Gruczoły ślinowe zostały zaproponowane jako miejsce docelowe dla terapii genowej, szczególnie w obszarze szczepienia przez transfer genów. Pokazujemy dostarczanie genów w modelu naczelnych innym niż człowiek, wykorzystując infuzję ślinianki przyusznej wstecznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wsteczny wlew gruczołu przyusznego przez przewód Stensena u naczelnych innych niż człowiek w celu wektorowego dostarczania genów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Gruczoły ślinowe są atrakcyjnym celem tkankowym dla terapii genowej, a obiecujące wyniki już doprowadziły do badań na ludziach. Są one z natury zdolne do wydzielania białek do krwiobiegu i są łatwo dostępne, co czyni je potencjalnie lepszymi miejscami tkankowymi do produkcji hormonów zastępczych lub szczepienia przez transfer genów. Sugerowane metody dostarczania genów obejmują wstrzyknięcie przezskórne i infuzję wsteczną przez przewody ślinowe. Pokazujemy, jak przeprowadzić infuzję wstecznych gruczołów ślinowych (RSGI) u naczelnych innych niż ludzie. Opisujemy ważne anatomiczne punkty orientacyjne, w tym identyfikację brodawki ślinianki przyusznej, atraumatyczną metodę kaniulowania i uszczelniania przewodu Stensena przy użyciu podstawowych narzędzi dentystycznych, rurki polietylenowej i cyjanoakrylanu oraz odpowiednią szybkość infuzji. Chociaż jest to najmniej traumatyczna metoda porodu, metoda ta jest nadal ograniczona przez objętość, którą można dostarczyć (<0,5 ml) i możliwość urazu przewodu i gruczołu. Za pomocą fluoroskopii wykazujemy, że infuzat może być w pełni dostarczony do gruczołu, a następnie demonstrujemy za pomocą immunohistochemii transdukcję typowego wektora i ekspresję dostarczonego genu.
Wprowadzenie
Chociaż gruczoły ślinowe są dobrze znane ze swojej zewnątrzwydzielniczej produkcji śliny, badacze od dawna dostrzegli ich zdolność do bezpośredniego wydzielania białek do krwiobiegu1, co czyni je potencjalnym celem terapii genowej do podawania ogólnoustrojowego, takiego jak hormony zastępcze lub produkcja przeciwciał. W rzeczywistości gruczoły ślinowe mają kilka zalet w porównaniu z innymi celami tkankowymi, takimi jak wrodzona zdolność do wytwarzania białek do wydzielania (właściwość, której brakuje mięśniom), ciężka enkapsulacja, która może ograniczać dyfuzję wektorów, oraz dobrze zróżnicowana tkanka zapewniająca stabilność wektorom nieintegrującym. Ponadto, w przypadku poważnego zdarzenia niepożądanego, gruczoły ślinowe nie są krytyczne dla życia i mogą zostać usunięte chirurgicznie. Chociaż nie jest to od razu intuicyjne, ślinianki przyuszne są również łatwo dostępne z ust przez ich główny przewód wydalniczy, Stensen's Duct2.
Biorąc pod uwagę zalety tkanki ślinowej w terapii genowej, rośnie zainteresowanie badaniem tego celu tkankowego. Przeprowadzono już liczne badania na modelach gryzoni, psów i naczelnych, a co najmniej jedno badanie kliniczne na ludziach jest w toku3,4,5. Aby dalej badać i rozwijać użyteczność tego celu tkankowego dla celów terapii genowej, konieczne będzie przeprowadzenie większej liczby badań na naczelnych innych niż ludzie. W artykule opisano metodę dostępu do ślinianek przyusznych przez przewód Stensena w celu dostarczenia wektorowego genu do transdukcji w modelu naczelnych innych niż człowiek. Aby w widoczny sposób zademonstrować podawanie infuzji i anatomię przewodu w momencie jego wchodzenia do gruczołu, wykonano fluoroskopię z użyciem radiokontrastu. Aby zademonstrować udaną transdukcję wektora, wykorzystano gen egfp wektorowany przez adenowirusa serotyp 5 (Ad5). Ad5 jest dobrze opisanym wektorem zdolnym do transdukcji tkanki ślinowej. Chociaż jest zbyt immunogenny, aby można go było ostatecznie zastosować klinicznie, do tego badania demonstracyjnego wybrano wektor Ad5, aby zapewnić skuteczną transdukcję. Ocena produkcji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) jest dobrze opisaną metodą wykazania udanej transkrypcji i translacji wektorowego genu po transdukcji i została przeprowadzona tutaj.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały przeprowadzone w Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus w celu przeprowadzenia badań na zwierzętach. Skonsultowano się z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC) w celu uzyskania informacji etycznych i przedłożono szczegóły procedur do przeglądu. IACUC w Wake Forest zatwierdziło nasz protokół badania, a wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem #A17-147.
1. Przygotowanie urządzenia infuzyjnego
- Pokrój rurkę polietylenową w rozmiarze 10 (PET10) na 25 cm długości za pomocą nożyczek.
- Oznacz PET10 w odległości 1 cm i 2 cm od jednego końca za pomocą czarnego markera.
- Wlej 0,5 ml roztworu Ad5-EGFP (109 cząstek wirusa/ml) do strzykawki o pojemności 1 ml (tuberkulina).
- Nasunąć nieoznakowany koniec probówki PET10 na igłę 29-31 G przymocowaną do strzykawki. Ogólnie rzecz biorąc, łatwiej jest wykonać to zadanie w powiększeniu.
- Wlej roztwór do PET10, aż probówka będzie całkowicie pełna (widoczna kropla na wolnym końcu).
- Używaj w pełni standardowych środków ochrony osobistej, w tym fartuchów chirurgicznych, fartucha z długimi rękawami, nieprzepuszczalnych rękawiczek, maski chirurgicznej, osłony twarzy, czepka do włosów i ochraniaczy na buty.
2. Przygotowanie zwierzęcia
UWAGA: Makaki Cynomolgus zostały użyte do demonstracji wideo. Anatomia innych naczelnych i zwierząt jest bardzo podobna, a protokół powinien być możliwy do przetłumaczenia na inne gatunki.
- Wstrzyknąć podskórnie 0,05 mg/kg atropiny na 15 minut przed zabiegiem, aby zminimalizować wydzielanie śliny oraz zoptymalizować dystrybucję i retencję infuzji.
- Znieczulenie należy podać za pomocą strzykawek o pojemności 5 ml z domięśniowo podawaną ketaminą/midazolamem (10-15 mg/kg ketaminy i 0,01-0,05 mg/kg midazolamu). Potwierdź prawidłowe znieczulenie, gdy zwierzę w sedacji straci przytomność i nie będzie w stanie reagować na bodźce.
3. Wykonywanie zabiegu
- Użyj retraktorów doustnych, aby usztywnić otwarte usta.
- Umieść gumową podkładkę jednego końca retraktora na podniebieniu twardym za górnymi zębami po stronie jamy ustnej przeciwnej do gruczołu, który będzie podawany. Umieść gumową podkładkę drugiego końca na dolnym knie po tej samej stronie co górny zwijacz. Delikatnie pozwól, aby sprężynowe działanie retraktora rozszerzyło się i otworzyło usta.
- Zidentyfikuj brodawkę ślinianki przyusznej, otwór przewodu Stensena, na tylnym policzku, w sąsiedztwie górnego 2. zęba trzonowego. Najlepiej zobrazować to za pomocą pętli dentystycznych do powiększenia.
- Delikatnie rozszerz brodawkę ślinianki przyusznej czubkiem stożkowego rozszerzacza. Najlepiej jest umieścić punkt rozszerzacza w środku lub otworze brodawki, a następnie delikatnie obracać go do przodu ido tyłu. Punkt powinien powoli wchodzić w brodawkę i rozszerzać ją przez około 20 - 30 s delikatnego obracania.
- Włóż rurkę PET10 do rozszerzonej brodawki ślinianki przyusznej. Najlepiej osiągnąć to, przytrzymując pęsetą oznaczony koniec rurki PET10 w odległości około 0,5 cm od dystalnego końca i delikatnie wkładając końcówkę rurki do rozszerzonej brodawki.
- Delikatnie przesuwaj rurkę, co często ułatwia się dzięki małym ruchom obrotowym, aby pomóc rurki się przesuwać, a następnie ponownie wyreguluj pęsetę o 0,5 cm proksymalnie do poprzedniego uchwytu. Powtarzaj to, aż znak 2 cm dotrze do brodawki ślinianki przyusznej.
- Nałóż cyjanoakrylan na policzek wokół brodawki i włożoną rurkę i poczekaj, aż wyschnie (nie zarejestrowano określonej ilości, tylko tyle, aby uszczelnić wejście do brodawki przewodu Stensena). Zwykle zajmuje to mniej niż minutę i pomaga uszczelnić brodawkę ślinianki przyusznej i zmniejszyć rozlewanie się infuzji z powrotem do jamy ustnej.
- Powoli przesuwać zawartość strzykawki przez 5 minut z szybkością 100 μl/min. Ta niska szybkość infuzji minimalizuje ryzyko uszkodzenia przewodu z powodu nagłego wzrostu ciśnienia wewnątrzprzewodowego.
- Pozostaw PET10 na miejscu na co najmniej 5 minut po zakończeniu infuzji. Utrzymuj kanalik szczelnie zamknięty i pozwól, aby infuzjat pozostał w śliniance przyusznej.
- Usuń PET10 z delikatnym trakcją. Cyjanoakrylan uwolni się wraz z rurką.
- Powtórz kroki od 3.2 do 3.8 po przeciwnej stronie.
- Powoli uwalniaj retraktory doustne po wstrzyknięciu obu ślinianek przyusznych i usunięciu obu rurek PET10.
UWAGA: Cała procedura dla obu stron powinna zająć mniej niż 30 minut.
4. Opieka pozabiegowa
- Po zakończeniu infuzji i deniulokacji przewodu Stensena obserwuj zwierzęta, aż efekt znieczulenia ustąpi (zwykle między 20-30 minutami po zabiegu).
- Zaoferuj zwierzęciu napoje, a następnie jedzenie, gdy w pełni się obudzi i wznowi rutynową opiekę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pomyślne przeprowadzenie procedury, transdukcja i transkrypcja
Rysunek 1 przedstawia brodawkę ślinianą przyusznie położoną obok 2nd trzonowca na tylnej górnej części policzka. Obraz pokazuje również prawidłowe umieszczenie klemy do pyska, z jednym gumowym końcem na podniebieniu twardym, a drugim na kłze po tej samej stronie. Rysunek 2 przedstawia obraz wykonany po pomyślnym kaniulowaniu brodawki ślinianej w miejscu oznaczenia 2 cm...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj opisujemy protokół wstecznej infuzji do ślinianki przyusznej przez przewód Stensena. Opisana metodologia zawiera wskazówki, które mogą być potencjalnie wykorzystane przez badaczy badających użyteczność tkanki ślinowej jako miejsca terapii genowej i innych zastosowań.
Istnieje wiele krytycznych kroków, aby zapewnić powodzenie procedury. Przede wszystkim wszystkie kroki proceduralne powinny być wykonywane delikatnie. Mocne usztywnienie jamy ustnej może spowodować podwichnięcie żuchwy. Siln...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Panu Cagneyowi Gentry'emu za jego audiowizualne wsparcie podczas filmowania procedury. Pragniemy również podziękować centrum medycznemu Hefner VA za wsparcie akademickie w realizacji tego projektu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 500 i mikro; Strzykawki L U100 z igłami o rozmiarze 30 Becton | Dickinson | 328466 | stała igła dla mniejszej ilości odpadów |
| Klej (np. Ethicon Dermabond) | Różne | kleje cyjanoakrylowe do uszczelniania i utrzymywania rurki w kanale podczas infuzji. | |
| Roztwór do wstrzykiwań atropiny | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropina inj. 0,54 mg / ml |
| BD Ultra-drobne strzykawki do insuliny 30G | Walmart | N/A | Dostępne w rozmiarach 0,5 ml i 1,0 mL. |
| Cyjanoakrylan (klej medyczny) | Ethicon | DNX12 | Dermabond miejscowy klej do skóry |
| Pętle dentystyczne ze światłem | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Służy do poprawy wizualizacji brodawki przewodu Stensena |
| Rozszerzacz łzowy dla niemowląt | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamina roztwór do wstrzykiwań | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg / ml |
| Rozszerzacz łzowy | Surgipro | SPOI-132 | Służy do dialongaty przewodu Stensena. |
| Roztwór do wstrzykiwań midazolamu | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5 mg / ml |
| Para nożyczek | Amazon (DDP) | Nie dotyczy / A | Służy do cięcia rurki PET10 |
| Rurki polietylenowe (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Rurka łącząca strzykawkę 30G i wkładana do kanału. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Służy do rozprowadzania cyjanoakrylanu na policzku |
| Rozmiar 10 Rurka polietylenowa (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | rurka polietylenowa o niskiej gęstości |
| Otwieracz do ust dla małych zwierząt | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Służy do utrzymywania otwartego pyska zwierzęcia. |
| Pęseta | Amazon (DDP) | Nie dotyczy | Służy do wprowadzania rurki PET10 do przewodu Stensona |
| Chlorek | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Zawarte w plazmidowych infuzjatach DNA |
Bibliografia
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4(2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
- Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
- Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
