Artykuł metodologiczny

Zastosowanie interferencji CRISPR (CRISPRi) do wyciszania genów u patogennych gatunków Leptospira

DOI:

10.3791/62631

⸱

14 sierpnia 2021

 ,  ,  , 
1Infectious Bacterial Diseases Research Unit, National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Laboratório de Desenvolvimento de Vacinas, Instituto Butantan

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisane jest zastosowanie interferencji CRISPR (CRISPRi) do specyficznego wyciszania genów u gatunków Leptospira. Komórki Leptospira są przekształcane przez koniugację z plazmidami eksprymującymi dCas9 (katalitycznie "martwy" Cas9) i jednoprowadnicowym RNA (sgRNA), odpowiedzialnym za parowanie zasad z pożądanym celem genomowym. Przedstawiono metody walidacji wyciszania genów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leptospiroza to zaniedbana na całym świecie choroba odzwierzęca wywoływana przez chorobotwórcze i zjadliwe gatunki z rodzaju Leptospira. U ludzi choroba odpowiada za ponad milion przypadków i 60 000 zgonów rocznie na całym świecie1,2. Jak dotąd nie ma długotrwałej i skutecznej szczepionki na tę chorobę. Identyfikacja czynników wirulencji i mechanizmów patogennych ma kluczowe znaczenie dla opracowania lepszych strategii terapeutycznych i profilaktycznych. Dlatego zdolność do generowania mutacji genetycznych i oceny wynikowego fenotypu ma kluczowe znaczenie dla funkcjonalnej analizy genomowej3.

Konstrukcja mutantów w patogennej Leptospira była do tej pory uważana za z natury nieefektywną, pracochłonną, kosztowną i trudną do wdrożenia. Ten scenariusz drastycznie się zmienił wraz z zastosowaniem niedawnej interferencji CRISPR (CRISPRi) do leptospiresów saprofitycznych4 i patogenic5 leptospires.

Wyciszanie genów osiąga się poprzez ekspresję dwóch składników: wariantu enzymu CRISPR/Cas (cluster regully interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated) ze Streptococcus pyogenes, zwanego katalitycznie martwym Cas9 (dCas9) i jednoprzewodnikowego RNA (sgRNA), który może być edytowany zgodnie z pożądanym celem6, 7,8. Białko dCas9, po związaniu z sgRNA, jest kierowane do określonych celów DNA przez parowanie zasad Watsona i Cricka, powodując steryczną blokadę wydłużania polimerazy RNA, co skutkuje wyciszeniem genu z powodu zablokowanej transkrypcji genu7 (Figura 1).

Ten manuskrypt ma na celu opisanie budowy plazmidu do ekspresji zarówno dCas9, jak i sgRNA, koniugacji między dawcą E. coli β2163 a biorcą komórek Leptospira, odzyskiwania transkoniugantu i wreszcie walidacji wybranych zmutowanych kolonii.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Definicja protospaceru i budowa plazmidu

UWAGA: W tej sekcji opisano pierwszy krok wyboru odpowiednich protospacerów do budowy sgRNA i dalszej ligacji do pMaOri.dCas9 (Rysunek 1). Ta sekwencja protospacerowa składa się z sekwencji 20 nukleotydów skierowanych przeciwko pożądanemu celowi.

  1. Uzyskaj sekwencję nukleotydową genu będącego przedmiotem zainteresowania do wyciszenia w GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Prześlij go na serwer WWW CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), z parametrami zdefiniowanymi dla Streptococcus pyogenes Cas9 i sąsiadującego z nim motywu protospacerowego NGG po wybraniu opcji "Fasta Target". Zdefiniuj parametry na "CRISPR/Cas9" i PAM (protospacer sąsiedni motyw) NGG.
  2. Na podstawie uzyskanych wyników wybierz protospacery z najlepszym możliwym wynikiem (zielona strzałka), które znajdują się jak najbliżej końca 5' regionu kodującego i, co najważniejsze, są zawarte w nici matrycowej (ujemnej), ponieważ sgRNA musi sparować się z nicią kodującą genu w celu całkowitego wyciszenia genu.
    UWAGA: Motyw NGG nie jest uwzględniony w końcowej sekwencji sgRNA.
  3. Użyj promotora lipL32 do ekspresji pojedynczego przewodnika RNA, który zawiera zmienną sekwencję nukleotydową 20 na końcu 5' i konserwatywną sekwencję rusztowania dCas9. Połącz sekwencję 20-nt, zwaną protospacerem, z promotorem wargi 32(na końcu 5') i rusztowaniem sgRNA (koniec 3') (Rysunek 1B).
    UWAGA: Aby uzyskać dobrze zdefiniowany promotor lipL32, użyj regionu promotora składającego się z -334 do TSS (miejsce rozpoczęcia transkrypcji, na podstawie Zhukova et al.9). Sprawdź plik uzupełniający dla końcowej kasety sgRNA.
  4. Wygeneruj kasetę sgRNA za pomocą sekwencyjnego PCR5 lub zleć jej syntezę komercyjnemu dostawcy.
  5. Po uzyskaniu kasety należy ją podwiązać do plazmidu pMaOri.dCas9 w miejscu restrykcji XmaI na obu końcach (cccggg)4.
    1. Trawić zarówno kasetę sgRNA, jak i plazmid pMaOri.dCas9 enzymem restrykcyjnym XmaI i przystąpić do ligacji (Figura 1B).
    2. Wykonaj kroki klonowania w dT auksotroficznym szczepie E. coli π110, ze względu na pochodzenie replikacji pMaOri11 (a tym samym pMaOri.dCas9), R6K-gamma.
      UWAGA: Szczegółowy protokół podwiązania i selekcji klonów można znaleźć w poprzednich publikacjach Fernandesa i Nascimento12. Sterowany przez sgRNA dCas9 zwiąże się z nicią kodującą wybranego genu będącego przedmiotem zainteresowania, a zatem będzie blokować wydłużanie polimerazy RNA (Figura 1C), powodując wyciszenie genu.

2. Transformacja Leptospira przez koniugację

UWAGA: Schemat graficzny tego kroku jest przedstawiony w Rysunek 2. Aby utworzyć nośniki HAN i płyty HAN, zapoznaj się z Hornsby et al.13 i Fernandes et al.5.

  1. Hodować chorobotwórcze komórki Leptospira w temperaturze 29 lub 37 °C w pożywce HAN13 pod mieszaniem, rozcieńczając nasyconą kulturę w świeżym HAN w stosunku 1:100; zazwyczaj L. interrogans serowar Copenhageni szczep Fiocruz L1-130 potrzebuje 4-6 dni, aby osiągnąć odpowiednią gęstość komórek.
    1. Upewnij się, że kultury osiągną średnicę zewnętrzną 0,2-0,4 przy 420 nm (2 do 5 x 108 komórek/ml) przed użyciem do koniugacji.
      UWAGA: Ponieważ pożywka HAN zmienia kolor wraz ze wzrostem gęstości komórek (z powodu czerwieni fenolowej zawartej w pożywce DMEM), odwirować (4,000 x g, 15 min, temperatura pokojowa) 1 ml pożywki hodowlanej w celu usunięcia leptospir i zastosować supernatant jako ślepą próbę do pomiaru średnicy zewnętrznej.
  2. Przekształć sprzężony szczep E. coli β2163, auksotroficzny dla kwasu diaminopimelicznego (DAP), z plazmidem pMaOri.dCas9 zawierającym kasetę sgRNA. Dla E. Transformacja coli, użyj protokołów szoku cieplnego lub elektroporacji. Uwzględnij transformację z plazmidem pMaOri.dCas9 bez kasety sgRNA jako kontrolę.
    1. W celu przemiany w wyniku szoku cieplnego należy zmieszać plazmidowe DNA (100 ng) z chemicznie kompetentnymi komórkami E. coli i inkubować na lodzie przez 30 minut. Przeprowadzić szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 90 s i ponownie umieścić go na lodzie na 5 minut. Odzyskać komórki, dodając 1 ml pożywki LB, inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i przejść do posiewu.
    2. Do elektroporacji użyj elektrokompetentnych komórek zmieszanych ze 100 ng plazmidowego DNA. Użyj następujących parametrów dla impulsu: 1.8 kV, 100 Ω i 25 μF. Odzyskaj ogniwa, jak wyjaśniono powyżej.
    3. Umieść przekształcone komórki E. coli dawcy w pożywce agarowej LB uzupełnionej kwasem diaminomelicznym (DAP) (0,3 mM) i spektynomycyną (40 μg / ml) w celu wyselekcjonowania plazmidów.
  3. Do koniugacji wybierz jedną kolonię z każdej płytki na dzień przed dniem koniugacji (który określa się poprzez monitorowanie średnicy zewnętrznej kultur leptospires).
    1. Wybierz jedną kolonię E. coli β2163 z pustych płytek pMaOri.dCas9 i jedną z pMaOri.dCas9sgRNA. Pozwól im rosnąć przez noc w 10 ml LB plus DAP i spektynomycyny w temperaturze 37 °C.
    2. Następnego dnia rozcieńczyć nasycone kultury w stosunku 1:100 w 10 ml świeżego LB plus DAP (nie uwzględniaj tutaj antybiotyku) do OD420 nm 0,2-0,4. Zwykle E. coli potrzebuje 2-3 godzin, aby osiągnąć taką gęstość.
  4. Wewnątrz okapu bezpieczeństwa biologicznego BSL2 zmontuj aparat filtracyjny, umieszczając filtr membranowy z mieszanych estrów celulozy o średnicy 25 mm i wielkości porów 0,1 μm na górze szklanej podstawy. Umieść szklany lejek o pojemności 15 ml na górze i przytrzymaj oba kawałki za pomocą sprężyny clamps. Podłącz szklankę do pompy próżniowej i dodaj kultury do lejka w celu filtracji.
  5. Dodać 5 ml kultury Leptospira do lejka. Dodaj objętość E. coli, aby uzyskać proporcję 1:1 w oparciu o wartości OD420 nm obu kultur. Włącz pompę próżniową i skoncentruj komórki przez filtrację. Po zagęszczeniu komórek w filtrze membranowym ostrożnie je odzyskaj. Upewnij się, że pożywka jest filtrowana przez membranę.
    UWAGA: Filtracja trwa od 5 do 10 minut.
  6. Umieść filtr na dostępnej w handlu płytce EMJH (patrz Tabela materiałów) uzupełnionej DAP (0.3 mM). Upewnij się, że strona z bakteriami jest skierowana do góry. Inkubować płytki w temperaturze 29 °C przez 24 h.
    UWAGA: Jeśli używane są płytki HAN lub uzupełnione wewnętrzne EMJH14, E. coli może się namnażać i osiągnąć zamierzoną proporcję 1:1, co z kolei może zmniejszyć wydajność koniugacji5.
  7. Po 24 godzinach wyjmij filtry z płytek i umieść każdy pojedynczy filtr w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  8. Użyj 1 ml ciekłego podłoża HAN, aby uwolnić komórki z powierzchni filtra poprzez intensywne pipetowanie i wirowanie.
  9. Wizualizacja odzyskanych mieszanych roztworów bakteryjnych za pomocą mikroskopii ciemnego pola w celu sprawdzenia żywotności i ruchliwości komórek oraz proporcji Leptospira:E. coli.
    UWAGA: Na tym etapie można zaobserwować równoważną liczbę E. coli i Leptospira.
  10. Rozprowadzić 100-200 μl tej kultury na płytkach HAN zawierających 0,4% inaktywowanej surowicy królika i 40 μg/ml spektynomycyny. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 3%CO2.
    UWAGA: Zwykle komórki L. interrogans serowar Copenhageni szczep Fiocruz L1-130 tworzą kolonie w ciągu 5-7 dni na płytkach kontrolnych i w ciągu 8-10 dni na płytkach spektynomycyny. Na tym etapie E. coli nie będą rosły, ponieważ są auksotroficzne dla DAP.
  11. Jako kontrolę, rozcieńczyć kultury w stężeniu 104 leptospires/ml i dodać 100 μl na płytki bez antybiotyku, w celu monitorowania wzrostu leptospirali.

3. Selekcja kolonii oraz wzrost i walidacja transkoniugantów

UWAGA: Kolonie powinny być widoczne do 10 dnia. Nie są one jednak zbyt łatwe do zwizualizowania. Zwykle w tym momencie płytki HAN są nieco nieprzezroczyste z powodu wysuszonych komórek, które zostały rozprzestrzenione, a kolonie Leptospira mogą wyglądać jak przezroczysta aureola na białawym tle. Zaleca się oglądanie płytek pod różnymi kątami, aby uzyskać różne padanie światła, dzięki czemu kolonie są bardziej widoczne. Przy dłuższym czasie inkubacji kolonie mogą nabrać gęstszego wyglądu, aw tym przypadku prezentują się jako mleczne aureole na ciemnym tle.

  1. Dodać 100 μl płynnej pożywki HAN do każdej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml w celu odzyskania mutantów. Weź co najmniej 3 kolonie z każdej płytki.
    1. Za pomocą końcówki do mikropipet "wykop" agar, aby pobrać kolonie z płytek, ponieważ kolonie leptospiralne mogą znajdować się pod powierzchnią.
      UWAGA: Oczekuje się, że na tym etapie zostanie zabrany agar. Kolonie powinny być pobierane z płytek kontrolnych zawierających pusty plazmid pMaOri.dCas9 oraz płytek z leptospirami zawierającymi plazmidy eksprymujące zarówno dCas9, jak i pojedynczy przewodnik RNA, przeznaczone dla genu docelowego.
    2. Dozować zebraną kolonię w 100 μl pożywki HAN do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i energicznie homogenizować. Na tym etapie należy zapewnić maksymalne naruszenie integralności agaru, aby uwolnić komórki. Wirować zawieszenie przez 10 s.
  2. Zwizualizuj odzyskane komórki za pomocą mikroskopii ciemnego pola w powiększeniu 200-400x, dodając kroplę o pojemności 5 μl na szkiełko podstawowe i natychmiast przykryj próbki szkiełkiem nakrywkowym.
    1. Potwierdź obecność żywych i żywotnych leptospirów odzyskanych z kolonii.
    2. Po wizualizacji i potwierdzeniu żywotności leptospirów, przenieść 100 μl komórek do płynnej pożywki HAN zawierającej 40 μg/ml spektynomycyny.
  3. Po wzroście w płynnych pożywkach HAN oceń kultury pod kątem obecności plazmidu ze starterem pMaOri2 F (ACGCAATGTATCGATACCGAC) i R (ATAGGTGAAGTAGGCCCACCC), które rozpoznają region flankujący kasetę sgRNA.
    1. Zebrać 200 μl kultury, odwirować (4 000 x g, 15 min), wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić powstały osad w 20 μl wody.
    2. Użyj tej zawiesiny jako matrycy do dodatkowego PCR, bez potrzeby ekstrakcji DNA12.
      UWAGA: Komórki z pMaOri.dCas9 będą renderować amplikon 281 pz, w porównaniu do tych zawierających plazmidy z kasetą sgRNA, która da amplikon 723 pz.
  4. W celu potwierdzenia wyciszenia genów należy wykonać immunoblot z wykorzystaniem ekstraktów komórkowych z transkoniugantów zawierających tylko pMaOri.dCas9 (kontrola ujemna) i pMaOri.dCas9sgRNA.
    1. Nałożyć odpowiednik 5 x 107 komórek na pas żelu poliakryloamidowego z dodecylosiarczanem sodu (SDS).
    2. Białka przenoszące elektroelektronicznie do błony w celu inkubacji z odpowiednimi przeciwciałami. Oprócz przeciwciała przeciwko genowi docelowemu do wyciszenia, użyj innego do kontroli obciążenia.
  5. Utrzymuj zmutowane kultury w pożywce HAN plus spektynomycyna w celu utrzymania plazmidu. Jeśli do pożywki nie zostaną zastosowane żadne antybiotyki, można zaobserwować całkowite wyciszenie genów dla co najmniej trzech pasaży5.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mimo że zawartość CG w genomach Leptospira spp. wynosi zazwyczaj około 35%; praktycznie każdy gen prawdopodobnie zawiera PAM 5'NGG 3'; ten motyw musi być uwzględniony w nici szablonu. Po wprowadzeniu sekwencji kodującej genu (od kodonów start do stop), na podstawie wyników CHOPCHOP, należy wybrać protospacery na nici minus (-, matryca). Ważne jest, aby nie włączać motywu NGG do protospacerki 20-nt sgRNA.

Jeśli koniugacja jest wykonywana z proporcją komórek dawcy do biorcy 1:1, przez 24 godziny na powierzchni płytek agarowych EMJH plus DAP, a 200 μL odzyskanej zawiesiny bakteryjnej rozprowadza się na płytkach agarowych HAN plus spektynomycyna, kolonie transkoniugantów powinny być widoczne po około 8-10 dniach. Rozprzestrzenianie się tej objętości zwykle skutkuje 20-40 koloniami na płytkę (Rysunek 3A). W celu sprawdzenia żywotności komórek po koniugacji, komórki można rozprowadzać na płytkach HAN bez selekcji antybiotyków. W takim przypadku kolonie można zaobserwować już po 7 dniach. Płytki HAN zmieniają kolor na bladożółty w atmosferze 3% CO2 .

Po pobraniu kolonii i wzroście w płynnych pożywkach plus spektynomycyna, PCR z użyciem całych komórek i starterów pMaOri2 może być użyty do wstępnej kontroli jakości transkoniugantów (Rysunek 3B). Komórki leptospiralne zawierające kontrolny plazmid pMaOri.dCas9 powinny skutkować amplikonem 281 pz, podczas gdy komórki zawierające plazmid do wyciszania, to znaczy zawierające zarówno dCas9, jak i sgRNA, powinny skutkować amplikonem 723 pz. Startery pMaOri2 F i R zostały zaprojektowane tak, aby flankować miejsce restrykcyjne XmaI, które jest miejscem używanym podczas ligacji kasetowej sgRNA.

Po potwierdzeniu obecności plazmidu, komórki mogą być pobrane z pożywki, dwukrotnie przemyte PBS, a następnie użyte do przygotowania ekstraktu z całych komórek do immunoblottingu. Jeżeli nastąpiło wyciszenie, białka docelowe, w tym przypadku LipL32 lub zarówno LigA, jak i LigB, powinny być obserwowane tylko w komórkach typu dzikiego oraz w komórkach zawierających pMaOri.dCas9; nawet przy dłuższych czasach ekspozycji, żadne odpowiadające im białka nie powinny być widoczne w komórkach zawierających pMaOri.dCas9sgRNA (Rysunek 3C).

Jeśli planowane są eksperymenty mające na celu ocenę zjadliwości leptospirali po wyciszeniu genów, hodowle używane do koniugacji powinny być zjadliwymi Leptospira o niskiej pasażowości. Po potwierdzeniu wyciszenia genów kilka podwielokrotności można zamrozić jako kopię zapasową. Jeśli wyciszony gen ma mierzalny fenotyp, np. na podstawie wcześniejszych prac z białkami rekombinowanymi, do walidacji można wykorzystać hodowle i, w tym przypadku, komórki zawierające tylko pMaOri.dCas9 mogą zostać włączone jako kontrola ujemna.

figure-results-1
Rysunek 1: Rozwój plazmidu eksprymującego dCas9 i sgRNA. (A) Protospacer o długości 20 nt, po którym następuje S. pyogenes dCas9 PAM 5'-NGG-3', jest wybierany w obrębie nici matrycowej docelowego genu, dzięki czemu kolejne sgRNA może wykonać parowanie zasad Watsona i Cricka z odpowiednią nicią kodującą, co skutkuje całkowitym wyciszeniem genu. (B) Kaseta sgRNA składa się z promotora lipL32, protospaceru 20-nt i rusztowania dCas9. Plazmid pMaOri.dCas9 jest używany jako szkielet do ligacji kasety sgRNA w miejscu restrykcji XmaI. Powstały plazmid, określany jako pMaOri.dCas9sgRNA, jest dostarczany do leptospires, a ekspresja zarówno dCas9, jak i sgRNA jest odpowiedzialna za wyciszenie genu. (C) dCas9 skierowany przez sgRNA działa jako fizyczna bariera dla wydłużania polimerazy RNA, utrudniając w ten sposób transkrypcję. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie protokołu koniugacji. Pożądany gatunek Leptospira jest uprawiany w pożywce HAN, pod mieszaniem, aż do średnicy zewnętrznej 0,2-0,4 (faza mid-log) przy 420 nm. Na dzień przed koniugacją z płytek agarowych LB + DAP + Spc pobiera się kolonię rekombinowanego dawcy E. coli β2163 zawierającą plazmid, który jest przedmiotem zainteresowania, ponieważ komórki są hodowane przez noc w płynnym LB z tą samą suplementacją. Następnego dnia nasycony E. Kultury coli rozcieńcza się w LB plus DAP i hoduje do uzyskania średnicy zewnętrznej 0,2-0,4 przy 420 nm. Zarówno dawca E. coli, jak i biorca Leptospira są mieszane w proporcji komórek 1:1 na powierzchni filtra 0,1 μm przez aparat filtracyjny pod podciśnieniem. Następnie filtry umieszcza się na płytkach agarowych EMJH uzupełnionych DAP i inkubacja trwa 24 godziny w temperaturze 29 °C. Stosowanie EMJH ogranicza namnażanie się bakterii E. coli, a zamierzona proporcja 1:1 jest zachowana. Bakterie są odzyskiwane z filtrów przez pipetowanie za pomocą pożywki HAN o pojemności 1 ml, a zawiesiny są wizualizowane pod mikroskopią w ciemnym polu. Na koniec 100-200 μl każdej zawiesiny wysiewa się na płytki agarowe HAN zawierające 0,4% surowicy króliczej i inkubuje w temperaturze 37 °C w 3% CO2 . Na tym etapie DAP jest pomijany, w wyniku czego auksotroficzne E. coli nie będą rosły. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki do oceny mutantów. (A) Kolonie z płytek zawierających Leptospira przekształcone pustym pMaOri.dCas9 (kontrola negatywna do dalszych eksperymentów) i plazmidy pMaOri.dCas9sgRNA (z wyciszonym genem docelowym) są wybierane, energicznie homogenizowane w płynnym HAN i hodowane w płynnym HAN zawierającym spektynomycynę. Rekombinowane komórki można zwalidować metodą PCR ze starterami flankującymi miejsce XmaI w obrębie pMaOri.dCas9. (B) W tym przypadku komórki zawierające pMaOri.dCas9 spowodowały tylko amplikon 281 pz, podczas gdy komórki zawierające plazmid do wyciszania, zawierające zarówno dCas9, jak i sgRNA, wykazały amplikon 723 pz. Po potwierdzeniu obecności plazmidów, wyciszenie genów zostało zweryfikowane za pomocą analizy immunoblot. (C) Zaleca się inkubację z przeciwciałami zarówno przeciwko białku docelowemu, jak i białku kontrolnemu obciążenia; w reprezentatywnym immunoblocie wyświetlane są ekstrakty całokomórkowe z transkoniugantów zawierających pMaOri.dCas9 samodzielnie lub z kasetami sgRNA ukierunkowanymi na lipL32 (pMaOri.dCas9sgRNAlipL32) oraz geny LigA i LigB (pMaOri.dCas9sgRNAligAB). Jednoczesna inkubacja z anty-LipL32, anty-LigAB i anty-LipL41 (non-target, kontrola obciążenia) potwierdza, że ekspresja białka LipL32 jest zniesiona w komórkach zawierających pMaOri.dCas9sgRNAlipL32 oraz zarówno LigA, jak i LigB w komórkach zawierających pMaOri.dCas9sgRNAligAB. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający: Sekwencja kasety z pojedynczym przewodnikiem RNA (sgRNA). Transkrypcja sgRNA jest kierowana przez konstytutywny promotor lipL32 (pogrubione nukleotydy). sgRNA składa się z 20 nukleotydów odnoszących się do protospaceru, odpowiedzialnego za parowanie zasad z nicią kodującą genu docelowego oraz sekwencji rusztowania dCas9 (podkreślone nukleotydy). Xma (Międzynarodowa Sieć TMiejsca restrykcyjne I (cccggg) znajdują się na obu końcach do podwiązania plazmidu pMaOri.dCas9. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po wczesnym sekwencjonowaniu patogennych 15,16,17,18 i saprofitycznych19 gatunków Leptospira, eksploracja danych genomu rzuciła światło na kilka aspektów patogenezy leptospiralnej. W większości przypadków funkcję białek badano przy użyciu rekombinowanego odpowiednika przypuszczalnych białek leptospiralnych eksponowanych na powierzchnię, a następnie spekulacji na temat natywnej funkcji białka 20,21,22,23,24,25,26.

Generowanie mutantów i ocena ich odpowiedniego fenotypu są kluczowymi elementami funkcjonalnej analizy genomowej. Początkowe próby wygenerowania mutantów w Leptospira spp. osiągnięto poprzez losową mutagenezę transpozonów 27,28,29,30; jednak po obszernej i pracochłonnej analizie mającej na celu wywnioskowanie tożsamości zaburzonych genów, zauważono, że tylko 15% wszystkich genów u L. interrogans serowar Manilae było zakłóconych27. Celowany nokaut genów został następnie osiągnięty przez rekombinację homologiczną z wykorzystaniem plazmidów samobójczych w celu dostarczenia kasety oporności na antybiotyki otoczonej homologicznymi ramionami w pożądanym celu31,32.

Stosując te technologie, zbadano kilka aspektów podstawowej biologii i zjadliwości leptospirali 31,33,34,35,36,37. Opracowanie koniugacyjnego wektora wahadłowego E. coli-Leptospira, pMaOri 11, umożliwiło dostarczenie składników do episomalnego wyciszania genów.

Wcześniej wykazano, że wywołane przez Cas9 pęknięcie podwójnej nici jest śmiertelne dla Leptospira spp., a jako alternatywa katalitycznie nieaktywny wariant enzymu, dCas9, może być stosowany do wyciszania genów zarówno u gatunków saprofitycznych, jak i patogennych4, 5. Wykorzystując plazmid pMaOri.dCas9 jako szkielet do ligacji kasetowej sgRNA, można uzyskać specyficzne i stabilne wyciszenie genów dzięki ekspresji zarówno dCas9, jak i sgRNA; sgRNA związane z dCas9 doprowadzi białko do pożądanego celu poprzez parowanie zasad Watsona-Cricka.

W celu całkowitego wyciszenia genu, protospacer powinien być zaprojektowany w oparciu o nić matrycową pożądanego genu, tak aby parowanie zasad sgRNA zachodziło z nicią kodującą. W oparciu o średnią zawartość C+G wynoszącą 35% w Leptospira spp., PAM 5'-NGG-3' występuje co najmniej 3 razy na 100 pz. Dlatego praktycznie każdy gen w genomie Leptospira będzie zawierał co najmniej jeden PAM. Jeśli jednak motyw NGG nie zostanie znaleziony, można ocenić alternatywny motyw NAG.

Poprzednie techniki wyciszania genów, takie jak palce cynkowe i TALE (efektory podobne do aktywatora transkrypcji), opierały się na budowie jednego innego białka dla każdego celu, co sprawiało, że techniki te były pracochłonne ikosztowne. W przypadku CRISPRi składową zmienną jest sgRNA, co sprawia, że konieczna jest zmiana tylko 20 pz na końcu 5'. Całkowite, stabilne i ukierunkowane wyciszenie genów zaobserwowano nie tylko u Leptospira spp.4,5, ale także u innych bakterii 8,39,40,41.

Rozwój pożywki HAN13 sprzyjał odzyskiwaniu mutantów poprzez drastyczne skrócenie czasu inkubacji w celu utworzenia kolonii i umożliwienie Leptospira wzrostu w temperaturze 37 oC. Jednak na etapie koniugacji jego stosowanie nie jest zalecane, ponieważ E. coli może energicznie namnażać się w tej pożywce i pokonywać zamierzoną proporcję 1:1 między komórkami dawcy i biorcy. Na tym etapie EMJH plus DAP jest lepszym wyborem, ponieważ E. coli słabo się replikują w tym pożywce. Warto wspomnieć, że niektóre laboratoria wytwarzają we własnym zakresie suplementy EMJH, które mogą zawierać dodatkowe składniki, które mogą również wspierać wzrost komórek E. coli .

Przedstawiony tutaj protokół koniugacji został zoptymalizowany dla L. interrogans serowar Copenhageni szczep Fiocruz L1-130, a także udowodniono, że jest skuteczny w transformacji niedawno wyizolowanego szczepu chorobotwórczego z próbek gleby5. Wstępne próby z różnymi serowarami z gatunku L. borgpetersenii wskazują na niższą skuteczność koniugacji z opisanym protokołem. W związku z tym, podczas pracy z różnymi gatunkami/serowarami Leptospira, optymalne warunki koniugacji powinny być określone empirycznie, biorąc pod uwagę proporcje komórek dawcy do biorcy, początkową gęstość komórek, pożywkę koniugacyjną i czas (24 i 48 godzin). Rozsądne jest założenie, że różne gatunki Leptospira i serotypy będą zachowywać się inaczej przy różnych protokołach koniugacji.

Mimo że saprofityczne kolonie Leptospira są stosunkowo łatwe do uwidocznienia na płytkach, kolonie chorobotwórcze mogą być trudniejsze do zaobserwowania. Zwykle, stosując pożywkę HAN uzupełnioną 0,4% surowicą króliczą i spektynomycyną, kolonie transkoniugowane można zaobserwować w 10 dniu. Z naszego doświadczenia wynika, że kolonie początkowo prezentują się jako przezroczysta aureola na powierzchni ośrodka. W protokole wideo pokazane są gęstsze kolonie po 14 dniach wzrostu, ponieważ przezroczyste były trudne do sfilmowania. Na tym etapie obracanie płytki w celu uzyskania różnego padania światła i przechodzenie między białym i ciemnym tłem może pomóc w identyfikacji kolonii.

W przypadku walidacji mutantów immunoblotting oferuje proste podejście; Ponieważ jednak przeciwciała przeciwko białkom docelowym nie zawsze są dostępne, można zastosować alternatywne strategie walidacji wyciszania genów. Ilościowa reakcja PCR z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR) przy użyciu starterów dla genu docelowego i kontroli konstytutywnej jest skuteczna w walidacji wyciszania genów, ponieważ dCas9 sterowany przez sgRNA jest odpowiedzialny za blokowanie transkrypcji genu. Jeśli gen docelowy koduje wyraźnie zdefiniowane pasmo białkowe w żelach białkowych, SDS-PAGE może wykazać wyciszenie i zgodnie z lipL32 gen wyciszenia5. Jeśli geny biosyntezy LPS zostaną wyciszone, można zastosować barwienie LPS; w przypadku wyciszania genów kodujących enzymy z dobrze zdefiniowanymi substratami, testy kinetyczne z substratami chromogennymi są odpowiednimi strategiami; Wyciszanie β-galaktozydazy u L. biflexa zwalidowano przy użyciu substratów X-gal i ONPG (orto-nitrofenylo-β-galaktozyd)4.

Po potwierdzeniu wyciszenia genów można zaprojektować eksperymenty w celu dalszej oceny fenotypu. Testy wiązania można wykonać w przypadku wyciszania adhezyn bakteryjnych; Testy prowokacyjne w surowicy potwierdziły rolę LigA i LigB w przeżywalności surowicy wykazywanej przez patogenną Leptospira5. Mutanty mogą być również używane do inokulacji zwierząt w celu oceny osłabienia zjadliwości; w takim przypadku zwierzęta zaszczepione mutantem należy porównać z tymi, które zostały zakażone komórkami zawierającymi tylko pMaOri.dCas9.

Podsumowując, obecny protokół opisuje zastosowanie CRISPRi do wyciszania genów u patogennych gatunków Leptospira przy użyciu pożywek HAN w celu ułatwienia odzyskiwania zmutowanych w ciągu 10 dni. Wyciszanie genów w połączeniu z funkcjonalną analizą genomu poprawi nasze zrozumienie mechanizmów patogennych Leptospira i ostatecznie doprowadzi do opracowania lepszych strategii profilaktycznych w celu kontroli choroby.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą. Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tej publikacji mają na celu wyłącznie dostarczenie konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. Brazylijska agencja FAPESP (grant 2014/50981-0) wsparła finansowo te prace; LGVF jest finansowany ze stypendium FAPESP (2017/06731-8 i 2019/20302-8). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowywaniu manuskryptów. Autorzy dziękują również Hannah Hill i Alexandrowi Grimesowi z USDA Visual Services za sfilmowanie i montaż protokołu wideo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 &mikro; m wielkość porów mieszana membrana estrów celulozyMilliporeVCWP02500Filtracja do koniugacji bakteryjnej
Kwas 2,6-diaminopimeliczny (DAP)SigmaD1377Wzrost auksotroficznych E. coli β 2163
Agar NobleBD & Firma214230Służy do przygotowania stałych płytek EMJH i HAN
Bacto AgarBD & Firma214010Służy do przygotowania litych płytek LB
Przejrzystość Zachodni substrat ECLBiorad170-5060Podłoże chemiluminescencyjne
zestaw dNTPThermo Fisher10297-018dNTP do reakcji PCR
Szklany uchwyt filtra do mikroanalizyFiltracja XX1012530koniugacji bakteryjnej
System obrazowaniaBioradChemiDoc MPDetekcja chemiluminescencji
bulion LB, MillerBD & Firma244620Lizogeniczne płynne podłoże dla E. coli hodowla
Leptospira Wzbogacanie EMJHBD & Firma279510Suplementacja EMJH media
Leptospira Medium Base EMJHBD & Firma279410Pożywka EMJH dla Leptospira
Mini-PROTEAN TGX Gels 12%Biorad4568043Używany do eletrorezy żelu poliakrylamidowego
Czytnik gęstości optycznejUrządzenia molekularneSpectraMax M2Do pomiarów gęstości optycznej kultur bakteryjnych Sól fizjologiczna
buforowana fosforanem 7,4Sigma806552Roztwór soli do mycia granulek bakteryjnych
SpectinomycinSigmaS0692Wybór plazmidów szkieletowych pMaOri
Taq DNA Polimeraza ThermoFisherEP0402Enyme, bufor i MgCl2 do reakcji PCR
TermocyklerZastosowany BiosystemGeneAmp PCR System 9700Używany do cyklicznych reakcji PCR
Tymidyna (dT)SigmaT9250Wzrost auksotroficznych E. coli π 1
Enzym restrykcyjny XmaINowy Englan BioLabsR0180LTrawienie plazmidów i insertów
do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bharti, A. R., et al. Leptospirosis: A zoonotic disease of global importance. Lancet Infectious Disease. 3 (12), 757-771 (2003).
  2. Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLoS Neglected Tropical Disease. 9 (9), 0003898(2015).
  3. Shapiro, R. S., et al. A CRISPR-Cas9-based gene drive platform for genetic interaction analysis in Candida albicans. Nature Microbiology. 3 (1), 73-82 (2018).
  4. Fernandes, L. G. V., et al. Gene silencing based on RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9): a new tool for genetic engineering in Leptospira. Science Reports. 9 (1), 1839(2019).
  5. Fernandes, L. G. V., Hornsby, R. L., Nascimento, A. L. T. O., Nally, J. E. Genetic manipulation of pathogenic Leptospira: CRISPR interference (CRISPRi)-mediated gene silencing and rapid mutant recovery at 37 C. Science Reports. 11 (1), 1768(2021).
  6. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  7. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  8. Choudhary, E., Thakur, P., Pareek, M., Agarwal, N. Gene silencing by CRISPR interference in mycobacteria. Nature Communication. 6, 6267(2015).
  9. Zhukova, A., et al. Genome-wide transcriptional start site mapping and sRNA identification in the pathogen. Frontiers in Cell and Infectious Microbiology. 7, 10(2017).
  10. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPalpha) conjugative machineries, and their cognate Escherichia coli host strains. Research in Microbiology. 156 (2), 245-255 (2005).
  11. Pappas, C. J., Benaroudj, N., Picardeau, M. A replicative plasmid vector allows efficient complementation of pathogenic Leptospira strains. Applied Environmental Microbiology. 81 (9), 3176-3181 (2015).
  12. Fernandes, L. G. V., Nascimento, A. L. T. O. Specific gene silencing in Leptospira biflexa by RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9). Methods in Molecular Biology. 2134, 109-122 (2020).
  13. Hornsby, R. L., Alt, D. P., Nally, J. E. Isolation and propagation of leptospires at 37 °C directly from the mammalian host. Science Reports. 10 (1), 9620(2020).
  14. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 12, Unit 12E.12 (2006).
  15. Nascimento, A. L., et al. Comparative genomics of two Leptospira interrogans serovars reveals novel insights into physiology and pathogenesis. Journal of Bacteriology. 186 (7), 2164-2172 (2004).
  16. Nascimento, A. L., et al. Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Brazillian Journal of Medical Biology Research. 37 (4), 459-477 (2004).
  17. Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
  18. Bulach, D. M., et al. Genome reduction in Leptospira borgpetersenii reflects limited transmission potential. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (39), 14560-14565 (2006).
  19. Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLoS One. 3 (2), 1607(2008).
  20. Fernandes, L. G., et al. OmpL1 is an extracellular matrix- and plasminogen-interacting protein of Leptospira spp. Infections and Immunity. 80 (10), 3679-3692 (2012).
  21. Fernandes, L. G., et al. Leptospira spp.: Novel insights into host-pathogen interactions. Veterinary Immunology and Immunopathology. 176, 50-57 (2016).
  22. Castiblanco-Valencia, M. M., et al. Leptospiral immunoglobulin-like proteins interact with human complement regulators factor H, FHL-1, FHR-1, and C4BP. Journal of Infectious Diseases. 205 (6), 995-1004 (2012).
  23. Choy, H. A., et al. The multifunctional LigB adhesin binds homeostatic proteins with potential roles in cutaneous infection by pathogenic Leptospira interrogans. PLoS One. 6 (2), 16879(2011).
  24. Siqueira, G. H., et al. The recombinant LIC10508 is a plasma fibronectin, plasminogen, fibrinogen and C4BP-binding protein of Leptospira interrogans. Pathogen and Diseases. 74 (2), (2016).
  25. Teixeira, A. F., et al. Features of two new proteins with OmpA-like domains identified in the genome sequences of Leptospira interrogans. PLoS One. 10 (4), 0122762(2015).
  26. Kochi, L. T., et al. The interaction of two novel putative proteins of Leptospira interrogans with E-cadherin, plasminogen and complement components with potential role in bacterial infection. Virulence. 10 (1), 734-753 (2019).
  27. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infections and Immunity. 77 (2), 810-816 (2009).
  28. Bourhy, P., Louvel, H., Saint Girons, I., Picardeau, M. Random insertional mutagenesis of Leptospira interrogans, the agent of leptospirosis, using a mariner transposon. Journal of Bacteriology. 187 (9), 3255-3258 (2005).
  29. Pětrošová, H., Picardeau, M. Screening of a Leptospira biflexa mutant library to identify genes involved in ethidium bromide tolerance. Applied Environmental Microbiology. 80 (19), 6091-6103 (2014).
  30. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods in Molecular Biology. 859, 169-176 (2012).
  31. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: Disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infections and Immunity. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  32. Picardeau, M., Brenot, A., Saint Girons, I. First evidence for gene replacement in Leptospira spp. Inactivation of L. biflexa flaB results in non-motile mutants deficient in endoflagella. Molecular Microbiology. 40 (1), 189-199 (2001).
  33. King, A. M., et al. High-temperature protein G is an essential virulence factor of Leptospira interrogans. Infections and Immunity. 82 (3), 1123-1131 (2014).
  34. Lambert, A., et al. FlaA proteins in Leptospira interrogans are essential for motility and virulence but are not required for formation of the flagellum sheath. Infections and Immunity. 80 (6), 2019-2025 (2012).
  35. Murray, G. L., et al. Leptospira interrogans requires heme oxygenase for disease pathogenesis. Microbes and Infections. 11 (2), 311-314 (2009).
  36. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathogens. 3 (7), 97(2007).
  37. Sasaki, Y., et al. Leptospiral flagellar sheath protein FcpA interacts with FlaA2 and FlaB1 in Leptospira biflexa. PLoS One. 13 (4), 0194923(2018).
  38. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  39. Cress, B. F., et al. Rapid generation of CRISPR/dCas9-regulated, orthogonally repressible hybrid T7-lac promoters for modular, tuneable control of metabolic pathway fluxes in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (9), 4472-4485 (2016).
  40. Zhao, C., Shu, X., Sun, B. Construction of a gene knockdown system based on catalytically inactive ("dead") Cas9 (dCas9) in Staphylococcus aureus. Applied Environmental Microbiology. 83 (12), (2017).
  41. Zhao, Y., et al. CRISPR/dCas9-mediated multiplex gene repression in Streptomyces. Biotechnology Journal. , 1800121(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pathogenic LeptospiraFunctional GenomicsdCas9 Guide RNAPlasmid ConjugationHornsby Alt Nally MediaMutant Colony IsolationDark Field MicroscopyImmunoblot Analysis

Powiązane artykuły