Artykuł metodologiczny

System OnePot PURE bezkomórkowy

DOI:

10.3791/62625

⸱

23 czerwca 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Bioengineering, School of Engineering, École Polytechnique Fédérale de Lausanne

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy szybką i opłacalną metodę produkcji rekombinowanego, bezkomórkowego systemu TX-TL PURE przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdefiniowany system transkrypcji i translacji PURE (synteza białek przy użyciu elementów rekombinowanych) stanowi atrakcyjną podstawę dla bezkomórkowej biologii syntetycznej. Niestety, dostępne na rynku systemy są kosztowne, a ich możliwość dostrajania jest ograniczona. Dla porównania, domowe podejście można dostosować do potrzeb użytkownika. Jednak przygotowanie domowych systemów jest czasochłonne i żmudne ze względu na konieczność rybosomów, a także 36 oczyszczania białek na średnią skalę. Usprawnienie oczyszczania białek poprzez kokulturację i kooczyszczanie pozwala zminimalizować wymagania czasowe i pracochłonne. Poniżej przedstawiamy łatwą, regulowalną, efektywną czasowo i kosztowo metodę produkcji wszystkich elementów systemu PURE w ciągu 1 tygodnia, przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. Co więcej, wydajność OnePot PURE jest porównywalna z dostępnymi na rynku systemami. Metoda przygotowania OnePot PURE rozszerza dostępność systemu PURE na większą liczbę laboratoriów ze względu na swoją prostotę i opłacalność.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy transkrypcyjno-translacyjne (TX-TL) bez komórek stanowią obiecującą platformę do badania i inżynierii systemów biologicznych. Zapewniają one uproszczone i regulowane warunki reakcji, ponieważ nie polegają już na procesach podtrzymujących życie, w tym na wzroście, homeostazie lub mechanizmach regulacyjnych1. W związku z tym przewiduje się, że systemy bezkomórkowe przyczynią się do badania systemów biomolekularnych, stworzą ramy do testowania racjonalnych strategii bioprojektowania2 i zapewnią podwozie dla przyszłej komórki syntetycznej3,4. W pełni rekombinowany system PURE oferuje szczególnie atrakcyjną obudowę ze względu na swój zdefiniowany i minimalistyczny skład, a także możliwość regulacji i strojenia5.

Od czasu powstania pierwszego funkcjonalnego, w pełni rekombinowanego systemu PURE w 2001 roku5, podjęto wysiłki w celu rozszerzenia limitów systemu i optymalizacji składu systemu w celu poprawy wydajności systemu6,7,8, pozwala na regulację transkrypcji9, membrane10,11 i synteza białek wydzielniczych12, oraz w celu ułatwienia składania białek13,14. Obecnie na rynku dostępne są trzy systemy: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) i Magic PURE (Creative Biolabs). Systemy te są jednak kosztowne, ich dokładny skład jest zastrzeżony, a zatem nieznany, a możliwości adaptacji są ograniczone.

Systemy PURE przygotowane we własnym zakresie okazały się najbardziej opłacalną i możliwą do dostosowania opcją15,16. Jednak wymagane 37 etapów oczyszczania frakcji białkowych i rybosomów jest czasochłonne i żmudne. Podjęto kilka prób poprawy efektywności systemu PURE preparation17,18,19. Niedawno wykazaliśmy, że możliwa jest kokultura i kooczyszczanie wszystkich wymaganych białek nierybosomalnych obecnych w systemie PURE. Ta metoda OnePot okazała się opłacalna i efektywna czasowo, skracając czas przygotowania z kilku tygodni do 3 dni roboczych. W wyniku tego podejścia powstał system PURE o zdolności produkcji białek porównywalnej z dostępnym na rynku systemem PURExpress system20. W przeciwieństwie do poprzednich podejść mających na celu uproszczenie PURE preparation17,18,19, w podejściu OnePot wszystkie białka są nadal wyrażane w oddzielnych szczepach. Dzięki temu użytkownik może dostroić skład systemu OnePot PURE, po prostu pomijając lub dodając określone szczepy lub dostosowując objętość inokulacji, generując w ten sposób odpowiednio systemy dropout PURE lub zmieniając końcowe proporcje białka.

Przedstawiony tutaj protokół zawiera szczegółową metodę tworzenia systemu OnePot PURE, jak opisano wcześniej20, chociaż β-merkaptoetanol został zastąpiony tris(2-karboksyetylo)fosfiną (TCEP). Ponadto opisano dwie metody oczyszczania rybosomów: tradycyjne oczyszczanie rybosomów bez znaczników za pomocą interakcji hydrofobowej i poduszki sacharozy, zaadaptowane z Shimizu et al.15, oraz oczyszczanie rybosomów Ni-NTA oparte na Wang et al.18 i Ederth et al.21, ale znacznie zmodyfikowane. Ta ostatnia metoda dodatkowo ułatwia przygotowanie systemu PURE i sprawia, że jest on dostępny dla większej liczby laboratoriów, ponieważ wymagany jest tylko standardowy sprzęt laboratoryjny.

Protokół eksperymentalny podsumowuje przygotowanie wszechstronnego systemu TX-TL do wykorzystania w systemie PURE bez komórek, aby zapewnić prostą, dostrajalną, opłacalną platformę bezkomórkową, którą można przygotować przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego w ciągu tygodnia. Oprócz wprowadzenia standardowego składu PURE, wskazujemy, jak i gdzie można go dostosować, koncentrując się przede wszystkim na krytycznych krokach w protokole w celu zapewnienia funkcjonalności systemu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ten protokół opisuje przygotowanie bezkomórkowego systemu TX-TL z rekombinowanych komponentów. Dla wygody praca jest podzielona na pięć części. W pierwszej części opisano kroki przygotowawcze, które należy wykonać przed rozpoczęciem protokołu. W drugiej części opisano sposób przygotowania roztworu białkowego OnePot. Trzecia część opisuje oczyszczanie rybosomów, czwarta część szczegółowo opisuje przygotowanie roztworu energetycznego, a ostatnia część zawiera instrukcję konfiguracji reakcji PURE. Dla wygody protokoły są podzielone na dni i podsumowane w harmonogramach dziennych w tabeli 1. Zgodnie z harmonogramem, cały system może zostać przygotowany w ciągu 1 tygodnia przez jedną osobę.

1. Prace wstępne

  1. Przygotować pożywki do hodowli bakterii i suplementy pożywki zgodnie z opisem w tabeli uzupełniającej 1. Przygotuj i wysterylizuj wymagane materiały, w tym końcówki do pipet, 96 płytek głębinowych.
  2. Przygotowanie szczepu
    1. Przekształć szczepy ekspresji wskazane w tabeli 2 z odpowiadającymi im wektorami ekspresji przy użyciu metody szoku cieplnego.
      1. Dodaj oczyszczony plazmid do chemicznie kompetentnych bakterii i inkubuj na lodzie przez 20-30 minut.
      2. Umieść mieszaninę w temperaturze 42 °C na 30 s (szok cieplny), a następnie umieść ją z powrotem na lodzie na 2 minuty.
      3. Pobrać pipetą 20 μl bakterii bezpośrednio na płytki agarowe zawierające ampicylinę (AMP) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
      4. Zaszczepić 3 ml pożywki LB zawierającej AMP pojedynczą kolonią bakterii z płytek agarowych. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 260 obr./min przez noc.
      5. Zmieszać 250 μl kultury z 250 μl 50% (v/v) glicerolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
        UWAGA: W celu szybszego przygotowania w przyszłości, przechowuj szczepy na 96-dołkowej płytce jako zapasy glicerolu.
    2. Potwierdź wszystkie transformacje wektorowe za pomocą PCR kolonii i sekwencjonowania. Zsekwencjonuj gen, region promotora i miejsce wiązania rybosomów.
  3. Test ekspresji
    1. Zaszczepić 300 μl pożywki LB zawierającej AMP około 1 μl przygotowanych zapasów glicerolu na płytce o pojemności 1,3 ml z głęboką studzienką. Uszczelnić płytkę oddychającą membraną, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 260 obr./min przez noc.
      UWAGA: W tym momencie wszystkie wyrażenia są wykonywane osobno.
    2. Zaszczepić 300 μl świeżej pożywki LB zawierającej AMP z 1 μl nocnych kultur. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 260 obr./min przez noc. Po 2 godzinach indukuj komórki 100 μM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i hoduj przez dodatkowe 3 godziny.
    3. Zmieszać 10 μl kultury z 10 μl 2x buforu Laemmli i podgrzewać do 95 °C przez 10 min. Wirować próbki przez 1 minutę za pomocą wirówki stołowej i załadować 10 μl supernatantu do żelu PAGE. Uruchomić żel w buforze Tris/Glycine/SDS pod napięciem 200 V przez 30 minut. Dobrze spłucz wodą dejonizowaną. Przykryj żel barwnikiem białkowym Coomassie i inkubuj przez 1 godzinę. W razie potrzeby odbarwić żel w wodzie (reprezentatywne wyniki dla testu ekspresji w Rysunek 1).
      UWAGA: Użyj gradientowych (4%-15% lub 4%-20%) żeli PAGE, aby uzyskać dobrą separację.
  4. Renowacja i czyszczenie żywicy IMAC Sepharose
    1. Przygotowanie kolumny.
      1. Dobrze wymieszaj żywicę Sepharose przez wirowanie.
      2. Odpipetować wymaganą ilość żywicy do pustej kolumny przepływu grawitacyjnego.
        UWAGA: Wymagana ilość żywicy różni się w zależności od oczyszczania rybosomów Hisa i oczyszczania białka i jest określona w odpowiednich sekcjach.
      3. Umyj żywicę 30 ml wody dejonizowanej.
      4. Kontynuować napełnianie kolumny, jak określono w sekcji 1.4.4.
        UWAGA: Zawsze pozwól, aby cała ciecz przeszła przez kolumnę przed przejściem do następnego kroku. Upewnij się jednak, że kolumna nigdy nie wyschnie. Za każdym razem, gdy przepuszczasz jakąkolwiek ciecz przez kolumnę, upewnij się, że zatrzymałeś przepływ lub przejdź do następnego kroku, gdy tylko ciecz dotrze do żywicy.
    2. odbudowa.
      1. Umyj kolumnę 30 ml wody dejonizowanej.
      2. Nałożyć 10 ml 0,2 M roztworu EDTA i 0,5 M NaCl.
      3. Dodać 30 ml 0,5 M roztworu NaCl.
      4. Przemyć kolumnę 50 ml wody dejonizowanej.
      5. Przechowywać w 20% (v/v) etanolu w temperaturze 4 °C lub przejść do następnego kroku.
    3. Czyszczenie.
      UWAGA: Nosić sprzęt ochronny.
      1. Przemyć kolumnę 30 ml 0,5 M NaOH.
      2. Umyj kolumnę 30 ml wody dejonizowanej.
      3. Przemyć kolumnę 30 ml 0,1 M kwasu octowego.
      4. Umyj kolumnę 30 ml wody dejonizowanej.
      5. Przemyć kolumnę 30 ml 70% (v/v) etanolu.
      6. Przemyć kolumnę 50 ml wody dejonizowanej.
      7. Przechowywać w 20% (v/v) etanolu w temperaturze 4 °C lub przejść do następnego kroku.
    4. Ponowne ładowanie.
      1. Dodać 10 ml 0,1 M roztworu siarczanu niklu do kolumny.
        UWAGA: Siarczan niklu jest toksyczny. Odpady siarczanu niklu należy wyrzucać z zachowaniem środków ostrożności wskazanych przez dostawcę.
      2. Przemyć kolumnę 50 ml wody dejonizowanej.
      3. Przechowywać w 20% ((v/v)) etanolu w temperaturze 4 °C lub kontynuować wyrównywanie kolumny.
        UWAGA: Jeśli kolumna jest przechowywana w etanolu między etapami, należy usunąć wszelkie ślady etanolu, myjąc kolumnę wodą.

2. Ekspresja i oczyszczanie roztworu białkowego OnePot

UWAGA: Protokół składa się z trzech części podzielonych na dni (Rysunek 2). Idealna procedura przygotowania wytwarza 1,5 ml 13,5 mg/ml roztworu białkowego OnePot, co odpowiada ponad tysiącowi 10 μl reakcji PUSTE. Jednak ilość i idealne stężenie roztworu będą się różnić w zależności od partii. Doświadczeni użytkownicy mogą wykonywać wiele preparatów OnePot PURE jednocześnie.

Dzień 1:

  1. Przygotować pożywki do hodowli bakteryjnych i suplementy pożywki zgodnie z opisem w tabeli uzupełniającej 1.
  2. Przygotuj i wysterylizuj wymagane materiały, w tym końcówki do pipet, dwie płytki z 96 głębokimi dołkami i jedną kolbę Erlenmeyera o pojemności 1 litra z przegrodą.
  3. Przygotować i suplementy zgodnie z opisem w tabeli uzupełniającej 2. Filtr Wysterylizuj wszystkie za pomocą filtrów butelkowych (0,45 μm) i przechowuj je w temperaturze 4 °C. Uzupełnij wszystkie o 1 mM TCEP bezpośrednio przed użyciem, chyba że wskazano inaczej.
  4. Użyj 2 ml żywicy sefarozy do oczyszczania białka OnePot. Przygotować kolumnę zgodnie z opisem w sekcji 1.4.
  5. Aby przygotować kultury starterowe, połącz 20 ml pożywki LB z 20 μl AMP. W sterylnej 96 płytce głębokiej o pojemności 1,3 ml dodaj 300 μl pożywki do 35 dołków. Zaszczep każdy z nich odpowiednim szczepem, z wyjątkiem współczynnika wydłużenia niestabilnego termicznie (EF-Tu) i uszczelnij płytkę oddychającą membraną.
    UWAGA: Zaszczepić płytkę za pomocą 96-dołkowego replikatora (patrz Tabela materiałów). Zasadnicze znaczenie ma objętość studzienki płytki głębinowej i objętość kultury starterowej. Większe objętości pożywki lub mniejsze objętości studzienek doprowadzą do innej gęstości bakterii z powodu niespójności napowietrzania.
  6. W przypadku hodowli EF-Tu należy zaszczepić 3 ml pożywki LB w probówce hodowlanej o pojemności 14 ml z zatrzaskową nasadką. Pojedyncze 3 ml kultury dla EF-Tu wystarcza na jedną hodowlę ekspresji OnePot.
  7. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 260 obr./min przez noc.

Dzień 2:
UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej.

  1. Przenieść 500 ml pożywki LB i 500 μl AMP do sterylnej kolby z przegrodami.
  2. Zaszczepić kulturę OnePot PURE 1675 μl kultury EF-Tu i 55 μl każdej z kultur z płytki głębinowej (Tabela 2).
    UWAGA: Na tym etapie ogólny skład białka można dostosować, dostrajając proporcje inokulacji. Upewnij się, że całkowita objętość inokulacji pozostaje stała i wynosi 3,6 ml.
    OPCJONALNIE: Aby potwierdzić, że wszystkie szczepy wyrosły w ciągu nocy, należy zmierzyć gęstość optyczną nocnych kultur przy 600 nM (OD600) na 96-dołkowej płytce za pomocą czytnika płytek. Do pomiaru gęstości optycznej należy użyć rozcieńczenia 10x.
  3. Inkubować kulturę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, wytrząsając 260 obr./min lub do momentu, gdy OD600 kultury osiągnie 0,2-0,3.
  4. Wywołaj kulturę za pomocą 500 μl 0,1 mM IPTG i hoduj przez dodatkowe 3 godziny.
  5. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 °C i 3220 x g przez 10 minut i przechowywać granulki komórek w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Aby zoptymalizować czas, przygotuj roztwór energetyczny opisany w sekcji 4 podczas czasu inkubacji w dniu 2 (Tabela 1).

Dzień 3:

  1. Zmierz ilości potrzebnych do oczyszczania opisanego w poniższych krokach i dodaj TCEP do wszystkich z nich, jak wskazano w tabeli uzupełniającej 2. Pozostałe bez TCEP należy przechowywać w temperaturze 4 °C do przyszłego oczyszczania.
  2. Wyrównać naładowaną kolumnę (ppkt 2.4) z 30 ml buforu A. Po przejściu 25 ml buforu A zamknąć kolumnę od dołu. Równolegle kontynuuj kroki 2.15-2.17.
  3. Rozmrozić komórki i za pomocą pipety serologicznej ponownie zawiesić osad komórkowy w 7,5 ml buforu A.
  4. Lizuj ogniwa za pomocą sonikatora sondy o mocy 130 W (patrz Tabela materiałów, średnica końcówki sondy: 6 mm) o następujących parametrach: 4 x 20 s impuls włączony, 20 s impuls wyłączony, 70% amplitudy. Jeśli sonikacja się powiedzie, roztwór zmieni kolor na ciemniejszy (Rysunek 2).
    UWAGA: Upewnij się, że komórki są trzymane na lodzie podczas sonikacji. Umieść sondę wystarczająco głęboko w roztworze, nie dotykając rurki. Jeśli zostanie wygenerowana duża ilość piany, transfer energii zostanie stłumiony. W takim przypadku pozwól pianie osiąść, opuść sondę głębiej w roztwór i wydłuż czas sonikacji.
  5. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie przy 21130 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C bezpośrednio po sonikacji. Utrzymuj lizat na lodzie.
  6. Dodać supernatant do kolumny zrównoważonej. Zamknij kolumnę od góry i upewnij się, że nie ma wycieków. Inkubować kolumnę przez 3 godziny w temperaturze 4 °C przy użyciu rotatora probówkowego.
  7. Eluować niezwiązane składniki z kolumny i przemyć 25 ml buforu A.
  8. Przemyć kolumnę 25 ml 25 mM buforu imidazolowego (23,95 ml buforu A i 1,25 ml buforu B).
  9. Eluować białka za pomocą 5 ml 450 mM buforu imidazolowego (0,5 ml buforu A i 4,5 ml buforu B). Uwolnione białka należy przez cały czas utrzymywać na lodzie.
  10. Rozcieńczyć eluat 25 ml buforu HT, mieszaninę utrzymać na lodzie. Dodać 15 ml do 15 ml filtra odśrodkowego i stężyć do objętości 1,5 ml. Dodać pozostałe 15 ml do filtra ze stężonym roztworem i ponownie zagęścić do 1,5 ml.
  11. Dodać 10 ml buforu HT do zagęszczonej próbki i zagęścić do 1 ml. Dodać równą ilość bufora B i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Jedna runda wymiany/koncentracji trwa około 60 minut wirowania w temperaturze 3220 x g w temperaturze 4 °C.
  12. Podczas wymiany bufora przywrócić kolumnę zgodnie z opisem w sekcji 1.4.

Dzień 4:

  1. Zmierzyć stężenie białka za pomocą testu Bradforda zgodnie z opisem dostawcy. Zagęścić próbkę z 0,5 ml filtra odśrodkowego o stężeniu 3 kDa do 20 mg/ml.
    UWAGA: Rozcieńczyć roztwór białka 25-krotnie lub 50-krotnie przed pomiarami stężenia, aby uniknąć przesycenia testu Bradforda.
  2. W celu ustalenia idealnego stężenia białka, należy przeprowadzić próbę ekspresji na tym etapie (sekcja 5.2) z różnymi stężeniami roztworu białkowego. Aby przeprowadzić miareczkowanie, należy utrzymać stałą całkowitą objętość roztworu i odpipetować roztwór białkowy OnePot, w tym bufor podstawowy B, w pięciu różnych proporcjach (Tabela uzupełniająca 7).
  3. Sprawdź skład białka OnePot PURE za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 3A). Rozcieńczyć 2,5 μl próbki w 7,5 μl wody, wymieszać z 10 μl 2x buforu Laemmli, a następnie załadować 5 μl i 2,5 μl próbek do żelu. Uruchom SDS-PAGE zgodnie z opisem w sekcji 1.3.3.
  4. Podwielokrotność roztworu białkowego podzielić na 50 μl podwielokrotności po sprawdzeniu ekspresji i dostosowaniu stężenia. Roztwór białkowy OnePot PURE należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Jeśli podejrzewa się, że składnik białkowy nie jest obecny lub jest obecny w stężeniu niższym niż oczekiwano w OnePot PURE, należy wykonać następujące czynności.
  5. Sprawdź, czy kultura nocna danego szczepu rosła w tempie porównywalnym z innymi kulturami, wykonując pomiary gęstości optycznej (OD600) wszystkich kultur.
  6. Wykonać dodatkowy test ekspresji określonego szczepu w celu zweryfikowania ekspresji podejrzanego białka.

3. Roztwór rybosomów

UWAGA: Wprowadzono dwie różne strategie oczyszczania rybosomów, jedną dla rybosomów znakowanych heksahistydyną, a drugą dla rybosomów nieoznakowanych. Główną zaletą metody oczyszczania z wykorzystaniem oczyszczania Hisa na kolumnie przepływowej Ni-NTA o standardowym powinowactwie jest to, że oczyszczanie jest łatwe, szybkie i nie wymaga dodatkowego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak system FPLC i ultrawirówka. Jednak zdolność produkcji białka w reakcjach OnePot PURE wynosi około jednej trzeciej w porównaniu z rybosomami bez znaczników. Dlatego wybierz metodę produkcji rybosomów w oparciu o to, czy wysoka wydajność jest ważna dla danego zastosowania.

  1. Oczyszczanie rybosomów z jego tagiem
    UWAGA: Ten protokół wykorzystuje szczep E. coli RB1, prezent od profesora Wanga (Columbia University, USA)18. Szczep ten ma genomową insercję znacznika heksahistydyny na końcu C białka rybosomalnego 50S (L7 / L12), co pozwala na oczyszczanie przy użyciu kolumny grawitacyjnej Ni-NTA. Zwykła wydajność wynosi około 0,5 ml rybosomów o wielkości 3,45 μM, co wystarcza na ponad pięćset 10 μl reakcji PUR.

Dzień 1:

  1. Przygotować pożywki do hodowli bakteryjnych i suplementy pożywki zgodnie z opisem w tabeli uzupełniającej 1.
  2. Przygotuj i wysterylizuj wymagane materiały, w tym końcówki do pipet, jedną kolbę Erlenmeyera o pojemności 5 l i jedną kolbę Erlenmeyera o pojemności 100 ml.
  3. Przygotować i suplementy zgodnie z opisem w tabeli uzupełniającej 2. Filtruj wszystkie za pomocą filtrów butelkowych (0,45 μm) i przechowuj je w temperaturze 4 °C.

Dzień 2:

  1. Odpipetować pipetą 5 ml żywicy do kolumny i przygotować kolumnę zgodnie z opisem w sekcji 1.4.
    UWAGA: Ze względu na większą objętość żywicy, odbudowa i oczyszczanie trwają znacznie dłużej. Użyj innej kolumny do oczyszczania rybosomów, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego i dokładnie wyczyść ją przed oczyszczeniem.
  2. Przygotować nocną hodowlę szczepu E. coli RB1, zaszczepiając 35 ml pożywki LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 260 obr./min.

Dzień 3:
UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej.

  1. Dodać 2 l pożywki LB do sterylnej kolby o pojemności 5 l, zaszczepić 12 ml nocnej hodowli, a następnie inkubować przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 260 obr./min.
    UWAGA: Alternatywnie należy przeprowadzić hodowlę bakteryjną w 4 x 500 ml kultur w kolbach z przegrodami o pojemności 1 l.
  2. Granulować komórki przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 3220 x g i w temperaturze 4 °C. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

Dzień 4:

  1. Zrównoważyć kolumnę przygotowaną w kroku 3.1.4 z 30 ml buforu do lizy.
  2. Zawiesić osad w 20 ml buforu do lizy za pomocą pipety serologicznej.
  3. Lizować ogniwa za pomocą sonikatora o mocy 130 W (patrz Tabela materiałów, średnica końcówki sondy: 6 mm) na lodzie o następujących parametrach: impuls 11 x 20 s; impuls wyłączony 20 s, amplituda 70% (patrz krok 2.16, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat procedury).
  4. Natychmiast po sonikacji usunąć resztki komórek przez odwirowanie przez 20 minut w temperaturze 21130 x g w temperaturze 4 °C. Przechowywać lizat na lodzie.
  5. Załaduj supernatant do kolumn i pozwól mu przejść.
  6. Przemyć kolumnę następującymi mieszaninami do lizy i elucji.
    1. Mycie 0: użyć 30 ml buforu do lizy.
    2. Przemycie 1: użyć 30 ml 5 ml imidazolu (29 ml buforu do lizy, 1 ml buforu elucyjnego).
    3. Przemycie 2: użyć 60 ml 25 ml imidazolu (50 ml buforu do lizy, 10 ml buforu elucyjnego).
    4. Przemycie 3: użyć 30 ml 40 ml imidazolu (22 ml buforu do lizy, 8 ml buforu elucyjnego).
    5. Przemycie 4: użyć 30 ml 60 mM imidazolu (18 ml buforu do lizy, 12 ml buforu elucyjnego).
  7. Eluować rybosomy za pomocą 7,5 ml buforu elucyjnego. Uwolnione białka należy przez cały czas utrzymywać na lodzie.
  8. Dodać 22 μl czystego β-merkaptoetanolu do 45 ml buforu rybosomowego.
    UWAGA: β-merkaptoetanol jest toksyczny. Podejmij środki ostrożności i pracuj pod wyciągiem.
  9. Dodać eluat do 15 ml filtra odśrodkowego i zagęścić do 1 ml.
  10. Dodać 15 ml buforu rybosomu do zagęszczonej próbki i ponownie zagęścić do 1 ml.
    UWAGA: Powtórz poprzedni krok dwukrotnie.
  11. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Jedna runda wymiany/zatężania zajmuje około 60 minut wirowania w temperaturze 3220 x g w temperaturze 4 °C.
  12. Podczas wymiany bufora przywrócić kolumnę zgodnie z opisem w sekcji 1.4.

Dzień 5:

  1. Oznaczyć stężenie rybosomu, mierząc absorbancję przy 260 nM próbki rozcieńczonej w stosunku 1:100 w buforze rybosomowym. Wartość absorbancji 10 rozcieńczonego roztworu odpowiada 23 μM nierozcieńczonego roztworu, jak opisano wcześniej16.
  2. Wprowadzić końcowe stężenie zapasu 3,45 μM. Aby dostosować stężenie, rozcieńczyć rybosomy buforem rybosomów lub zagęścić je dalej przez odwirowanie przy 14000 x g w filtrze odśrodkowym o stężeniu 3 kDa 0,5 ml w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Aby uzyskać optymalną ekspresję systemu, należy przeprowadzić miareczkowanie stężenia rybosomów (sekcja 5.2, Tabela uzupełniająca 7).
  3. Sprawdź skład rybosomu za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 3A), jak określono w sekcji 1.3.3. Rozcieńczyć 2,5 μl próbki w 7,5 μl wody, wymieszać z 10 μl 2x buforu Laemmli, a następnie załadować 5 μl i 2,5 μl próbek na żel.

  1. Oczyszczanie rybosomów bez znaczników
    UWAGA: Oczyszczanie rybosomów bez znaczników odbywa się za pomocą systemu FPLC (Tabela materiałów) i opiera się na chromatografii oddziaływań hydrofobowych przy użyciu kolumn butylowych 2 x 5 ml (Tabela materiałów). Chociaż rybosomy mogą być oczyszczane z dowolnego szczepu, użycie szczepu E. coli A19 (E. coli Genetic Resources at Yale CGSC) jest korzystne ze względu na jego delecję RNazy I22. Oczyszczanie należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C w chłodni lub komorze chłodniczej. Zwykła wydajność wynosi około 0,5 ml rybosomów o wielkości 10 μM, co odpowiada ponad pięciuset reakcjom PURE o pojemności 10 μM.

Dzień 1:

  1. Przygotować pożywki do hodowli bakteryjnych i suplementy pożywki zgodnie z opisem w tabeli uzupełniającej 1.
  2. Przygotuj i wysterylizuj wymagane materiały, w tym końcówki do pipet, kolbę Erlenmeyera o pojemności 5 l i kolbę Erlenmeyera o pojemności 100 ml.
  3. Przygotować i suplementy zgodnie z opisem w tabeli uzupełniającej 2. Filtruj wszystkie za pomocą filtrów butelkowych (0,45 μm) i przechowuj je w temperaturze 4 °C.

Dzień 2:

  1. Aby przygotować nocną hodowlę szczepu E. coli A19, należy zaszczepić 35 ml pożywki LB w 100 ml kolbie Erlenmeyera. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 260 obr./min.

Dzień 3:

  1. Przenieść 2 l pożywki LB do sterylnej kolby z przegrodami o pojemności 5 l, zaszczepić 30 ml nocnej hodowli, a następnie inkubować przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min.
  2. Osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 25 ml buforu do sporządzania zawiesiny i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

Dzień 4:

  1. Wykonaj kroki 3.2.8-3.2.12 równolegle z krokami 3.2.13-3.2.19.
  2. Rozmrażaj i lizuj ogniwa za pomocą sonikatora o mocy 130 W (patrz Tabela materiałów i średnica końcówki sondy: 6 mm) na lodzie o następujących parametrach: 12 x 20 s impuls włączony; 20 s wyłączony impuls, 70% amplitudy (patrz krok 2.16 szczegóły procedury).
  3. Natychmiast usunąć resztki komórek przez odwirowanie przy 20000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Odessać supernatant i zmierzyć objętość. Dodać równą objętość buforu zawiesinowego (o wysokiej zawartości soli), aby dostosować końcowe stężenie siarczanu amonu do 1,5 M i dobrze wymieszać.
  5. Usunąć osad przez odwirowanie w temperaturze 20000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra strzykawkowego z membraną polieterosulfonową 0,45 μm przed oczyszczeniem FPLC i zebrać filtrat do szklanej butelki o pojemności 100 ml. Utrzymywać supernatant w temperaturze 4 °C przez cały czas.
  7. Skonfigurować system FPLC do oczyszczania metodą chromatografii oddziaływań hydrofobowych przy użyciu podwójnej kolumny butylowej (2 x 5 ml) w następujący sposób. W przypadku tej konfiguracji objętość jednej kolumny (CV) odnosi się do objętości 10 ml.
  8. Potrzebne będą trzy wloty: dwa jako linie buforowe i jeden jako linia próbkowania. Ze względu na domyślne ustawienia oczyszczacza, wygodnie jest wybrać linie A1 i B1 odpowiednio dla bufora C i buforu D oraz linię A2 jako linię próbkowania. Zastosuj domyślne natężenie przepływu 4 ml/min, z wyjątkiem mycia pompą (10 ml/min) lub o ile nie wskazano inaczej.
    UWAGA: Ponieważ TCEP jest kosztownym odczynnikiem, odpowiednią ilość należy dodać do C i D dopiero po etapie równoważenia.
  9. Wykonaj mycie pompy systemowej w 20% ((v/v)) etanolu, aby oczyścić układ i usunąć potencjalne zanieczyszczenia z poprzednich oczyszczań. Ręcznie ustaw natężenie przepływu na 0,2 ml/min i zamontuj kolumnę. Zatrzymaj przepływ.
  10. Wykonaj mycie pompy systemowej wodą. Umyj kolumnę 3 CV wody.
  11. Równowaga: umieścić wloty A1 i A2 w buforze C, a wlot B1 w buforze D bez TCEP. Przeprowadzić płukanie pompą i zrównoważyć kolumnę z 4 CV buforu C.
  12. Dodaj TCEP do C i D.
  13. Przygotować probówki o pojemności 15 ml lub przezroczyste okrągłe probówki do zbierania frakcji do kolektora frakcji w celu zebrania 4-5 ml frakcji elucyjnych.
  14. Ładowanie: Umieścić wlot A2 w butelce z przefiltrowaną próbką. Załadować około 90% objętości próbki na kolumnę. Rozcieńczyć próbkę 20 ml buforu C zawierającego TCEP i załadować 10 ml próbki do kolumny. Powtórzyć etap rozcieńczania co najmniej dwa razy i załadować jak najwięcej próbki do kolumny. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że żadne powietrze nie jest zasysane do maszyny.
  15. Etap mycia 1: przemyć 3 CV buforu C w celu usunięcia niezwiązanych składników.
  16. Krok mycia 2: przemyć 5 CV 80% buforu C i 20% buforu D.
  17. Elucja: wymyć produkt przez nałożenie 50% buforu C i 50% buforu D, przy całkowitej objętości elucji wynoszącej 5 CV. Zebrać tę frakcję w probówkach kolektora.
  18. Krok mycia 3: Eluować wszystkie silnie oddziałujące zanieczyszczenia za pomocą 100% buforu D o całkowitej objętości 5 CV.
  19. Przeanalizuj widmo absorpcyjne frakcji próbki przy 260 lub 280 nM (Rysunek 4). Pierwszy pik pokazuje niewchłonięte białka wymyte podczas ładowania i pierwszego etapu mycia; Drugi pik pokazuje zanieczyszczenia, które zostały wymyte podczas drugiego etapu mycia. Trzeci pik monitoruje produkt końcowy, a ostatni pik pokazuje silnie oddziałujące zanieczyszczenia. Zebrać wszystkie frakcje próbki odpowiadające trzeciemu pikowi do dalszego przetwarzania. Uwolnione białka należy przez cały czas utrzymywać na lodzie.
  20. Delikatnie nałożyć odzyskaną frakcję na 15 ml buforu poduszkowego w czterech probówkach do ultrawirowania z poliwęglanu. Dodać maksymalnie 15 ml próbki do 15 ml buforu poduszkowego. Upewnij się, że dobrze zrównoważyłeś ciężar rurki. Granulować rybosomy przez ultrawirowanie w temperaturze 100000 x g w temperaturze 4 °C przez 16 godzin
    UWAGA: Upewnij się, że w probówkach do ultrawirowania nie ma pęknięć.
  21. Wyczyść i zresetuj kolumnę w następujący sposób. Dobrze sprawdza się natężenie przepływu 5 ml/min. Umieść wszystkie wloty w wodzie i wykonaj mycie pompą. Przemyć kolumnę 2 CV wody.
    1. Umieścić wlot w 0,5 M roztworze NaOH, przeprowadzić płukanie pompą, a następnie przemyć kolumnę 3 CV NaOH.
    2. Umieść wlot w wodzie, wykonaj mycie pompy, a następnie umyj kolumnę w 2 CV wody.
    3. Umieścić wlot w 0,1 M roztworze kwasu octowego, przeprowadzić płukanie pompą, a następnie przemyć kolumnę 3 CV roztworu kwasu octowego.
    4. Umyj pompę i umyj kolumnę 2 CV wody.
    5. Umieścić wszystkie wloty w 20% ((v/v)) etanolu, wykonać etap płukania pompą i przechowywać kolumnę w 20% ((v/v)) etanolu, przemłukując ją 3 CV 20% ((v/v)) roztworu etanolu.
      UWAGA: Upewnij się, że system nigdy nie pracuje na sucho ani nie zasysa powietrza. Nigdy nie nakładaj buforu bezpośrednio na etanol ani etanolu na bufor. Zawsze dodawaj etap mycia wodą pomiędzy nimi, ponieważ w przeciwnym razie istnieje ryzyko zatkania kolumny przez osady. Upewnij się, że dodałeś wystarczającą ilość probówek do pobierania próbek.

Dzień 5:

  1. Wyrzuć supernatant i ostrożnie, nie naruszając półprzezroczystego osadu, przemyj każdą osadkę 0,5 ml lodowatego buforu rybosomowego. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  2. Zawiesić ponownie każdą z przezroczystych granulek w 100 μl buforu rybosomu na lodzie za pomocą mieszadła magnetycznego (średnica 3 mM, długość 10 mM) na mieszadle magnetycznym, używając najniższej możliwej prędkości. Zebrać zawieszone rybosomy i przemyć probówki dodatkowymi 50 μl buforu rybosomowego.
    UWAGA: Półprzezroczysta pelety jest trudna do zobaczenia. Dlatego ostrożnie umyj granulat z boków tuby.
  3. Oznaczyć stężenie rybosomu, mierząc absorbancję próbki rozcieńczonej w stosunku 1:100 w stosunku 1:100 w buforze rybosomowym. Absorbancja 10 rozcieńczonego roztworu odpowiada 23 μM nierozcieńczonego roztworu, jak opisano wcześniej16.
  4. Wprowadzić końcowe stężenie zapasu 10 μM. Aby dostosować stężenie, rozcieńczyć rybosomy buforem rybosomów lub zagęścić je dalej przez odwirowanie przy 14000 x g w filtrze odśrodkowym o sile 3 kDa w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Aby osiągnąć optymalną ekspresję systemu, należy przeprowadzić miareczkowanie rybosomów (sekcja 5.2, Tabela uzupełniająca 7).
  5. Sprawdź skład rybosomu za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 3A), jak określono w sekcji 1.3.3. Rozcieńczyć 2,5 μl próbki w 7,5 μl wody, wymieszać z 10 μl 2x buforu Laemmli, a następnie załadować 5 μl i 2,5 μl próbek do żelu.

4. Rozwiązanie energetyczne

UWAGA: Skład przedstawionego tutaj rozwiązania o energii 2,5x jest przykładem rozwiązania, które dobrze sprawdziło się w przypadku standardowej reakcji TX-TL. Aby zoptymalizować czas, przygotuj roztwór energetyczny w ciągu 2 dnia. Przygotowanie roztworu aminokwasowego jest szczegółowo wyjaśnione, a następnie następuje końcowa procedura przygotowania.

  1. Roztwór aminokwasów
    UWAGA: Przygotuj roztwór aminokwasów luzem. Przygotowanie ilości roztworów podstawowych aminokwasów wymaganej dla końcowej objętości co najmniej 2000 μl zmniejszy błąd ważenia dla bardzo małych ilości, które w przeciwnym razie byłyby bardzo małe. Całkowite stężenie roztworu aminokwasów jest ograniczone przez rozpuszczalność aminokwasów i odpowiednie stężenia roztworu podstawowego. Dla standardowego systemu PURE należy przygotować roztwór o końcowym stężeniu 3,25 mM. Użyj tabeli obliczeń roztworu aminokwasów (tabela uzupełniająca 3) jako szablonu. Używaj cysteiny w postaci soli, aby zapewnić wystarczającą rozpuszczalność. Unikaj stosowania metod przygotowania aminokwasów na bazie KOH. Możliwe jest bezpośrednie zważenie dokładnych ilości aminokwasów do końcowego roztworu aminokwasów bez przygotowywania roztworu podstawowego dla wszystkich aminokwasów. Jest to jednak trudniejsze i mniej precyzyjne.
    1. Przygotować roztwory podstawowe dla każdego aminokwasu, jak opisano w tabeli uzupełniającej 3, z wyjątkiem tyrozyny.
      UWAGA: Ze względu na różną rozpuszczalność aminokwasów w wodzie, odpowiednie sugerowane stężenia roztworu podstawowego różnią się.
    2. Masa minimalna [mg] podaje przybliżoną minimalną masę wymaganą do uzyskania wystarczającej ilości roztworu podstawowego dla docelowej objętości całkowitej, jako odniesienie.
      UWAGA: Masę minimalną oblicza się przy nadwyżce 10%.
    3. Aby ułatwić przygotowanie roztworów, nie waż dokładnej ilości aminokwasu, ale zamiast tego, w zależności od masy, dostosuj ilość wody, aby osiągnąć pożądane stężenie. Oblicz potrzebną ilość wody dejonizowanej (Woda do dodania [μL]) na podstawie rzeczywistej masy wypełnionej (jasnożółte komórki) i pożądanego stężenia, korzystając z arkusza kalkulacyjnego w Tabeli Uzupełniającej 3.
    4. Rozpuszczaj roztwory podstawowe aminokwasów przez wirowanie, aż cały osad się rozpuści. Poszczególne roztwory podstawowe aminokwasów można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
      UWAGA: Niektóre aminokwasy są trudne do rozpuszczenia w wodzie; Proces ten może zająć trochę czasu.
    5. Odważyć dokładną ilość tyrozyny potrzebną do uzyskania końcowego stężenia 3,25 mM bezpośrednio do probówki dla roztworu aminokwasu.
      UWAGA: Tyrozyna jest bardzo trudna do rozpuszczenia w wodzie. Dodaj go bezpośrednio, zamiast przygotowywać roztwór podstawowy.
    6. Dodaj odpowiednie ilości roztworów podstawowych aminokwasów i wody, jak wskazano w końcowej objętości, aby dodać kolumnę [μl] (jasnoniebieskie komórki) i dobrze zmieszać roztwór. Gotowy roztwór aminokwasów należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
  2. Przygotowanie roztworu energetycznego
    UWAGA: W sumie 2,5-krotny roztwór energetyczny zawiera odpowiednio 0,75 mM każdego aminokwasu, 29,5 mM octanu magnezu, 250 mM glutaminianu potasu, po 5 mM ATP i GTP, 2,5 mM CTP, UTP i TCEP, 8,75 mg/ml tRNA z E. coli MRE 600, 50 mM fosforanu kreatyny, 0,05 mM kwasu folinowego, 5 mM spermidyny i 125 mM HEPES. Początkujący użytkownicy przygotowują roztwór energetyczny w małych partiach po 200 μl. Poszczególne roztwory przygotowane zgodnie z tabelą uzupełniającą 4 należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C do późniejszego wykorzystania.
    1. Rozmrozić na lodzie wszystkie roztwory wodne wymienione w tabeli uzupełniającej 5.
    2. W międzyczasie należy przygotować roztwory podstawowe dla pozostałych składników wymienionych w tabeli uzupełniającej 4. Po przygotowaniu wszystkie roztwory należy przechowywać na lodzie.
      UWAGA: Dodaj 500 μl wody wolnej od RNaz i DNaz bezpośrednio do fiolki, aby rozpuścić liofilizowane tRNA. Dobrze wymieszaj, delikatnie wirując; ogranicz pipetowanie, aby uniknąć wprowadzania RNaz.
    3. Dodać obliczone objętości (tabela uzupełniająca 5) roztworów podstawowych i wody i dobrze wymieszać za pomocą wiru. Roztwór należy przez cały czas utrzymywać na lodzie.
    4. Zmierzyć pH roztworu, pipetując 1 μl na pasek pH, aby upewnić się, że pH roztworu jest neutralne.
    5. Roztwór energetyczny należy rozdzielić w ilości 50-100 μl na probówkę na lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. Podczas porcjowania często wiruj główny zapas, aby zapobiec wytrącaniu się składników.
      UWAGA: Opcjonalnie należy przeprowadzić test aktywności nowo powstałego rozwiązania energetycznego w porównaniu z komercyjnymi rozwiązaniami energetycznymi, np. roztworem A w PURExpress. W przypadku zaobserwowania znacznie niższej wydajności systemu z roztworem energetycznym, korzystna może być optymalizacja stężeń jonów, zwłaszcza jonów magnezu, poprzez miareczkowanie (5-20 mM).

5. Reakcja OnePot PURE

  1. Matryca DNA
    UWAGA: Białka kodowane za promotorem T7 mogą ulegać ekspresji w PURE z liniowego lub kolistego DNA. Generując liniową matrycę DNA za pomocą rozszerzającego PCR, można pominąć żmudne etapy klonowania. Matryce liniowe do tego badania zostały wygenerowane metodą PCR, jak opisano poniżej, przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności (tabela materiałów). Sekwencje starterów, temperatury topnienia i ustawienia termocyklera użyte w tym badaniu są określone w tabeli uzupełniającej 6. Przygotowanie matrycy DNA nie jest uwzględnione w planie dnia.
    1. Ustawić reakcję PCR zgodnie z zaleceniami dostawcy polimerazy.
      UWAGA: Zoptymalizowane parametry dla polimerazy DNA o wysokiej wierności (tabela materiałów) podano w tabeli uzupełniającej 6.
    2. Amplifikować gen docelowy (np. eGFP) jako liniową matrycę z plazmidu lub genomu za pomocą starterów specyficznych dla genu (500 nM) (dla parametrów, patrz Tabela uzupełniająca 6).
    3. Amplifikacja generuje krótkie przedłużenia, aby zapewnić sekwencje wyżarzania dla następujących etapów PCR przedłużenia.
    4. Sprawdź amplikon na żelu agarozowym pod kątem prawidłowego rozmiaru i czystości.
    5. Użyj amplifikowanego DNA jako matrycy dla kolejnych etapów rozszerzenia. Ustawić reakcję o objętości co najmniej 50 μl.
    6. Uruchom 10 cykli amplifikacji PCR ze starterami rozszerzającymi (2,5 nM). Po zakończeniu cykli amplifikacji należy natychmiast dodać końcowe startery (500 nM) do tej samej reakcji i uruchomić 30 cykli, aby amplifikować rozszerzony produkt PCR. Temperatury topnienia i sekwencje starterów można znaleźć w tabeli uzupełniającej 6.
    7. Oczyść fragmenty DNA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA i wymyj DNA w wodzie wolnej od nukleaz zamiast buforu elucyjnego zawierającego EDTA.
    8. Sprawdź liniowy szablon na żelu agarozowym pod kątem prawidłowego rozmiaru i czystości.
    9. Zmierzyć stężenie DNA w ng/μl za pomocą spektrofotometru UV-Vis.
  2. Ustawianie reakcji PURE
    UWAGA: Ostateczny skład reakcji to 1x roztwór energetyczny, rybosomy bez znaczników lub rybosomy z tagiem His, białka OnePot PURE i matryca DNA. Stosunek objętości reakcji składa się z 40% roztworu energetycznego, 30% roztworu białka i rybosomu oraz 30% DNA i wody. Typowe objętości reakcji wahają się od 5 μl do 25 μl. Określić ilościowo ekspresję białka fluorescencyjnego w sposób ciągły na czytniku płytkowym. Użyj systemu etykietowania translacyjnego Green Lys in vitro, który włącza znakowaną fluorescencyjnie resztę lizyny do nowo zsyntetyzowanych białek, aby zweryfikować ekspresję białek niefluorescencyjnych w żelu SDS-PAGE. Przykładowy szablon reakcji znajduje się w tabeli uzupełniającej 7, aby pomóc w ustaleniu CZYSTEJ reakcji ekspresji bezkomórkowej. Pola w kolorze żółtym wskazują wartości wprowadzone przez użytkownika, a komórki w kolorze pomarańczowym wskazują dodatkowe odczynniki, które mają być opcjonalnie dodane do reakcji. Utrzymuj precyzyjne proporcje objętości składników, aby zapewnić prawidłową równowagę jonową. Na przykład, aby osiągnąć wyższe stężenie białka, zwiększ stężenie roztworu białkowego OnePot; Nie należy jednak zwiększać objętości roztworu białkowego dodawanego do reakcji.
    1. Wypełnij stężenie [ng/μl] i długość [pary zasad] DNA w odpowiednich żółtych komórkach w arkuszu kalkulacyjnym. Do reakcji użyj 2-10 nM DNA.
    2. Uzupełnij żądaną całkowitą objętość reakcji w μl.
    3. Wyjmij wymagane odczynniki z zamrażarki i rozmroź je na lodzie.
      UWAGA: Ponowne zamrożenie komponentów jest możliwe bez pogorszenia funkcjonalności. Należy jednak w miarę możliwości zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania oraz czas przechowywania próbek na lodzie.
    4. Odpipetować obliczone ilości wody, DNA i roztworu energetycznego po jednej stronie probówki do PCR lub w jednym rogu studzienki na płytce 384-dołkowej. Dodać wymaganą ilość dodatkowego odczynnika po tej samej stronie. Zminimalizuj liczbę próbek w eksperymencie, aby uniknąć parowania próbki i odchylenia czasu rozpoczęcia eksperymentu.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby składnik energetyczny był fizycznie oddzielony od składników białkowych, aby uniknąć przedwczesnego zużycia źródeł energii i niższych plonów.
    5. Odpipetować obliczone ilości roztworu białka i rybosomu na drugą stronę probówki do PCR lub w przeciwległy róg płytki 384-dołkowej.
      UWAGA: Zawsze, gdy jest to możliwe, należy używać mieszanek wzorcowych, aby zmniejszyć wpływ błędów pipetowania. Po wstępnych testach roztwory rybosomów i białek można mieszać i przechowywać jako jeden roztwór.
    6. Wirować przez krótki czas (30 s), aby połączyć składniki reakcji. Aby zapobiec parowaniu podczas eksperymentów z czytnikiem płytek, należy dodać 35 μl płynnego wosku i uszczelnić płytkę przezroczystym uszczelniaczem (patrz Tabela materiałów).
    7. Inkubować przez co najmniej 3 godziny w temperaturze 37 °C.
    8. W celu odczytu na czytniku płytek, mierz intensywność fluorescencji na wymaganej długości fali co 2 minuty (reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 3B).
    9. Wykonaj następujące czynności dla próbek oznaczonych etykietą Green Lys.
    10. Po bezkomórkowym odciąganiu próbki inkubować z 0,16 μg/μl RNazy A przez 30 minut w temperaturze 37 °C, aby usunąć fluorescencyjne tło z zestawu do etykietowania Green Lys.
      UWAGA: Użyj RNazy A, ponieważ inne typy RNaz nie usuwają wystarczająco dobrze tła.
    11. Wizualizację ekspresji białka należy wykonać uruchamiając SDS-PAGE, jak określono w sekcji 1.3.3. Delikatnie umyj niezabarwiony żel w wodzie dejonizowanej i zobrazuj go na obrazie fluorescencyjnym przy użyciu długości fali wzbudzenia 488 nm.
    12. Następnie zabarwić żel przy użyciu konwencjonalnych metod barwienia Coomassie. Odpowiednie parametry znajdują się w sekcji 1.3.3.
      UWAGA: Wykonaj miareczkowanie roztworu białkowego o zalecanym stężeniu rybosomów, a następnie, jeśli to konieczne, miareczkuj rybosomy optymalnym stężeniem białka OnePot. Użyj komercyjnego zestawu PURExpress ΔRibosome jako kontroli pozytywnej. Roztwór A, Factor Mix i roztwór rybosomu odpowiadają odpowiednio przygotowanej energii, roztworowi białka OnePot i oczyszczonym rybosomom.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyższy protokół ma na celu ułatwienie stworzenia systemu PURE bezkomórkowego TX-TL w każdym laboratorium. Protokół zawiera szczegółowy opis przygotowania trzech odrębnych części systemu PURE: białka OnePot, rybosomu i roztworu energetycznego. Szczegółowy harmonogram dnia, który optymalizuje przepływ pracy, przedstawiono w tabeli 1. Przepływ pracy jest zoptymalizowany pod kątem oczyszczania rybosomów znakowanych przez Hisa, a ramy czasowe mogą się nieznacznie różnić, jeśli przeprowadzane jest oczyszczanie rybosomów bez znaczników. Jeden preparat dostarcza wystarczającą ilość PURE na minimum pięćset 10 μl reakcji. Ponadto przygotowane roztwory są stabilne przez ponad rok w temperaturze -80 °C i mogą wytrzymać wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania.

Odpowiednie poziomy nadekspresji dla wszystkich szczepów są kluczowe dla funkcjonalności końcowego roztworu białkowego. Rysunek 1 pokazuje udaną nadekspresję we wszystkich 36 indywidualnych szczepach użytych następnie do przygotowania białka OnePot. Różnice w intensywności pasm białek o nadmiernej ekspresji wystąpiły najprawdopodobniej z powodu odchylenia w objętości ładowania żelu SDS-PAGE. Oczekiwane rozmiary białek podsumowano w Tabeli 2. GlyRS i PheRS składają się z dwóch podjednostek o różnej masie cząsteczkowej; Pozostałe 34 białka składają się z pojedynczej podjednostki. Kluczem do prostoty i efektywności czasowej tego protokołu jest etap kokulturacji i współoczyszczania (Rysunek 2). Roztwór białkowy OnePot przygotowano poprzez zwiększenie stosunku szczepu EF-Tu w stosunku do wszystkich innych szczepów ekspresyjnych. Ogólny skład końcowych białek analizowano za pomocą SDS-PAGE (Ryc. 3A). Z żeli (pasy 2, 3) można zauważyć, że EF-Tu (43,3 kDa) jest obecny w wyższym stężeniu w porównaniu z innymi białkami, zgodnie z oczekiwaniami. Chociaż żel stanowi dobrą pierwszą wskazówkę dotyczącą proporcji ekspresji białka, trudno jest określić, czy i na jakim poziomie każde pojedyncze białko uległo ekspresji. Dlatego zdecydowanie zaleca się potwierdzenie nadekspresji w każdym szczepie przed hodowlą, jak pokazano powyżej.

Rybosom E. coli to złożona maszyna molekularna składająca się z ponad 50 indywidualnych podjednostek białkowych23. Reprezentatywne widmo absorpcyjne przy 260 nm do oczyszczania rybosomów bez znaczników pokazano w Rysunek 4; Trzeci pik jest charakterystyczny dla udanej elucji rybosomów. W przypadku obu metod oczyszczania rybosomów zaobserwowano oczekiwany wzorzec biegania na żelu SDS-PAGE (Rysunek 3A)18. Zaobserwowaliśmy zanieczyszczenia w przypadku obu oczyszczań, choć w niewielkich ilościach (<10%). Warto zauważyć, że różne zanieczyszczenia były obecne w rybosomach bez znaczników (pasy 5, 6) i Hisa (pasy 11, 12) ze względu na różnice w metodzie. W celach informacyjnych dołączone są również żele SDS-PAGE do systemów kombinowanych (pasy 8, 9 i 14, 15).

Na koniec, porównano wydajność przygotowanych systemów (Rysunek 3) przy użyciu różnych wariantów rybosomów. Przebiegi czasowe ekspresji eGFP in vitro pokazują, że oba systemy PURE są funkcjonalne i wytwarzają fluorescencyjne eGFP. Jednak roztwór białkowy OnePot w połączeniu z rybosomami znakowanymi His, przy użyciu stężenia rybosomów zoptymalizowanego przez miareczkowanie, dał tylko jedną trzecią poziomu ekspresji nieznakowanej wersji rybosomu (Figura 3B). Podobne wyniki zaobserwowano, gdy trzy białka o różnych rozmiarach zostały wyrażone i znakowane przy użyciu systemu znakowania tRNA in vitro Green Lys (Figura 3C). Jak widać na żelu fluorescencyjnym, produkty o pełnej długości zostały z powodzeniem wyrażone w obu systemach; jednak tylko około połowa poziomu ekspresji została osiągnięta za pomocą systemu rybosomów His-tag. Oprócz znakowania fluorescencyjnego, oczekiwane prążki dla wszystkich trzech białek można rozróżnić na żelu barwionym Coomassie (Rysunek 3D). Wyniki pokazują, że wprowadzony system ekspresji, który można przygotować w ciągu tygodnia w laboratorium ze standardowym sprzętem, może być wykorzystany do ekspresji in vitro białek kodowanych za promotorem T7 z matryc liniowych.

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki testu nadekspresji dla wszystkich szczepów ekspresji systemu PURE. Liczbę i wielkość białka PURE podsumowano w Tabeli 2. Białka o numerach 21, 24 i 27 są oznaczone gwiazdką dla lepszej wizualizacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Oczyszczanie białka OnePot. Schematyczne przedstawienie i odpowiadające mu fotografie wszystkich etapów związanych z produkcją roztworu białkowego OnePot. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wydajność przygotowanych systemów wykorzystujących różne warianty rybosomów. (A) Niebiesko barwione żele SDS-PAGE Coomassie roztworu białkowego OnePot (tory 2, 3), rybosomy bez znaczników bez roztworu białkowego (tory 5, 6) i z roztworem białkowym (tory 8, 9), rybosomy oznaczone przez Hisa bez roztworu białkowego (tory 11, 12) i z roztworem białkowym (tory 14, 15). Na próbkę przypadały dwa różne stężenia. (B) Porównanie ekspresji eGFP rybosomów znakowanych His i rybosomów wolnych od znaczników. Intensywność fluorescencji ekspresji eGFP in vitro jest monitorowana w czasie pod kątem reakcji PURE przy użyciu rybosomów bez znaczników (1,8 μM, niebieski) i rybosomów znakowanych Hisem (0,62 μM, czerwony). Stężenia matrycy liniowej i roztworu białka OnePot wynosiły odpowiednio 4 nM i 2 mg/ml. Panele (C) i (D) pokazują żel SDS-PAGE białek zsyntetyzowanych w OnePot z rybosomami bez znaczników (1,8 μM, niebieski, tory 3, 4, 5) i His-tag (0,62 μM, czerwony, pasy 6, 7, 8) znakowane odpowiednio zestawem do znakowania in vitro GreenLys (C) i barwione kolorem Coomassie niebieskim (D). Czarne strzałki wskazują oczekiwane pasma syntetyzowanych białek: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). Stężenia matrycy liniowej i roztworu białkowego OnePot wynosiły odpowiednio 4 nM i 1,6 mg/ml. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Widma absorbancji przy 260 nm. Reprezentatywne wyniki widm absorbancji przy 260 nm podczas oczyszczania rybosomów bez znaczników w oddziaływaniach hydrofobowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Codzienny harmonogram przygotowania wszystkich roztworów OnePot PURE. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Lista białek PURE Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 1: Odczynniki. W tabeli wymieniono stężenia, objętości i inne szczegółowe informacje na temat odczynników i składników użytych podczas tego badania. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2:. Arkusz kalkulacyjny zawiera dokładne składy dla oczyszczania białek, rybosomów bez znaczników i rybosomów His-tag, a także stężenia roztworów podstawowych użytych do ich przygotowania. Ponadto oblicza wymagane ilości składników na podstawie objętości bufora. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 3: Obliczenia aminokwasów. Arkusz kalkulacyjny zawiera listę aminokwasów i ich zalecanych stężeń w roztworze podstawowym wymaganych dla roztworu energetycznego. Oblicza ilość wody, którą należy dodać do każdego aminokwasu na podstawie rzeczywistej zważonej masy, a także oblicza objętość roztworu aminokwasu, który należy dodać do końcowej mieszaniny aminokwasów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 4: Roztwory podstawowe dla rozwiązania energetycznego. W tabeli wymieniono stężenia i objętości roztworów podstawowych potrzebnych do roztworu energetycznego oraz wskazano dalsze szczegóły, w tym warunki przechowywania. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 5: Rozwiązanie energetyczne. W tabeli wymieniono składniki roztworu energetycznego i ich zalecane stężenia. Ponadto oblicza ich wymagane objętości, które należy dodać do roztworu końcowego na podstawie stężeń roztworu podstawowego i objętości roztworu energetycznego. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 6: PCR. W tabeli wymieniono sekwencje i stężenia starterów używanych do przedłużającego PCR oraz wskazano temperatury topnienia i etapy termocyklera zoptymalizowane pod kątem polimerazy DNA o wysokiej wierności. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 7: Czysta reakcja. Arkusz kalkulacyjny przedstawia przykładową konfigurację reakcji PURE. Wymienia użyte stężenia i objętości składników do reakcji PURE przy użyciu rybosomów bez znaczników lub rybosomów ze znacznikiem His. Ponadto oblicza proporcje objętości dla miareczkowania białek i rybosomów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół opisuje prostą, efektywną czasowo i kosztowo metodę przygotowania wszechstronnego systemu ekspresji PURE20 opartego na wzorcowym składzie15. Wykorzystując protokół wraz z dostarczonymi harmonogramami dziennymi (tabela 1), wszystkie składniki można przygotować w ciągu 1 tygodnia i uzyskać ilości wystarczające do przeprowadzenia reakcji do pięciuset 10 μl PUSTE. Ponieważ białka stosowane w tym protokole są nadmiernie eksprymowane z plazmidów o wysokiej liczbie kopii i mają niską toksyczność dla E. coli, obserwuje się dobre poziomy ekspresji dla wszystkich wymaganych białek (ryc. 1). Pozwala to na łatwą regulację szczepów, a tym samym składu białek w kokulturach, po prostu poprzez modyfikację proporcji szczepów inokulacyjnych20. Oprócz białek rybosomalnych, stężenie EF-Tu okazało się mieć fundamentalne znaczenie dla ekspresji6. Natomiast zmiany w stężeniu pozostałych składników białkowych miały stosunkowo niewielki wpływ na odporność systemu PURE 7,24. W związku z tym, dostosowując współczynnik inokulacji EF-Tu w odniesieniu do wszystkich pozostałych składników, można uzyskać skład porównywalny ze standardowym składem PURE i osiągnąć system PURE o podobnej wydajności20. Przygotowując roztwór białkowy, ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie szczepy dobrze rosną i wykazują nadekspresję kodowanego białka po indukcji (ryc. 1).

Funkcja rybosomów ma kluczowe znaczenie dla ogólnej wydajności systemu PURE24. W tym protokole przedstawiono dwie różne metody przygotowania roztworu rybosomu, tj. oczyszczanie rybosomu bez znaczników i oczyszczanie rybosomu znakowane przez Hisa. Oczyszczanie rybosomów bez znaczników opiera się na chromatografii oddziaływań hydrofobowych, po której następuje wirowanie z poduszką sacharozy, co wymaga dostępu do systemu oczyszczania FPLC i ultrawirówki15. Natomiast metoda wykorzystująca rybosomy znakowane Hisem18 i oczyszczanie chromatograficzne z powinowactwem grawitacyjnym nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być wykonywana w większości laboratoriów. Ta ostatnia metoda przynosi zatem korzyści, takie jak prostota i dostępność. Zaobserwowaliśmy jednak znacznie niższą wydajność syntezy przy użyciu rybosomów znakowanych Hisem w OnePot PURE w porównaniu z wariantem bez znaczników (ryc. 3). W zależności od rodzaju aplikacji, ta niższa wydajność może być akceptowalna.

Rozwiązanie energetyczne dostarcza składniki o niskiej masie cząsteczkowej i tRNA niezbędne do napędzania reakcji TX-TL in vitro . Protokół ten stanowi receptę na typowe rozwiązanie energetyczne, które można łatwo dostosować w zależności od potrzeb użytkownika. Wraz z tRNA, NTP i fosforanem kreatyny, obfitość i stężenie jonów Mg2+ miały kluczowe znaczenie dla ogólnej wydajności systemu PURE8, ponieważ są one krytycznymi kofaktorami dla transkrypcji i translacji. W niektórych przypadkach miareczkowanie jonów może zatem znacznie poprawić ogólną wydajność PURE. Integralność DNA ma kluczowe znaczenie dla wydajności PURE. W ten sposób weryfikacja sekwencji regionu promotora, miejsca wiązania rybosomów i genu docelowego oraz zapewnienie odpowiedniego stężenia DNA (<2 nM) pomoże rozwiązać problemy, które mogą pojawić się podczas ustawiania reakcji PURE.

System PURE jest minimalnym systemem TX-TL, w związku z czym niektóre zastosowania mogą wymagać dodatkowych regulacji25. Mogą one obejmować włączenie różnych polimeraz RNA 9,26, białek opiekuńczych13 i czynników białkowych, takich jak EF-P lub ArfA8. Chociaż szczepy ekspresyjne dla tych białek mogą być włączone do kokultur, dodanie ich oddzielnie do przygotowanego systemu może zapewnić lepszą kontrolę wymaganych poziomów białka. Ponadto włączenie pęcherzyków jest niezbędne do produkcji białek błonowych10,11. Środowiska utleniające, a nie redukujące, oraz izomeraza wiązania dwusiarczkowego ułatwiają prawidłowe tworzenie wiązań dwusiarczkowych, które są na przykład wymagane dla białek wydzielniczych12.

Istotne jest, aby upewnić się, że żadne dodatkowe składniki nie zakłócają reakcji. Najważniejsze czynniki, na które należy zwrócić uwagę podczas ustawiania reakcji lub dodawania innych składników, są wymienione poniżej. Upewnij się, że nie są używane niekompatybilne ani nie są zaburzone stężenia jonów. W miarę możliwości unikaj roztworów zawierających glicerol, wysokie stężenia potasu, magnezu, jonów wapnia, osmolitów, pirofosforanu, antybiotyków lub EDTA. Na przykład zastąpienie buforu elucyjnego wodą podczas oczyszczania DNA może być korzystne, ponieważ EDTA jest powszechnym dodatkiem w tym buforze. Zaopatrzenie roztworów w dodatkowe ujemnie naładowane cząsteczki, takie jak NTP lub dNTP, wymaga dostosowania stężenia magnezu8, ponieważ ujemnie naładowane cząsteczki zachowują się jak czynniki chelatujące i wiążą dodatnio naładowane cząsteczki. Neutralne pH jest idealne dla tej reakcji. W związku z tym wszystkie składniki powinny być buforowane do odpowiedniego pH; Jest to szczególnie ważne w przypadku cząsteczek silnie kwaśnych lub zasadowych, takich jak NTP. Wreszcie, temperatura i objętość są kluczowymi parametrami reakcji. Aby osiągnąć dobry plon, należy zastosować temperaturę około 37 °C, ponieważ temperatury poniżej 34 °C znacznie obniżą plon27.

Należy zauważyć, że przed przygotowaniem OnePot PURE należy wziąć pod uwagę docelowe zastosowanie i związane z nim wymagania, takie jak objętość, czystość, łatwość modyfikacji oraz włączenie lub pominięcie składników. W przypadku wielu zastosowań system będzie doskonałym wyborem, ale inne mogą wymagać plonów, możliwości regulacji i innych czynników, których system OnePot nie może zapewnić. Niezależnie od tego, wprowadzony protokół będzie korzystny dla przygotowania każdego domowego systemu, ponieważ wszystkie krytyczne kroki takiego przygotowania są tutaj podsumowane.

Jedną z głównych zalet systemu OnePot jest jego kompatybilność z dostępnym na rynku systemem PURExpress, który zapewnia możliwość testowania funkcjonalności i integralności wszystkich komponentów z osobna poprzez sekwencyjną wymianę każdego komponentu PURExpress na jego odpowiednik OnePot. Zalety systemu OnePot PURE, takie jak możliwość przestrajania oraz łatwe, szybkie i ekonomiczne przygotowanie, sprawią, że bezkomórkowy TX-TL będzie dostępny dla większej liczby laboratoriów na całym świecie i przyczyni się do rozszerzenia wdrożenia tej potężnej platformy w bezkomórkowej biologii syntetycznej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach grantu Unii Europejskiej Horyzont 2020 na badania i innowacje 723106, grantu szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (182019) oraz EPFL.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x Bufor Tris/Glycine/SDSBio-Rad Laboratories1610732
15 ml probówek wirówkowychVWR International525-0309
384-dołkowe czarne płytki testoweCorning3544
4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Prefabrykowane żele białkoweBio-Rad Laboratories4561096
probówki wirówkowe 50 mlVWR International525-0304
96-dołkowa polipropylenowa płytka DeepWellNunc260252
Kwas octowy, 99,8 %Acros222140010
Ä kta purifierGE Healthcareoczyszczanie rybosomów bez znaczników
AMICON ULTRA 0,5 ml - 3 KDaMerck MilliporeUFC500324
AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDaMerck MilliporeUFC900324
AminokwasySigma-AldrichLAA21-1KT
Chlorek amonuSigma-Aldrich09718-250G
Amon siarczanSigma-AldrichA4418
AmpicylinaCondalab6801
BenchMark Fluorescencyjny standard białkowy ThermoFisherLC5928
Oddychaj-Easy  membrana uszczelniającaDiversified BiotechZ380059-1PAK
Probówki wirówkowe z poliwęglanuBeckman355631oczyszczanie rybosomów bez znaczników
Chill-out Liquid WaxBio-Rad LaboratoriesCHO1411
Fosforan kreatynySigma-Aldrich27920
DNA Clean & Koncentrator-25 (z pokrywą)ZymoZYM-D4034-200TS
DTTSantaCruz Biotechsc-29089B
Econo-Pac Kolumny chromatograficzneBio-Rad Laboratories7321010
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)Sigma-Aldrich03609-250G
Probówki do mikrowirówek Eppendorf Protein LoBindVWR International / Eppendorf525-0133
Falcon 14 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z zatrzaskiemKolby 352051
z przegrodą 1000 ml 4 przegrody, szkło borokrzemianoweScilabware9141173
FluoroTect Green Lys System etykietowania tłumaczeń in vitroPromegaL5001opcjonalnie
Kwas folinowySigma-AldrichPHR1541
GlycerolSigma-AldrichG7757-1L
HEPESGibco15630-056
HiTrap Butyl HP Kolumna GEHealthcare28411005oczyszczanie rybosomów bez znaczników
IMAC Sepharose 6 Fast FlowGE Healthcare17-0921-07
ImidazolSigma-AldrichI2399
InstantBlueExpedeonISB1L-1L
IPTG (Izopropylo-beta-D-tiogalaktozyd)Alfa AesarB21149.03
Bufor Laemmli (2x), bufor do próbekSigma-AldrichS3401-1VL
Pożywka bulionowa lizogeniczna (LB)AppliChemA0954
Octan magnezuSigma-AldrichM0631
Chlorek magnezuHoneywell Fluka63020-1L
Siarczan nikluAlfa Aesar15414469
NTPThermoFisherR0481
Polimeraza DNA o wysokiej wierności Phusion (2 U/&mikro; L)ThermoFisherF530S
Chlorek potasuSigma-AldrichP5405-1KG
Glutaminian potasuSigma-Aldrich49601
PURExpress Zestaw do syntezy białek in vitroNEBE6800S
PURExpress  Złącze Delta;   Zestaw rybosomówNEBE3313S
Szybki start Bradford 1x odczynnik barwnikowyBio-Rad Laboratories5000205
Szybkoprzepływowe sterylne jednorazowe filtry próżnioweThermoFisher564-0020
Roztwór RNazyAPromegaA7973
SealPlate  filmExcel ScientificZ369659-100EA
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich6203
SpermidynaSigma-AldrichS2626
SacharozaSigma-Aldrich84097
TCEP (Tris(2-karboksetylo)fosfina-chlorowodorek)Sigma-Aldrich646547-10X1mL
Grubościenna rurkaz poliwęglanuBeckman355631
Kwas trichlorooctowySigma-AldrichT0699
Tris baseThermoFisherBP152-500
tRNA10109541001
Ultrawirówka Optima L-80Beckmanoczyszczanie rybosomów bez znaczników Filtry
strzykawkowe Whatman GD/XGE Whatman WHA68722504
β-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250-100mL
Falcon, Roche

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213(2020).
  2. Laohakunakorn, N. Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788(2020).
  3. Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).
  4. Gaut, N. J., Adamala, K. P. Reconstituting natural cell elements in synthetic cells. Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188(2021).
  5. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  6. Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. Improved cell-free RNA and protein synthesis system. PLoS One. 9 (9), 106232(2014).
  7. Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system. Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).
  8. Li, J., et al. Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system. Translation. 5 (1), Austin, Tex. 1327006(2017).
  9. de Maddalena, L. L., et al. GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system. ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).
  10. Kuruma, Y., Ueda, T. The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins. Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).
  11. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  12. Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), San Diego, Calif. 299-304 (2005).
  13. Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).
  14. Niwa, T., et al. Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system. Frontiers in Microbiology. 6, 1113(2015).
  15. Shimizu, Y., Ueda, T. PURE technology. Methods in molecular biology. 607, Clifton, N.J. 11-21 (2010).
  16. Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. Directed evolution of glycopeptides using mRNA display. Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).
  17. Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).
  18. Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).
  19. Shepherd, T., et al. De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).
  20. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).
  21. Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 37 (2), 15(2009).
  22. Gesteland, R. F. Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).
  23. Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
  24. Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system. Molecular Systems Biology. 5, 297(2009).
  25. Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes. Nature Communications. 11 (1), 904(2020).
  26. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).
  27. Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. A partially self-regenerating synthetic cell. Nature Communications. 11 (1), 6340(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

PURE SystemCell Free Protein ExpressionProtein PurificationOnePot MethodRecombinant Protein SynthesisSDS PageRibosome PreparationSynthetic BiologyBradford AssayIn Vitro Transcription

Powiązane artykuły