Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Podsumowanie

Ten uproszczony protokół szczegółowo opisuje proces wykrywania i obrazowania bakterii w złożonych próbkach tkanek, od utrwalania tkanki po barwienie mikrobów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Streszczenie

Pomiar lokalizacji mikrobów w kontekście in vivo jest niezbędnym krokiem w odkrywaniu funkcjonalnych relacji między mikrobiotą a jelitami kręgowców. Krajobraz przestrzenny mikrobioty jelitowej jest ściśle kontrolowany przez cechy fizyczne – śluz jelitowy, krypty i fałdy – i wpływają na niego właściwości kontrolowane przez gospodarza, takie jak pH, dostępność tlenu i czynniki odpornościowe. Właściwości te ograniczają zdolność drobnoustrojów komensalnych i patogenów do stabilnej kolonizacji jelit. W skali mikronowej organizacja mikrobiologiczna określa interakcje bliskiego zasięgu między różnymi drobnoustrojami, a także interakcje między drobnoustrojami a ich gospodarzem. Interakcje te wpływają następnie na funkcjonowanie narządów na dużą skalę i zdrowie gospodarza.

Ten protokół umożliwia wizualizację przestrzennej organizacji mikrobioty jelitowej od odległości między komórkami do skali obejmującej całe narządy. Metoda opiera się na utrwalaniu tkanek jelitowych przy jednoczesnym zachowaniu struktury jelit i właściwości śluzu. Utrwalone próbki są następnie osadzane, dzielone na sekcje i barwione w celu uwydatnienia określonych gatunków bakterii poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH). Cechy gospodarza, takie jak śluz i składniki komórek gospodarza, są znakowane fluorescencyjnie znakowanymi lektynami. Na koniec zabarwione sekcje są obrazowane za pomocą mikroskopu konfokalnego wykorzystującego obrazowanie skanowania płytek w dużym powiększeniu, aby połączyć skale długości mikronów i centymetrów. Ten rodzaj obrazowania można zastosować do wycinków jelit z modeli zwierzęcych i biopsji tkanek ludzkich w celu określenia biogeografii mikrobioty w jelitach w zdrowiu i chorobie.

Wprowadzenie

Techniki wizualizacji mikrobiologicznej mają początki tak stare jak sama mikrobiologia, kiedy Antonie Van Leeuwenhoek używał swojego mikroskopu do obserwacji bakterii (które nazwał "animalcules") z płytki nazębnej i stolca w XVII^wieku. Od tego czasu opracowano wiele technik wizualizacji organizacji przestrzennej konsorcjum bakterii, grzybów i wirusów, które żyją w powiązaniu z gospodarzem - mikrobiota¹. Wyjaśnienie lokalizacji tych drobnoustrojów jest niezbędne do określenia ich funkcji w organizmie gospodarza. Biogeografia bakterii jest ważna zarówno w taksonach komensalnych, jak i patogennych, ponieważ bliskość określonych lokalizacji (np. nabłonka), substratów odżywczych i określonych drobnoustrojów może dyktować produkcję przez bakterie metabolitów leżących u podstaw interakcji międzygatunkowych i międzykrólestwowych.

Kluczową strukturą oddzielającą bakterie od tkanek gospodarza w kilku różnych miejscach ciała, takich jak jama ustna, jelito lub płuco, jest śluz - warstwa wytwarzana przez gospodarza, która zarówno zapobiega translokacji drobnoustrojów na komórki nabłonka gospodarza, jak i służy jako źródło odżywcze dla mikrobioty^2,3,4. Scharakteryzowanie przełamań i zmian w tej barierze ma kluczowe znaczenie, prowadząc do mechanistycznego wglądu w interakcje między gospodarzem a mikrobiotą, którego nie uzyskano by za pomocą samego sekwencjonowania^5,6,7. Na przykład obrazowanie umożliwiło odkrycie, że ekspozycja na antybiotyki może zakłócić warstwę śluzową i organizację mikrobioty^7,8, oraz że środki przeczyszczające mogą zubożać śluz, co koreluje z dużymi zmianami parametrów immunologicznych⁵.

Ten protokół nakreśla ogólne ramy utrwalania, barwienia i obrazowania mikrobioty i tkanki gospodarza (Rysunek 1), zbudowane na podstawie pracy Johanssona i Hanssona⁹. Chociaż protokół ten jest modelowany w kontekście odcinków jelitowych, można go łatwo dostosować do innych typów tkanek. Protokół ten umożliwia przetwarzanie próbek klinicznych pobranych od zwierząt doświadczalnych lub ludzi; Dołączono uwagi dotyczące przetwarzania obu typów próbek. W przedstawionym przykładzie nabłonek gospodarza i bakterie luminalne zostały jednocześnie znakowane barwieniem 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI), śluzem lektyną sprzężoną z fluoresceiną (FITC), aglutyniną Ulex europaeus I (UEA-1) oraz specyficznym taksonem bakteryjnym za pomocą FISH. Sondy FISH są zwykle projektowane w oparciu o geny 16S rRNA taksonu, aby zapewnić wysoki sygnał z wiązania transkryptu o dużej liczbie kopii.

W tym przykładzie sonda celuje w 16S rRNA z rodziny bakterii Muribaculaceae (Rysunek 2). Jednak barwienia są łatwo zastępowane różnymi sondami FISH i/lub lektynami, aby dostosować się do odpowiedniego pytania biologicznego. Wcześniej zwalidowane sondy FISH można znaleźć w ProbeBase¹⁰, internetowym zasobie sond oligonukleotydowych ukierunkowanych na rRNA, lub w SILVA¹¹, bazie danych rybosomalnego RNA. W celu zaprojektowania nowych sond czytelnik może odwołać się do nowych rurociągów, takich jak HiPR-FISH⁸ lub Oligominer¹². Korzystając z tego protokołu, można zaobserwować ścisłe upakowanie bakterii w świetle jelita i różne cechy śluzu jelitowego w całym przewodzie pokarmowym. Opisany tutaj przebieg pracy umożliwia ilościową analizę mikrobioty w kontekście przestrzennym środowiska gospodarza.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach i pobieranie tkanek opisane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC) i zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Użyto wolnych od zarazków szwajcarskich myszy Webster. Wszystkie zwierzęta były w wieku 8-10 tygodni, wykorzystano obie płcie, a wszystkie myszy były trzymane razem z co najmniej dwiema myszami w klatce. Zwierzęta zostały poddane eutanazji przy użyciu dwutlenku węgla z wtórnym zwichnięciem szyjki macicy lub nakłuciem serca.

1. Projektowanie eksperymentu z obrazowaniem: rozważania i pobieranie próbek

1. Konstrukcja sondy FISH
   1. Jeśli istnieje odpowiednia sonda FISH, wybierz istniejącą wcześniej opublikowaną sondę, która pokazuje silny sygnał w oznaczonych komórkach w porównaniu z tłem.
   2. Walidacja nowych sond in vitro w celu określenia ich skuteczności wiązania z ustalonymi próbkami bakterii docelowych i wiązania poza celem z innymi bakteriami.
   3. Należy sprawdzić wszystkie sondy 16S FISH, które mają być używane w odniesieniu do sekwencji 16S z organizmu docelowego lub z sekwencjonowania 16S rRNA z próbek, które mają być analizowane, aby upewnić się, że występuje oczekiwany odsetek dodatnich dopasowań i że sondy nie będą wiązać się niespecyficznie z innymi członkami mikrobioty.
      1. Dopasuj sondy FISH do sekwencji o pełnej długości lub wariantów sekwencji amplikonów za pomocą narzędzia, takiego jak Clustal Omega¹³, aby ocenić potencjalne wiązanie sond i ich celów.
      2. Oprócz testów in silico, przetestuj dokładność i poziom barwienia FISH niezatwierdzonych sond na czystych kulturach^8,14.

UWAGA: Podczas barwienia wielu członków społeczności, sondy mogą być używane kombinacyjnie (np. kombinacja sondy specyficznej dla rodziny i sondy specyficznej dla rodzaju), jeśli użyte fluorofory nie nakładają się na siebie w widmach wzbudzenia i emisji (chyba że obrazowanie odbywa się w systemie z możliwością wykonywania liniowego rozmieszania). Dodatkowo, specyficzność można wykazać poprzez włączenie kontroli specyficzności/sond kodowanych lub poprzez konkurencję z sondami niefluorescencyjnymi.

1. Rodzaje próbek i pobieranie tkanek
   1. Za pomocą ostrych i czystych narzędzi wytnij segmenty jelit gnotobiotycznych szwajcarskich myszy Webster do obrazowania. Zminimalizuj zakłócanie próbki tak bardzo, jak to możliwe, i trzymaj sekcje za ich krawędzie, aby uniknąć wpływu na obszar obrazowania. Utrwalić próbkę tak szybko, jak to możliwe po rozbiorze, aby zapobiec degradacji.
      UWAGA: W przypadku badań na zwierzętach preferowane są nienaruszone, niezapłukane odcinki jelita; Membrana pomoże utrzymać nienaruszoną organizację światła i błony śluzowej.
   2. Wyczyść narzędzia, przecierając je 70% etanolem między próbkami i miejscami. Należy uzyskać co najmniej trzy powtórzenia biologiczne na wycinek jelita/lokalizację biopsji, zwracając uwagę na pobieranie próbek z różnych lokalizacji jelit, ponieważ śluz i architektura jelit, a także mikrobiota zmieniają się znacząco w różnych miejscach.

2. Utrwalanie i infiltracja próbki tkanki

1. Utrwalenie
   1. Przygotuj świeży metakarn w kompatybilnym pojemniku o następujących proporcjach: 60% metanolu bezwzględnego, 30% chloroformu i 10% lodowatego kwasu octowego. Dozuj każdą z tych substancji chemicznych do dygestorium. Wybierz pojemnik, który można odpowietrzyć, otwierając pokrywę. Ponieważ metakarn nie jest kompatybilny z polistyrenem, należy go przygotować w pojemniku polietylenowym, używając szklanych cylindrów z podziałką/pipet serologicznych do chloroformu i lodowatego kwasu octowego.
      UWAGA: Podczas mieszania wytwarzają się opary, które mogą powodować wzrost ciśnienia wewnątrz pojemnika. Zaleca się, aby pojemnik był stosunkowo szczelnie zamknięty po wyjęciu z dygestorium, jeśli próbki nie są aktywnie dodawane. Chloroform jest toksyczny; Nie wdychać, nie połykać ani nie wchłaniać przez skórę. Metanol jest toksyczny i wysoce łatwopalny; Nie wdychać, nie połykać ani nie wchłaniać przez skórę. Lodowaty kwas octowy jest łatwopalny i silnie dla skóry i oczu.
   2. Po dozowaniu zamknij pojemnik, zamieszaj, aby wymieszać, a następnie odpowietrzyć; powtarzaj tę czynność, aż ustanie odgazowywanie (a ciśnienie pod pokrywką nie wzrośnie już znacząco).
      UWAGA: Nie wyrzucaj metakarnu do kanalizacji; Zbieraj i utylizuj jako niebezpieczne odpady chemiczne zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Użyj ołówka do oznaczania kaset histologicznych, ponieważ wiele atramentów do pióra odpadnie w roztworze metakarnu.
   3. Umieść skrawki jelita w kasetach histologicznych, delikatnie przytrzymując krawędź tkanki pęsetą. Zamknij kasetę i całkowicie zanurz ją w świeżym roztworze metakarnu. Upewnij się, że roztwór nie jest starszy niż kilka godzin po zanurzeniu kaset.
   4. W przypadku próbek klinicznych, które będą pobierane w pomieszczeniu klinicznym bez dostępu do dygestorium, należy użyć polietylenowego pojemnika do przechowywania z klapką wyciętą w pokrywie, która umożliwi przejście kaset histologicznych. Zaklej tę klapkę taśmą, gdy nie przepuszcza próbek, aby zapobiec wydostawaniu się toksycznych oparów.
      UWAGA: Ważne jest, aby używać taśmy maskującej, aby uniknąć rozpuszczenia kleju na pojemniku - niektóre rodzaje taśm (np. plastikowa taśma pakowa) mogą nie wytrzymywać dobrze oparów metakarnu.
   5. Próbki należy utrwalać na minimum 3 godziny, a maksymalnie na dwa tygodnie.
      UWAGA: Grubsze próbki mogą wymagać czasu utrwalania dłuższego niż 3 godziny. Czas wiązania może być wybrany tak, aby umożliwić jednoczesne przetwarzanie infiltracji parafiny w przypadku kaset utrwalonych w różnych roztworach metakarny (np. w celu jednoczesnego przeprowadzenia infiltracji parafiny na grupach próbek pobranych i utrwalonych w ciągu dwóch tygodni).
2. Infiltracja i zatapianie parafiny
   1. Umieść parafinę w żaroodpornym pojemniku i rozpuść ją w piekarniku w temperaturze 60 °C przez noc. Ponieważ granulki parafiny zajmują więcej miejsca przed stopieniem, upewnij się, że stopiono wystarczającą ilość parafiny, aby pokryć wszystkie kasety.
      UWAGA: Temperatura nie powinna być wyższa niż 60 °C, ponieważ może to spowodować powstawanie artefaktów.
   2. Umyj chusteczkę, wylewając płyn do odpowiedniego pojemnika na odpady i natychmiast zastępując go następującymi chemikaliami.
      1. Inkubować w metanolu absolutnym przez 30 minut. Powtórzyć raz.
      2. Inkubować w absolutnym etanolu przez 20 minut. Powtórzyć raz.
      3. Inkubować w ksylenach przez 15 minut. Powtórzyć raz.
      4. Szybko wymieniaj prania, uważając, aby kasety nie wyschły. Upewnij się, że każde mycie całkowicie zakrywa kasety w zlewce lub pojemniku.
         UWAGA: Ksyleny są łatwopalne, a w przypadku wdychania opary mogą działać negatywnie na ośrodkowy układ nerwowy z potencjalnymi długoterminowymi konsekwencjami neurologicznymi po narażeniu na wysokie stężenia (>200 ppm). Z ksylenami należy obchodzić się tylko w obrębie dygestorium. Ponieważ ksyleny są niebezpieczne, należy zachować minimalną ilość niezbędną do pokrycia kaset histologicznych.
   3. Podczas osadzania zorientuj segmenty jelita równolegle do długości kasety (w przeciwieństwie do pionowej) za pomocą pęsety, aby zapewnić podłużne, poprzeczne przekroje zamiast pączków o przekroju poprzecznym, aby zapewnić większą potencjalną powierzchnię próbki do obrazowania ilościowego (Rysunek 1B).
   4. Lekko otwórz kasety (~ 1-2 cm lub 0,5 cala), aby umożliwić wejście parafiny bez utraty segmentów tkanki. Do tego kroku użyj podwójnych rękawiczek lub pęsety, aby zapobiec przegrzaniu lub lekkiemu poparzeniu palców. Zanurzyć i zamknąć kasety w pojemniku z roztopioną parafiną, umieszczając pojemnik z powrotem w piecu o temperaturze 60 °C. Upewnij się, że kasety są wypełnione parafiną i nie pozostały żadne duże pęcherzyki powietrza.
   5. Po inkubacji przez 2 godziny w temperaturze 60 °C wyjąć pojemnik z suszarki. Za pomocą kleszczy ostrożnie wyjmij kasety i połóż je pojedynczo na kawałku folii aluminiowej, aby ostygły. Przechowuj je w temperaturze pokojowej, aż będą gotowe do osadzenia i pokrojenia.
   6. Skrawki parafiny należy podzielić na sekcje za pomocą mikrotomu, wciskając je na tyle głęboko, aby odsłonić zawartość światła, umożliwiając wykonanie podłużnego przekroju kosmków i/lub krypt oprócz zawartości światła i śluzu. Uważaj, aby wymienić ostrza, ponieważ materiał kałowy szybko ostrze w porównaniu z tkanką. Przytnij sekcje o grubości 4 μm, aby uzyskać optymalną ostrość obrazów. Przenieś sekcje na zwykłe niepowlekane szkiełka.
   7. W przypadku barwienia RYB należy zabarwić odcinki jelita tak szybko, jak to możliwe (tj. w ciągu kilku tygodni od cięcia), aby uzyskać silny sygnał FISH. W przypadku pominięcia barwienia FISH, barwienie lektyną + DAPI można przeprowadzić na mniej świeżych (tj. miesięcznych) próbkach bez znacznej utraty sygnału.

3. Barwienie bakterii i cech gospodarza

1. preparat
   1. Rozgrzej piekarnik do 60 °C. Podgrzej pusty słoik z koplinu i objętość wystarczającą do dwukrotnego przykrycia szkiełek w słoiku ksylenami w szklanej butelce, uważając, aby wokół pokrywki pokryć parafilm, aby zapobiec parowaniu ksylenów. Pozwól, aby temperatura ksylenów osiągnęła 60 °C.
      UWAGA: Standardowy słoik Coplin mieści 8 szkiełek, a szkiełka można zalać około 50 ml płynu (może się różnić od 40 do 60 ml w zależności od marki). Substytuty ksylenu są mniej toksyczne i są z powodzeniem stosowane przez inne grupy na etapie dewoskowania (krok 3.2)^8,9.
   2. Jeśli dostępny jest oddzielny piekarnik, należy go wstępnie rozgrzać do temperatury 50 °C. W przeciwnym razie krok ten można wykonać w tym samym piecu, który został użyty do pieczenia szkiełka po kroku 3.2.3.
   3. Przygotuj roztwór hybrydyzacyjny FISH: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 M NaCl; 0,01%²⁶ - 0,1^%9 (w/v) dodecylosiarczan sodu (SDS) w wodzie wolnej od nukleaz. W razie potrzeby dodać 5-50% (v/v) formamidu. Podczas deparafinowania roztwór hybrydyzacyjny należy wstępnie ogrzać w temperaturze 50 °C.
      UWAGA: Formamid jest amidem, który działa jako teratogen; Z formamidem należy obchodzić się w rękawiczkach i okularach ochronnych. W małych dawkach i po ekspozycji na oczy, skórę lub błony śluzowe działa drażniąco. W dużych ilościach opary formamidu mogą wymagać interwencji medycznej. Formamid może być przechowywany w 100% w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
2. Przygotowanie szkiełek do barwienia: deparafinizacja
   1. Umieść szkiełka w słoiku Coplin, upewniając się, że sekcje nie stykają się z innymi szkiełkami lub słoikiem, a następnie piecz szkiełka w temperaturze 60 °C przez 10 minut.
   2. W dygestoriach napełnij słoik Coplin wstępnie podgrzanymi ksylenami z pieca, uważając, aby nie wylać ich bezpośrednio na próbki i nie spowodować przemieszczenia tkanek. Umieść słoik Coplin z powrotem w piekarniku o temperaturze 60 °C. Pozostaw butelkę z pozostałymi ksylenami w dygestorium.
   3. Wlej zużyte ksyleny do odpowiedniego pojemnika na odpady do utylizacji, uważając, aby nie naruszyć skrawków tkanek na szkiełkach i używając kleszczy, aby szkiełka nie wypadły ze słoika Coplin. Uzupełnij słoik Coplin pozostałymi ksylenami i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w dygestorium.
   4. Inkubować sekcje w 99,5% etanolu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po tym etapie inkubacji wyjmij szkiełka ze słoika Coplin, wytrzyj tylną część szkiełek chusteczką laboratoryjną lub ręcznikiem papierowym i krótko wysusz na powietrzu, aż znikną kropelki etanolu.
      UWAGA: Wycieranie tylnej części szkiełek umożliwia lepszą wizualizację postępu suszenia.
3. Barwienie bakteryjne za pomocą FISH
   1. Użyj blokera płynu lub wstrzykiwacza PAP, aby ograniczyć obszar rozszerzania się płynu, okrążając obszar każdego odcinka tkanki. Upewnij się, że atrament nie styka się z samą sekcją. Utwórz okrąg jak najbliżej każdej sekcji tkanki bez kontaktu z tkanką, aby zminimalizować powierzchnię, która musi zostać pokryta roztworem hybrydyzacyjnym.
   2. Przygotuj roztwór do hybrydyzacji: na każde 50 μl wstępnie podgrzanego roztworu do hybrydyzacji dodaj 0,5 μg sondy (np. 0,5 μl z 1 μg/μL sondy). Odpipetować roztwór hybrydyzacyjny na sekcje na szkiełku (~20 μl/sekcję, w zależności od wielkości przekroju/koła). Od tego momentu należy chronić roztwór do hybrydyzacji i szkiełka przed światłem podczas etapów inkubacji i przechowywania.
   3. Upewnij się, że objętość użytego płynu pokrywa całą sekcję po nałożeniu elastycznego plastikowego szkiełka nakrywkowego. Inkubować szkiełko w wilgotnej komorze, aby zmniejszyć parowanie. Stwórz wilgotną komorę z pudełkiem na końcówki do pipet z chusteczkami lub ręcznikami papierowymi na dnie, które zostały nasączone nadmiarem roztworu hybrydyzacyjnego lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby zapewnić wilgotność. Inkubować sekcje w temperaturze 45-50 °C, w zależności od zestawu sond, przez >3 godziny.
   4. W okresie inkubacji rozgrzać bufor do płukania FISH: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 M NaCl do 50 °C. Przygotuj wystarczającą ilość buforu do mycia, aby przykryć szkiełka w słoiku Coplin.
   5. Usunąć plastikowe szkiełka nakrywkowe; inkubować szkiełka w buforze do mycia FISH w słoiku z kopliny, oba wstępnie podgrzane do 50 °C. Włożyć słoik Coplin z powrotem do piekarnika o temperaturze 50 °C na 10-20 minut. W przypadku grubych próbek usuń szkiełka nakrywkowe ze słoika Coplin, dodając bufor i delikatnie usuwając szkiełka nakrywkowe, aby uniknąć rozmazania plasterka.
4. Barwienie śluzu i cech gospodarza
   1. Przygotować ogólny barwnik przeciwbarwny DNA/śluzu w PBS: końcowe 10 μg/ml DAPI + 40 μg/ml barwienie śluzu UEA-1. Przygotuj wystarczającą ilość barwnika, aby pokryć plamy w przypadku braku szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć uszkodzenia tkanki dodatkowymi szkiełkami nakrywkowymi.
      UWAGA: Pokrycie plam w przypadku braku szkiełka nakrywkowego będzie wymagało większych objętości niż 20 μl użyte w ppkt 3.3.2. W przypadku odcinków średniej wielkości (średnica ~10 mm) 200 μL wystarcza na pokrycie jednego miejsca; Przetestuj tę objętość wcześniej na atrapie szkiełka.
   2. Wyjmij bufor do mycia FISH i zastąp go PBS w słoiku Coplin. Natychmiast po napełnieniu słoika Coplin PBS, zdekantuj PBS.
   3. Wyjmij szkiełka ze słoika i odpipetuj przeciwplamę na górze sekcji, uważając, aby nie dotknąć chusteczki końcówką pipety. Przykryj całą sekcję bańką. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 45 minut w ciemności.
   4. Szybko zmyj plamy 3 razy świeżym PBS: przytrzymując szkiełka na miejscu za pomocą pęsety, wylej PBS do zlewu i natychmiast napełnij świeżym PBS.
   5. Wycierając tylną część szkiełek o chusteczkę lub ręcznik papierowy, pozwól, aby większość PBS odparowała z sekcji, wspomagana przez przewód podciśnieniowy podłączony do końcówki pipety. Również w tym przypadku należy unikać dotykania sekcji końcówką pipety.
   6. Zamontuj sekcje za pomocą medium montażowego (bez DAPI) i pozwól mu zastygnąć w temperaturze pokojowej przykryte szklanymi szkiełkami nakrywkowymi, upewniając się, że szkiełka nakrywkowe są płaskie i nie ma pęcherzyków powietrza w medium montażowym.
   7. Przymocuj szkiełka nakrywkowe do szkiełka podstawowego, malując wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci, uważając, aby trzymać się z dala od krawędzi szkiełka, aby upewnić się, że szkiełko będzie leżeć poziomo w uchwycie szkiełka mikroskopowego podczas obrazowania.
   8. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez kilka tygodni, zanim fluorescencja zostanie wyczerpana.

4. Obrazowanie i analiza obrazu

1. Wizualizacja plam
   1. Wybierz obszar tkanki, który zawiera zarówno tkankę, jak i światło, aby zobrazować granicę między mikrobiotą a gospodarzem. Do ilościowego obrazowania grubości śluzu i biogeografii światła należy wybrać pola widzenia, w których wycinki kosmków nabłonka i/lub krypt są podłużne, a nie przekrojowe. Unikaj obszarów z dużymi przerwami między śluzem a nabłonkiem, aby uniknąć cięcia artefaktów.
   2. Zlokalizuj tkankę i skoryguj płaszczyznę ogniskowej, wykorzystując sygnał DAPI do lokalizacji i ustawiania ostrości, aby uniknąć fotowybielania sygnału fluorescencji FISH.
   3. Dostosuj ustawienia obrazowania. Aby uwidocznić bakteryjne barwienie DAPI, zwiększ moc lasera i wzmocnienie do punktu, w którym sygnał DAPI z komórek nabłonka jest przesycony lub "wydmuchiwany".
      UWAGA: Nie należy nadmiernie nasycać, ponieważ doprowadzi to do fotowybielania i artefaktów wizualnych w jądrach, których nie można odzyskać.
   4. W przypadku wszystkich innych kanałów należy używać minimalnej mocy lasera, która zapewni wyraźny sygnał ponad tłem, i uważać, aby nie przesycić.
      UWAGA: Jest to szczególnie ważne podczas wykonywania skanowania kafelków, ponieważ fotowybielanie będzie problematyczne, gdy obrazowane jest nakładanie się płytek.
   5. Użyj 40-krotnego lub większego powiększenia, aby zobrazować poszczególne bakterie.
   6. Zdobądź obrazy.
      1. Pozyskaj skany płytek, aby uzyskać dane ilościowe na temat grubości śluzu i przestrzennego rozmieszczenia drobnoustrojów w świetle słonecznym. Upewnij się, że kafelki zachodzą na siebie w 15% i sprawdź, czy nie ma winietowania/nierównomiernego oświetlenia, które może się pogorszyć przy <1-krotnym powiększeniu. Podczas konfigurowania skanowania kafelków należy zwrócić szczególną uwagę na to, czy tkanka jest wyostrzona na wszystkich kafelkach, ponieważ nie można analizować rozmytych/nieostrych obrazów (Rysunek 3B).
      2. Jeśli to możliwe, zminimalizuj liczbę kafelków potrzebnych do zobrazowania danej długości nabłonka, obracając obszar skanowania tak, aby warstwa nabłonka i śluzu były równoległe do płytki, a nie pod kątem. W przeciwnym razie znajdź odcinek nabłonka, który jest równoległy lub prostopadły do obszaru obrazowania, aby uzyskać podobny efekt.

Wyniki

Aby zbadać lokalizację specyficznych bakterii komensalnych jelitowych w jelicie myszy, w tym badaniu wykorzystano wolne od zarazków szwajcarskie myszy Webster, które zostały skolonizowane indywidualnymi izolatami bakteryjnymi. W tym eksperymencie oznaczone gatunki bakterii to i) ludzki izolat z rodziny Muribaculaceae⁵, Muribaculum intestinale, liczna i rozpowszechniona rodzina bakterii w mysiej mikrobiocie¹⁵, a także ii) Bacteroides thetaiotaomicron, genetycznie podatna i powszechna bakteria jelitowa. Po dwóch tygodniach równowagi myszy poddano eutanazji, a segment jelita grubego zawierający osad kału został pocięty i umieszczony w świeżo przygotowanym metakarnie. Po dwóch dniach utrwalania skrawki zostały odwodnione przez przetwarzanie przez metanol, etanol i ksyleny, infiltrowane parafiną, zatapiane, a następnie cięte na plastry światła o wielkości 4 μm. Próbki te zostały następnie wybarwione sondą FISH (3' oznaczoną Cy3) specyficzną dla izolatu Muribaculum, zaprojektowaną przy użyciu oprogramowania Oligominer ¹² i sprawdzoną pod kątem struktury drugorzędowej i trzeciorzędowej oraz minimalnego niespecyficznego wiązania za pomocą NuPACK i mathFISH^16,17. Próbki były również barwione przeciwstawnie lektyną UEA-1 związaną z rodaminą (która barwi fukozylowane glikany w śluzie) i DAPI. Poplamione fragmenty zostały zobrazowane za pomocą 40-krotnego obiektywu olejowego i modułu o wysokiej rozdzielczości.

Rysunek 1: Przebieg wizualizacji interfejsu mikrobiota-gospodarz w jelicie. (A) Ilustrowany przepływ pracy dla rurociągu. (B) Dwie płaszczyzny przekroju dadzą albo przekroje poprzeczne (preferowane dla tego rurociągu), albo przekrojowe "pączki". (C) Osadzanie tkanek o bardzo różnej grubości może skutkować plastrami, które są optymalne tylko dla jednej lub drugiej tkanki. Skróty: FISH = fluorescencyjna hybrydyzacja in situ; DAPI = 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Obrazowanie jelita grubego pokazuje lokalizację jelita Muribaculum w stosunku do śluzu w modelu myszy gnotobiotycznej. Skrawki barwiono sondą DAPI (niebieska), Muribaculaceae FISH (czerwona) i UEA-1 (zielona). (A) Dystalna okrężnica myszy mono-skolonizowana Muribaculum intestinale i (B) dystalna okrężnica myszy dwuskolonizowana Muribaculum intestinale i Bacteroides thetaiotaomicron. Podziałka = 20 μm. (C i D) Cy3-FISH (po lewej), DAPI (w środku) i połączone kanały Cy3-FISH + DAPI dla części wstawki luminalnej odpowiednio (A) i (B). Podziałka = 5 μm. W (A) i (C) wszystkie sygnały DAPI w kształcie bakterii i wielkości bakterii są oznaczone Cy3 (pojedyncze groty strzałek), a w (B) i (D), oprócz tych podwójnie dodatnich komórek Cy3 i DAPI (pojedyncze groty strzałek), istnieją komórki bakteryjne barwione DAPI, które są Cy3-ujemne (podwójne groty strzałek), zgodnie z oczekiwaniami dla stanów mono- i dwukolonizacyjnych. Z wyjątkiem dłuższych bakterii nitkowatych, większe (>4 μm długości) struktury DAPI (strzały) to materiał roślinny lub jądra z komórek gospodarza. Skróty: FISH = fluorescencyjna hybrydyzacja in situ; DAPI = 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Częste problemy. (A) Płytkie przekroje nie zapewnią luminalnych wycinków jelita. (Po lewej) Odcinek jelita, który został podzielony na głębokość, która zapewnia widok światła, a także podłużne widoki nabłonka. (Po prawej) Odcinek jelita, który został pocięty zbyt płytko, odsłaniając tylko przekroje krypt i brak stałej warstwy śluzu lub bakterii. (B) Nierównomierne pokrycie tkanki/szkiełka nakrywkowego może skutkować rozmytymi i nierównomiernie oświetlonymi skanami płytek. Skanowanie kafelków zostało skonfigurowane z pozycjami, które były nieostre (prawy górny róg). (C) Przykład normalnego tła (po lewej) i wysokiego tła (po prawej). W tym przykładzie dla sygnału DAPI zwróć uwagę na sygnał pochodzący z nabłonka, na zewnątrz jąder. Wszystkie pręty skali = 20 μm. Skrót: DAPI = 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisany powyżej protokół zapewnia powtarzalną metodę wizualizacji interfejsu gospodarz-mikrobiota. Testy te znacznie skorzystały na opracowaniu protokołu, począwszy od optymalizacji znakowania FISH¹⁸ po zachowanie śluzu i obrazowanie⁹. Utrwalanie i osadzanie zapewniają również użyteczne przechowywanie próbek; Co więcej, kasety z naciekami parafiny mogą być wysyłane bez żadnych ograniczeń, ponieważ próbki są całkowicie utrwalone i obojętne.

Znaczenie i metody alternatywne
Połączenie barwienia FISH i śluzu umożliwia analizę składu mikrobioty w określonych lokalizacjach tkanek oraz interakcji między poszczególnymi bakteriami a gospodarzem. Alternatywne techniki, które obejmują analizę określonych miejsc w obrębie mikrobioty, zwykle nie są w stanie zbadać jednokomórkowego charakteru tych interakcji, tak jak w przypadku mikrodysekcji wychwytywania laserowego w połączeniu z sekwencjonowaniem¹⁹. Techniki oparte na sekwencjonowaniu mają jednak tę zaletę, że są w stanie uchwycić skład genetyczny mikrobioty na dokładniejszym poziomie i szerzej niż sondy 16S rRNA.

Pułapką przedstawionego protokołu jest to, że zapewnia on jednorazowy obraz mikrobioty w odniesieniu do gospodarza. Do obrazowania w czasie rzeczywistym u żywych zwierząt wymagane są specjalne techniki obrazowania, które ułatwiają uzyskanie sygnału fluorescencyjnego w głębokich tkankach (np. Mikroskopia dwufotonowa przyżyteczna i mikroskopia fluorescencyjna z arkuszami świetlnymi^20,21). W tych metodach organizm modelowy jest albo kolonizowany przez bakterie, które są barwione cząsteczkami, które wiążą się z ich otoczką²⁰, albo genetycznie zmodyfikowanymi bakteriami, które zawierają białka fluorescencyjne²¹. W tym drugim przypadku dojrzewanie białek fluorescencyjnych jest kluczową kwestią, ponieważ większość standardowych białek fluorescencyjnych wymaga tlenu do emitowania światła. W związku z tym wymagane są organizmy modelowe, które mają co najmniej środowisko natlenowe (nanomolowe stężenie tlenu), takie jak tlenowe jelito danio pręgowanego²¹.

W tym protokole metanol-Carnoy jest używany jako utrwalacz zamiast paraformaldehydu lub formaliny, ponieważ nie zawiera wody. Zapobiega to nawodnieniu, odwodnieniu i zapadaniu się warstwy śluzu podczas przetwarzania i ułatwia dokładne pomiary grubości śluzu. Podczas gdy utrwalanie metakarny i zatapianie parafiny stało się standardem w tej dziedzinie, badano różne utrwalacze i techniki zatapiania w celu optymalizacji zachowania śluzu ^9,22, przy czym niektóre badania wskazują, że żywice mogą być lepsze od osadzania parafiny²². Innym ważnym ograniczeniem w zatapianiu parafiny i wiązaniu metakarny jest utrata fluorescencji białek fluorescencyjnych, której można uniknąć, stosując alternatywne utrwalacze (np. formalinę lub paraformaldehyd (PFA)) lub zmodyfikowane techniki zatapiania²³. Każdy utrwalacz ma zalety i wady, a wybór utrwalacza zależy od priorytetów obrazowania. Metody obrazowania można łączyć, jeśli kontrpróby biologiczne są utrwalone w PFA i metakarnie, a obrazy uzyskuje się z obu próbek.

FISH połączono z immunofluorescencją w izolowanych przypadkach ze specyficznymi przeciwciałami poliklonalnymi królika anty-Muc2C3 ^9,24. Wyniki te nie zostały szeroko powtórzone z innymi przeciwciałami Muc2, co wskazuje, że wybór przeciwciał może mieć kluczowe znaczenie dla powodzenia kombinacji FISH-immunofluorescencyj. Warunki pomyślnego barwienia przeciwciał dla danego przeciwciała mogą nie pozwalać na utrzymanie barwienia FISH.

Rozwiązywanie problemów
W tym protokole pobieranie, cięcie i barwienie próbek stanowią krytyczne kroki zapobiegające tworzeniu się artefaktów obrazowania. Na przykład uciskanie tkanki po pobraniu i przed osadzeniem może prowadzić do nieprawidłowej lokalizacji mikrobioty i wpływać na jakość śluzu. Inną ważną kwestią jest unikanie łączenia segmentów o bardzo różnej grubości w jednej kasecie, takiej jak stosunkowo pusty kawałek jelita cienkiego i osad w dalszej części okrężnicy. Różne grubości prowadzą do trudności w obrazowaniu: po osadzeniu przekrój poprzeczny na określonej głębokości dla jednego segmentu może być na niewłaściwej głębokości dla obrazowania dla drugiego (np. światło będzie na różnych głębokościach dla każdej tkanki) (ryc. 1B, C i ryc. 3A). Ponadto, w celu obrazowania osadów kału z modelu zwierzęcego, mogą one być owinięte błoną otrzewnową²⁴. W tej technice niewielka część świeżo wyizolowanej otrzewnej jest delikatnie zawijana wokół stolca i zachowuje strukturę osadu podczas etapów mycia opisanych w protokole.

W przeciwieństwie do przetwarzania tkanek zwierzęcych z zawartością, obrazowanie próbek jelit ludzkich wiąże się z pewnymi wyzwaniami. W szczególności zawartość światła i wyściółka błony śluzowej zostaną prawdopodobnie zakłócone przez kolonoskopowe przygotowanie jelita, zwykle wykonywane przed biopsjami jelit lub zabiegami resekcji. Dodatkowo, podczas pobierania biopsji, pomocne jest zwrócenie uwagi na orientację tkanki, aby pomóc w identyfikacji określonych cech (np. światła świetlnego vs. błony podśluzowej) przy braku treści jelitowej. Wstępne zatapianie 3% mieszanin agaru i/lub agaru: żelatyna może być przydatne w utrzymaniu polarności tkanek²⁵; Istnieją jednak problemy z odwodnieniem i sekcją agaru, jak opisano w literaturze, a czas przetwarzania może wymagać zmiany.

Kluczowym aspektem dla uzyskania dobrego barwienia FISH jest dostosowanie stężenia formamidu dla określonych sond FISH. Formamid będzie kontrolował rygorystyczność hybrydyzacji sond FISH w stosunku do ich celów. Ważne jest, aby upewnić się, że a) do barwienia danej społeczności wybrano odpowiednie stężenie formamidu oraz b) że odpowiednie stężenie formamidu jest w ogóle możliwe dla używanej kombinacji sond - może to wpłynąć na optymalny wybór sondy w przypadku korzystania z wielu sond. Strony internetowe takie jak mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) mogą pomóc w obliczeniu prawidłowych stężeń formamidu dla danej sondy. W przypadku braku informacji o odpowiednich stężeniach formamidu, protokół ten może być testowany z 0% i 10% formamidem.

Cięcie osadzonych próbek wymaga przycięcia bloku do wystarczającej głębokości, aby uzyskać przekroje luminalne, ponieważ zbyt płytkie przecięcie w bloku spowoduje przekrój poprzeczny kosmków/krypt bez zawartości światła (ryc. 3A). Wybarwić próbki wkrótce po przekrojeniu, aby uzyskać optymalny sygnał FISH, i użyć świeżego DAPI (lub DAPI przechowywanego w temperaturze -20 °C), aby rozwiązać problemy z tłem (rysunek 3C). Barwienie RYB na odcinkach, które mają więcej niż miesiąc, może skutkować gorszym/niespójnym zabarwieniem.

Jeśli tkanka lub szkiełko nakrywkowe nie jest idealnie płaskie w stosunku do szkiełka, próbka może nie być ostra w każdej pozycji na skanie kafelkowym (ryc. 3B), co prowadzi do zmarnowanego wysiłku i potencjalnego fotowybielania. Można to rozwiązać, wykonując mniejsze skany płytek, w których wszystkie pozycje zostały zweryfikowane jako ostre. Cięcie z ostrzami może również prowadzić do oderwania śluzu i zawartości światła, które podczas obrazowania pojawiają się jako duże ciemne obszary. Wreszcie, odparowanie roztworu lub pęcherzyków podczas etapu hybrydyzacji może prowadzić do nierównomiernego zabarwienia sond FISH w tkance.

Kolejnym krytycznym parametrem, który wpływa na skuteczność wiązania sondy FISH, jest konkurencja między różnymi sondami. Przydatnym sprawdzeniem, czy sonda FISH znakuje bakterie, jest zbadanie kolokalizacji sygnału z sondy FISH z DAPI (rysunek 2C,D). W próbkach, które wymagają użycia wielu sond rRNA, dostosowanie parametrów, takich jak temperatura hybrydyzacji, stężenie sondy i formamid, staje się krytyczne, aby zapewnić, że sondy skutecznie wiążą się z właściwymi gatunkami¹⁸.

Uwagi dotyczące obrazowania
Bakterie barwione rybami najlepiej uwidocznić za pomocą mikroskopu konfokalnego i obiektywu o co najmniej 40-krotnym powiększeniu. Podczas gdy 63-krotne powiększenie jest preferowane do obrazowania bakterii na poziomie pojedynczej komórki, 40-krotne powiększenie może być również używane poprzez maksymalizację zoomu cyfrowego lub zastosowanie systemu super rozdzielczości. Systemy wyposażone w funkcje superrozdzielczości mogą również zapewniać subkomórkową rozdzielczość pojedynczych komórek bakteryjnych. Obiektywy o mniejszym powiększeniu mogą być wykorzystane, aby uzyskać ogólne poczucie lokalizacji bakterii i grubości śluzu.

Pozyskiwanie obrazów 16-bitowych zamiast 8-bitowych jest również wysoce zalecane, ponieważ wyższy zakres dynamiki pomoże uchwycić szeroki zakres sygnału DAPI z bardzo jasnych jąder nabłonka i stosunkowo słaby sygnał bakterii luminalnych. Oprócz korzystania z opisanej powyżej konfiguracji obrazowania, ważną kwestią do rozważenia jest wybór fluoroforów. Aby uzyskać najlepszą separację między typami bakterii, należy upewnić się, że użyte fluorofory nie nakładają się na widma wzbudzenia i emisji (chyba że obrazowanie odbywa się w systemie z możliwością liniowego rozmieszania). Dodatkowo, sondy mogą być używane w połączeniu (np. połączenie sondy specyficznej dla rodziny i sondy specyficznej dla rodzaju) w celu identyfikacji dodatkowych członków społeczności. W przypadku korzystania z sond do rozdzielania liniowego lub niezwalidowanych, konieczne jest przetestowanie dokładności i poziomu barwienia FISH na czystych kulturach ^8,14.

Po zebraniu obrazów dostępnych jest wiele narzędzi do analizy ilościowej interfejsu gospodarz-mikrobiota, takich jak BacSpace²⁶, HiPR-FISH⁸ i inne narzędzia do segmentacji²⁷. BacSpace to oprogramowanie firmy MATLAB, które umożliwia segmentację składników tkankowych i świetlnych oraz usuwanie materiału roślinnego z obrazów²⁶. Program zapewnia również analizę grubości śluzu w 2D oraz kwantyfikację rozkładu przestrzennego na podstawie odległości pikseli w różnych kanałach²⁶. I odwrotnie, oprogramowanie do analizy obrazu HiPR-FISH umożliwia segmentację komórek barwionych FISH⁸. Wreszcie, inne narzędzia do segmentacji bakterii, które zostały zoptymalizowane pod kątem eksperymentów in vitro ^{27 ,} mogą być również dostosowane do tego zastosowania.

Konkluzja
Obrazowanie in situ umożliwia analizę ilościową poszczególnych taksonów drobnoustrojów w kontekście innych członków społeczności i różnych mikrośrodowisk tworzonych przez dietę, śluz i krypty nabłonka gospodarza. Interakcja między organizmami dyktuje biologię systemów mikrobiologicznych związanych z gospodarzem i zapewnia niezbędną analizę zmian w tych strukturach podczas perturbacji, które mają wpływ na zdrowie. Warto zauważyć, że możliwość obrazowania mikrobioty in situ za pomocą opisanego powyżej protokołu zapewnia niesamowite okno na biogeografię mikrobioty w odniesieniu do zwierzęcego gospodarza.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Folia
Chloroform	Fisher	C298-500	Toksyczny
słoik z kopliny	Fisher	08-813E
Szkło nakrywkowe, 22 & razy; 22 mm, nie #1	VWR	CA48366-227-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Zawieszony do 5 mg/ml
Puste pudełko(a)			na końcówki do pipetDo topienia parafiny
Etanol, bezwodny, klasy molekularnej	--	--
Sondy FISH Roztwór
hybrydyzacyjny FISH	--	--	20 mM Tris– HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl, 0,01% (w/v) SDS w wodzie wolnej od nukleaz. Opcjonalne dodanie 5– 50% (v/v) formamid
bufor do płukania ryb	--	-- 20	mM Tris– HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl
Znakowana fluorescencyjnie lektyna Ulex Europaeus Agglutynina (UEA-1)	Vector Laboratories	FL-1061 (znakowana fluoresceiną) lub RL-1062-2 (znakowana rodaminą)	UEA-1 znakuje fukozylowane glikany, więc nie jest odpowiednia dla myszy wolnych od zarazków lub dla próbek od gospodarzy z niedoborem fukozylotransferazy 2 (FUT2).
Kleszcze
Formamid	Sigma-Aldrich	F9037
Fumehood
Glacial Acetic Acid	Fisher	A38-212	i łatwopalne
elastyczne szkiełka nakrywkowe z tworzywa sztucznego HybriSlip, 22 x 22 mm i razy 0,25 mm	Sigma Aldrich	GBL722222	do etapów hybrydyzacji FISH, może zastąpić szklane szkiełka nakrywkowe
ImmEdge Hydrofobowa bariera PAP Pen	Pen Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes
Metanol	Fisher	A412	Toksyczny i łatwopalny
mikrotom			do cięcia
Uniwersalne pojemniki do przechowywania próbek, 473 ml	Fisher	14-955-117A	Można zastąpić wybranym pojemnikiem szklanym lub polietylenowym. Metakarna nie jest kompatybilna ze styropianem ani metalem.
Lakier do paznokci	Mikroskopia elektronowa Nauki	72180	Każdy lakier do paznokci powinien działać
Piekarnik			Niezbędny zakres: 45-60 ° C
Parafina: Leica Paraplast	Leica	39601006
PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x roztwór)	Fisher	BP3991	Rozcieńczyć do 1x dla protokołu
Chlorek sodu	Fisher	S271
Dodecylosiarczan sodu (SDS), 20% roztwór, bez RNaz	Invitrogen	AM9820
Tissue-Loc HistoScreen Kasety	Thermo Scientific	CA83009-999
Roztwór chlorowodorku Trizma, 1M Tris-HCl, pH 7,4	Sigma-Aldrich	T2663-1L
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Woda, bez nukleaz	Fisher	BP2484100
Xylenes	Fisher	X3P-1GAL	Toksyczny i łatwopalny