Artykuł metodologiczny

Ultrawirowanie w gradiencie gęstości do badania recyklingu endocytarnego w komórkach ssaków

DOI:

10.3791/62621

⸱

30 czerwca 2021

 ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł ma na celu przedstawienie protokołu przygotowania endosomów do recyklingu z komórek ssaków za pomocą ultrawirowania w gradiacji gęstości sacharozy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomalny transport jest niezbędnym procesem komórkowym, który reguluje szeroki zakres zdarzeń biologicznych. Białka są internalizowane z błony plazmatycznej, a następnie transportowane do wczesnych endosomów. Zinternalizowane białka mogą być przenoszone do lizosomu w celu degradacji lub zawracane z powrotem do błony plazmatycznej. Solidny szlak recyklingu endocytarnego jest wymagany, aby zrównoważyć usuwanie materiałów błonowych z endocytozy. Doniesiono, że różne białka regulują ten szlak, w tym czynnik ADP-rybozylacji 6 (ARF6). Ultrawirowanie w gradiencie gęstości jest klasyczną metodą frakcjonowania komórek. Po odwirowaniu organelle są sedymentowane na ich powierzchni izopiknicznej. Frakcje są zbierane i wykorzystywane do innych dalszych zastosowań. Opisano tutaj protokół uzyskiwania frakcji zawierającej endosom do recyklingu z transfekowanych komórek ssaków za pomocą ultrawirowania w gradionym gradiacji gęstości. Wyizolowane frakcje poddano standardowemu Western blot w celu analizy zawartości białka. Stosując tę metodę, stwierdziliśmy, że celowanie w błonę plazmatyczną pochłaniania i ruchliwości komórek 1 (ELMO1), czynnika wymiany nukleotydów guaninowych z substratem toksyny botulinowej C3 (Rac1) związanego z Ras, odbywa się poprzez recykling endocytarny za pośrednictwem ARF6.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomalny transport jest niezbędnym procesem fizjologicznym, który implikuje różne zdarzenia biologiczne1, na przykład transport receptorów sygnałowych, kanałów jonowych i cząsteczek adhezyjnych. Białka zlokalizowane na błonie plazmatycznej są internalizowane przez endocytozę2. Zinternalizowane białka są następnie sortowane według wczesnej klasy endosome3. Niektóre z białek są kierowane do lizosomów w celu degradacji4. Jednak znaczna ilość białek jest zawracana z powrotem na powierzchnię komórki w wyniku szybkiego recyklingu i powolnych procesów recyklingu. W szybkim recyklingu białka opuszczają wczesne endosomy i bezpośrednio wracają do błony plazmatycznej. I odwrotnie, w powolnym recyklingu białka są najpierw sortowane do przedziału recyklingu endocytarnego, a następnie transportowane z powrotem do błony plazmatycznej. Różne białka ładunkowe, na przykład klatryna, kompleks retromerów, kompleks retriever i białko zespołu Wiskotta-Aldricha oraz kompleks homologu SCAR (WASH), uczestniczą w takich procesach recyklingu błonowego4,5,6,7,8,9. Równowaga między endocytozą a recyklingiem ma kluczowe znaczenie dla przetrwania komórki i przyczynia się do różnych zdarzeń komórkowych10, na przykład adhezji komórek, migracji komórek, polaryzacji komórek i transdukcji sygnału.

ARF6, mała GTPaza, jest zgłoszonym regulatorem transportu endocytarnego7,11,12. Co ciekawe, różne grupy badawcze zilustrowały znaczenie ARF6 w recyklingu endocytarnym13,14,15,16,17. Badanie ma na celu zbadanie związku między wzrostem neurytów za pośrednictwem ARF6 a recyklingiem endocytarnym. Poprzedni raport sugeruje, że aktywacja ARF6 jest wcześniejsza od aktywności Rac1 poprzez działanie na ELMO1-dedykator cytokinezy 1 (DOCK180) complex18. Jednak sposób, w jaki ARF6 wyzwala sygnalizację Rac1 za pośrednictwem ELMO1-DOCK180, pozostaje niejasny. Ultrawirowanie w gradiencie gęstości wykorzystano do zbadania roli recyklingu endocytarnego za pośrednictwem ARF6 w takim procesie. W ten sposób uzyskano frakcję zawierającą endosom do recyklingu z lizatów komórkowych19. Frakcję poddano Western blot w celu analizy zawartości białka. Wyniki badań wykazały, że w obecności FE65, białka adaptorowego wzbogaconego w mózg, aktywny ARF6 znacznie zwiększył poziom ELMO1 we frakcji zawierającej recycling endosomy. Poniższy protokół obejmuje procedury dotyczące: (1) transfekcji komórek ssaków; 2) przygotowanie próbek i kolumn gradientu gęstości; oraz (3) otrzymanie frakcji zawierającej endosomy do recyklingu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla i transfekcja komórek ssaków

  1. Płytka 2 x 106 komórek w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm. Do każdej transfekcji należy użyć czterech szalek.
    UWAGA: Wymagana liczba komórek może się różnić w zależności od linii komórkowych. Optymalizacja może być konieczna przed przejściem do etapu izolacji.
  2. Następnego dnia należy przetransfekować komórki lipofetaminą zgodnie z zaleceniami producenta.

2. Zbieranie komórek

  1. Wyrzucić pożywkę hodowlaną 48 godzin po transfekcji.
  2. Umyj komórki lodowatym PBS (10 mM fosforanów sodu, 2,68 mM chlorku potasu, 140 mM chlorku sodu) dwukrotnie.
  3. Dodaj 1 ml lodowatego PBS+ (PBS uzupełnionego 0,5x koktajlem inhibitorów proteazy i 0,5x koktajlem inhibitorów fosfatazy) do każdego dania.
  4. Zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  5. Granulować komórki przez odwirowanie za pomocą obracającego się wirnika kubełkowego o sile 400 x g przez 5 minut.
  6. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu homogenizacyjnego (HB; 250 mM sacharozy, 3 mM imidazol o pH 7,4, 1 mM EDTA uzupełniony 0,03 mM cykloheksymidem, 1x koktajl inhibitora proteazy i 1x koktajl inhibitora fosfatazy).
  7. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 1 300 x g przez 10 minut.
  8. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml HB.
  9. Homogenizuj komórki za pomocą homogenizatora Dounce przez 15-20 uderzeń.
    UWAGA: Można zastosować inne metody homogenizacji, na przykład przepuszczenie próbki przez strzykawkę. Skuteczność homogenizacji można ujawnić, obserwując homogenat pod mikroskopem z kontrastem fazowym.
  10. Przenieść homogenat do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml.
    UWAGA: Zebrać 50 μl homogenatu z 12,5 μl 5x buforu próbki i oznaczyć go jako lizat całkowity.
  11. Dodać 0,7 ml HB do homogenatu.
  12. Wirować rozcieńczony homogenat w temperaturze 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Osad zawiera jądra i nieuszkodzone komórki.
  13. Zebrać 1,5 ml supernatantu i powtórzyć krok 2.12 jeden raz.
  14. Zebrać 1,4 ml supernatantu i oznaczyć go jako supernatant postjądrowy (PNS).

3. Przygotowanie kolumny gradientu gęstości

  1. Przenieś 1,2 ml PNS do probówki ultrawirówkowej.
  2. Dodać 1 ml 62% roztworu sacharozy (2,351 M sacharozy, 3 mM imidazolu o pH 7,4) do próbki i dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie.
    UWAGA: Otrzymany roztwór to 40,6% roztwór sacharozy.
  3. Ostrożnie dodać 3,3 ml 35% roztworu sacharozy (1,177 M sacharozy, 3 mM imidazolu o pH 7,4) na wierzch próbki.
  4. Ostrożnie dodać 2,2 ml 25% roztworu sacharozy (0,806 M sacharozy, 3 mM imidazolu o pH 7,4) na wierzch 35% roztworu sacharozy.
    UWAGA: Współczynnik załamania światła 62%, 40,6%, 35% i 25% roztworów sacharozy w temperaturze pokojowej wynosi odpowiednio 1,44, 1,40, 1,39 i 1,37. Współczynniki załamania światła roztworów sacharozy można sprawdzić za pomocą refraktometru, aby zapewnić precyzję i spójność eksperymentu.
  5. Napełnij probówkę do ultrawirowania HB.
    UWAGA: Przygotować kolumnę gradientu gęstości należy tymczasowo przechowywać w temperaturze 4 °C.

4. Frakcjonowanie i odzysk frakcji zawierającej endosomy z recyklingu

  1. Odwirować kolumnę przy 210 000 x g przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.
  2. Ostrożnie zbierz 12 frakcji (po 1 ml każda), zaczynając od góry gradientu.
    UWAGA: Endosomy do recyklingu powinny znajdować się na granicy między 35% a 25% roztworami sacharozy. Zebrane frakcje można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Rozcieńczyć wszystkie frakcje 1 ml buforu rozcieńczającego (3 mM imidazol o pH 7,4, 1 mM EDTA).
  4. Odwirować rozcieńczoną próbkę o masie 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  5. Odessać supernatant i dodać 50 μl 1x buforu do próbki w celu zebrania frakcji.
  6. Przeanalizuj zawartość białka we frakcjach metodą western blot.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po frakcjonowaniu nietransfekowanych komórek HEK293 za pomocą ultrawirowania gradientu gęstości, zebrano 12 frakcji, zaczynając od góry gradientu. Zebrane frakcje rozcieńczono buforem rozcieńczającym w stosunku 1:1 i poddano drugiej rundzie wirowania. Próbki zostały następnie poddane western blot w celu analizy zawartości białka. Jak pokazano na Rysunek 1, marker endosomu recyklingu Rab11 jest wykrywany we frakcji 720. Badano również inne markery subkomórkowe, w tym β...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyższy protokół przedstawia procedury izolowania endosomów recyklingowych z hodowanych komórek za pomocą ultrawirowania. Niezawodność tej metody została wykazana w najnowszej publikacji22, udowadniając, że endosomy recyklingowe są z powodzeniem izolowane z innych organelli (ryc. 1), takich jak aparat Golgiego i mitochondria. Aby uzyskać dobry wynik separacji, należy zwrócić uwagę na kilka krytycznych kroków. Podczas przygotowywania roztworów sacharozy zaleca się wal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów z treścią niniejszego artykułu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez fundusze z Research Grants Council Hong Kong, programu bezpośrednich grantów CUHK, United College endowment fund oraz TUYF Charitable Trust. Dane liczbowe w tej pracy zostały zaadaptowane z naszej poprzedniej publikacji "ARF6-Rac1 wzrost neurytów za pośrednictwem sygnalizacji jest wzmacniany przez adaptor neuronalny FE65 poprzez orkiestrację ARF6 i ELMO1" opublikowaną w czasopiśmie FASEB w październiku 2020 r.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml, grubościenna probówka polipropylenowa Open-Top, 11 x 34 mmBeckman Coulter347287
100 mm naczynie do hodowli tkankowychSPL20100
13,2 mL, certyfikowana bezpłatna cienkościenna ultraprzezroczysta probówka z otwartym dachem, 14 x 89 mmBeckman CoulterC14277
5x Bufor do próbekGenScriptMB01015
cOmplete, koktajl inhibitorów proteazy bez EDTARoche11873580001
COX IV (3E11) Technologiasygnalizacji komórkowej4850S Przeciwciałomonoklonalne królika do wykrywania COX IV.
CycloheximideSigma-AldrichC1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mlDWK Life Sciences357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z przeciwciałemHyCloneSH30021.01
ELMO1 o niskiej zawartości glukozy (B-7)Santa Cruz BiotechnologySC-271519Mysie przeciwciało monoklonalne do wykrywania ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi Kit PrzeciwciałoQIAGEN12362
FE65 (E-20)Santa Cruz BiotechnologySC-19751Przeciwciało poliklonalne Goat do wykrywania FE65.
Płodowa surowica bydlęca, HyClone klasy badawczejSV30160.03
Przeciwciało monoklonalne GAPDH (6C5)AmbionAM4300Mysie przeciwciało monoklonalne do wykrywania GAPDH.
Oprogramowanie ImageLabBio-RadPomiar natężenia pasma
ImidazolSigma-AldrichI2399
Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcjiInvitrogen11668019
Przeciwciało monoklonalne anty-β-COPSigmaG6160Mysie przeciwciało monoklonalne do wykrywania β-COP.
Myc-tag (9B11) mysia technologiasygnalizacji komórkowej2276SMysie przeciwciało monoklonalne do wykrywania białek znakowanych myc.
OmniPur EDTA, sól disodowa, dwuwodzianCalbiochem4010-OP
Optima L-100 XPBeckman Coulter392050
Optima MAX-TLBeckman CoulterA95761
Opti-MEM I Zredukowane podłoże surowicyGibco31985070
tabletki PBSGibco18912014
PhosSTOPRoche
Przeciwciało poliklonalne swoiste dla RAB11AProteintech20229-1-APKrólicze przeciwciało poliklonalne do wykrywania Rab11.
SacharozaAffymetrixAAJ21931A4
SW 41 Ti Rotor uchylno-kubełkowyBeckman Coulter331362
TLA-120.2 Rotor stałokątowyBeckman Coulter362046
Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaGibco25300062
mAb królika mAb 4906845001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
  2. Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
  3. Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
  4. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
  5. Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
  6. Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
  7. Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
  8. Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
  9. McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
  10. O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074(2020).
  11. D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).
  12. Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
  13. Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
  14. Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
  15. Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471(2019).
  16. Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
  17. Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074(2020).
  18. Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
  19. Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).
  20. Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
  21. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  22. Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
  23. Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
  24. Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
  25. Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
  26. Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
  27. Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
  28. Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
  29. Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
  30. Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
  31. Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).
  32. Rickwood, D., Graham, J. Centrifugation Techniques. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).
  33. Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
  34. Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transport endosomalnyendosomy recyklinguj cefrakcjonowanie kom rekwestern blottingregulacja ARF6marker Rab11transport bia ek

Powiązane artykuły