Prezentowany jest protokół ekspansji produktu leczniczego limfocytów T Gamma-Delta (γδ). Limfocyty są izolowane przez elutriację i wzbogacane γδ kwasem zoledronowym i interleukiną-2. Limfocyty T alfa-beta są wyczerpywane za pomocą klinicznego urządzenia do separacji magnetycznej. Komórki γδ są hodowane wspólnie z pochodzącymi z K562, sztucznymi komórkami prezentującymi antygen i ekspandowane.
Artykuł metodologiczny
Ekspansja i wzbogacanie limfocytów T gamma-Delta (γδ) z aferezowanego produktu ludzkiego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chociaż limfocyty T Vγ9Vδ2 stanowią niewielki podzbiór limfocytów T, ta populacja jest poszukiwana ze względu na jej zdolność do rozpoznawania antygenów w sposób niezależny od głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) i rozwijania silnej funkcji efektora cytolitycznego, co czyni ją idealnym kandydatem do immunoterapii raka. Ze względu na niską częstotliwość limfocytów T Gamma-Delta (γδ) we krwi obwodowej, opracowaliśmy skuteczny protokół do znacznego rozszerzenia produktu leczniczego limfocytów T γδ o wysokiej czystości do pierwszego zastosowania u ludzi allogenicznych limfocytów T γδ u pacjentów z ostrą białaczką szpikową (AML). Wykorzystując aferezę zdrowego dawcy jako allogeniczne źródło komórek, limfocyty izoluje się za pomocą zwalidowanego urządzenia do metody wirowania przeciwprądowego polegającej na rozdzielaniu komórek według wielkości i gęstości.
Wykorzystywana jest frakcja bogata w limfocyty, a limfocyty T γδ są preferencyjnie aktywowane kwasem zoledronowym (zatwierdzonym przez FDA) i interleukiną (IL)-2 przez 7 dni. Po preferencyjnej ekspansji limfocytów T γδ stosuje się kliniczne urządzenie do magnetycznej separacji komórek i kulki TCRαβ w celu wyczerpania zanieczyszczających receptora komórek T (TCR)αβ limfocytów T. Wysoko wzbogacone limfocyty T γδ przechodzą następnie drugą ekspansję przy użyciu zmodyfikowanych sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) pochodzących z komórek K562 - genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji jednołańcuchowego zmiennego fragmentu (scFv) dla CD3 i CD28, 41BBL (CD137L) i IL15-RA - wraz z kwasem zoledronowym i IL-2. Wysiew wszystkich 7 wzbogaconych limfocytów T γδ w kokulturze z aAPC ułatwia wytwarzanie wysoce czystych limfocytów T γδ o średniej krotnej ekspansji > 229 000 razy ze zdrowej krwi dawcy.
Wprowadzenie
Nawrót białaczki jest główną przyczyną śmiertelności po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych (HCT) u pacjentów z AML1,2,3. Lepsze przeżycie wolne od białaczki odnotowano wraz ze zwiększonym odzyskiwaniem limfocytów T γδ we krwi po HCT bez zwiększonego ryzyka choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD)4. Zdolność limfocytów T γδ do rozpoznawania antygenów w sposób niezależny od MHC i rozwijania silnych funkcji cytolitycznych i efektorowych podobnych do Th1 sprawia, że ta niewielka subpopulacja limfocytów T jest idealna do leczenia pacjentów z AML poddawanych przeszczepowi allogenicznemu zagrożonych nawrotem5. Biorąc pod uwagę, że limfocyty T Vγ9Vδ2 stanowią niewielki podzbiór limfocytów T w zakresie od 0,5% do 5% limfocytów T na peryferii6, postanowiliśmy stworzyć solidny system do rozszerzenia tej rzadkiej populacji komórek krwi w celu osiągnięcia potencjalnie terapeutycznych dawek do badań klinicznych.
Chociaż innym udało się rozwinąć limfocyty T γδ za pomocą kwasu zoledronowego, a nawet aAPC, my opracowaliśmy proces, który potencjalnie może zwiększyć limfocyty T γδ o 229 749 razy. Ekspansja jest dwufazowa: najpierw limfocyty uzyskuje się przez elutriację za pomocą przyrządu do separacji. Sprzęt zapewnia zamknięty system, który umożliwia separację komórek na podstawie ich rozmiaru, kształtu i gęstości za pomocą wirowania przeciwprądowego. Po wzbogaceniu na limfocyty, selektywną ekspansję limfocytów T Vγ9Vδ2 uzyskuje się poprzez leczenie kwasem zoledronowym i IL-2 przez 7 dni. Bezpośrednio po tym zabiegu limfocyty T TCR-αβ są wyczerpywane za pomocą technologii mikrokulek, co pozwala na późniejszą ekspansję limfocytów T γδ za pomocą aAPC pochodzących z K562.
Do walidacji procesu użyto tylko 5 × 106 limfocytów T γδ ekspandowanych kwasem zoledronowym do ekspansji kokultury fazy 2 z aAPC. W tej drugiej fazie ekspansji limfocyty T γδ są aktywowane przy użyciu aktualnego Banku Komórek Roboczych (WCB) zgodnego z Dobrymi Praktykami Produkcyjnymi (cGMP) genetycznie modyfikowanych aAPC pochodzących z K562 (K562VL6(scFv-CD3-41BBL; scFv-CD28-IL15-RA)) wyprodukowany w Moffitt. Uzasadnienie tej dwufazowej ekspansji opiera się na zdolności kwasu zoledronowego do hamowania syntazy difosforanu farnezylu (FDPS) w monocytach, co prowadzi do akumulacji pirofosforanu izopentenylu, który bezpośrednio stymuluje komórki Vγ2Vδ2. W drugiej fazie ekspansji aAPC pochodzące z K562 (K562VL6(scFv-CD3-41BBL; scFv-CD28-IL15-RA)) zapewniają silną stymulację wszystkich limfocytów T. Jednak produkt komórkowy został już wzbogacony o limfocyty T γδ, co spowodowało silną ekspansję limfocytów T γδ.
Dzięki zastosowaniu specjalnego sprzętu i kolb, proces ten jest funkcjonalnie zamkniętym systemem, co zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia. Ponadto bioreaktor o pojemności 1 l w systemie zamkniętym umożliwia maksymalny wzrost i ekspansję komórek w całkowitej objętości 1 l podłoża przy minimalnym zapotrzebowaniu na karmienie. Zaletą metody Moffitt jest to, że zapewnia ona szybki, powtarzalny i wysoce wykonalny system GMP do wytwarzania wysoce czystego, pochodzącego od dawcy produktu z komórek T γδ do podawania allogenicznego. Metodę tę można zastosować do każdego badania klinicznego, które ma na celu wykorzystanie ludzkich limfocytów T γδ eksprymujących receptory limfocytów T Vγ2Vδ2 jako immunoterapii adoptywnej w celu pośredniczenia w odporności na drobnoustroje i nowotwory u pacjentów z rakiem z częściową i całkowitą remisją. Ponadto stanowi solidną platformę do rozwoju i produkcji limfocytów T γδ z dodatnim receptorem antygenu chimerycznego (CAR+).
Protokół
UWAGA: Uzyskano zgodę IRB i uzyskano świadomą zgodę od darczyńców.
1. Izolacja limfocytów
- Przenieść produkt do aferezy do pomieszczenia czystego.
UWAGA: Walidacja procesu została przeprowadzona przy użyciu normalnej aferezy dawcy od zewnętrznego dostawcy komercyjnego zgodnego z przepisami dotyczącymi pobierania surowego materiału komórkowego. - Zbierz próbki do testów sterylności, liczby komórek i fenotypowania komórek.
- Elutriować na urządzeniu wirującym przeciwprądowym przy użyciu pierwotnego podłoża ze zbilansowanego roztworu soli Hanksa z 1% albuminą surowicy ludzkiej (HSA) i wtórnym podłożem roztworu soli (0,9% chlorku sodu do wstrzykiwań USP) lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS). Ustawić prędkość wirowania elutriacyjnego na 900 × g i zbierać frakcje w zależności od natężenia przepływu i czasu.
- Pobrać próbki z frakcji 2 i wykonać następujące testy: 2 ml do badania sterylności; 0,5 ml do badania liczby i żywotności komórek przy użyciu pomarańczy akrydynowej/jodku propidyny (AO/PI); 5 × 106 komórek do fenotypowania komórek metodą cytometrii przepływowej.
- Ekspandować czystą frakcję limfocytów (frakcję 2) komórek w hodowli w temperaturze 10 × 106 komórek/cm2 w bioreaktorze o pojemności 1 l w układzie zamkniętym z 5 μmol/l kwasu zoledronowego i 300 j.m./ml IL-2.
- Inkubować przez siedem dni w inkubatorze ustawionym w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
2. Zubożenie limfocytów T alfa-beta (αβ)
- Pobrać komórki z kolby bioreaktora o pojemności 1 l w układzie zamkniętym. Sterylnie przyspawać opakowanie transferowe o pojemności 1 litra do czerwonej linii bioreaktora w układzie zamkniętym i użyć odpowiedniej pompy farmaceutycznej do przeniesienia komórek do opakowania transferowego.
- Pobrać następujące próbki: 10 ml do sterylności zużytego podłoża; 0,5 ml komórek do zliczania i żywotności komórek przy użyciu AO/PI; 5 × 106 komórek do cytometrii przepływowej
- Ponownie zawiesić komórki na ~ 5 × 108 komórek/ml w buforze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub buforze (PBS/kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)) + 0,5% HSA i biotynylowanym przeciwciałie specyficznym TCR αβ.
- Umieścić shaker w lodówce i inkubować komórki w temperaturze 2-8 °C przez około 15 minut z wytrząsaniem.
- Umyj komórki łącznie 600 ml buforu PBS/EDTA + 0,5% HSA. Odwirować w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała w temperaturze 200-500 × g przez 15 minut w temperaturze 2-8 °C. Zawiesić ~5 × 108 komórek/ml w buforze PBS/EDTA + 0,5% HSA z mikrogranulkami specyficznymi dla antybiotyny (7,5 ml/1 fiolkę).
- Umieścić shaker w lodówce i inkubować komórki w temperaturze 2-8 °C przez około 15 minut z wytrząsaniem. Po inkubacji odwirować komórki w temperaturze 200–500 × g przez 15 minut w temperaturze 2–8 °C w celu usunięcia niezwiązanych mikrogranulek. Ponownie zawieś ~6 × 107 komórek/ml w buforze PBS/EDTA + 0,5% HSA i przenieś je do worka transferowego.
- Zainstaluj zestaw przewodów w magnetycznym urządzeniu do separacji komórek klasy klinicznej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta, umieść opakowania z buforem PBS/EDTA i pakiet transferowy z produktem komórkowym w instrumencie i nabij go zgodnie z instrukcjami instrumentu.
- Wybierz protokół Depletion 1.2 dla wyczerpania znakowanych limfocytów T αβ.
- Odwirować frakcję docelową (wzbogacone limfocyty T γδ) i ponownie zawiesić komórki w pożywce uzupełnionej 10% ludzką surowicą AB.
- Weź próbkę o objętości 0,5 ml i wykonaj zliczanie komórek i żywotność za pomocą barwienia AO/PI. Doprowadź komórki do końcowego stężenia około 1 × 106 komórek/ml. Pobrać próbkę składającą się z 5 × 106 komórek produktu do fenotypowania cytometrii przepływowej po wyczerpaniu.
3. Współkultura z APC
- Napromieniować 5 × 107 aAPC/kolbę o ciśnieniu 100 Gy na przyrząd do generowania promieniowania rentgenowskiego.
- Stosować aAPC w kohodowli w stosunku 10:1 z limfocytami T γδ. Umieścić napromieniowane aAPC (5 × 107 komórek/kolbę) i limfocyty T γδ (5 × 106 komórek/kolbę) umieścić w 1 l kolbach bioreaktora z systemem zamkniętym z 1 l pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% ludzką surowicą AB. Wysiewać do 10 kolb.
- Namnażać komórki w hodowli przez 10 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Monitoruj poziom glukozy i mleczanu co 3-4 dni za pomocą pasków, glukometru i glukometru.
- Jeśli poziom glukozy spadnie do 250 mg/dl, należy zmniejszyć objętość w kolbie do 200 ml za pomocą pompy farmaceutycznej poprzez sterylne spawanie opakowania transferowego o pojemności 1 litra do czerwonej linii bioreaktora w układzie zamkniętym.
- Wymieszaj komórki w pozostałych 200 ml i weź 0,5 ml próbki do zliczenia komórek i pomiaru żywotności za pomocą barwienia AO-PI. Jeśli liczba komórek wynosi ≥109, podzielić jedną kolbę na dwie kolby i napełnić każdą kolbę do objętości 1 l AIM-V uzupełnionym 10% ludzką surowicą AB. Jeśli liczba komórek wynosi <109, nakarm komórki świeżym litrem pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% ludzką surowicą AB.
- Powtórzyć krok 3.6 dla wszystkich kolb i umieścić je z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Powtarzaj kroki 3.4-3.7 co 3 do 4 dni.
4. Zbieranie komórek
- Pod koniec 10 dni w kokulturze należy zebrać wszystkie kolby bioreaktora. Zbierz po 1 kolbie bioreaktora na raz i zbierz wszystkie komórki w opakowaniu transferowym o odpowiedniej wielkości. Sterylnie zespawać pakiet transferowy do czerwonej linii bioreaktora w układzie zamkniętym i użyć pompy farmaceutycznej do przeniesienia komórek do pakietu transferowego.
- Usunąć następujące próbki kontroli jakości: 1% produktu leczniczego (DP) dla sterylności przez posiew krwi i barwienie metodą Grama; 0,5 ml dla zliczania i żywotności komórek przy użyciu AO/PI; 5-10 × 106 komórek do cytometrii przepływowej (patrz Rysunek 1 dla strategii bramkowania); 0,5 ml dla endotoksyny; 0,5 ml dla barwienia metodą Grama; 106 komórek wzbogaconych o 10 ml zużytej pożywki do badania Mykoplazmy.
- Odwirować komórki w temperaturze 200-500 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
- Umyj komórki w roztworze zrównoważonego roztworu krystaloidu + 0,5% HSA o stężeniu 200-500 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić je ponownie w docelowej objętości 100-300 ml zrównoważonego roztworu krystaloidu + 0,5% HSA.
5. Testowanie wersji
- Przeprowadzić badania kontroli jakości limfocytów T γδ DP pod kątem: czystości i tożsamości metodą cytometrii przepływowej (żywe/martwe, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); żywotności przez barwienie AO/PI; endotoksyny; Badanie mykoplazmy metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR); bezpłodność przez barwienie metodą Grama oraz tlenowe i beztlenowe posiewy krwi; resztkowy test K562 metodą cytometrii przepływowej (CD3-CD16-CD56-CD71+).
Wyniki
Proces otrzymywania limfocytów γδ T został scharakteryzowany i zoptymalizowany pod kątem produkcji produktu leczniczego z limfocytów γδ T. Optymalizacja procesu obejmowała: 1) wzbogacanie frakcji limfocytów za pomocą elutracji, 2) specyficzną dla komórek ekspansję substancji czynnej (DS) limfocytów γδ T z użyciem kwasu zoledronowego, 3) usuwanie TCRαβ z substancji czynnej (DS) limfocytów γδ T, 4) wtórną ekspansję substancji czynnej (DS) limfocytów γδ T przy użyciu aAPC pochodzących z linii K562 oraz 5) końcowe zbieranie produktu gotowego (DP) i jego formulację w celu podania lub krio konserwacji. Po optymalizacji procesu przeprowadzono serie potwierdzające w skali przemysłowej z wykorzystaniem materiału pochodzącego od trzech zdrowych dawców, aby potwierdzić przydatność procesu przetwarzania komórek. Wszystkie dane zostały przeanalizowane i podsumowano w Tabeli 1, Tabeli 2 oraz Tabeli 3. Komórki wyizolowane z frakcji 2 (F2) po wirowaniu przeciwprądowym stanowiły czystą populację limfocytów ze średnią zawartością 99,23% komórek CD45+ (podaną jako częstość w całkowitej bramce komórek żywych) i doskonałą średnią żywotnością na poziomie 95,80% (Tabela 1).
Specyficzna ekspansja komórek T γδ z zastosowaniem kwasu zoledronowego była zależna od początkowego odsetka komórek natural killer (NK) obecnych we frakcji limfocytów (F2) po elutriacji. Wzbogacenie DS komórek T γδ poprzez deplecję TCRαβ było spójne (Tabela 2). DP komórek T γδ otrzymane od trzech zdrowych dawców zawierały średnio 0,11% ± 0,05% limfocytów B CD20+ oraz 0,00% ± 0,00% limfocytów T TCR αβ+, spełniając tym samym kryterium zwolnienia ≤1% limfocytów T TCR αβ+. Średni odsetek komórek NK w produkcie końcowym wyniósł 17,06% ± 26,19%, co spełnia kryterium zwolnienia <35%. Dodatkowo średni odsetek komórek ujemnych pod względem linii komórek T i NK w produkcie końcowym wyniósł 0,48% ± 0,42% (Tabela 3). Do charakterystyki tożsamości, czystości oraz zanieczyszczeń procesowych DS i DP wykorzystano barwienie powierzchniowe komórek oraz analizę cytometryczną, co przedstawiono na Rysunku 2A-D.
Wtórna ekspansja, przeprowadzona w kokulturze banku komórek roboczych (WCB) aAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) oraz substancji wyjściowej (DS) limfocytów T γδ w stosunku 10:1, pozwoliła na otrzymanie produktu końcowego (DP) limfocytów T γδ, który spełniał wszystkie kryteria zwolnienia, co przedstawiono w Tabeli 4. Ponadto komórki barwiono i analizowano metodą cytometrii przepływowej w dniu 0 (komórki F2 po wirowaniu przeciwprądowym), w dniu 7 (limfocyty T rozszerzone kwasem zoledronowym), w dniu 7 (po deplecji limfocytów T TCR αβ) oraz w dniu 17 (końcowy DP) pod kątem następujących biomarkerów: klastra różnicowania (CD)3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, receptora chemokin CC 7 (CCR7), białka śmierci programowanej 1 (PD-1), białka 4 związanego z cytotoksycznymi limfocytami T (CTLA4), genu 3 aktywującego limfocyty (LAG3) oraz białka 3 zawierającego domenę immunoglobulinową i mucynową limfocytów T (TIM3). Dane przedstawione na Rysunku 3 są średnimi z trzech niezależnych serii i wykazują, że komórki nie osiągnęły stanu wyczerpania. Ośrodek Moffitt CTF opracował również test na resztkowe komórki K562, aby określić zanieczyszczenia w DP związane z aAPC pochodzącymi z linii K562 (Rysunek 4).
Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej wykorzystana do określenia odsetka typów komórek była następująca: 1) bramkowanie na populację negatywną pod względem linii komórek T i NK (CD3-CD56-CD16-); 2) bramkowanie na CD71+ (receptor transferryny eksprymowany w linii erytroidalnej i AML, umożliwiający wykrycie pozostałych komórek K562). Ta strategia bramkowania pozwoliła na ocenę komórek CD3-CD16-CD56-CD71+, które stanowią aAPC (K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) WCB (określone jako „pozostałe K562” na Rysunku 4). Bramkowanie to umożliwia wyliczenie liczby pozostałych komórek K562 w końcowym DP poprzez pomnożenie częstości występowania pozostałych komórek K562 przez całkowitą liczbę żywych komórek (TVC) w DP (%CD71+ × DP TVC = pozostałe komórki K562 w DP). Wszystkie dane z cytometrii przepływowej przedstawiono jako częstość występowania żywych komórek. Tabela 5 oraz Rysunek 4 zawierają odsetki komórek negatywnych pod względem linii komórek T i NK, a także pozostałych komórek K562. W celu określenia istotności statystycznej różnic między tymi populacjami przeprowadzono dwustronny test t, który wykazał istotną różnicę między WCB a DP komórek T γδ oraz między WCB a komórkami T γδ (t = 0,0019 dla linii negatywnej komórek T i NK; t < 0,0001 dla pozostałych K562 oraz t = 0,0314 dla linii negatywnej komórek T i NK; t < 0,0001 dla pozostałych K562) (Tabela 5).
Rycina 1: Schematyczna reprezentacja strategii bramkowania w cytometrii przepływowej. Skróty: aAPC = sztuczna komórka prezentująca antygen; SSC-A = powierzchnia sygnału bocznego rozproszenia; FSC-A = powierzchnia sygnału przedniego rozproszenia; SSC-H = wysokość sygnału bocznego rozproszenia; FSC-H = wysokość sygnału przedniego rozproszenia; CD = klaster różnicowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Skład materiału wyjściowego, produktów pośrednich i końcowego produktu leczniczego. Wszystkie przedstawione dane są średnimi z trzech niezależnych serii. (A) Materiał z aferezy od zdrowych dawców poddawany jest elutracji przy użyciu urządzenia do wirowania przeciwprądowego, w wyniku czego otrzymuje się F2 (frakcję bogatą w limfocyty), która służy jako materiał wyjściowy. (B) F2 poddawana jest specyficznej ekspansji limfocytów T Vγ9Vδ2 przez 7 dni z dodatkiem 5 µmol/L kwasu zoledronowego i 300 IU/mL IL-2 w 1 L pożywki uzupełnionej 10% ludzką surowicą grupy AB. (C) Produkt po ekspansji kwasem zoledronowym poddawany jest deplecji limfocytów T TCR αβ. (D) Wysokiej czystości produkt leczniczy zawierający limfocyty T γδ jest pozyskiwany po drugiej, 10-dniowej ekspansji z napromienionymi aAPC w stosunku 1:10 z dodatkiem 5 µmol/L kwasu zoledronowego i 300 IU/mL IL-2 w 1 L pożywki uzupełnionej 10% ludzką surowicą grupy AB. Skróty: NK = komórki natural killer; CD = klaster różnicowania; TCR = receptor limfocytów T; IL = interleukina; aAPCs = sztuczne komórki prezentujące antygen. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Biomarkery materiału wyjściowego, produktów pośrednich i końcowego produktu leczniczego. Komórki są zbierane i barwione pod kątem CD3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CCR7, PD-1, CTLA4, LAG3 oraz TIM3 w Dniu 0 – komórki F2 po wirowaniu przeciwprądowym, Dniu 7 – limfocyty T po ekspansji kwasem zoledronowym, Dniu 7 – po deplecji limfocytów T TCR αβ oraz Dniu 17 – końcowy produkt leczniczy. Wszystkie przedstawione dane są uśrednione z trzech niezależnych serii. (A) Komórki typu macierzystego (CD3+, TCR γδ+, CD45RA+, CD45RO- oraz CCR7+) przedstawione jako całkowita liczba żywych komórek. (B) Komórki pamięci centralnej (CD3+, TCR γδ+, CD45RA-, CD45RO+ oraz CCR7+) przedstawione jako procent komórek CD3+ TCR γδ+. Skróty: CD = cluster of differentiation; TCR = receptor limfocytów T; IL = interleukina; CCR7 = receptor chemokin CC 7; PD-1 = programowana białko śmierci komórkowej 1; CTLA4 = białko 4 towarzyszące cytotoksycznym limfocytom T; LAG3 = gen aktywujący limfocyty 3; TIM3 = białko 3 zawierające domenę immunoglobuliny i mucyny limfocytów T. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Reprezentatywne dane z testu pozostałości komórek K562(CD3-CD16-CD56-CD71+). Skróty: aAPC = sztuczna komórka prezentująca antygen; NK = komórka natural killer; SSC-A = pole rozproszenia bocznego szczytu; CD = klaster różnicowania; IL = interleukina; TCR = receptor limfocytów T; MCB = główny bank komórek; FMO = fluorescence minus one; DP = produkt leczniczy; WCB = roboczy bank komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
| Etapy procesu | Parametry | Dawcy | Średnia | Odchylenie std. | |||
| Seria 1 | Seria 2 | Seria 3 | |||||
| Po wzbogaceniu (frakcja limfocytów F2) | Wszystkie walidacje procesu TVC zostały zaszczepione w ilości 109 TVC | 1.00 X 109 | 1.00 X 109 | 1.00 X 109 | 1.00 X 109 | 0.00 | |
| Żywotność (%) | 98.6 | 96.6 | 92.2 | 95.8 | 3.27 | ||
| Limfocyty B CD20+ (%) | 15.6 | 23.4 | 15.2 | 18.07 | 4.62 | ||
| Limfocyty T CD3+ (%) | 80.04 | 66.7 | 76.1 | 74.28 | 6.85 | ||
| TCR αβ+ (%) | 77.59 | 58.03 | 68.96 | 68.19 | 9.8 | ||
| TCR γδ+ (%) | 2.48 | 1.59 | 2.1 | 2.06 | 0.45 | ||
| Komórki NK CD3-CD56+CD16+ (%) | 6.57 | 19.4 | 10.5 | 12.16 | 6.57 | ||
| Komórki z linią limfocytów T i NK ujemną (%) | 13 | 13.7 | 13.4 | 13.37 | 0.35 | ||
Tabela 1: Podsumowanie wzbogacania limfocytów metodą elutracji przedstawione jako częstość występowania żywych komórek.Skróty: TVC = całkowita liczba żywych komórek; TCR = receptor komórek T; CD = klastry różnicowania; NK = komórka natural killer.
| Etapy procesu | Parametry | Dawcy | Średnia | odch. std. | |||
| Próba 1 | seria 2 | seria 3 | |||||
| 7-dniowa ekspansja po podaniu kwasu zoledronowego (przed deplecją TCRαβ) | TVC (całkowita liczba drobnoustrojów) | 3,69 X 109 | 1,79 X 109 | 1,42 X 109 | 2,3 X 109 | 1,22 X 109 | |
| Żywotność (%) | 99.2 | 82.6 | 89.8 | 90.53 | 8.32 | ||
| CD20+ Limfocyty B | 2.1 | 11.5 | 7.08 | 6.89 | 4.7 | ||
| CD3+ limfocyty T (%) | 95.7 | 64.1 | 91.9 | 83.9 | 17.25 | ||
| TCR αβ+ (%) | 13.88 | 38.14 | 31.98 | 28 | 12.61 | ||
| TCR γδ+ (%) | 81.44 | 24.93 | 56.98 | 54.45 | 28.34 | ||
| CD3-CD56+CD16+ komórki NK (%) | 3.59 | 33.1 | 7.28 | 14.66 | 16.08 | ||
| Odsetek komórek z linii T i NK ujemnych (%) | 0.67 | 2.7 | 0.82 | 1.4 | 1.13 | ||
| Po usunięciu TCRαβ | całkowita liczba mikroorganizmów (TVC) | 1,81 x 109 | 4,95 X 108 | 3,80 X 108 | 8,95 X108 | 7,94 X 108 | |
| Żywotność komórek (%) | 98.8 | 87.6 | 89.8 | 92.07 | 5.93 | ||
| CD20+ limfocyty B | 2.26 | 12 | 6.59 | 6.95 | 4.88 | ||
| CD3+ limfocyty T (%) | 95.8 | 45.3 | 89.7 | 76.93 | 27.56 | ||
| TCR αβ+ (%) | 0 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | ||
| TCR γδ+ (%) | 95.61 | 45.07 | 89.16 | 76.61 | 27.51 | ||
| CD3-CD56+CD16+ komórki NK (%) | 3.85 | 59.9 | 9.79 | 24.51 | 30.79 | ||
| Odsetek komórek z linii limfocytów T i NK ujemny (%) | 0.34 | 1.72 | 0.45 | 0.84 | 0.77 | ||
| TCR αβ+ TVC | 0.00 | 4,95 x 103 | 3,8 x 103 | 2,92 x 103 | 2,59 X 103 | ||
| TCR γδ+ TVC | 1,73 X 109 | 2,23 X 108 | 3,39 x 108 | 7,64 X 108 | 8,39 x 108 | ||
| CD3-CD56+CD16+ NK TVC | 6,97 X 107 | 2,97 x 108 | 3,72E+07 | 1,35 x 108 | 1,42 X 108 | ||
Tabela 2: Podsumowanie ekspansji limfocytów T γδ z kwasem zoledronowym i wzbogacenia instrumentalnego raportowanego jako częstość występowania żywych komórek. Skróty:TVC = całkowita liczba żywych komórek; TCR = receptor limfocytów T; CD = klaster różnicowania; NK = komórka natural killer.
| Atrybuty produktu | Parametry | Dawcy | Średnia | Odch. std. | |||
| Seria 1 | Seria 2 | Seria 3 | |||||
| Komórki γδ T w dniu 0 | 2.48 X 107 | 1.59 X 107 | 2.10 X 107 | 2.06 X 107 | 4.47 X 107 | ||
| Komórki γδ T w dniu 7 po wzbogaceniu | 1.73 X 109 | 2.23 X 108 | 3.39 X 108 | 7.64 X 108 | 8.39 X 108 | ||
| Krotność ekspansji w dniu 7 | 69.76 | 14.03 | 16.14 | 33.31 | 31.58 | ||
| TVC podczas zbioru* | 8.14 X 1010 | 1.67 X 1010 | 6.84 X 1010 | 5.55 X 1010 | 3.42 X 1010 | ||
| Żywotność komórek (%) | 92.8 | 85.5 | 87.3 | 88.53 | 3.80 | ||
| Komórki B CD20+ (%) | 0.12 | 0.06 | 0.15 | 0.11 | 0.05 | ||
| Komórki T CD3+ (%) | 97.8 | 52 | 97.5 | 82.43 | 26.36 | ||
| TCR αβ+ (%) | 0 | 0.001 | 0 | 0.00 | 0.00 | ||
| TCR γδ+ (%) | 97.51 | 50.13 | 97.21 | 81.62 | 27.27 | ||
| Komórki NK CD3-CD56+CD16+ (%) | 2.16 | 47.3 | 1.71 | 17.06 | 26.19 | ||
| Pozostałe K562 CD71+, ujemne pod względem linii komórek T i NK (%) | 0.018 | 0.61 | 0.82 | 0.48 | 0.42 | ||
| Całkowita liczba komórek γδ T podczas zbioru | 7.93 X 1012 | 8.38 X 1011 | 6.65 X 1012 | 5.14 X 1012 | 3.78 X 1012 | ||
| Całkowita krotność ekspansji komórek γδ T (od dnia 0 do zbioru) | 3.20 X 105 | 5.27 X 104 | 3.17 X 105 | 2.30 X 105 | 1.53 X 105 | ||
| *Walidacja procesu została zredukowana do kolby z 5 X 106 komórkami γδ T i 50 X 106 napromieniowanymi aAPC. Przedstawione liczby dotyczą planowanej serii w pełnej skali, przy założeniu wysiania 24 kolb z substancji leczniczej z dnia D7. | |||||||
Tabela 3: Podsumowanie kokultury limfocytów γδ+ T z aAPC oraz zbioru namnożonych limfocytów γδ+ T przedstawionego jako częstotliwość żywych komórek. *Walidacja procesu została zredukowana do jednego bioreaktora w systemie zamkniętym (pojemność 1 L) z 5 × 106 limfocytów γδ T i 50 × 106 napromieniowanych aAPC. Przedstawione liczby dotyczą projektowanego procesu w pełnej skali, jeśli z substancji leczniczej z dnia 7 (D7) zaszczepionych zostanie 24 kolby. Skróty: aAPCs = sztuczne komórki prezentujące antygen; TVC = całkowita liczba żywych komórek; TCR = receptor limfocytów T; CD = klastry różnicowania; NK = komórki natural killer.
| Parametr testu | Kryteria akceptacji | Wyniki | ||
| Walidacja 1 | Walidacja 2 | Walidacja 3 | ||
| Żywotność | ≥ 70% | 92.80% | 85.50% | 87.30% |
| Mykoplazmy | Negatywny | Negatywny | Negatywny | Negatywny |
| Sterylność | Brak wzrostu końcowego (14 dni) | Brak wzrostu końcowego (14 dni) | Brak wzrostu końcowego (14 dni) | Brak wzrostu końcowego (14 dni) |
| Barwienie metodą Grama | Nie stwierdzono organizmów (NOS) | NOS | NOS | NOS |
| Endotoksyna | ≤ 2 EU/mL | <0.50 EU/mL | <0.50 EU/mL | <0.50 EU/mL |
Tabela 4: Podsumowanie wyników testów kontroli jakości dla limfocytów γδ T.
| Analiza pozostałości komórek K562 | K562 | WCB | Wyłącznie γδ | Produkt γδ + WCB | ||||
| % komórek z linii T i NK neg. | % pozostałości K562 | % komórek z linii T i NK neg. | Procent pozostałych komórek K562 | % komórek z linii T i NK neg. | Procent pozostałych komórek K562 | % linii komórek T i NK neg. | Procent pozostałych komórek K562 | |
| 99.4 | 98.8 | 98.7 | 96.83 | 3.49 | 0.58 | 0.48 | 0.07 | |
| 99.2 | 98.31 | 99.5 | 98.21 | 12.8 | 0.38 | 3.87 | 0.71 | |
| 98.9 | 98.6 | 97.6 | 95.55 | N/A | Brak danych | 14.4 | 0.63 | |
| 99.2 | 98.9 | 97.9 | 96.53 | Nie dotyczy | Brak danych | Brak danych | Brak danych | |
| 98.7 | 98.3 | 98.6 | 97.6 | Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do tłumaczenia. | Nie dotyczy | Nie dotyczy | Brak danych | |
| Średnia | 99.08 | 98.58 | 98.46 | 96.94 | 8.15 | 0.48 | 6.25 | 0.47 |
| Odch. std. | 0.28 | 0.27 | 0.74 | 1.02 | 6.58 | 0.14 | 7.26 | 0.35 |
Tabela 5: Procentowy udział komórek linii T i NK ujemnych oraz pozostałych komórek K562, przedstawiony jako częstość występowania wśród żywych komórek. Skróty: NK = komórka natural killer; WCB = roboczy bank komórek.
Dyskusja
Laboratorium Terapii Komórkowej Moffit opracowało protokół z dwufazową ekspansją limfocytów T γδ o wysokiej czystości do stosowania jako DP w badaniach klinicznych. Protokół ten zapewnia metodę produkcji zgodnie z wytycznymi cGMP w zamkniętym systemie, który daje wysoce czystą limfocyt T γδ DP, która jest z powodzeniem aktywowana i namnażana przez kwas zoledronowy i aAPC WCB. Protokół ten został zatwierdzony przez FDA do produkcji allogenicznego limfocytu T γδ DP dla pacjentów z AML. Korzystając ze zdrowych dawców, udało nam się powiększyć małą populację limfocytów T γδ dawcy w ciągu zaledwie 7 dni z 2,06 ± 0,45% do 54,45 ± 28,34%. Po 7-dniowej ekspansji kwasem zoledronowym zaobserwowano, że donor 2 miał wzrost populacji NK.
Kwas zoledronowy hamuje syntazę difosforanu farnezylu (FDPS) w monocytach, co z kolei prowadzi do akumulacji pirofosforanu izopentenylu (IPP), co jest skorelowane ze znacznym wzrostem proliferacji limfocytów T i naturalnych komórek NK 7,8,9. Ta zwiększona populacja NK utrudniadrugą fazę ekspansji za pomocą aAPC, ponieważ aAPC przyczynią się tylko do dalszej ekspansji komórek NK. Z tego powodu kryteria dawstwa zostały zmodyfikowane tak, aby wykluczyć dawców o wysokiej populacji NK. Po wyczerpaniu limfocytów T αβ, limfocyty T γδ zostały dodatkowo wzbogacone do 76,61 ± 27,51%. Ten unikalny protokół obejmuje drugą ekspansję wykorzystującą aAPC wyprodukowane przez Moffit do celowania w receptory CD8, CD28 i CD127L w komórkach T γδ. Ta druga faza ekspansji z aAPC dała DP z ≥65% dla limfocytów T CD3 + TCR γδ +, ≤1% TCRαβ T i <35% komórek NK CD3-CD16 + CD56 +. Ze względu na zastosowanie transporterów opancerzonych pochodzących z K562 konieczne było wykazanie, że stanowią one <1% produktu końcowego.
Firma Moffit CTF opracowała test cytometrii przepływowej stosowany jako kryteria uwalniania do pomiaru procentu pozostałych komórek K562 w końcowym DP. Ten test cytometrii przepływowej łagodzi wszystkie problemy związane z wykorzystaniem antygenów powierzchniowych komórek do identyfikacji komórek K562. Ponieważ aktywowane limfocyty T mogą wyrażać CD71, opracowaliśmy strategię wykluczenia wszystkich limfocytów T i komórek NK poprzez bramkowanie na populacjach CD3-CD56- i CD16, a następnie badanie komórek CD71 +, które byłyby wyłącznie komórkami K562. Protokół ten pokazuje, że limfocyt T γδ DP daje 0,48 ± 0,42% pozostałych komórek K562 i spełnia wszystkie kryteria uwalniania ≥70% żywotności, ujemności Mykoplazmy metodą PCR, braku organizmów widocznych w barwieniu metodą Grama, ≤2 EU/ml endotoksyny i braku końcowej (14 dni) sterylności posiewu krwi we wzroście.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Celluracions-Investigator Initiated Trials Award Intramural Funding Opportunity z Moffitt Cancer Center za udostępnienie funduszy na rozwój tego protokołu. Dziękujemy również dr Claudio Anasettiemu za jego nieocenioną pomoc i wskazówki w tym projekcie. Na koniec dziękujemy dr Justinowi Boucherowi za jego spostrzeżenia i recenzję manuskryptu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Hanks Zrównoważony roztwór soli | R& D | 285-GMP | |
| Albumina ludzka 25% | Grifolis | 65483-16-071 | |
| Plasmalyte A | Fisher | 2B2543Q | |
| Kwas zoledronowy (Zometa) | Hos pira | 4215-04-8 | Lek zatwierdzony przez FDA |
| DMSO | WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH | WAK-DMSO-10 | |
| CS10 | ROZTWORY BIOLIFE | 210374 | |
| 3 ml strzykawka | BD | 309657 | |
| 10 ml strzykawka | BD | 309604 | |
| 20 ml strzykawka | BD | 302830 | |
| Strzykawka 50 ml | BD | 309653 | |
| Strzykawka 100 ml | JMS | 992861 | |
| 18g Igła | Fisher | 305198 | |
| Cryovials 1,8 ml | Fisher | 375418 | |
| Pipeta 5 ml | Fisher | 1367811D | |
| Pipeta 50 ml | Fisher | 1367610Q | |
| Pipeta 10 ml | Fisher | 1367811E | |
| Pipeta 100 ml | Fisher | 07-200-620 | |
| 15 ml stożkowa | Fisher | 05-539-12 | |
| 50 ml stożkowa | Fisher | 05-539-7 | |
| 250 ml stożkowa | Fisher | 430776 | |
| 600 ml Pakiet transferowy | TERUMO BCT INC | 1BBT060CB71 | |
| 4" Zestaw do transferu osocza | INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES | 03-220-90 | |
| Zestaw węży Elutra | TerumoBCT | 70800 | |
| 100 MCS GREX | WILSON WOLF MFG CORP | 81100-CS | |
| Ashton Sterylny system | dozowania płynów PumpmaticFisher Scientific | 22-246660 | |
| Osłona pompy akacjowej | MPS Medical In | 17789HP3MLL | |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec Inc | 130-070-525 | |
| Dornase Alpha | Genentech, Inc | 50242-100-40/186-0055 | Zatwierdzony przez FDA lek |
| 1000 ml 0,22 um Filtr | Fisher | 157-0020 | |
| Filtr krwi 170um | B. Zestaw węży Braun | V2500 | |
| CliniMACs | Miltenyi Biotec Inc | 130-090-719 | |
| CliniMACS TCRα/β Zestaw | Miltenyi Biotec Inc | 130-021-301 | |
| Zestaw krwi grupy Y | Fenwal | FWL4C2498H | |
| 75 ml Kolba | Fisher | 430641U | |
| IL-2 | Prometheus | 65483-116-071 | Zatwierdzony przez FDA lek |
| AIM-V | Fisher | 0870112BK | |
| Ludzka surowica AB | Gemini Bio-Product | 100H41T | |
| 3-litrowy pakiet transferowy | Independent Medical Associates | T3109 | |
| 1000 końcówki do pipet | Fisher Scientific | 5991040 | |
| CF-250 | KOLBio | CF-250 | |
| Elutra | TERUMOBCT | ||
| CliniMACS | Miltenyi Biotec Inc | ||
| GatheRex Płynna obsługa, pompa do zbierania komórek | WILSON WOLF MFG Inkubator | ||
| HERAcell Vios | Thermo Scientific |
Bibliografia
- Bejanyan, N., et al. Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).
- Bejanyan, N., et al. Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).
- Schmid, C., et al. Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation. Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).
- Siegers, G. M., et al. Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model. PLoS One. 6 (2), 16700(2011).
- Airoldi, I., et al. γδ T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-αβ+/CD19+ lymphocytes. Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).
- Acuto, O., et al. The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors. Cell. 34 (3), 717-726 (1983).
- Xiao, L., et al. Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells. Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).
- Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. In vitro expansion of Vγ9Vδ2 T cells for immunotherapy. Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).
- Xu, Y., et al. Allogeneic Vγ9Vδ2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer. Cellular & Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).
Przedruki i uprawnienia
