Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62633

⸱

22 czerwca 2021

 ,  , 
1Department of Neurological Sciences, University of Nebraska Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Streszczenie

Aby w pełni zrozumieć fizjologię komórkową neuronów i gleju u zachowujących się zwierząt, konieczne jest wizualizację ich morfologii i zarejestrowanie ich aktywności in vivo u zachowujących się myszy. W artykule opisano metodę implantacji przewlekłego okna czaszkowego, aby umożliwić podłużne obrazowanie komórek mózgowych u przytomnych, skrępowanych głowami myszy. W połączeniu ze strategiami genetycznymi i iniekcjami wirusowymi możliwe jest znakowanie określonych komórek i regionów za pomocą markerów strukturalnych lub fizjologicznych. Protokół ten pokazuje, jak łączyć zastrzyki wirusowe w celu znakowania neuronów w pobliżu astrocytów wykazujących ekspresję GCaMP6 w korze mózgowej w celu jednoczesnego obrazowania obu komórek przez okno czaszkowe. Wielofotonowe obrazowanie tych samych komórek może być wykonywane przez dni, tygodnie lub miesiące u jawych, zachowujących się zwierząt. Takie podejście zapewnia naukowcom metodę obserwacji dynamiki komórkowej w czasie rzeczywistym i może być stosowane do odpowiedzi na wiele pytań w neurobiologii.

Wprowadzenie

Zdolność do wykonywania in vivo wielofotonowej mikroskopii fluorescencyjnej w korze myszy jest kluczowa dla badania sygnalizacji komórkowej i struktury1,2,3,4,5,6,7,8, 9, patologia choroby10,11, oraz rozwój komórkowy12,13. Dzięki implantacji przewlekłych okien czaszkowych możliwe jest obrazowanie podłużne, co pozwala na wielokrotne obrazowanie obszarów korowych przez dni, tygodnie lub miesiące13,14 u żywych zwierząt. Mikroskopia wielofotonowa jest idealna do wielokrotnego obrazowania in vivo ze względu na ulepszone sondowanie głębokości i zmniejszone fotouszkodzenia związane z zastosowanym laserem na podczerwień. Pozwala to na badanie dynamiki molekularnej i komórkowej określonych komórek w różnych obszarach kory mózgowej.

Mikroskopia wielofotonowa została wykorzystana do obrazowania in vivo komórek neuronalnych i glejowych u myszy15,16,17,18,19,20. Można wdrożyć różne strategie oznaczania określonych typów komórek i obszarów zainteresowania. Jednym z powszechnych podejść jest sterowanie ekspresją genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych w sposób specyficzny dla komórki za pomocą systemu rekombinacji Cre-Lox. Można to przeprowadzić na genetycznie zmodyfikowanych myszach, np. krzyżując "floxowaną" mysz tdTomato (Ai14) z myszą wykazującą ekspresję Cre-rekombinazy pod promotorem zainteresowania21. Alternatywnie, znakowanie specyficzne dla komórek i miejsca można osiągnąć za pomocą zastrzyków wirusowych. W tym przypadku wirus kodujący rekombinazę Cre pod promotorem specyficznym dla komórki i wirus kodujący kłaczkowaty gen będący przedmiotem zainteresowania są wstrzykiwane do określonego regionu. Odpowiednie typy komórek, które otrzymają oba wektory wirusowe, będą następnie wyrażać pożądane geny (geny). Geny te mogą być markerami strukturalnymi, takimi jak tdTomato, do wyświetlania zmian w morfologii komórek22 lub genetycznie kodowanymi wskaźnikami wapnia (GECI), takimi jak GCaMP i/lub RCaMP, w celu zbadania dynamiki wapnia23. Metody rekombinacji genetycznej mogą być stosowane pojedynczo lub w połączeniu w celu oznakowania jednego lub więcej typów komórek. Trzecim podejściem, niewymagającym transgenicznych myszy lub konstruktów wirusowych (które mają ograniczoną zdolność pakowania), jest elektroporacja konstruktów DNA w macicy24. W zależności od czasu elektroporacji, różne typy ogniw mogą być celowane25,26,27.

Podczas wykonywania obrazowania wielofotonowego, myszy mogą być obrazowane w stanie czuwania lub znieczulone. Obrazowanie obudzonych myszy można wykonać, zabezpieczając mysz za pomocą dołączonej płyty czołowej28. Podejście to jest mniej stresujące, ponieważ pozwala na względnie swobodne poruszanie się zwierzęcia za pomocą takich metod, jak swobodnie unoszące się, wspierane powietrzem kulki styropianowe29, bieżnie swobodnie pływające1, lub system klatek domowych podnoszony powietrzem, w którym myszy są mocowane za pomocą dołączonej płyty czołowej i mogą poruszać się w otwartej komorze30. W przypadku każdego z tych warunków obrazowania konieczne będzie najpierw przyzwyczajenie myszy do konfiguracji obrazowania. W artykule opisano procedurę habituacji i obrazowania przy użyciu systemu klatek domowych podnoszonych powietrzem.

Ten protokół opisuje implantację przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania in vivo w korze mózgowej. Tutaj użyjemy myszy, które warunkowo eksprymują GCaMP6f w astrocytach, aby monitorować dynamikę sygnalizacji wapnia. Ponadto w artykule opisano procedurę wstrzykiwania wirusa przy użyciu tdTomato jako etykiety dla neuronów. Pozwala to na określenie zmian w strukturze synaptycznej neuronów i/lub dostępności jako markera strukturalnego, który umożliwia wielokrotne obrazowanie tego samego astrocytu. W całym protokole podkreślone zostaną kluczowe kroki mające na celu zapewnienie najlepszej możliwej jakości obrazów uzyskanych z mikroskopii wielofotonowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez IACUC w Centrum Medycznym Uniwersytetu Nebraska.

1. Przed operacją

  1. Przygotuj pipety do wstrzykiwań wirusowych. Pociągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do pipet i ukosuj pipetę pod kątem 20°. Wysterylizuj pipety przez noc.
  2. Przygotuj świeże kawałki sterylnej pianki żelowej, krojąc je na małe kwadraty. Zanurz piankę żelową w sterylnej probówce do mikrofugi zawierającej 0,5 ml soli fizjologicznej. Namocz piankę żelową w soli fizjologicznej na co najmniej 30 minut przed użyciem.
  3. Przygotuj świeże kawałki pasków biszkoptu, krojąc je w cienkie paski.
  4. Dwadzieścia minut przed zabiegiem wstrzyknij 4-6-tygodniowym myszom GLAST-CreER/GCaMP6f dootrzewnowo 0,2 mg/kg deksametazonu, aby zapobiec obrzękowi mózgu i 5 mg/kg karprofenu, aby zmniejszyć stan zapalny><. UWAGA: Aby indukować rekombinację i ekspresję GCaMP6f w około 40% astrocytów, myszom GLAST-CreER/GCaMP6f wstrzyknięto 100 mg/kg tamoksyfenu przez 3 tygodnie przez 5 kolejnych dni.

2. Rozpoczęcie operacji

  1. Po 20 minutach znieczulić myszy 3% izofluranem z tlenem przy natężeniu przepływu 1 l/min przez około 1,5 minuty.
  2. Po znieczuleniu umieść mysz na ramie stereotaktycznej, która znajduje się na kocu recyrkulującym wodę, aby utrzymać temperaturę ciała 37 °C przez cały czas trwania operacji. Przymocuj mysz do ramy za pomocą zacisku pyska i nauszników. Upewnij się, że zacisk pyska i pręty uszne są na tyle stabilne, że głowa nie będzie się poruszać podczas zabiegu, ale nie na tyle ciasno, aby czaszka została uszkodzona.
  3. Utrzymuj znieczulenie 1-1,5% izofluranem z tlenem przy natężeniu przepływu 1-2 l/min. Należy pamiętać, że niektóre zwierzęta mogą potrzebować mniej lub więcej izofluranu, aby utrzymać uspokojenie. Monitoruj oddech zwierzęcia, a także jego odruchy na szczypanie palców u nóg i ogona oraz odpowiednio dostosuj izofluran.
  4. Nałóż maść na oko na każde oko za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu.
  5. Za pomocą trymerów do gryzoni zgol włosy od szyi do tuż za oczami. Zachowaj ostrożność, aby upewnić się, że wąsy zwierzęcia nie zostaną przypadkowo przycięte.
  6. Oczyść ogolony obszar jednym wacikiem jodowym, a następnie jednym wacikiem nasączonym alkoholem.
  7. Za pomocą sterylnych kleszczyków tkankowych i nożyczek chirurgicznych przeciąć i usunąć skórę od szwów czołowych przed bregmą aż do lambda.
  8. Po usunięciu skóry dodaj około 0,1 ml 1% ksylokainy (lidokainy z epinefryną 1:200 000) do czaszki, aby zminimalizować krwawienie czaszki.
  9. Używając sterylnego ostrza chirurgicznego ze stali węglowej w rozmiarze 11 przymocowanego do rękojeści, delikatnie zeskrob tkankę łączną z czaszki. Zachowaj szczególną ostrożność podczas usuwania tkanki łącznej w pobliżu krawędzi czaszki, ponieważ pozostała tkanka może zapobiec późniejszemu silnemu przyleganiu szkła lub płytki głowy.
  10. Użyj sterylnych kleszczyków tkankowych, aby usunąć luźną tkankę łączną z czaszki.
  11. Za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką usuń pozostałą ksylokainę z czaszki.
  12. Po zakończeniu dokładnie odtłuść czaszkę za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką zamoczonego w acetonie. Użyj sprężonego powietrza, aby natychmiast wysuszyć czaszkę.

3. Kraniotomia

  1. Za pomocą cienkiego markera punktowego i linijki zmierz odpowiedni rozmiar otworu w żądanym miejscu. Potwierdź rozmiar otworu, porównując go z rozmiarem szkła nakrywkowego (o średnicy 3 lub 5 mm); Upewnij się, że otwór jest nieco mniejszy niż rozmiar szkła nakrywkowego.
  2. Za pomocą wiertła dentystycznego stopniowo śledź kontur otworu, przerzedzając kość. Wiercić powoli, aby zapobiec przewiercaniu się przez kość, i wiercić w koncentrycznych okręgach, aby ułatwić równomierne przerzedzenie kości.
  3. Po każdym koncentrycznym przejściu dodaj kroplę lub dwie sterylnej soli fizjologicznej do wierconego obszaru. Pozostaw sól fizjologiczną na co najmniej 10 sekund, aby zapobiec przegrzaniu kości i uszkodzeniu leżącej pod nią opony twardej.
  4. Użyj sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby wchłonąć pozostałą sól fizjologiczną. Przedmuchaj obszar sprężonym powietrzem, aby upewnić się, że cała pozostała sól fizjologiczna wyparowała przed wznowieniem wiercenia. Zrób to, aby zdmuchnąć resztki kości, które pozostały.
  5. Powtarzaj kroki 3.2-3.4, aż kość zostanie odpowiednio rozrzedzona do usunięcia.
  6. Upewnij się, że kość jest odpowiednio cieńsza do usunięcia, delikatnie naciskając na środkową część kości cienkimi kleszczami, aby sprawdzić, czy przerzedzona czaszka się porusza. Znajdujące się poniżej naczynia krwionośne powinny być widoczne w miejscu, w którym nastąpiło wiercenie. Zauważ, że kość może wyglądać tak, jakby pękła w miejscu, w którym nastąpiło przerzedzenie.
    UWAGA: Trening na tym etapie ma kluczowe znaczenie dla określenia, kiedy kość została odpowiednio przerzedzona.
  7. Przed próbą usunięcia kości sprawdź, czy mysz jest całkowicie uspokojona. Jeśli nie, należy stopniowo zwiększać konserwację izofluranu, aby zapobiec obrzękowi mózgu podczas usuwania kości.
  8. Dodaj mały kawałek pianki żelowej nasączonej solą fizjologiczną do rozcieńczonej czaszki. Dodaj jedną lub dwie dodatkowe krople soli fizjologicznej do rozcieńczonej czaszki.
    UWAGA: Duża ilość soli fizjologicznej na przerzedzonej czaszce pomaga zmniejszyć krwawienie i chronić oponę twardą podczas usuwania płata kostnego.
  9. Używając miniaturowego ostrza spiczastego pod kątem 15°, ostrożnie włóż ostrze do przerzedzonej kości i przetnij wzdłuż przerzedzonej kości. Utrzymuj piankę żelową nasączoną solą fizjologiczną, gotową do zatrzymania wszelkich krwawień, które mogą wystąpić.
  10. Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś i usuń kość. Bądź tak delikatny, jak to możliwe, aby uniknąć uszkodzenia leżącej pod spodem tkanki i naczyń krwionośnych. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić opony twardej.
  11. Po usunięciu płata kostnego dodaj do kory świeży kawałek pianki żelowej nasączonej solą fizjologiczną. Dodaj kilka kropli soli fizjologicznej, aby zapobiec wysychaniu pianki żelowej, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tkanki znajdującej się pod spodem.

4. Zastrzyki wirusowe

  1. Wykonaj zastrzyki wirusowe za pomocą aparatu stereotaktycznego.
    1. Przygotuj AAV1. CaMKII.0.4.Cre (miano 3 × 1013 kopii genomu (GC)/ml) w stosunku 1:5 000 przez seryjne rozcieńczenia w roztworze soli fizjologicznej.
    2. Przygotować mieszaninę AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5 000) oraz AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (miano 5 × 1012 GC/mL) na małym kawałku parafilmu.
    3. Napełnij sterylną szklaną pipetę ze ściętym skosem o rozmiarze końcówki 20 μm mieszaniną wirusów, delikatnie umieszczając pipetę na roztworze.
    4. Opuścić pipetę tak, aby dotykała tylko powierzchni mózgu i kontynuować obniżanie o dodatkowe 200-300 μm w przypadku wstrzyknięć L2/3. Korzystając z wewnątrzkomórkowego systemu dozowania mikroiniekcji (patrz Tabela materiałów), wstrzyknij ciśnieniowo 12-15 razy w ciągu 2 minut (20 psi, czas trwania impulsu 9 ms). Przy każdym wstrzyknięciu należy obserwować menisk w kropli pipety, aby upewnić się, że pipeta nie jest zablokowana.
    5. Po wstrzyknięciu pozostaw pipetę w mózgu na 4-5 minut, aby zapobiec cofaniu się. Powoli wycofaj pipetę.
    6. Powtórzyć wstrzyknięcia w 2-3 miejscach (około 500 μm od siebie).
    7. Wyrzuć zużyte szklane pipety, parafilm, końcówki do pipet i probówki do mikrofug używane do seryjnych rozcieńczeń wirusa Cre do 10% wybielacza.

5. Implantacja okna czaszkowego

  1. Usuń piankę żelową i użyj małego paska pasków gąbki, aby wchłonąć pozostałą sól fizjologiczną.
  2. Dodaj kilka kropli antybiotyku enrofloksacyny (22,7 μg/ml) do otworu i pozostaw go tam na 1 minutę. Po 1 minutach użyj świeżego kawałka biszkoptu, aby wchłonąć pozostałą enrofloksacynę. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy.
  3. Po trzecim praniu dodaj kilka kropel soli fizjologicznej do otworu i pozostaw ją tam na 1 minutę. Po 1 minutie użyj świeżego kawałka biszkoptu, aby wchłonąć pozostałą sól fizjologiczną. Powtórz ten proces prania jeszcze dwa razy, a po trzecim praniu dodaj małą kroplę soli fizjologicznej do otworu.
  4. Umieść szklankę nakrywkową nad otworem. Użyj kleszczyków, aby upewnić się, że szkło jest równo z otworem, aby uzyskać obrazy dobrej jakości.
  5. Delikatnie przytrzymując szybę na miejscu, nałóż klej cyjanoakrylowy (tabela materiałów) na obwodzie szkła, aby uszczelnić krawędzie okna do czaszki. Upewnij się, że klej nie przedostanie się pod szkło nakrywkowe i trzymaj jak najwięcej kleju z powierzchni szkła nakrywkowego.
  6. Nałóż warstwę super kleju na żel adhezyjny. Nałóż warstwę płynu z cementu dentystycznego na klej, aby mógł stwardnieć.
  7. Weź odpowiedniej wielkości płytę czołową typu helikopterowego i nałóż cienką warstwę kleju wokół środkowego otworu. Umieść płytę głowicy na szkle nakrywkowym i poczekaj, aż klej na chwilę wyschnie.
  8. W probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml dodaj proszek cementu dentystycznego do oznaczenia 0,1 ml na probówce. Dodaj 7-8 kropli szybkoutwardzalnego, błyskawicznego kleju i wymieszaj. Pobrać do strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o sile 19 g, która została przecięta w celu utworzenia większego otworu.
  9. Wstrzyknąć mieszaninę przez boczne otwory pręta helikoptera, aż zacznie wyciekać z obu stron. Nałóż mieszankę cementu dentystycznego i kleju na resztę odsłoniętej czaszki, aby przymocować płytkę głowy do czaszki, co zmniejszy artefakty ruchu podczas obrazowania.
  10. Pozostaw mieszaninę do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 15 minut.
  11. Wstrzyknij mysz 0,5 ml soli fizjologicznej podskórnie, aby wspomóc regenerację.

6. Operacja po operacji

  1. Wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i umieść ją z powrotem w klatce.
  2. Umieść część klatki na kocu recyrkulacyjnym wody, poduszkach grzewczych z żelu kosmicznym lub podkładkach izotermicznych, aby pomóc w rekonwalescencji.
  3. Zapewnij zwierzęciu niewielką porcję granulek pokarmowych i mokrej karmy, oprócz regularnej diety, aby jeszcze bardziej pomóc w powrocie do zdrowia. Dodawaj nowe granulki karmy i mokrą karmę każdego dnia po operacji na czas rekonwalescencji.
  4. Dzień po zabiegu należy wstrzyknąć myszom raz 5 mg/kg karprofenu i 5 mg/kg enrofloksacyny.
  5. W dniach 2-6 wstrzyknąć myszom raz 5 mg/kg karprofenu i dwa razy 5 mg/kg enrofloksacyny, w oczekiwaniu na zatwierdzenie przez lokalny IACUC. Wstrzyknięcia enrofloksacyny należy oddzielić od siebie o co najmniej 8 godzin.
  6. W dniach 7-20 należy codziennie wstrzykiwać myszom 5 mg/kg karprofenu.

7. Przyzwyczajenie zwierząt do obrazowania

  1. W 14 dniu po zabiegu zbadaj okno czaszki pod kątem jasności optycznej. Nie używaj myszy z niejasnymi lub w inny sposób uszkodzonymi oknami (tj. nadmierną angiogenezą).
  2. Sprawdź ekspresję tdTomato pod mikroskopem fluorescencyjnym. Jeśli można zidentyfikować znakowane komórki, przystąp do habituacji zwierząt.
  3. Pierwszy dzień habituacji (obsługi)
    1. Przytrzymaj mysz przez kilka minut, a po użyciu włóż ją z powrotem do klatki. Powtórz obsługę trzy razy w 15-minutowym odstępie między sesjami.
    2. Po trzeciej próbie przyzwyczaj mysz, owijając zwierzę w mały kawałek materiału.
    3. Trzymaj mysz owiniętą w szmatkę przez około 1 minutę.
    4. Po próbie włóż mysz z powrotem do klatki. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy, pozostawiając 15-minutowy odstęp między każdą próbą.
  4. Drugi dzień habituacji
    1. Zważ i zapisz wagę myszy.
    2. Owiń mysz w szmatkę i przymocuj ją za pomocą płyty czołowej do ramienia mocującego głowę klatki domowej podnoszonej powietrzem.
    3. Pozostaw klatkę domową wystawioną na działanie światła.
    4. Pozostaw mysz zabezpieczoną w klatce domku mobilnego przez 15 minut.
    5. Po przyzwyczajeniu wyjmij mysz z klatki domowej i wyłącz przepływ powietrza.
    6. Zważ mysz i umieść ją z powrotem w klatce. Uważaj, aby uwzględnić tylko myszy, które nie tracą więcej niż 10% masy ciała. Wyklucz z eksperymentów obrazowych myszy, które tracą więcej niż 10% swojej wagi w ciągu dowolnego dnia przyzwyczajenia.
  5. Trzeci dzień przyzwyczajenia i kolejne dni
    1. Zważ i zapisz wagę myszy przed przymocowaniem jej do podniesionej pneumatycznie klatki domowej.
    2. Przymocuj mysz do podniesionej pneumatycznie klatki domowej.
    3. Przykryj klatkę domową czymś, co zapewni ciemne wnętrze, np. pudełkiem, i pozwól myszy pozostać zabezpieczoną przez 30 minut.
    4. Po 30 minutach odsłoń klatkę domową, wyjmij mysz i wyłącz przepływ powietrza.
    5. Zważ i zapisz wagę myszy po przyzwyczajeniu.
    6. Powtarzaj ten proces codziennie, wydłużając czas mocowania myszy do klatki domowej o 15 minut. Kontynuuj ten proces, aż mysz będzie mogła zostać przymocowana do klatki domowej na 1,5 godziny, ponieważ jest to przybliżony czas trwania sesji obrazowania dwufotonowego.
    7. Aby przyzwyczaić mysz do hałasu, wykonaj kilka sesji habituacyjnych pod mikroskopem, aby przyzwyczaić mysz do dźwięków luster skanujących laser. Wyklucz myszy, które nie przyzwyczajają się wystarczająco (tj. wokalizacje i defekacja wywołana stresem).

8. Obrazowanie wielofotonowe

  1. Rozpocznij obrazowanie 3 tygodnie po operacji, aby umożliwić oczyszczenie okna.
  2. Wykonaj obrazowanie na specjalnie wykonanym lub dostępnym na rynku mikroskopie wielofotonowym wyposażonym w laser Ti:Sapphire. Rejestruj obrazy za pomocą obiektywu zanurzeniowego w wodzie z dużą aperturą numeryczną (NA).
    UWAGA: Obrazowanie dwukanałowe uzyskuje się dzięki zastosowaniu zwierciadła dichroicznego 565 nm i dwóch zewnętrznych lamp fotopowielaczy. Filtr pasmowoprzepustowy 535/50 służy do wykrywania emisji GCaMP6f, a filtr pasmowoprzepustowy 610/75 służy do wykrywania tdTomato. Do uzyskania obrazów pokazanych na Rysunek 1 i Rysunek 2) użyto obiektywu z 25-krotnym zanurzeniem w wodzie (1,05 NA) i skanerów rezonansowych. Każdy obszar zainteresowania składał się ze stosu obrazów oddzielonych osiowo o 1 μm. Każdy wycinek optyczny został zebrany w rozdzielczości 512 x 512 pikseli, 0,18 μm/piksel. Obrazy uzyskano z obszaru kończyn przednich pierwszorzędowej kory ruchowej, zgodnie ze współrzędnymi stereotaktycznymi.
  3. Ustaw długość fali lasera na 920 nm (990 nm, jeśli używany jest GECI z przesunięciem ku czerwieni).
  4. Umieść mysz na klatce domu mobilnego i clamp płytę główną do ramienia mocującego głowę.
  5. Dodaj kilka kropel wody na środek okna.
  6. Korzystając z trybu szerokokątnego mikroskopu, wybierz 2-3 pozycje łatwo rozpoznawalnego układu naczyniowego. Zapisz obrazy tych naczyń krwionośnych i zapisz współrzędne X i Y, które pojawiają się na sterowniku silnika, aby przemieścić dendryty znakowane tdTomato na kolejne sesje obrazowania. Za każdym razem dostosowuj współrzędne X i Y, aby wyrównać je z zapisanymi obrazami naczyń krwionośnych.
  7. Po zobrazowaniu układu krwionośnego i zarejestrowaniu pozycji zlokalizuj regiony, w których neurony wyrażają tdTomato (Rysunek 1). Obraz struktur synaptycznych (dendrytów i aksonów) neuronów i aktywności GCaMP6f w astrocytach.
    UWAGA: Dendryty będą służyć jako punkty orientacyjne, aby niezawodnie powrócić do tych samych regionów i obrazować te same dendryty i astrocyty przez powtarzające się dni. Nie zaobserwowano wykrywalnego przesunięcia w płaszczyźnie obrazowania przy stabilnym unieruchomieniu głowy i po przyzwyczajeniu do fiksacji głowy. Przemieszczenie występujące w kierunkach X i Y jest korygowane ruchem.
  8. Po zobrazowaniu umieść mysz z powrotem w klatce.
    UWAGA: Myszy są zwykle trzymane na lunecie przez maksymalnie 2 godziny. Gdy obrazowanie utrzymuje się przez długi czas, woda pod obiektywem może wyschnąć. Podczas eksperymentów należy dodawać wodę. Alternatywnie zamiast wody można użyć żelu ultradźwiękowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jakość okna czaszkowego można ocenić na podstawie ostrości obrazu struktur neuronalnych. W przypadku dobrze wykonanego okna kolce dendrytyczne są wyraźnie widoczne (Rycina 1). Dzięki zapisaniu danych strukturalnych i pozycyjnych, to samo zwierzę może być obrazowane wielokrotnie przez dni, tygodnie lub miesiące w celu badania tych samych komórek (Rycina 1). Obrazy na Rycynie 1 uzyskano z obszaru kończyny przedniej pierwotnej kory ruc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj przedstawiliśmy protokół implantacji przewlekłych okien czaszkowych do obrazowania in vivo astrocytów korowych i neuronów u obudzonych, skrępowanych głowami myszy na podniesionej powietrzem klatce domowej. Podano konkretne przykłady zastosowania okna czaszkowego do obrazowania astrocytów, które wyrażają GECI i neuronalne struktury synaptyczne. Dzięki zastosowaniu mikroskopii wielofotonowej astrocytowa dynamika sygnalizacji wapniowej i strukturalna dynamika synaptyczna mogą być rejestrowane wielokrotnie w c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15o Pointed BladeSurgistar6500Narzędzia chirurgiczne
19 G IgłyBD305186Zaopatrzenie chirurgiczne
AAV1-CAG-FLEX-tdTomatoAddgene28306-AAV1Wektor wirusowy
AAV1-CaMKII-0-4-CreAddgene105558-AAV1Wektor wirusowy
ActeoneFisher ScientificA16P4Odczynnik
Podkładki do przygotowania alkoholuFisher ScientificCovidien 5750Zaopatrzenie chirurgiczne
BevelerNarishige
Equipment Szkło borokrzemianoweWorld Precision InstrumentsTW100F-4Zaopatrzenie chirurgiczne
Wiertła z węglików spiekanychSS White Dental14717Narzędzia chirurgiczne
Karprofen (Rimadyl), 50 mg / mlZoetis Mylan Institutional, LLC.Drug
Sprężone powietrzeFisher Scientific23-022-523Zaopatrzenie chirurgiczne
Aplikatory z bawełnianą końcówkąPuritan836-WC NO BINDER
Szkło nakrywkowe do chirurgii, nr 1 grubość, 3 mm/5 mmWarner Instruments64-0720, 64-0700Zaopatrzenie chirurgiczne
Wiertło dentystyczneSprzęt aseptyczny
Deksametazon, 4 mg/mLMylan Institutional, LLC.
Mikroskop do preparowaniaSprzęt Nikon
Duralay Liquid  (płyn do cementu dentystycznego)Odczynnik Duralay w proszku Patterson Dental602-8518
  (proszek cementu dentystycznego)Patterson Dental602-7932Odczynnik
Enrofloksacyna, 2,27%do oczu BayerDrug
Dechra17033-211-38Chirurgia Dostawa
Fiber Lite Oświetlacz o wysokiej intensywnościDolan-Jenner IndustriesKleszcze do sprzętu
(duże)World Precision Instruments14099Narzędzia chirurgiczne
Kleszcze ( Small)World Precision Instruments501764Narzędzia chirurgiczne
GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/JLaboratorium JacksonaNumer magazynowy: 024105Linia myszy
Sprzęt naukowyGerminator
GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/JLaboratorium JacksonaNr magazynowy: 012586Linia myszy
HeadplateNeurotarModel 1, Model 3Chirurgia Zaopatrzenie
Kleszcze hemostatyczneWorld Precision Instruments501705Narzędzia chirurgiczne
Uchwyt na 15o < / sup>Pointed BladeWorld Precision Instruments501247Uchwyt na narzędzia chirurgiczne
ostrzy skalpelaPrecision Instruments500236Narzędzia
Jodowe podkładki przygotowawczeAvantor15648-926Zaopatrzenie chirurgiczne
IzofluranPiramalSurgery
Dostawa System blatów izofranowych z pudełkiem indukcyjnymSprzętdo aparatury
Waporyzator izofluranuSurgiVet
Krazy GlueOffice DepotKG517Odczynnik
Loctite 401Henkel40140szybkoutwardzalny klej błyskawiczny
Loctite 454Fisher ScientificNC9194415cyjanoakrylowy żel samoprzylepny
Ściągacz do mikropipetSutter Instruments SprzętSprzęt
domikroskopów
AzotMathesonNI M200Gaz
TlenMathesonOX M250Gas
PicospritzerParkerwewnątrzkomórkowy system dozowania mikroiniekcji
Końcówki do pipetRainin17014340 Surgery Supply
Maszynka do strzyżenia włosów gryzoniSprzęt
fizjologiczna (0,9% chlorku sodu)Med Vet InternationalRX0.9NACL-30BACChirurgia
Zaopatrzenie Ostrza skalpela, rozmiar 11Integra4-111Narzędzia chirurgiczne
NożyczkiŚwiat Instrumenty precyzyjne503667Narzędzia chirurgiczne
stoeltinguInstrumenty stereotaktyczne
Paski gąbki Sugi (paski gąbki)Zaopatrzenie chirurgiiKettenbach Dental31002
SURGIFOAM (pianka żelowa)Ethicon1972zaopatrzeniowa chirurgiczna
z igłą 26 GZaopatrzenie chirurgiczne BD309625
TamoksyfenSigma AldrichT5648-1GOdczynnik
Ti: Szafirowe laserowekoherentne
pipety transferoweFisher Scientific13-711-9AMKoc wodny zaopatrzenia chirurgicznego
Fisher ScientificEquipment
Xylocaine MPF z epinefryną (1:200 000), 10 mg / mLFresenius Kabi USALek
leków maść Fisher do World chirurgiczne Harvarda Sprzęt wielofotonowychSól Sprzęt do Strzykawka

Bibliografia

  1. Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
  2. Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
  3. Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
  4. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  5. Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
  6. Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
  7. Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
  8. Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
  9. Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
  10. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
  11. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742(2014).
  12. Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
  13. Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
  14. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  15. Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
  16. Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
  17. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  18. Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
  19. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  20. Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
  21. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  22. Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
  23. Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
  24. Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024(2011).
  25. Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
  26. Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
  27. Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
  28. Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
  29. Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  30. Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869(2014).
  31. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  32. Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
  33. De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
  34. Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
  35. Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  36. Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742(2012).
  37. Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
  38. Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
  39. Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464(2018).
  40. Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
  41. Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
  42. Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Implantacja okna czaszkowegoobrazowanie budzących się myszyobrazowanie wielofotonoweunieruchomienie głowyiniekcje wirusoweastrocyty GCaMP6fstruktura neuronalnaobrazowanie wapniaanaliza behawioralna
Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.