie bioluminescencyjnemikroskopia time-lapseodpowiedź na chemioterapiępromieniowanie jonizującemikrośrodowisko guza
Model wycinka mózgu ex vivo do badania i celowania we wzrost guza z przerzutami do mózgu raka piersi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.