Artykuł metodologiczny

Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych innych niż człowiek w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62638

⸱

14 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 4Singapore Eye Research Institute (SERI), 5UCL Institute of Ophthalmology, 6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 8Department of Ophthalmology, University of Bonn

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Naczelny (NHP) jest idealnym modelem do badania terapii komórkowej ludzkiej siatkówki ze względu na podobieństwa anatomiczne i genetyczne. W artykule opisano metodę podplamkowego przeszczepu komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w oku NHP oraz strategie zapobiegania powikłaniom śródoperacyjnym związanym z manipulacją plamki żółtej.

Streszczenie

Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) jest bardzo obiecujący w leczeniu dziedzicznych i nabytych chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Stany te obejmują barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP) i zaawansowane formy zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD), takie jak atrofia geograficzna (GA). Łącznie zaburzenia te stanowią znaczną część obecnie nieuleczalnej ślepoty na całym świecie. Te niezaspokojone potrzeby medyczne spowodowały wzrost zainteresowania środowiska akademickiego opracowywaniem metod zastępowania RPE. Wśród modeli zwierzęcych powszechnie wykorzystywanych do przedklinicznych testów terapeutycznych, naczelny inny niż człowiek (NHP) jest jedynym modelem zwierzęcym, który ma plamkę żółtą. Ze względu na podobieństwo anatomiczne do oka ludzkiego, oko NHP jest ważnym i odpowiednim przedklinicznym modelem zwierzęcym do opracowywania produktów leczniczych terapii zaawansowanej (ATMPs), takich jak terapia komórkowa RPE.

Ten manuskrypt opisuje metodę podplamkowego przeszczepu monowarstwy RPE, hodowanej na nośniku komórkowym z politereftalanu etylenu (PET), pod plamką żółtą, na chirurgicznie utworzoną ranę RPE u immunosupresyjnych NHP. Dołek - centralna jałowa część plamki żółtej - jest miejscem największego osłabienia mechanicznego podczas przeszczepu. Uraz dołka nastąpi, jeśli początkowe wstrzyknięcie płynu podsiatkówkowego wytworzy nadmierną siłę na siatkówkę. W związku z tym zaleca się powolne wstrzykiwanie pod tamponadę ciała szklistego w płynie perfluorowęglowym (PFCL) za pomocą dwuotworowej kaniuli do wstrzykiwań podsiatkówkowych przy niskich ustawieniach ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) w celu wytworzenia pęcherzyka siatkówki.

Zalecane jest również wstępne leczenie wstrzyknięciem plazminogenu do ciała szklistego w celu uwolnienia zrostów przydołkowych RPE-fotoreceptorów. Te połączone strategie mogą zmniejszyć prawdopodobieństwo wystąpienia rozdarcia dołka w porównaniu z konwencjonalnymi technikami. NHP jest kluczowym modelem zwierzęcym w przedklinicznej fazie rozwoju terapii komórkowej RPE. Protokół ten odnosi się do wyzwań technicznych związanych z dostarczaniem terapii komórkowej RPE w oku NHP.

Wprowadzenie

Przeszczep RPE jest bardzo obiecujący w leczeniu dziedzicznych i nabytych chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Schorzenia te obejmują barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP, dystrofia pręcikowo-czopkowa) i zaawansowane formy AMD, takie jak GA. Łącznie zaburzenia te stanowią znaczny odsetek obecnie nieuleczalnej ślepoty na całym świecie1,2. Zaawansowane stadia AMD dzielą się na neowaskularne AMD (nAMD) i GA. Chociaż istnieją skuteczne opcje leczenia nAMD, takie jak zastrzyki z czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (anty-VEGF), pacjenci z GA mają ograniczone możliwości leczenia. RP to wysoce niejednorodna grupa dziedzicznych schorzeń siatkówki charakteryzujących się postępującym zwyrodnieniem fotoreceptorów siatkówki. U niektórych pacjentów przyczynowa wada genetyczna zlokalizowana jest w RPE, a nie w fotoreceptorach; w związku z tym terapia zastępcza RPE może być alternatywną strategią, jeśli terapia genowa nie jest wykonalna.

Istnieje duże zainteresowanie opracowaniem skutecznych metod leczenia tych schorzeń. W szczególności przeszczep RPE zyskuje na popularności jako potencjalne podejście terapeutyczne3,4,5,6,7,8. Odkąd w latach 80. pojawiły się pierwsze doniesienia na temat transplantacji RPE9, dziedzina ta rozszerzyła się o różne źródła komórek RPE, strategie dostarczania oraz eksperymentalne modele chorób i transplantacji10,11,12,13,14. Spośród różnych modeli zwierzęcych tylko NHP ma "plamkę żółtą" z "dołkiem centralnym", anatomiczną specjalizacją na tylnym biegunie siatkówki dzieloną z ludźmi. Dołek centralny zawiera bardzo dużą gęstość fotoreceptorów czopków, które umożliwiają widzenie centralne w wysokiej rozdzielczości15. NHP ma również podobny genomiczny i proteomiczny skład16 w porównaniu z ludźmi. Te podobieństwa sprawiają, że jest to ważny i odpowiedni model zwierzęcy do badania chorób oczu, które wpływają na ludzką siatkówkę17,18.

Ten manuskrypt opisuje metodę podplamkowego przeszczepu ksenoprzeszczepu RPE, wspieranego przez nośnik komórek PET, u immunosupresji NHP. Technika transszklistkowa do podsiatkówkowego przeszczepu RPE u królików została opisana w poprzednim manuskrypcie19. Jednak w NHP obecność dołka centralnego wymaga szczególnej ostrożności podczas manipulacji śródoperacyjnej20. W szczególności istnieje wysokie ryzyko pęknięcia dołka, jeśli metody iniekcji płynu podsiatkówkowego generują nadmierną siłę działającą na siatkówkę20. W związku z tym niniejszy manuskrypt koncentruje się na strategiach mających na celu zmniejszenie ryzyka nieumyślnego urazu dołka w NHP.

Obejmują one przedoperacyjne wstrzykiwanie plazminogenu do ciała szklistego w celu uwolnienia zrostów przydołkowych oraz śródoperacyjną optyczną tomografię koherentną (miOCT) zintegrowaną z mikroskopem chirurgicznym do wizualizacji anatomii dołka w czasie rzeczywistym. Zaproponowano wykonaną na zamówienie dwuotworową kaniulę podsiatkówkową 25/41 G z wewnątrzgałkową tamponadą PFCL przy niskich ustawieniach IOP, aby umożliwić bardziej kontrolowany proces odwarstwiania dołka. Ponadto przed implantacją zaleca się chirurgiczne usunięcie natywnego RPE, aby umożliwić lepszą integrację między przeszczepionymi komórkami RPE a fotoreceptorami gospodarza. Na koniec opisano około- i pooperacyjny protokół immunosupresji systemowej dla modeli NHP w celu poprawy przeżycia ksenoprzeszczepu RPE po przeszczepie11,21.

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z The Association of Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Aprobatę etyczną uzyskano od Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania, SingHealth, Singapur. Zwierzęta były trzymane w Centrum Medycyny Doświadczalnej SingHealth zatwierdzonym przez Stowarzyszenie na rzecz Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC). Zatwierdzenie to podkreśla, że wszystkie doświadczenia na zwierzętach są zgodne ze standardami wytycznych Krajowego Komitetu Doradczego ds. Badań na Zwierzętach Laboratoryjnych określonych przez Urząd ds. Rolnictwa i Weterynarii w Singapurze. Następujący protokół eksperymentalny został ustalony na podstawie eksperymentów przeprowadzonych w 6 oczach 6 Macaca fascicularis (4 samce i 2 samice, w wieku od 4 do 6 lat, o wadze od 2,8 do 4,0 kg).

1. Osiągnięcie immunosupresji w modelu NHP

  1. Immunosupresję należy rozpocząć 7 dni przed zabiegiem i kontynuować immunosupresję przez cały okres obserwacji.
  2. Zważ NHP przed podaniem ogólnoustrojowej immunosupresji, aby zapewnić dokładne dawkowanie leku. Zwierzę waży się na początku badania, a następnie co tydzień.
  3. Stosować syrolimus doustny, doksycyklinę i minocyklinę w celu uzyskania ogólnoustrojowej immunosupresji.
    1. Należy podać doustnie dawkę nasycającą 2 mg, a następnie dobową dawkę podtrzymującą 1 mg. Przed podaniem należy określić wyjściowe stężenie syrolimusa we krwi i monitorować je przez cały okres obserwacji. Zapewnić stężenie co najmniej 5 μg/l w celu odpowiedniej immunosupresji.
      UWAGA: Dawka syrolimusa nie jest dostosowana do masy ciała.
    2. Podawać doustnie dawkę 7,5 mg/kg doksycykliny na dobę, dwa razy na dobę.
    3. Podawać doustnie dawkę 7,5 mg/kg minocykliny dwa razy na dobę.
  4. Podczas immunosupresji należy monitorować wszystkie NHP pod kątem niepożądanych skutków ogólnoustrojowych. Zwróć uwagę na znaczną utratę masy ciała (>10%), zmniejszony apetyt i spożycie wody, niezadbane wypadanie włosów i nienormalne zachowanie, takie jak agresja i letarg. Oceny będą przeprowadzane w 3., 14. i 1. miesiącu, a następnie oceny miesięczne.

2. Sterylizacja narzędzi

  1. Opłucz narzędzia chirurgiczne wodą destylowaną.
  2. Umieść narzędzia w łaźni ultradźwiękowej wypełnionej 500 ml wody destylowanej i 2 ml środka do dezynfekcji narzędzi. Czyścić narzędzia za pomocą funkcji zamiatania kąpieli ultradźwiękowej przez 15 minut.
  3. Wyjmij narzędzia z kąpieli ultradźwiękowej. Spłucz dwukrotnie dokładnie wodą destylowaną przez 5 minut każde płukanie. Po spłukaniu wysuszyć instrumenty na powietrzu.
  4. Umieść instrumenty w skrzynce na instrumenty. Autoklawować pudełko za pomocą uniwersalnego ustawienia programu (sterylizacja narzędzi w temperaturze 134 °C przez 50 min: 30 min w przypadku autoklawowania, 20 min w przypadku suszenia).

3. Przygotowanie triamcynolonu bez konserwantów (40 mg/mL)

  1. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml pobrać 1 ml roztworu triamcynolonu (10 mg/ml). Przenieś go do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wymieszaj z 4 ml sterylnego zbilansowanego roztworu soli (BSS).
  2. Odwirować roztwór o stężeniu 120 × g przez 5 minut. Upewnij się, że wszystkie cząstki triamcynolonu znajdują się na dnie stożkowej probówki. Wyrzucić supernatant (BSS) ze stożkowej probówki.
  3. Ponownie zawiesić cząstki triamcynolonu w 5 ml sterylnego BSS w stożkowej probówce. Odwirować roztwór o stężeniu 120 × g przez 5 minut. Ponownie odrzucić supernatant.
  4. Powtórzyć krok 3.3, aby zakończyć przemywanie cząstek triamcynolonu za pomocą BSS (3x).
  5. Ponownie zawiesić cząstki triamcynolonu w 0,25 ml sterylnego BSS, aby osiągnąć stężenie 40 mg/ml.
  6. Odessać ponownie zawieszony triamcynolon (40 mg/ml) za pomocą nowej strzykawki o pojemności 1 ml. Założyć igłę o sile 25 G z końcówką i przygotować strzykawkę z roztworem triamcynolonu do śródoperacyjnego użycia.

4. Wstępne leczenie oczu NHP plazminogenem doszklistkowym (0,25 μg/μL)

  1. Na tydzień przed zabiegiem należy wykonać iniekcję doszklistkową (20 μL) plazminogenu małpiego (0,25 μg/μL).
  2. Uspokojenie NHP przed zabiegiem poprzez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy (10-20 mg/kg m.c.) i podskórne wstrzyknięcie atropiny (0,05 mg/kg m.c.). Podawać krople do oczu z tetrakainą w znieczuleniu miejscowym.
  3. Przed wstrzyknięciem do ciała szklistego należy zdezynfekować obszar okołooczodołowy 10% jodowidonem. Zdezynfekuj oko, podając 5% jodu powidonu do ujściówek NHP. Upewnij się, że roztwór pozostaje w forneszach przez co najmniej 1 minutę, a następnie dokładnie spłucz sterylnym BSS.
  4. Za pomocą strzykawki o pojemności 250 μl odessać wstępnie rozcieńczony plazminogen małpy (0,25 μg/μl) z fiolki. Przymocować igłę 30 G do strzykawki i utrzymywać plazminogen małpy w gotowości do podania doszklistkowego.
  5. Użyć suwmiarki, aby zidentyfikować miejsce wstrzyknięcia w oku. Wstrzyknięcie do ciała szklistego należy wykonać w odległości 3 mm od rąbka.
  6. Wstrzyknięcie należy wykonać z igłą skierowaną w stronę środka kuli ziemskiej. Po wyjęciu igły z gałki należy użyć bawełnianego aplikatora w sztyfcie, aby tamponadować miejsce wstrzyknięcia i zapobiec cofaniu się treści wewnątrzgałkowej.
  7. Podaj żel lub maść nawilżającą, aby zmniejszyć natychmiastowe pooperacyjne podrażnienie powierzchni oka.

5. Stół chirurgiczny i konfiguracja sprzętu

  1. Ustal sterylne pole. Przebywając w sterylnym polu, przez cały czas noś fartuchy chirurgiczne, maskę i osłonę włosów.
  2. Przygotować triamcynolon bez konserwantów (40 mg/ml) do śródoperacyjnej wizualizacji ciała szklistego (patrz punkt 3). Przygotować sterylny BSS w strzykawce o pojemności 10 ml i smar w strzykawce o pojemności 5 ml. Umieść je na zasłonie.
  3. Trzymaj inne instrumenty w gotowości na zasłonie, w tym jedwab 3-0, szwy vicryl 7-0, bawełniane patyczki do aplikatorów, paski do zamykania ran i drut z włókna do endoiluminacji żyrandola.
  4. Podłącz zestaw do witrektomii, w tym szybki witrektor, kasetę Venturiego i endoiluminator żyrandolowy 25 G, do urządzenia do witrektomii za pomocą sterylnej techniki.
  5. Otwórz butelkę BSS klasy okulistycznej o pojemności 500 ml i podłącz ją do kasety Venturiego zgodnie z instrukcjami producenta. Kontynuuj zalewanie systemu.
  6. Włączyć miOCT/mikroskop chirurgiczny. Wybierz wstępnie ustawione konfiguracje mikroskopu chirurgicznego do chirurgii tylnego odcinka i oświetlenia. Wprowadź szczegóły zabiegu, w tym dowód osobisty, płeć, lateralizację oka zwierzęcia i nazwę zabiegu.
  7. Zamontuj bezkontaktową, szerokokątną soczewkę dna oka 128 stopni.
  8. Przymocuj sterylne jednorazowe osłony rękojeści do mikroskopu chirurgicznego/miOCT. Dostosuj pozycję mikroskopu i ustaw ostrość za pomocą pedału nożnego. Kontynuuj operację.

6. Przygotowanie znieczulenia i ułożenie zwierzęcia (najlepiej wykonywane przez zespół weterynarzy)

  1. Upewnij się, że NHP jest na czczo przez co najmniej 8 godzin przed indukcją znieczulenia, aby zapobiec niedomykalności i wymiotom. Uspokoić NHP przed indukcją znieczulenia (patrz krok 4.2, aby uzyskać instrukcje dotyczące sedacji).
  2. Stosować krople do oczu 1% tropikamidu i 2,5% fenylefryny co najmniej 3 razy w odstępach 5 minut, aby uzyskać rozszerzenie źrenicy.
  3. Należy podać domięśniowe wstrzyknięcie buprenorfiny (0,005-0,03 mg/kg masy ciała) 30 minut przed zabiegiem w celu uzyskania analgezji.
  4. Zaintubuj NHP rurką dotchawiczą, zwykle o wielkości 3-5 mm. Podczas próby intubacji upewnij się, że dostępnych jest kilka rozmiarów. Użyj największego rozmiaru, który można przejść przez krtań bez powodowania urazu. Zmierz końcowy oddechowy CO2, aby zapewnić odpowiednie umieszczenie rurki dotchawiczej.
  5. Dostarczyć 2% gazowego izofluoranu przez rurkę dotchawiczą w celu wywołania znieczulenia ogólnego. Potwierdź stan znieczulenia ogólnego (brak reakcji na dotyk), oceniając reakcję NHP na otaczające bodźce, w tym dźwięki i dotyk. Użyj 0,5-2% gazowego izofluoranu, aby utrzymać stan znieczulenia ogólnego.
  6. Stale monitoruj elektrokardiogram NHP, częstość oddechów, ciśnienie krwi i saturację tlenem podczas całej operacji.
  7. Umieść NHP na stole operacyjnym tak, aby oko było prostopadłe do mikroskopu operacyjnego. Podaj żel lub maść nawilżającą do oka, które nie jest operowane, aby zmniejszyć podrażnienie powierzchni oka podczas znieczulenia.
  8. Obetnij rzęsy nożyczkami, aby zmniejszyć ryzyko infekcji.
  9. Zdezynfekuj obszar okołooczodołowy 10% jodowidonem. Zdezynfekuj oko, podając 5% jodu powidonu do ujściówek NHP. Upewnij się, że roztwór pozostaje w forneszach przez co najmniej 1 minutę, a następnie dokładnie spłucz sterylnym BSS.
  10. Umieść sterylną serwetę tak, aby wstępnie wycięty otwór był wyśrodkowany nad okiem, aby poddać się operacji. Zakryj oko samoprzylepną serwetą do nacięcia chirurgicznego.
  11. Wykonaj kantotomię boczną na oku, aby poddać się operacji.
  12. Włóż wziernik Liebermana, aby zapewnić odpowiednie otwarcie powiek w celu wizualizacji oka.

7. Witrektomia

UWAGA: Aby uzyskać dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej w celu dostarczenia przeszczepu RPE z rusztowania PET, protokół ten zaleca wykonanie 4-portowej (z zastawką) witrektomii 25 G przy użyciu standardowego zestawu chirurgicznego witreoretinalnego i bezdotykowej, szerokokątnej soczewki dna oka 128°. Protokół zaleca również użycie mikroskopu chirurgicznego wyposażonego w miOCT w celu przeprowadzenia kilku krytycznych kroków chirurgicznych, w tym indukcji odwarstwienia dołka, implantacji przeszczepu RPE i drenażu płynu podsiatkówkowego.

  1. Wykonaj peritomię spojówek 360°, nacinając spojówkę w pobliżu rąbka za pomocą nożyczek vannas. Powiększ peritomię, wykonując rozwarstwienie.
  2. Za pomocą ostrza mikrowitreoretinalnego o wadze 25 G wykonaj sklerotomię na godzinie 8 dla prawego oka lub 4 dla lewego oka. Wykonaj sklerotomię 3 mm od rąbka oka.
  3. Włóż i zszyj niestandardową kaniulę infuzyjną 25 G z bocznym portem za pomocą szwu 7-0 vicryl. Po potwierdzeniu lokalizacji doszklistkowej należy rozpocząć infuzję BSS i ustawić system tak, aby utrzymywał ciśnienie wewnątrzgałkowe na poziomie 20 mmHg.
  4. Używając trocharu płaskiej głowy o stężeniu 25 G, wykonaj sklerotomię na godzinie 2 dla prawego oka lub na godzinie 10 dla lewego oka, jak w kroku 7.2.
  5. Włóż lampę żyrandolową 25 G do płaskiego trochara i zabezpiecz ją taśmą klejącą. Ustaw źródło światła na około 60%.
  6. Wykonaj kolejną sklerotomię, podobną do kroku 7.2, na godzinie 10 dla prawego oka lub 2 dla lewego oka. Umieść szwy vicryl 7-0 w kształcie litery U wokół sklerotomii bez wiązania węzłów. Włóż końcówkę noża do witrektomii przez tę sklerotomię.
  7. Rozpocznij witrektomię wokół portów wejściowych, a następnie krótką witrektomię rdzeniową z następującymi ustawieniami: maksymalnie 5000 cięć na minutę, maksymalna aspiracja przy 400 mmHg.
  8. Wstrzyknąć 20-50 μl triamcynolonu (40 mg/ml) dla lepszej wizualizacji ciała szklistego.
  9. Wywołać tylne odwarstwienie ciała szklistego (PVD) poprzez oddzielenie ciała szklistego od siatkówki.
    1. Umieść wirektor nad tarczą nerwu wzrokowego, aby umożliwić delikatną indukcję PVD. Utrzymuj wirektor tylko podczas aspiracji na maksymalnym ustawieniu 400 mmHg bez konieczności cięcia.
    2. W razie potrzeby użyj kleszczy wewnątrzgałkowych o sile 25 G, aby manipulować ciałem szklistym na brzegu dysku, aby stworzyć rozdarcie w korze ciała szklistego i ułatwić odwarstwienie.
      UWAGA: PVD uważa się za udane, jeśli kryształy triamcynolonu ślizgają się bez przeszkód po powierzchni siatkówki.
  10. Otwórz tylną błonę szklistą za pomocą noża i usuń oderwaną osłonę ciała szklistego aż do podstawy ciała szklistego (na równiku siatkówki). Odessać pozostały triamcynolon na powierzchni siatkówki.

8. oderwanie dołka kierowanego przez miOCT

  1. Wstrzyknąć 1-2 ml PFCL, aby pokryć tylny biegun aż do przedniej, środkowej siatkówki obwodowej.
  2. Wprowadzić do oka za pomocą kaniuli do wstrzykiwań podsiatkówkowych. Ustaw ciśnienie wewnątrzgałkowe na 0-4 mmHg w maszynie do witrektomii (upewnij się, że system jest idealnie wodoszczelny; w razie potrzeby zawiąż szwy wokół portów).
  3. Używając niestandardowej dwuotworowej podsiatkówkowej kaniuli iniekcyjnej 25/41 G lub podsiatkówkowej kaniuli iniekcyjnej 25/38 G podłączonej do strzykawki o pojemności 250 μl, delikatnie wykonaj podsiatkówkowe wstrzyknięcie BSS, aby wywołać miejscowe odwarstwienie siatkówki. Gdy pęcherzyk przejdzie przez dołek centralny, należy przerwać wstrzyknięcie. Utwórz drugi bleb z innego kierunku. Połącz oba pęcherzyki, aby całkowicie odłączyć dołek środkowy.
  4. Włącz funkcję miOCT, aby wyświetlić tworzenie się pęcherzyków. Upewnij się, że skany linii i sześcianu są w trybie HD z ustawieniami (512 x 128 pikseli, szerokość skanowania 4 mm), aby uzyskać obraz w dołku środkowym. Obserwuj obraz miOCT pod kątem całkowitego oderwania siatkówki nerwowej od warstwy RPE na dołku środkowym.
  5. Powiększ retinotomię do 1,5 mm za pomocą pionowych nożyczek witreoretinalnych o wadze 25 G, aby umożliwić dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej w celu przeszczepu.

9. Usunięcie natywnego RPE

  1. Ustaw ciśnienie wewnątrzgałkowe na 50 mmHg na maszynie do witrektomii.
  2. Usuń PFCL poprzez aktywną ekstruzję za pomocą szczotkowanej silikonowej kaniuli.
  3. Przedłuż sklerotomię za pomocą noża do nacinania 1,4 mm, aby umożliwić wejście narzędzia o wadze 20 G.
  4. Korzystając z niestandardowego instrumentu do rozszerzalnej pętli 20 G, zeskrob RPE hosta podplamkowego w celu usunięcia. Zeskrob obszar o wymiarach co najmniej 2 x 3 mm.

10. Załadunek strzelca do dostarczania jednowarstwowego przeszczepu komórek RPE

  1. Ogólne instrukcje dotyczące ładowania przeszczepu w kształcie kuli wyciętego z kultur RPE na nośniki komórek PET można znaleźć w poprzedniej publikacji22.

11. Implantacja przeszczepu pod kontrolą miOCT i regulacja pozycji

  1. Włóż końcówkę urządzenia strzeleckiego przez sklerotomię przy ciśnieniu IOP 20 mmHg. Wstrzyknąć implant w kierunku przestrzeni podsiatkówkowej przez krawędź retinotomii utworzoną z powierzchni siatkówki.
  2. Wstrzyknąć implant stroną nośnika komórek skierowaną w stronę błony Brucha, a stroną ksenoprzeszczepu RPE skierowaną w stronę fotoreceptorów.
  3. Włącz funkcję miOCT, aby uwidocznić lokalizację implantu. Upewnij się, że implant spoczywa płasko na błonie Brucha w przestrzeni podsiatkówkowej, z nienaruszoną siatkówką. Upewnij się, że znajduje się w rozsądnej odległości od utworzonej retinotomii i nie uderza w miejsce retinotomii.
  4. Dostosuj położenie implantu za pomocą kaniuli do wstrzykiwań podsiatkówkowych lub zakrzywionych nożyczek wewnątrzgałkowych o sile 25 G, aby upewnić się, że jest on dobrze umieszczony pod plamką żółtą.

12. drenaż płynu podsiatkówkowego sterowany przez miOCT

  1. Za pomocą szczotkowanej silikonowej kaniuli z końcówką wykonaj wymianę płyn-powietrze i ostrożny drenaż płynu podsiatkówkowego. Spróbuj delikatnie zaaspirować płyn podsiatkówkowy z odwarstwienia siatkówki pęcherzyka i przyłączenia krawędzi retinotomii.
  2. Włącz funkcję miOCT, aby w czasie rzeczywistym wizualizować odpowiedni drenaż płynu podsiatkówkowego, dopóki siatkówka nie zostanie ponownie przymocowana do implantu.

13. Zakończenie operacji

  1. Zamknij roboczą sklerotomię portu za pomocą zastąpionego szwu vicryl 7-0. Wyjmij żyrandol 25 G i kaniulę infuzyjną 25 G. Zamknij te sklerotomie za pomocą szwów vicryl 7-0.
  2. Podawać 2 mg w 0,05 ml triamcynolonu (40 mg/ml) w miejscu sklerotomii na godzinie 8 przed szyciem.
  3. Zbadaj palpacyjnie oko, aby upewnić się, że ciśnienie wewnątrzgałkowe mieści się w dopuszczalnym zakresie. W razie potrzeby wstrzyknąć przefiltrowane powietrze (lub BSS) za pomocą igły 30 G.
  4. Zszyj spojówkę szwami 7-0 vicryl i kantotomię 5-0 prolenem (usuń po 10-14 dniach).

14. Pooperacyjna opieka nad zwierzętami

  1. Ułóż NHP twarzą do dołu przez 1 godzinę po operacji. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyskasz przytomności. Upewnij się, że weterynarz i technik opieki nad zwierzętami są dostępni do obserwacji i wsparcia podczas procesu pooperacyjnego.
  2. Stosuj miejscowo antybiotyk (tobramycyna), maść steroidową (deksametazon) i krople do oczu z homatropiną dwa razy dziennie przez 5 dni po operacji.
  3. Podać kolejne podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,005-0,03 mg/kg m.c.) 6 godzin po zabiegu w celu odpowiedniej kontroli bólu.
  4. NHP należy zwrócić w towarzystwie innych zwierząt dopiero wtedy, gdy w pełni odzyska przytomność.
  5. Przeprowadzaj kontrolne badania obrazowania multimodalnego w 3., 14. i 1. miesiącu po zabiegu, a następnie comiesięczne wizyty kontrolne. Wykonuj ERG co miesiąc po zabiegu. Usunąć szwy prolenowe 5-0 do kantotomii w dniu 14 równocześnie z okresem sedacji stosowanym do obrazowania multimodalnego. Pozostałe szwy to wchłanialne szwy vicryl 7-0, które nie wymagają usuwania.

15. Metody monitorowania pooperacyjnego w obrazowaniu multimodalnym

  1. Pościć NHP przez noc. Uspokoić NHP tuż przed obrazowaniem (patrz krok 4.2 dla leku i stężenia dla sedacji). Jeśli sedacja jest niewystarczająca do zatrzymania ruchu gałek ocznych, rozważ zastosowanie znieczulenia ogólnego.
  2. Zastosuj 1% tropikamidu i 2,5% krople do oczu fenylefryny, aby uzyskać rozszerzenie źrenicy przed obrazowaniem (patrz krok 6.2).
  3. Wykonaj autofluorescencję (AF), angiografię fluoresceinową dna oka (FFA) i optyczną tomografię koherentną (OCT) przy użyciu urządzenia OCT o wysokiej rozdzielczości z soczewką o polu 55° i soczewką o polu 30°.
    1. Podawać dożylnie 10% fluoresceinę (0,1 ml/kg masy ciała) na FFA. Aby uzyskać obraz wczesnej fazy, należy wykonać obraz w ciągu 30 sekund od wstrzyknięcia. W przypadku obrazu późnej fazy należy wykonać obraz 5-10 minut po wstrzyknięciu.
  4. Wykonaj fotografię dna oka za pomocą aparatu do badania dna oka między wczesną i późną fazą FFA.

16. Metody monitorowania pooperacyjnego w badaniach elektroretinogramu pełnego pola (ERG)

  1. Pościć NHP przez noc. Uspokaj NHP przed badaniami ERG (patrz krok 4.2 dla leku i stężenia dla sedacji). W trakcie nagrań ERG w razie potrzeby ponownie podaj sedację.
  2. Oddzielne obrazowanie multimodalne i zapisy ERG w odstępie co najmniej 2-3 dni.
  3. Po podaniu środków uspokajających upewnij się, że NHP jest przystosowany do ciemności przez 30 minut przed zapisem ERG.
  4. Umieść podskórne elektrody igłowe ze stali nierdzewnej na lewej i prawej bocznej kancie (elektrody odniesienia) oraz z tyłu korpusu NHP (elektroda uziemiająca). Umieść elektrody soczewek kontaktowych ERG na rogówce NHP za pomocą żelu vidycycznego, aby wspomóc kontakt i przyczepność.
  5. Wszystkie badania ERG należy oprzeć na protokołach stosowanych u ludzi zalecanych przez Międzynarodowe Towarzystwo Klinicznej Elektrofizjologii Wzroku (ISCEV)14. Rozpocznij nagrywanie ERG w warunkach skotopowych i zacznij od przyciemnianych błysków. Należy postępować zgodnie z zaleceniami ISCEV dotyczącymi zalecanych interwałów między bodźcami.
  6. Upewnij się, że NHP jest przystosowany do światła przez 10 minut przed badaniem fotopowym, ponownie stosując standardowe zalecenia ISCEV dotyczące siły tła.

17. Eutanazja NHP

  1. Aby poddać NHP eutanazji w celu enukleacji, należy podać dożylnie pentobarbital sodu (75 mg/kg), zgodnie z zaleceniami Panelu ds. Eutanazji Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych.

Wyniki

Multimodalne metody obrazowania (fotografia dna oka, obrazowanie autofluorescencji dna oka (FAF), angiografia fluoresceinowa dna oka (FFA) w fazie wczesnej i późnej oraz optyczna koherentna tomografia (OCT)) podkreślają cechy udanego przeszczepu graftu RPE podplamkowy (Rycina 1). Fotografia dna oka pokazuje rozmieszczenie przeszczepu graftu RPE w dołku środkowym bez migracji w czasie. Obrazowanie FAF wykazuje minimalne zmiany w hiperautofluorescencji (przedstawione przez białe obszary o wysokiej intensywności) nakładające się na graft RPE. FFA w fazie wczesnej i późnej nie wykazuje żadnych oczywistych przecieków (przedstawionych przez białe obszary o wysokiej intensywności, które powiększają się z czasem) wokół graftu RPE. Początkowe obrazy z 3. dnia wykazują defekt okna wynikający z usunięcia natywnego RPE przed implantacją graftu. Obrazy OCT plamki wykazują zachowanie zewnętrznych warstw siatkówki (w szczególności warstwy fotoreceptorów) nad graftem RPE wraz z upływem czasu. Barwienie hematoksyliną i eosiną wykazuje nienaruszone warstwy siatkówki bez oznak mikrorzerwań. Zachowanie zewnętrznej warstwy jądrowej nad obrzeżami graftu sugeruje, że komórki RPE pełnią swoje funkcje fizjologiczne polegające na utrzymaniu zdrowia fotoreceptorów.

Widoki wewnątrzgałkowe i zewnętrzne kaniuli dwulumenowej 25/41 G ukazują mechanizm kontroli IOP podczas wstrzykiwania podsiatkówkowego (Rysunek 2). Podczas wstrzykiwania płynu podsiatkówkowego BSS dostaje się do przestrzeni podsiatkówkowej poprzez centralną, dłuższą kaniulę. Znaczne wzrosty ciśnienia wewnątrzgałkowego powodują, że BSS znajdujący się w jamie ciała szklistego opuszcza oko przez szerszy metalowy lumen kaniuli. BSS przemieszcza się następnie wzdłuż kaniuli i zostaje ostatecznie wypchnięty przez port odpływowy znajdujący się w pobliżu nasady kaniuli. Aby ocenić, czy kaniula działa prawidłowo, należy upewnić się, że płyn wypływa z portu odpływowego w pobliżu nasady kaniuli.

miOCT umożliwia śródoperacyjną wizualizację wymiarów pęcherzyka oraz potencjalnego rozdarcia dołka podczas odwarstwienia dołka (Rysunek 3). Rysunek 3A1-A3 przedstawiają przypadek pęcherzyka z rozdarciem dołka. Na Rysunku 3A1, podczas gdy dolny pęcherzyk jest widoczny pod mikroskopem chirurgicznym, wizualizacja rozdarcia jest utrudniona. Rysunek 3A2 przedstawia przekrój podłużny pęcherzyka bez żadnych rozdarć. Rysunek 3A3 pokazuje rozdarcia dołka podczas oceny przekroju pionowego pęcherzyka. Rysunek 3B1-B3 przedstawiają pomyślnie stworzony pęcherzyk bez obecności żadnych rozdarć.

Brak znaczącego pogorszenia kształtu fal ERG sugeruje, że globalna funkcja fotoreceptorów pręcikowych i czopkowych jest zachowana w przypadku ksenoprzeszczepów RPE podsiatkówkowych (Rysunek 4). Kształty fal ERG odzwierciedlają ogólną funkcję siatkówki. W szczególności należy zwrócić uwagę na fale A, aby określić ewentualną utratę funkcji fotoreceptorów.

Badanie obrazowania siatkówki: zdjęcia dna oka, angiografia fluorescencyjna, wyniki OCT w ciągu 3 miesięcy, przekrój histologiczny.
Rycina 1: Pooperacyjna analiza in vivo z obrazowaniem multimodalnym. (A) Obrazowanie in vivo podsiatkówkowego przeszczepu RPE w lewym oku (kolor żółty na zdjęciu dna oka) przy użyciu różnych metod obrazowania (kolumny od lewej do prawej: zdjęcie dna oka, autofluorescencja, angiografia fluorescencyjna dna oka – faza wczesna, angiografia fluorescencyjna dna oka – faza późna, tomografia optyczna koherentna) w punktach czasowych do 3 miesięcy (rzędy od góry do dołu: dni 3, 14; miesiące 1, 3). Gwiazdka na zdjęciu dna oka wskazuje miejsce retinotomii; biała przerywana strzałka wskazuje kierunek skanu liniowego. Żółty narysowany kształt na obrazach autofluorescencji dna oka zaznacza lokalizację przeszczepu. Białe trójkąty na obrazach OCT wskazują odpowiednie krawędzie boczne przeszczepu (zgodnie ze skanem liniowym na kolorowym zdjęciu dna oka). (B) Barwienie hematoksyliną i eozyną przeszczepu pod zanikową plamką żółtą (z powodu śródoperacyjnego pęknięcia) z opisanymi warstwami. Paski skali = 1 mm w A (obrazy autofluorescencji i FA), 200 µm w A (obrazy OCT) oraz 100 µm w B. Skróty: FA = angiografia dna oka; OCT = tomografia optyczna koherentna; RGC = warstwa komórek zwojowych siatkówki; INL = wewnętrzna warstwa jądrowa; ONL = zewnętrzna warstwa jądrowa; RPE = nabłonek barwnikowy siatkówki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Widoki wewnątrzgałkowe i zewnętrznej, procedura operacji oka, badanie siatkówki, obrazowanie medyczne.
Rysunek 2: Widoki wewnątrzgałkowe i zewnętrzne kaniuli dwulumenowej 25/41 G. (A) Widok wewnątrzgałkowy kaniuli dwulumenowej 25/41 G podczas tworzenia pęcherzyka podsiatkówkowego. Biała strzałka wskazuje dłuższą kaniulę centralną do wstrzykiwania podsiatkówkowego. Przerywana strzałka wskazuje otwór kaniuli odpływowej, przez którą BSS wypływa z oka. (B) Widok zewnętrzny kaniuli dwulumenowej 25/41 G. Gwiazdka oznacza port odpływowy w pobliżu główca kaniuli, przez który odprowadzany jest wewnątrzgałkowy BSS. Skrót: BSS = zrównoważony roztwór soli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Optyczna koherentna tomografia obrazująca przekroje poprzeczne siatkówki; skan oka, analiza obrazowania medycznego.
Rysunek 3: Obrazy z mikroskopu śródoperacyjnego i obrazy miOCT pęcherzyka podsiatkówkowego powikłanego pęknięciem dołka środkowego. (A1) Obraz z mikroskopu śródoperacyjnego przedstawiający położenie skanów podłużnych (niebieski) i poprzecznych (czerwony) w pęcherzyku z pęknięciem dołka środkowego. (A2) Podłużny skan miOCT przedstawiający pęcherzyk podsiatkówkowy w obszarze dołka środkowego (żółta strzałka). (A3) Poprzeczny skan miOCT ukazujący pęknięcie dołka środkowego (biała grot strzałki) wraz z retinotomią (gwiazdka) i pęcherzykiem podsiatkówkowym (żółta strzałka). (B1) Obraz mikroskopowy śródoperacyjny przedstawiający położenie skanów podłużnych (niebieski) i poprzecznych (czerwony) w prawidłowo uformowanym pęcherzyku. (B2) Podłużny skan miOCT przedstawiający pęcherzyk podsiatkówkowy w obszarze dołka środkowego (żółta strzałka). (B3) Poprzeczny skan miOCT przedstawiający prawidłowo utworzony pęcherzyk podsiatkówkowy z nienaruszonym dołkiem środkowym powyżej (biały romb). Skrót: miOCT = mikro-zintegrowana optyczna koherentna tomografia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres odpowiedzi ksenoprzeszczepu RPE, amplituda w funkcji czasu, przedstawiający aktywność siatkówki w różnych warunkach.
Rysunek 4: ERG oka po ksenotransplantacji RPE. W ramach oceny funkcjonalnej siatkówki, pełnopolowe pomiary ERG oka z ksenoprzeszczepem RPE wykonane w punkcie wyjściowym (górny rząd) oraz 3 miesiące po transplantacji (dolny rząd) nie wykazują istotnego wpływu ksenotransplantacji RPE na amplitudy odpowiedzi, czas ich wystąpienia ani kształt fali, zarówno w warunkach ciemnoadaptowanych, jak i jasnoadaptowanych. Skróty: RPE = nabłonek pigmentowy siatkówki; ERG = elektroretinogram; DA = ciemnoadaptowany; LA = jasnoadaptowany. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Istnieją dwa główne podejścia oceniane pod kątem podplamkowego przeszczepu RPE - wstrzyknięcie zawiesiny RPE i przeszczepienie jednowarstwowego przeszczepu RPE. Szczegółowe porównanie tych dwóch metod wykracza poza zakres tego manuskryptu. Jednak przeszczepienie jednowarstwowego przeszczepu RPE może być korzystne, ponieważ komórki RPE są bardziej zorganizowane w monowarstwie niż w zawiesinie. Komórki RPE w przeszczepie są zorganizowane w zlewającą się monowarstwę, która przypomina organizację fizjologicznej warstwy komórek RPE i umożliwia przeszczepionym komórkom RPE wykonywanie ich funkcji fizjologicznych. Umożliwia to bardziej precyzyjne parametry dozowania w porównaniu z zawiesinami komórek, co ma duże znaczenie dla prac regulacyjnych i zwiększania skali przemysłowej.

Dostarczenie przeszczepu plastra RPE do przestrzeni podsiatkówkowej wymaga starannej manipulacji plamką żółtą i dokładnego wprowadzenia przeszczepu do przestrzeni podsiatkówkowej. Postęp technologiczny w mikrochirurgii, taki jak miOCT, oraz lepsze zrozumienie śródoperacyjnej dynamiki tkanki siatkówki skróciły krzywą uczenia się tej procedury. W tej dyskusji wyjaśnione zostaną przesłanki następujących aspektów: i) przedoperacyjne wstrzyknięcie plazminogenu; ii) stosowanie śródoperacyjnego miOCT; iii) zastosowanie niestandardowej kaniuli dwuotworowej 41 G, niskich ustawień IOP i PFCL do tworzenia pęcherzyków podsiatkówkowych; iv) zeskrobanie natywnej warstwy komórek RPE przed przeszczepieniem; v) stosowanie syrolimusa, triamcynolonu, doksycykliny i minocykliny w celu zmniejszenia immunogennego odrzucenia przeszczepu.

Przedoperacyjne zastrzyki plazminogenu uwalniają zrosty przydołkowe siatkówki
W początkowych eksperymentach wyzwaniem było oderwanie dołka centralnego za pomocą pojedynczej fali płynu. Po ocenie za pomocą miOCT obrazy ujawniły obecność zewnętrznych zrostów siatkówki przydołkowej do natywnego RPE wraz z dowodami na uraz śródsiatkówkowy20. Te zrosty mogły prowadzić do pionowego rozszerzania się pęcherzyka, a nie do falowania płynu podsiatkówkowego rozchodzącego się po konturze siatkówki, powodując uraz dołka. Plazminogen jest nieaktywnym prekursorem plazminy, proteazy skierowanej przeciwko fibronektynie i lamininie. Okriplazmina jest bioinżynieryjnym wariantem ludzkiego plazminy, zatwierdzonym przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) oraz Europejską Agencję Leków (EMA) do leczenia objawowej trakcji szklistkowo-plamkowej ze współistniejącym otworem w plamce żółtej lub bez niej. Jednak doniesienia porejestracyjne dotyczące rozwoju torbielowatego obrzęku plamki żółtej po wstrzyknięciu okryplazminy sugerują bardziej rozległy wpływ enzymu na siatkówkę23.

Chociaż dokładne mechanizmy nie zostały zidentyfikowane, zasugerowano, że plazmina może osłabiać adhezję siatkówki poprzez degradację elementów macierzy międzyfotoreceptorowej odpowiedzialnych za adhezję fotoreceptora-RPE24. W tym protokole oczy NHP były leczone plazminogenem doszklistkowym na 1 tydzień przed zabiegiem w celu uwolnienia zewnętrznych zrostów siatkówki przydołkowej. Przy założeniu, że adhezja fotoreceptor-RPE jest osłabiona, do odłączenia siatkówki neurosensorycznej, w tym dystalnego pierścienia przydołkowego, wymagana jest mniejsza siła, która zwykle opiera się fali płynu podsiatkówkowego20. W ten sposób siła wywierana podczas odwarstwiania pęcherzyka siatkówki powoduje rozszerzenie pęcherzyka w poprzek konturu siatkówki, a nie styczne rozciąganie siatkówki. Zmniejsza to ryzyko rozdarcia dołka środkowego. Należy jednak zauważyć, że wpływ plazminogenu na długoterminowe przeżycie przeszczepu nie był badany w tym protokole. Przyszłe badania powinny próbować określić ten efekt.

miOCT zapewnia anatomiczne informacje zwrotne, które kierują tworzeniem pęcherzyków podsiatkówkowych, implantacją przeszczepu i drenażem płynu podsiatkówkowego
Śródoperacyjna, atraumatyczna manipulacja plamki żółtej jest kluczem do osiągnięcia dobrych wyników przeszczepu. Jednak zmiany mikrostrukturalne plamki żółtej związane z manipulacją nie zawsze muszą być widoczne pod mikroskopem operacyjnym. W takich procedurach miOCT jest ważnym narzędziem, które zapewnia w czasie rzeczywistym, trójwymiarowe, śródoperacyjne sprzężenie zwrotne struktury plamki żółtej. miOCT jest szczególnie przydatny podczas etapów odwarstwienia dołka, implantacji przeszczepu i drenażu płynu podsiatkówkowego za pomocą wymiany płyn-powietrze. Podczas odklejenia dołka miOCT może określić pionowe i poziome wymiary pęcherzyka. Mikropęknięcia dołka, które mogą nie być wyraźnie widoczne pod mikroskopem operacyjnym, można potwierdzić za pomocą miOCT (ryc. 3). Podczas implantacji przeszczepu obrazy miOCT pokazują lokalizację przeszczepu lub bliskość dołka środkowego przez często mniej przezroczystą, odklejoną siatkówkę. miOCT może również uwidocznić możliwe obszary zrostu siatkówki podczas trudnego procesu przeszczepu25. Wreszcie, w procesie drenażu płynu podsiatkówkowego, miOCT może niezawodnie kierować drenażem płynu podsiatkówkowego, aż do osiągnięcia pełnego kontaktu przeszczepu siatkówki z RPE.

Połączenie kaniuli dwuotworowej, niskich ustawień IOP i tamponady ciała szklistego PFCL synergistycznie zmniejsza uraz plamki żółtej podczas tworzenia pęcherzyków podsiatkówkowych
Styczne rozciąganie siatkówki i turbulencje płynu mogą wystąpić podczas iniekcji BSS podsiatkówkowej w celu odwarstwienia dołka, co prowadzi do niepożądanych rozdarć dołka. Aby przeciwdziałać tym zjawiskom, wykazano, że istotne są takie czynniki, jak względne położenie i odległość od centrum dołka, w którym rozpoczyna się wstrzyknięcie, objętość i prędkość wstrzyknięcia, tamponada ciała szklistego, wybór instrumentacji podsiatkówkowej i IOP 20,26,27. Pęcherzyk podsiatkówkowy do odwarstwienia dołka powinien być umieszczony w miejscu odpowiednio oddalonym od dołka, ponieważ rozciąganie siatkówki może być największe w miejscu inicjacji pęcherzyka27. Ciśnienie wewnątrzgałkowe powinno być również utrzymywane na niskim poziomie przez cały okres tworzenia pęcherzyka podsiatkówkowego. Gdy ciśnienie wewnątrzgałkowe oka jest wysokie, obserwuje się większy pionowy wzrost rozmiaru pęcherzyka, a nie rozszerzanie się wzdłuż konturu siatkówki, podczas gdy pęcherzyki są płytsze przy niższych ciśnieniach20. Co więcej, chociaż wstrzyknięcie doszklistkowe 50 μl skutecznie podwoi ciśnienie wewnątrzgałkowe u ludzi28, biorąc pod uwagę krótszą długość oczu u NHP, wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego podczas wstrzyknięcia podsiatkówkowego będzie prawdopodobnie wyższy i szybszy niż u ludzi. Podczas gdy większość urządzeń do witrektomii dostosowuje się do wahań ciśnienia wewnątrzgałkowego, regulacja nie jest procesem jednoczesnym, ale raczej reaktywnym, który zachodzi w miarę postępu wstrzykiwania podsiatkówkowego. W związku z tym im wyższe ciśnienie wewnątrzgałkowe, tym większe ryzyko nadmiernego rozciągnięcia siatkówki i wynikającego z tego urazu dołka środkowego. Dlatego ważne jest, aby utrzymać stabilny niski poziom ciśnienia wewnątrzgałkowego podczas iniekcji podsiatkówkowej.

Do wstrzykiwań podsiatkówkowych zaleca się komercyjną kaniulę podsiatkówkową 20/41 G (DORC) lub wykonaną na zamówienie kaniulę podsiatkówkową 25/41 G z podwójnym otworem. Kaniula umożliwia wydostanie się płynu z jamy ciała szklistego w zamian za BSS wstrzyknięty do przestrzeni podsiatkówkowej. Zapewnia to "jednoczesną" regulację ciśnienia wewnątrzgałkowego podczas iniekcji podsiatkówkowej. Schemat kaniuli dwuotworowej pokazano na rysunku 2. Wreszcie, PFCL jest stosowany w celu zmniejszenia ryzyka rozdarcia dołka 20,26,27. Ponieważ PFCL, takie jak oktalina, mają wyższy ciężar właściwy, wywierają siłę skierowaną w dół na siatkówkę podczas odwarstwienia dołka29. To dodatkowo stabilizuje proces tworzenia pęcherzyka odwarstwienia dołka i zwiększa rozszerzanie się pęcherzyka wzdłuż konturu siatkówki. Technika ta została z powodzeniem zastosowana do podsiatkówkowego wstrzykiwania rtPA w przypadku masywnego krwotoku podplamkowego z powodu nAMD30.

Przedtransplantacyjne usunięcie natywnego RPE pozwala na odtworzenie kompleksu RPE-fotoreceptor
Gospodarz RPE powinien zostać usunięty przed przeszczepem przeszczepu. Dzieje się tak, ponieważ odbudowa kompleksu RPE-fotoreceptor jest niezbędna, aby przeszczep RPE mógł pełnić swoje fizjologiczne funkcje wspierania fotoreceptorów21. Gospodarz RPE, jeśli nie zostanie usunięty, może stanowić mechaniczną barierę, która uniemożliwia odbudowę tego kompleksu. Można go usunąć poprzez podanie substancji chemicznych toksycznych dla RPE lub za pomocą fizycznych środków usuwania. Metody usuwania chemicznego obejmują ogólnoustrojowe lub podsiatkówkowe podawanie jodanu sodu31,32. Ponieważ jodan sodu powoduje rozległą degenerację fotoreceptorów, komórek RPE i naczyniówki włosowatej po podaniu, jego toksyczność siatkówkowa i ogólnoustrojowa wyklucza jego zastosowanie w badaniach na ludziach32,33. W związku z tym preferowane są fizyczne techniki śródoperacyjne. Opracowano różne metody fizyczne. W przypadku stosowania metod fizycznych ważne jest, aby membrana Brucha pozostała nieuszkodzona. Wiele badań in vitro wykazało zależność przeżywalności przeszczepu RPE od nienaruszonej błony Brucha 34,35,36.

Próby hydraulicznego oczyszczania wiązały się z pęknięciami błony Brucha, zwiększonym tempem rozwoju błony nasiatkówkowej i proliferacyjną witreoretinopatią, co skutkowało trakcyjnym odwarstwieniem siatkówki37. Szpatułka z pyłem diamentowym zaproponowana do oczyszczenia RPE doprowadziła również do pęknięć błony Brucha, co spowodowało proliferację komórkową z naczyniówki do przestrzeni podsiatkówkowej38. Co ciekawe, wykonany na zamówienie instrument z wysuwaną pętlą może usunąć leżące nad nim RPE z zachowaniem błony Brucha w oczach królików i świń11,39. Usunięcie leżącego u podstaw RPE jest również przydatne do tworzenia modeli zwierzęcych z RPE i zewnętrznym zanikiem siatkówki, podobnie jak w przypadku zaawansowanej zanikowej postaci AMD. Kiedy ogniskowy obszar RPE jest usuwany z plamki żółtej, rana RPE zamyka się poprzez przerost pozostałych komórek RPE. Jednak ta reakcja gojenia się ran jest związana z atrofią zewnętrznej warstwy jądrowej40. Chociaż stworzenie modelu zwierzęcego wykracza poza zakres tego manuskryptu, podobna procedura może stworzyć model zwierzęcy zaawansowanego zanikowego fenotypu AMD do testowania terapii komórkowych pochodzących z RPE.

Stosowanie syrolimusa, triamcynolonu, doksycykliny i minocykliny w celu zmniejszenia immunogennego odrzucenia przeszczepu
Uważa się, że przestrzeń podsiatkówkowa jest miejscem uprzywilejowanym immunologicznie, utrzymywanym przez nienaruszoną barierę krew-siatkówka i inne czynniki41. W wielu badaniach obejmujących podsiatkówkowe przeszczepianie pochodnych komórek macierzystych z nienaruszoną barierą krew-siatkówka, leki immunosupresyjne odgrywają znikomą rolę w przeżyciu przeszczepu42. Uważa się, że zewnętrzna bariera krew-siatkówka jest tworzona przez natywną warstwę RPE i ścisłe połączenia między komórkami RPE. Podczas gdy natywne usunięcie RPE pozwala na lepszą integrację przeszczepionego RPE i fotoreceptorów gospodarza, bariera krew-siatkówka zostaje w tym procesie zakłócona, co zwiększa prawdopodobieństwo odrzucenia immunologicznego. Klasycznie limfocyty T odgrywają kluczową rolę w procesie odrzucania przeszczepu innych narządów, takich jak nerka i wątroba43. W związku z tym początkowe schematy immunosupresyjne przeszczepu tkanki siatkówki były ukierunkowane na zmniejszenie tych adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych.

Sirolimus, mechanistyczny cel inhibitora rapamycyny, i takrolimus, inhibitor kalcyneuryny, są przykładami leków immunosupresyjnych ukierunkowanych na adaptacyjną odpowiedź immunologiczną. Jednak pomimo odpowiedniej supresji limfocytów T, wskaźniki przeżycia przeszczepów pozostają niskie. Ponadto wiadomo, że komórki RPE hamują aktywację limfocytów T poprzez uwalnianie czynników hamujących i promują wytwarzanie regulatorowych komórek T44. W związku z tym staje się coraz bardziej oczywiste, że odporność adaptacyjna może nie być jedynym czynnikiem przyczyniającym się do odrzucenia przeszczepu42. Podsiatkówkowe przeszczepienie produktów komórkowych może spowodować akumulację i aktywację mikrogleju45.

Mikroglej to makrofagi siatkówki. Składają się z dwóch głównych populacji: 1) mikrogleju okołonaczyniowego wewnętrznego unaczynienia siatkówki i 2) mikrogleju w miąższu tkanki siatkówki. Ponieważ mikroglej jest częścią wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, glikokortykosteroidy doszklistkowe, takie jak triamcynolon, mogą hamować proliferację cytokin, w której pośredniczą46. Doksycyklina i minocyklina mogą również hamować aktywację mikrogleju i należy je rozważyć 47,48. Wreszcie, różnice w odrzuceniu immunologicznym alloprzeszczepów RPE w porównaniu z ksenoprzeszczepami nie są w pełni poznane49. Na przykład alloprzeciwciała przeciwko indukowanym pluripotencjalnym komórkom macierzystym RPE pochodzącym z komórek macierzystych zostały zgłoszone w surowicy modeli odrzucenia immunologicznego in vivo. Jednak rola tych przeciwciał i znaczenie odrzucenia za pośrednictwem przeciwciał w przeżyciu przeszczepu pozostaje nieznane50. W związku z tym proponuje się schemat wielolekowy wykorzystujący syrolimus do tłumienia odporności adaptacyjnej oraz kombinację triamcynolonu, doksycykliny i minocykliny do tłumienia odporności wrodzonej. Schemat ten jest z powodzeniem stosowany u królików z dobrymi wynikami przeżycia przeszczepu i minimalnymi skutkami ogólnoustrojowymi11.

Ograniczenia tej techniki chirurgicznej
W artykule opisano możliwą metodę chirurgiczną polegającą na dostarczeniu arkusza przeszczepu RPE do przestrzeni podsiatkówkowej NHP; Nie oznacza to jednak, że jest to jedyny zoptymalizowany sposób. Różni chirurdzy szklistkowo-siatkówkowi mogą mieć inne preferencje dotyczące instrumentacji i techniki. Na przykład ta konstrukcja urządzenia do implantacji może dostarczyć tylko płaskie implanty wsparte sztywniejszym nośnikiem komórek, a zatem może nie być odpowiednia dla stosunkowo elastycznych (lub zwijanych) implantów. Przeszczepy zawiesiny RPE mogą pominąć wiele z tej techniki. W związku z tym szczegóły chirurgiczne będą wymagały modyfikacji w oparciu o każdą strategię porodu.

Ponieważ zainteresowanie terapiami komórkowymi w leczeniu chorób zwyrodnieniowych siatkówki stale rośnie, model zwierzęcy NHP będzie miał zasadnicze znaczenie w badaniach przedklinicznych w celu zbadania czynników wpływających na przeżycie przeszczepu RPE. W niniejszym artykule zaproponowano strategie umożliwiające płynniejsze dostarczenie podplamkowego jednowarstwowego przeszczepu RPE w oku NHP. Zalecane są również metody lepszej wizualizacji powikłań śródoperacyjnych. Przewiduje się, że metody te będą nadal ulepszane wraz z rozszerzaniem się stosowania terapii komórkowych. Przyszłe prace metodyczne powinny również rozważyć zaproponowanie wyczerpującej listy badań w celu oceny różnych strukturalnych i funkcjonalnych aspektów przeszczepu.

Oświadczenia

Boris Stanzel posiada amerykański 9980851 patentowy na instrument (skrobak RPE) używany w tym badaniu. Honorowi mówcy od C. Zeiss Meditec i Geuder dla Borisa Stanzela. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez IAF-PP (HMBS Domain) (OrBID): OculaR BIomaterials and Device, A*STAR, Singapore (H17/01/a0/013), grant NUS Start-up NUHSRO/2016/100/SU/01, grant NUHS Clinical Scientist Program (NCSP) oraz National Research Foundation Competitive Research Programme, Singapore (NRF-CRP21-2018-0008) do X.S., Hong Leong Endowed Professorship funds dla G.E.H. i B.V.S. Chcielibyśmy podziękować zespołowi weterynaryjnemu z Translational Pre-Clinical Model Platform (Singapore Eye Research Institute, Singapur) za zapewnienie wsparcia w przygotowaniu do operacji NHP i obserwacji zwierząt. Chcielibyśmy wyrazić nasze uznanie dla Jill Teo i kolegów z C. Zeiss Meditec Singapore za wsparcie techniczne dla OPMI-Lumera 700 ze zintegrowanym śródoperacyjnym urządzeniem OCT.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1% Mydriacyl (Tropicamid 1,0%) Sterylny preparat okulistycznyAlconSIN 4715PZabieg chirurgiczny
10% Neutralna buforowana formalinaLeica3800598Procedura histologiczna
2,5% Mydfrin (chlorowodorek fenylefryny) Roztwór okulistycznyAlconNo. 01785Zabieg chirurgiczny
25 G AWH Żyrandol VividSynergetics56.54.25PZabiegu chirurgicznego
Frez do ciała szklistego 25 Ga z dwoma ostrzami Połączony pakiet Stellaris Elite o szerokim poluBausch & LombSE5525WVBZabieg chirurgiczny
AMO ENDOSOL Zrównoważony roztwór soli do irygacji okulistycznejAbbott Medical Optics15020Zabieg chirurgiczny
Apo-minocyklinaApotex Inc2084104Immunosupresja
AUROVISC - Hypromeloza Roztwór okulistyczny USP 2% w/vAurolabTN 00002387Zabieg chirurgiczny
Autoklaw MELAG, VacuklavMELAG1131-B2300Zabieg chirurgiczny
Autostainer XL (ST5010)Leica2433Procedura histologiczna
Zrównoważony roztwór solifizjologicznej Beaver Visitec581732Zabieg chirurgiczny
Wacikkosmetyczny WINNER MEDICAL1NA6-100Zabieg chirurgiczny
Diagnosys Espion E3 KonsolaDiagnosys272Obrazowanie oftamatyczne
DoksycyklinaYung ShinMAL 19950403AEZImmunosupresja
Eozyna YMerck Millipore1.15935.0100Procedura histologiczna
Elektrody do soczewek kontaktowych ERG-JetFabrinalF-06Obrazowanie oftomatyczne
Wysuwana kaniula PolyTip 25 G/38 GMedOne3247Zabieg chirurgiczny
FlexTip Brush (25 g) 1,5 mmMedOne3222Zabieg chirurgiczny
Fluoresceina 10% FaureCuratis AG5030376Obrazowanie oftamyczne
Wacik z gazyWINNER MEDICAL1NP3275Zabieg chirurgiczny
Strzykawka gazoszczelna Hamilton 250 µ LHamilton81101Zabieg chirurgiczny
Heidelberg Spectralis HRA + OCT System komputerowyHeidelberg EngineeringN.A.Obrazowanie oftamiczne
Hematoksylina Gill IIMerck Millipore3801520Procedura histologiczna
Zaćmienie odwróconego mikroskopu Ti-E główny korpus (100-240V)Nikon33131Procedura histologiczna
Wstrzyknięcie ketaminyCeva37711/58317Zabieg chirurgiczny
Węglan lituMerck Millipore1.05680.0250Procedura histologiczna
Plazminogen małpyInnowacje molekularneSKU-CYPLGZabieg chirurgiczny
Bezkontaktowa szerokokątna soczewka dna oka 128 stopniC. Zeiss MedtechResight 700Zabieg chirurgiczny
Włóknina okulistyczna Serweta okulistycznaAlcon8065103120Zabieg chirurgiczny
Okulistyczny nóż rogówkowy/twardówkowy V-Lance 20 GAlcon8065912001Zabieg chirurgiczny
Osadzanie parafiny StacjaLeicaEG1150 HProcedura histologiczna
Paraplast Wysokotopliwa parafinaLeica39601095Procedura histologiczna
Floksyna BMerck Millipore1.15935.0025Procedura histologiczna
Wstępnie sproszkowane rękawice chirurgiczneMAXITEX85-173-2/85-173-3/85-173-4Zabieg chirurgiczny
PRODINE Powidon-jod Roztwór BPICM PHARMAPMLBLP20-01Zabieg chirurgiczny
Lampa szczelinowa Righton Model MW50D (RAA133CB)Righton-Oph5200162Obrazowanie oftamowe
Mikrotom obrotowyLeicaRM2255Procedura histologiczna
Safil Kwas poliglikolowy, pleciony, powlekany, wchłanialny szew chirurgiczny 7/0B.BraunG1048711Zabieg chirurgiczny
SHINCORT I.M. INJ. Triamcynolon Acetonid 40 mg/ mLYung ShinSHI40 SGP-2610015-001Zabieg chirurgiczny
Jednorazowa igła podskórna 21 GB.Braun4657527Zabieg chirurgiczny
Jednorazowa igła podskórna 23 GB.Braun4657667Zabieg chirurgiczny
SirolimusPfizerSIN12034PImmunosupresja
Elektroda podskórna ze stali nierdzewnejOcuScienceF-E2Obrazowanie oftamamiczne
Stellaris Elite system poprawy wzrokuBausch & LombBL15455Zabieg chirurgiczny
Jednorazowe igły insulinowe Sterican Długi skos 27 G 12 mmB.Braun4665406Zabieg chirurgiczny
Jednorazowe igły insulinowe Sterican Długi skos 30 G 12 mmB.Braun4656300Zabieg chirurgiczny
Fartuch chirurgiczny + 2 ręczniki do rąkSTERILAPP10 00 01Zabieg chirurgiczny
Folia Tegaderm3M1626WZabieg chirurgiczny
TERUMO Strzykawka 1 cc/mL Luer SlipTip z igłą 26 GTerumaSS-01SZabieg chirurgiczny
TERUMO Strzykawka 3 cc/mL Luer LockTipTerumaSS-03LZabieg chirurgiczny
TERUMO Strzykawka 5 cc/mL Luer LockTipTerumaSS-05LZabieg chirurgiczny
TobraDex (Tobramycin, deksametazon) Sterylna maść okulistycznaAlconNr 01577Zabieg chirurgiczny
Kamera siatkówkowa Topcon TRC-50DXTopcon948605Obrazowanie okulistyczne
Vidisic GelBausch & LombGB41789155517Zabieg chirurgiczny
Xylazil-20Ilium38653/50276Zabieg chirurgiczny
Zeiss Opmi Rescan 700Carl Zeiss Meditec AG7210Zabieg chirurgiczny

Bibliografia

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Progress in Retinal and Eye Research. 66, 157-186 (2018).
  3. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  4. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
  5. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  6. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  7. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  8. Sugita, S., et al. HLA-matched allogeneic iPS cells-derived RPE transplantation for macular degeneration. Journal of Clinical Medicine. 9 (7), 2217(2020).
  9. Gouras, P., Flood, M. T., Kjeldbye, H. Transplantation of cultured human retinal cells to monkey retina. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 56 (4), 431-443 (1984).
  10. Koster, C., et al. A systematic review on transplantation studies of the retinal pigment epithelium in animal models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2719(2020).
  11. Stanzel, B., et al. Surgical approaches for cell therapeutics delivery to the retinal pigment epithelium and retina. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1186, 141-170 (2019).
  12. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
  13. Ben M'Barek, K., et al. Clinical-grade production and safe delivery of human ESC derived RPE sheets in primates and rodents. Biomaterials. 230, 119603(2020).
  14. Fujii, S., et al. A strategy for personalized treatment of iPS-retinal immune rejections assessed in cynomolgus monkey models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (9), 3077(2020).
  15. Kolb, H., Nelson, R., Ahnelt, P., Ortuño-Lizarán, I., Cuenca, N. The Architecture Of The Human Fovea. Webvision. Moran Eye Center. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-ii-anatomy-and-physiology-of-the-retina/the-architecture-of-the-human-fovea/ (2021).
  16. Francis, P. J., et al. Rhesus monkeys and humans share common susceptibility genes for age-related macular disease. Human Molecular Genetics. 17 (17), 2673-2680 (2008).
  17. Picaud, S., et al. The primate model for understanding and restoring vision. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26280-26287 (2019).
  18. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  19. Al-Nawaiseh, S., et al. A step by step protocol for subretinal surgery in rabbits. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e53927(2016).
  20. Tan, G. S. W., et al. Hints for gentle submacular injection in non-human primates based on intraoperative OCT guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10(2021).
  21. Liu, Z., et al. Surgical transplantation of human RPE stem cell-derived RPE monolayers into non-human primates with immunosuppression. Stem Cell Reports. 16 (2), 237-251 (2021).
  22. Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  23. Shaikh, M., Miller, J. B., Papakostas, T. D., Husain, D. The efficacy and safety profile of ocriplasmin in vitreomacular interface disorders. Seminars in Ophthalmology. 32 (1), 52-55 (2017).
  24. Johnson, M. W., Fahim, A. T., Rao, R. C. Acute ocriplasmin retinopathy. Retina. 35 (6), 1055-1058 (2015).
  25. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: experience from a phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  26. Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. New England Journal of Medicine. 358 (21), 2240-2248 (2008).
  27. Xue, K., Groppe, M., Salvetti, A. P., MacLaren, R. E. Technique of retinal gene therapy: delivery of viral vector into the subretinal space. Eye. 31 (9), 1308-1316 (2017).
  28. Grzybowski, A., et al. Update on intravitreal injections: Euretina Expert Consensus Recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
  29. Wong, D., Williams, R., Stappler, T., Groenewald, C. What pressure is exerted on the retina by heavy tamponade agents. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 474-477 (2005).
  30. Steel, G. B., Kearns, V., Stanzel, B. V., Wong, D. Subretinal injection under perfluorocarbon liquids to avoid foveal dehiscence. Retina. , (2021).
  31. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
  32. Koh, A. E. -H. Retinal degeneration rat model: A study on the structural and functional changes in the retina following injection of sodium iodate. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 196, 111514(2019).
  33. Bürgi, H., Schaffner, T. H., Seiler, J. P. The toxicology of iodate: a review of the literature. Thyroid. 11 (5), 449-456 (2001).
  34. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  35. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 235 (1), 41-47 (1997).
  36. Castellarin, A. A., et al. In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane. Experimental Eye Research. 66 (1), 49-67 (1998).
  37. Lopez, P. F., et al. Retinal pigment epithelial wound healing in vivo. Archives of Ophthalmology. 113 (11), 1437-1446 (1995).
  38. Lopez, R., Gouras, P., Brittis, M., Kjeldbye, H. Transplantation of cultured rabbit retinal epithelium to rabbit retina using a closed-eye method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (7), 1131-1137 (1987).
  39. Thieltges, F., et al. Localized RPE removal with a novel instrument aided by viscoelastics in rabbits. Translational Vision Science & Technology. 5 (3), 11(2016).
  40. Phillips, S. J., et al. Autologous transplantation of retinal pigment epithelium after mechanical debridement of Bruch's membrane. Current Eye Research. 26 (2), 81-88 (2003).
  41. Sugita, S., Mandai, M., Kamao, H., Takahashi, M. Immunological aspects of RPE cell transplantation. Progress in Retinal & Eye Research. , (2021).
  42. Xian, B., Huang, B. The immune response of stem cells in subretinal transplantation. Stem Cell Research & Therapy. 6, 161(2015).
  43. Issa, F., Schiopu, A., Wood, K. J. Role of T cells in graft rejection and transplantation tolerance. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (1), 155-169 (2010).
  44. Yan, F., et al. Transforming growth factor-β2 increases the capacity of retinal pigment epithelial cells to induce the generation of regulatory T cells. Molecular Medicine Reports. 13 (2), 1367-1372 (2016).
  45. Singhal, S., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans and microglia prevent migration and integration of grafted Müller stem cells into degenerating retina. Stem Cells. 26 (4), 1074-1082 (2008).
  46. Singhal, S., Lawrence, J. M., Salt, T. E., Khaw, P. T., Limb, G. A. Triamcinolone attenuates macrophage/microglia accumulation associated with NMDA-induced RGC death and facilitates survival of Müller stem cell grafts. Experimental Eye Research. 90 (2), 308-315 (2010).
  47. Santa-Cecília, F. V., et al. Doxycycline suppresses microglial activation by inhibiting the p38 MAPK and NF-kB signaling pathways. Neurotoxicity Research. 29 (4), 447-459 (2016).
  48. Scholz, R., et al. Minocycline counter-regulates pro-inflammatory microglia responses in the retina and protects from degeneration. Journal of Neuroinflammation. 12, 209(2015).
  49. Sugita, S., Makabe, K., Iwasaki, Y., Fujii, S., Takahashi, M. Natural killer cell inhibition by HLA-E molecules on induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (5), 1719-1731 (2018).
  50. Sugita, S., et al. Detection of retinal pigment epithelium-specific antibody in iPSC-derived retinal pigment epithelium transplantation models. Stem Cell Reports. 9 (5), 1501-1515 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases
Posted by JoVE Editors on 12/29/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR),
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore,
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

to:

Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

Tagi

Transplantacja RPEchoroby degeneracyjne siatk wkitransplantacja podplamkowaoptyczna koherentna tomografiatamponada ciecz perfluorow glowdokleszczowy plazminogentworzenie p cherzyka siatk wkowegofotografowanie dna oka
Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych innych niż człowiek w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.