Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Platforma hodowli narządów w przednim segmencie do śledzenia urazów na otwartej kuli i wyników terapeutycznych

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62649

⸱

25 sierpnia 2021

 , 
1Department of Sensory Trauma, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston, 2Engineering Processes and Product Development Group, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston

W tym artykule

Podsumowanie

Urazy oczu na otwartej kuli mogą pozostać nieleczone przez wiele dni w scenariuszach związanych z obszarami wiejskimi lub wojskowymi, powodując ślepotę. Potrzebne są środki terapeutyczne, aby zminimalizować utratę wzroku. W tym miejscu szczegółowo opisujemy model uszkodzenia w kształcie otwartej kuli narządowej. Dzięki temu modelowi można właściwie ocenić potencjalne terapie stabilizujące te urazy.

Streszczenie

Urazy na otwartej kuli mają słabe wyniki widzenia, często skutkując trwałą utratą wzroku. Jest to częściowo spowodowane wydłużonym opóźnieniem między urazem a interwencją medyczną w środowiskach wiejskich i zastosowaniach medycyny wojskowej, gdzie opieka okulistyczna nie jest łatwo dostępna. Nieleczone urazy są podatne na infekcje po utracie wodoszczelnego uszczelnienia oka, a także na utratę żywotności tkanek z powodu niedociśnienia wewnątrzgałkowego. Terapie mające na celu tymczasowe uszczelnienie otwartych urazów gałki ocznej, jeśli są prawidłowo opracowane, mogą być w stanie przywrócić ciśnienie wewnątrzgałkowe i zapobiec infekcji, dopóki nie będzie możliwa właściwa opieka okulistyczna. Aby ułatwić rozwój produktu, szczegółowo opisano tutaj wykorzystanie platformy do hodowli narządów przedniego odcinka w celu śledzenia skuteczności terapeutycznej przez co najmniej 72 godziny po urazie. Tkanka przedniego segmentu świni może być utrzymywana w specjalnie zaprojektowanych szalkach do hodowli narządów i utrzymywana w fizjologicznym ciśnieniu wewnątrzgałkowym. Urazy kłute mogą być tworzone za pomocą systemu pneumatycznego, który jest w stanie generować rozmiary obrażeń o średnicy do 4,5 mm, podobne do rozmiarów urazów związanych z wojskiem. Spadek ciśnienia wewnątrzgałkowego można obserwować przez 72 godziny po urazie, co potwierdza prawidłową indukcję urazu i utratę wodoszczelności oka. Skuteczność terapeutyczną można śledzić, nakładając ją na oko po indukcji urazu, a następnie śledząc ciśnienie wewnątrzgałkowe przez wiele dni. Co więcej, model uszkodzenia przedniego odcinka ma zastosowanie do szeroko stosowanych metod funkcjonalnego i biologicznego śledzenia fizjologii przedniego odcinka, takich jak ocena przezroczystości, mechaniki oka, zdrowia nabłonka rogówki i żywotności tkanek. Ogólnie rzecz biorąc, opisana tutaj metoda jest niezbędnym kolejnym krokiem w kierunku opracowania biomateriałowych środków terapeutycznych do tymczasowego uszczelniania urazów na otwartej kuli, gdy opieka okulistyczna nie jest łatwo dostępna.

Wprowadzenie

Urazy na otwartej kuli (OG) mogą spowodować trwałą utratę wzroku, jeśli nie są leczone lub przynajmniej ustabilizowane po urazie1. Opóźnienia są jednak powszechne na odległych obszarach, gdzie dostęp do interwencji okulistycznej nie jest łatwo dostępny, takich jak obszary wiejskie lub na polu bitwy w scenariuszach wojskowych. Gdy leczenie nie jest łatwo dostępne, obecnym standardem opieki jest ochrona oka za pomocą sztywnej osłony do czasu, gdy możliwa będzie interwencja medyczna. W medycynie wojskowej opóźnienie to wynosi obecnie do 24 godzin, ale przewiduje się, że wzrośnie do 72 godzin w przyszłych operacjach bojowych w środowiskach miejskich, gdzie ewakuacja powietrzna nie jest możliwa2,3,4. Opóźnienia te mogą być jeszcze dłuższe w wiejskich, odległych zastosowaniach cywilnych, gdzie dostęp do interwencji okulistycznej jest ograniczony5,6. Nieleczony uraz OG jest bardzo podatny na infekcję i utratę ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) z powodu naruszenia wodoszczelności oka7,8. Utrata ciśnienia wewnątrzgałkowego może wpływać na żywotność tkanek, co sprawia, że jakakolwiek interwencja medyczna prawdopodobnie nie przywróci wzroku, jeśli opóźnienie między urazem a leczeniem jest zbyt długie9.

Aby umożliwić opracowanie łatwych do zastosowania środków terapeutycznych do czasu skontaktowania się ze specjalistą okulistą, wcześniej opracowano model urazów OG na stole10,11. W tym modelu urazy przy dużej prędkości powstawały w całych oczach świń, podczas gdy IOP było rejestrowane przez przetworniki ciśnienia. Terapie mogą być następnie zastosowane w celu oceny ich zdolności do uszczelnienia miejsca uszkodzenia OG12. Ponieważ jednak model ten wykorzystuje całe oczy świni, może ocenić tylko natychmiastową skuteczność terapeutyczną bez możliwości śledzenia długoterminowej skuteczności w możliwym oknie 72 godzin, w którym terapeuta musi ustabilizować miejsce urazu, dopóki pacjent nie dotrze do specjalistycznej opieki. W rezultacie, opracowano model uszkodzeń OG w hodowli narządów przedniego odcinka (ASOC), który został szczegółowo opisany w tym protokole jako platforma do śledzenia długoterminowej skuteczności terapeutycznej13.

ASOC jest powszechnie stosowaną techniką utrzymywania beznaczyniowej tkanki przedniego odcinka, takiej jak rogówka, przez wiele tygodni po enukleacji14,15,16,17. Przedni odcinek jest utrzymywany w fizjologicznym IOP poprzez perfuzję płynu z fizjologicznymi prędkościami przepływu i zachowanie obszaru odpływu z siatki beleczkowej, tkanki odpowiedzialnej za regulację IOP, podczas konfiguracji ASOC18,19. Platforma ASOC może fizjologicznie utrzymać tkankę, wywołać uraz OG za pomocą urządzenia zasilanego pneumatycznie, zastosować terapię i śledzić stabilizację urazu przez co najmniej 72 godziny po urazie13.

Tutaj protokół dostarcza krok po kroku metodologii korzystania z platformy ASOC. Po pierwsze, szczegółowo opisuje, jak skonfigurować i wyprodukować platformę ASOC. Następnie protokół szczegółowo opisuje, jak aseptycznie wypreparować przedni odcinek i utrzymać siatkę beleczkową, a następnie umieścić tkankę przedniego segmentu w specjalnie zbudowanych naczyniach do hodowli narządów. Następnie szczegółowo opisuje, jak tworzyć urazy na otwartej kuli i stosować terapię natychmiast po urazie. Wreszcie, protokół zawiera przegląd parametrów charakterystyki, które są możliwe do zastosowania za pomocą tej metody, która ocenia właściwości funkcjonalne, mechaniczne i biologiczne oka oraz to, jak dobrze uraz został ustabilizowany. Ogólnie rzecz biorąc, model ten stanowi bardzo potrzebną platformę do przyspieszenia rozwoju produktów do stabilizacji i leczenia urazów na otwartej kuli oraz poprawy rokowania w przypadku złego widzenia po urazie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zanim zastosujesz ten protokół, pamiętaj, że istnieją prawne i etyczne wymagania dotyczące wykorzystywania zwierząt w badaniach i szkoleniach. Jeśli żywe zwierzęta są wykorzystywane jako źródło tkanki oka, przed rozpoczęciem należy uzyskać zgodę lokalnego organu etycznego lub prawnego (IACUC lub komisji etycznej itp.). Jeśli istnieją jakiekolwiek wątpliwości co do uzyskania zgody na wykorzystanie zwierząt, nie kontynuuj. Wcześniej ustaliliśmy i opisaliśmy, że świeże oczy świń uzyskane i wykorzystane w ciągu 24 godzin po sekcji zwłok były najbliższe fizjologii in vivo i dobrze wypadły w tych badaniach (Animal Technologies, Tyler, TX, USA)10,13. W całym tym protokole nie wykorzystano żadnych żywych zwierząt, przy użyciu dostawcy tkanek w celu uzyskania tkanki w ciągu 24 godzin.

UWAGA: Przed przybyciem tkanek przygotuj naczynia do hodowli narządów (Protokół Uzupełniający 1), pierścienie zaciskowe (Protokół Uzupełniający 1), podstawki pod talerze (Protokół Uzupełniający 1), ustawienie zbierania danych przetwornika ciśnienia (Protokół Uzupełniający 2) i platformę do nakłuwania pneumatycznego (Protokół Uzupełniający 3)). Wysterylizuj naczynia, narzędzia i materiały eksploatacyjne oraz przygotuj miejsca pracy. Przydatne jest posiadanie niesterylnego obszaru do przeprowadzenia grubej sekcji oczu, ponieważ zwykle są one wyposażone w dołączoną łączną, dodatkową tkankę oczodołu. Wykonaj te pierwsze kroki na otwartej, czystej powierzchni roboczej, a następnie przenieś oczy aseptycznie do szafki BSC II w celu mikropreparacji (szafka #1). Optymalnie, szafa BSC II wykorzystywana do mikropreparacji jest oddzielona od zespołu naczynia Szafka BSC II (szafa #2) w celu zminimalizowania przepływu powietrza i maksymalizacji przestrzeni roboczej. Ustaw szafę mikropreparacyjną z mikroskopem preparacyjnym i sposobem wizualizacji powierzchni roboczej (kamera lub okulary wystające z szafki).

1. Etapy sterylizacji, materiały eksploatacyjne (więcej szczegółów w Tabeli Materiałów) i konfiguracja

  1. Przygotuj i wysterylizuj gazem następujące elementy (1 zestaw na każde oko): naczynie ASOC, pierścień zaciskowy, dwa złącza płynowe z O-ringami, dwie piasty igieł 18 G, cztery, dwie długości rurki PE-100 (długość odległości powinna być wystarczająco duża, aby rozciągać się od naczynia wewnątrz inkubatora do pompy strzykawkowej i zestawu do zbierania danych przetwornika ciśnienia), dwie piasty igiełkowe 18 G wygięte pod kątem 90°, dwa zawory 3-drogowe.
  2. Przygotuj i sterylizuj w autoklawie następujące zestawy.
    1. Przygotuj i autoklawuj zestaw narzędzi do mikropreparacji, zawierający jedną parę cienkich kleszczy, jedną parę nożyczek Vannas, jedną parę kleszczy o średnich zębach, jedną parę dużych nożyczek, waciki i żyletkę lub skalpel.
    2. Przygotuj i autoklaw zestaw narzędzi montażowych, zawierający jedną parę kleszczyków o średnich zębach, jedną parę nożyczek chirurgicznych i jeden klucz trzpieniowy.
    3. Przygotuj i autoklawuj codzienny zestaw (ilość: jeden na dzień hodowli), zawierający jeden klucz trzpieniowy do dokręcania pierścieni zaciskowych do naczyń każdego dnia w razie potrzeby.
    4. Autoklaw z czterema zlewkami o pojemności 100 ml do dezynfekcji i przechowywania oczu i przednich odcinków.
    5. Autoklawuj przedmioty do nakłuwania.
  3. Zbierz następujące sterylne przedmioty: szalka Petriego (1 szalka na oko), gaza (1-2 / oko), podstawka na naczynia, strzykawki 20 ml (1 / oko), strzykawki 10 ml (1 / oko), nylonowe filtry strzykawkowe (1 / oko).
  4. Przygotuj sterylne podłoża: DMEM z 4% FBS, 1x Glutamax, 1x Gentamycyna, 1x Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (AA; około 30-40 ml kompletnej pożywki/oko).
  5. Przygotuj AA-PBS: PBS z 1x AA (~500 ml).
  6. Przygotuj zestaw narzędzi do preparowania brutto: wyczyść i osusz duże nożyczki chirurgiczne i kleszcze.
  7. Skonfiguruj niesterylne miejsce pracy do sekcji: Zbierz zapasy z zestawu narzędzi do preparacji, wyłuszczonych oczu świń zanurzonych w PBS i na lodzie, obłożenia chirurgicznego, zlewki 100 ml z PBS. Rozłóż serwetę chirurgiczną i przedmioty wymagane do grubego rozwarstwienia.
  8. Skonfiguruj sterylne miejsce do przeprowadzania sekcji: Zbierz materiały z zestawu narzędzi do mikropreparacji, sterylnej gazy, mikroskopu preparacyjnego, roztworu betadyny, sterylnego PBS, sterylnych pożywek, czterech wysterylizowanych zlewek o pojemności 100 ml, sterylnej szalki Petriego. Przeprowadzić aseptycznie do szafy BSC II #1. Ustaw szafkę do wizualizacji oczu na mikroskopie preparacyjnym.
  9. Skonfiguruj obszar roboczy montażu ASOC: Zbierz zestawy sterylizowane gazem (zestaw naczyń i zestaw pokrywek), zestaw narzędzi montażowych, sterylne media, stojaki na naczynia, sterylne szalki Petriego, sterylne strzykawki i filtry strzykawkowe. Przeprowadzić aseptycznie do szafy BSC II #2. Ustaw szafkę do montażu naczynia.
  10. Gdy oczy są ustabilizowane i gotowe do nakłucia (72 godziny po ustawieniu), należy je w asepcie przenieść do szafy BSC II. Skonfiguruj obszar roboczy do indukcji urazów OG: Pneumatyczne urządzenie do indukcji urazów (zespół szczegółowo opisany w Dodatku 3) oraz podnośnik laboratoryjny i imadło śledzące krzyżowo do trzymania czaszy ASOC.

2. Sekcja tkanki

  1. Przygotuj tkankę wieprzową, korzystając z niesterylnego obszaru roboczego do sekcji.
    1. Zaopatrz się w wyłuszczone oczy świni z lokalnej rzeźni, badań na zwierzętach lub od sprzedawcy. Podczas dostawy utrzymuj oczy na lodzie zanurzonym w PBS i użyj natychmiast po otrzymaniu.
    2. Odetnij tkankę zewnątrzoczodołową i przytnij spojówkę, pozostawiając tylko powłokę korowo-twardówkową i nerw wzrokowy. Wykonaj sekcję w niesterylnych warunkach za pomocą dużych nożyczek chirurgicznych i kleszczy w zestawie narzędzi do preparowania.
    3. Umieść oczy z powrotem w świeżym PBS na lodzie, aż wszystkie oczy wymagane do konfiguracji eksperymentalnej zostaną wstępnie wycięte.
    4. Zanurzyć oczy w 10% roztworze betadyny na 2 minuty w zamkniętych pojemnikach i przenieść aseptycznie do szafki BSC II #1. Wszystkie kolejne prace należy wykonywać w sterylnych warunkach, aby zminimalizować zanieczyszczenia podczas konfiguracji.
  2. Sterylnie wypreparuj przednie segmenty.
    1. Po 2 minutach w roztworze betadyny przenieś oczy do trzech seryjnych płukań sterylnego AA-PBS w celu usunięcia nadmiaru roztworu betadyny z powierzchni oka przy zachowaniu sterylności tkanki oka. Po trzech praniach utrzymuj chusteczkę w AA-PBS do dalszego użycia.
    2. Hemisekcję oka za pomocą żyletki/skalpela i zakrzywionych nożyczek. Umieść oko na gazie nasączonej AA-PBS i wykonaj nacięcie sterylną żyletką lub skalpelem w pobliżu równika oka (podział 60/40 z 40 po stronie przedniej). Za pomocą zakrzywionych nożyczek chirurgicznych wykonaj półsekcję oka, aby wyizolować przednie oko (połowę rogówki).
      UWAGA: Nacięcie wokół przedniego odcinka musi być ciągłe, aby zapobiec postrzępionym, szorstkim krawędziom twardówki, które spowodują wycieki płynu po ustawieniu w hodowli narządów.
    3. Użyj mikronożyczek jako łopaty, aby nabrać ciało szkliste z przedniego odcinka. Usuń soczewkę z przedniego odcinka za pomocą mikronożyczek. Pozostaw przednie segmenty w AA-PBS do czasu dalszych etapów sekcji.
      UWAGA: Wszystkie oczy, które zostaną wypreparowane, można przytrzymać na tym etapie i jedno po drugim przeprowadzić przez pozostałą część procesu sekcji.
    4. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego stopniowo przycinaj tęczówkę do korzenia tęczówki, promieniowo, aż do wyświetlenia siatki beleczkowej (TM). TM to pigmentowana tkanka, która składa się z włókien zorientowanych obwodowo wokół powłoki korowo-twardówkowej. Ostrożne nacięcia w tęczówce w kierunku korzenia tęczówki odsłonią głębokość TM pod tkanką.
    5. Wytnij 360° wokół tęczówki na tej samej głębokości, co początkowe nacięcie w tkance, aby odsłonić cały obszar TM. W razie potrzeby oczyść wszelkie pozostałe resztki tęczówki pokrywające TM.
    6. Przyciąć resztki ciała rzęskowego za TM, pozostawiając tylko cienki pasek tkanki z tyłu obszaru TM (około 1 mm).
    7. Umieść wypreparowany przedni segment (AS) w pożywce do czasu dalszego ustawienia w ASOC w szafie BSC II #2.
      UWAGA: W tym momencie można przytrzymać wszystkie oczy przed konfiguracją ASOC, jeśli pojedynczy użytkownik przeprowadza sekcję zwłok i montaż naczynia do hodowli narządów.

3. Ustawianie przednich segmentów w naczyniach do hodowli organów

  1. Umieść pojedynczy AS na szalce Petriego z odwróconym AS (kubek do góry). Za pomocą bawełnianego wacika zwilż podłoże i delikatnie wklep w środek rogówki, aby usunąć pigment. Używając kleszczy do przytrzymania oka i tego samego wacika, przetrzyj bawełniany wacik wokół twardówki, aby usunąć dodatkowy pigment.
  2. Odwróć AS i umieść na wierzchu dolnej części naczynia nad podwyższonym obszarem, centrując rogówkę nad podwyższonym obszarem naczynia. Umieść clamppierścień na nowo umieszczonym AS.
  3. Umieść cztery w odpowiednich otworach, aby utrzymać pierścień na miejscu z AS pod pierścieniem. Delikatnie dokręć ręcznie za pomocą klucza trzpieniowego.
    UWAGA: Etap dokręcania będzie odbywał się codziennie przez cały czas trwania eksperymentu, więc celem początkowego dokręcania jest upewnienie się, że media nie przeciekają, unikając jednocześnie zerwania pierścienia zaciskowego.
  4. Za pomocą sterylnego zestawu szalek Petriego umieść wierzch na naczyniu i odwróć ustawienie. Zamocuj stojak na naczynia. Przymocuj złącza fluidyczne z O-ringami do gwintowanych portów na spodzie naczynia.
  5. Do jednego złącza fluidycznego podłącz piastę igły 18 G wygiętą pod kątem 90°, długość rurki, piastę igły 18 G, nylonowy filtr strzykawkowy, zawór trójdrogowy i strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną mediami.
  6. Do drugiego złącza fluidycznego podłącz piastę igły 18 G wygiętą pod kątem 90°, długość rurki, piastę igły 18 G, zawór trójdrogowy i część cylindryczną sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml (będzie ona działać jako zbiornik do wyłapywania płynu i pęcherzyków z ASOC).
  7. Przy zaworach trójdrogowych otwartych odpowiednio do strzykawek, delikatnie przepchnij media przez system za pomocą portu złącza fluidics określonego w kroku 3.5, aby napompować AS, napełnić media w przewodach, a na końcu w zbiorniku.
    UWAGA: Jeśli nośnik przecieknie do czaszy ASOC, AS nie jest wystarczająco mocno zabezpieczony za pomocą clamppierścienia.
  8. Usuń bąbelki, delikatnie wpychając media do naczynia i odwracając naczynie, aby wypchnąć bąbelki do zbiornika.
  9. Postaw naczynie i stań prosto. Umieść dolną część szalki Petriego pod nóżkami podstawy, uważając, aby nie zaplątać się w rurkę.

4. Rozpoczęcie hodowli narządów przedniego segmentu

  1. ASOC jest teraz gotowy do inkubacji. Umieścić naczynie ASOC w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ). Upewnij się, że wysokość czaszy ASOC w inkubatorze powyżej przetworników ciśnienia jest znana i uwzględniona, aby dokładnie obliczyć IOP (Protokół Uzupełniający 4).
  2. Przewody rurowe należy wyprowadzić przez spód drzwi inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 , tak aby nie przeszkadzały w otwieraniu i zamykaniu drzwi. Podłączyć strzykawkę o pojemności 20 ml do zestawu pompy strzykawkowej o natężeniu 2,5 μl/min.
  3. Umieść przewód rurowy ze zbiornikiem na przyrządzie przetwornika ciśnienia. Podłącz boczny zawór 3-drogowy do konfiguracji przetwornika ciśnienia podczas przepływu PBS przez przewód, aby uniknąć przedostawania się pęcherzyków powietrza do przewodów.
    UWAGA: Opróżnij PBS ze zbiorników po skonfigurowaniu systemu, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo zanieczyszczenia zbiornika rozwojem drobnoustrojów na czas hodowli narządów.
  4. Rozpocznij zbieranie danych IOP, najpierw upewniając się, że karta microSD jest dostępna do zapisywania plików danych. Następnie włącz konfigurację przetwornika ciśnienia, aby rozpocząć zbieranie danych.
    UWAGA: Szczegóły dotyczące konfiguracji urządzenia do zbierania danych przetwornika ciśnienia znajdują się w protokole uzupełniającym 2.

5. Codzienna konserwacja ASOC

  1. Po upływie 24 godzin od zrównoważenia przez ASOC wyjąć szalki z inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i umieścić je w komorze BSC II.
    UWAGA: Podczas zbierania danych o ciśnieniu, te okresy czasu wyglądają jak skoki, gdy ASOC są wyjmowane z inkubatora (zmiana wysokości) i regulowane w szafie.
  2. Sprawdź, czy pod każdym szalkiem na płytce Petriego nie ma wycieków. Jeśli występuje, sprawdź, czy pod naczyniem znajdują się szczelne połączenia płynów i w razie potrzeby ponownie dokręć. Sprawdź, czy nie ma wycieków w górnej części naczynia za pomocą sterylnego klucza trzpieniowego, aby dokręcić w clamppierścieniu.
    UWAGA: Tkanka twardówki AS ulegnie ściśnięciu i zmniejszeniu grubości o 24 godziny, a pierścień zaciskowy będzie musiał zostać dokręcony.
  3. Dobrze odessać pożywkę z naczynia.
    UWAGA: Siatka beleczkowa filtruje płyn z mediów pompowanych do ASOC. W związku z tym pożywka będzie obecna w czaszy ASOC wzdłuż krawędzi.
  4. Powtórz kroki 3.7 i 3.8, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza.
  5. Napełnij strzykawki na pompach strzykawkowych, upewnij się, że pompy strzykawkowe działają i potwierdź ustawienie zaworów perfuzji do ASOC. Umieścić szalkę ASOC z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    UWAGA: Optymalnie te czynności powinny być wykonywane codziennie. Jednak użycie początkowej objętości pożywki wynoszącej 20 ml, objętości studzienki czaszy ASOC i wydajności pompy 2,5 μl/min powinno wystarczyć, aby system działał bez zakłóceń przez kilka dni.

6. Indukcja obrażeń OG za pomocą pneumatycznego urządzenia do nakłuwania

UWAGA: Budowa pneumatycznego urządzenia do nakłuwania jest szczegółowo opisana w Protokole Uzupełniającym 3. Urazy OG są wywoływane po ustabilizowaniu się ciśnienia wewnątrzgałkowego, co zwykle występuje po 3 dniach w hodowli. Dopuszczalne wartości IOP to 5-20 mmHg w oparciu o fizjologiczne IOP, które można określić, oceniając pliki danych IOP lub ustawiając wskaźniki LED w systemie pomiaru ciśnienia, jak opisano w Protokole Uzupełniającym 2.

  1. Przygotuj szafkę BSC II do indukcji obrażeń OG, jak opisano w kroku 1.10. Podłącz platformę do nakłuwania do przewodu sprężonego powietrza. Przymocuj sterylny przedmiot do nakłuwania do uchwytu.
    UWAGA: Do zasilania urządzenia można użyć sprężarki powietrza, ale sprężone powietrze w zbiorniku lub wbudowane przewody laboratoryjne mogą wystarczyć, jeśli ciśnienie jest większe niż 50 psi.
  2. Ustaw regulator ciśnienia na platformie do nakłuwania na 50 psi, aby uzyskać odpowiednią siłę nakłucia na przedmioty o średnicy do 4.5 mm. Umieść imadło śledzące krzyżowo na podnośniku laboratoryjnym przed platformą do nakłuwania, aby przytrzymać szalkę ASOC podczas indukcji urazu.
  3. Wyjmij zestaw ASOC z inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i umieść w imadle poprzecznym prostopadłym do platformy do nakłuwania (Rysunek 2) po zdjęciu pokrywy i odłożeniu jej na bok. Utrzymuj przedni odcinek w stanie perfekcji, ale zamknij port zaworu 3-drogowego do przetwornika ciśnienia, aby zapobiec uszkodzeniu przetwornika przez nadmierne ciśnienie.
  4. Wysuń ramię tłoka na maksymalną odległość i ustaw wierzchołek rogówki w odległości nie większej niż 1 mm od nakłuwanego przedmiotu. Wycofaj ramię tłoka i przysuń przedni segment na 1 cm bliżej nakłuwanego przedmiotu.
    UWAGA: Ta odległość została zoptymalizowana pod kątem wysokowydajnej indukcji obrażeń bez uderzania w szalkę ASOC.
  5. Uruchom urządzenie do nakłuwania, włączając je i otwierając zawór elektromagnetyczny za pomocą drugiego przełącznika na urządzeniu. Aby schować urządzenie, ponownie naciśnij drugi przełącznik, aby wyjąć przyrząd do nakłuwania z oka. Sprawdź prawidłową indukcję obrażeń poprzez oględziny i wyciek mediów z miejsca urazu.
  6. Wyjmij miskę ASOC z imadła; umieść pokrywkę z powrotem na zespole naczynia i otwórz przewód płynowy do przetwornika ciśnienia. Umieścić ASOC z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    UWAGA: W tym momencie można zastosować terapię do ZZSK, aby ocenić jej skuteczność w uszczelnianiu urazów OG.

7. Usuwanie ASOC z kultury

UWAGA: W zależności od analizy punktu końcowego (zobacz Reprezentatywne wyniki dla możliwych metod końcowych), AS musi pozostać w naczyniu ASOC napompowany, podczas gdy inne metody wymagają wyizolowania tkanki AS z komory hodowlanej. Poniższa metodologia opisuje, w jaki sposób usunąć AS z narządów i usunąć resztę zestawu.

  1. Wyjąć szalki ASOC z inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zamknąć zawór 3-drogowy do strzykawki i zbiornika i odłączyć przewód od systemu. Wyrzuć strzykawkę, zbiornik i filtr. Umieść zawory 3-drogowe, rurki i piasty igieł w osobnym pojemniku do mycia i sterylizacji.
  2. Odłącz piasty igieł od przyłączy płynów na spodzie naczynia. Odkręć złącza hydrauliczne i o-ringi. Umieść wszystkie przedmioty w pojemniku do mycia i sterylizacji.
  3. Wykręć cztery z clamppierścień za pomocą klucza trzpieniowego. Ostrożnie zdejmij clamppierścień.
  4. Za pomocą kleszczy usuń AS z naczynia i, w zależności od analizy punktu końcowego i obrazu, umieść w utrwalaczu lub odpowiednich odpadach stanowiących zagrożenie biologiczne.

8. Analiza danych IOP

  1. Podłącz kartę microSD do komputera, aby usunąć .txt plik zawierający dane z najnowszego przebiegu eksperymentalnego.
    UWAGA: Plik jest wymieniony w kodzie sterującym mikrokontrolerem i powinien być aktualizowany dla każdego eksperymentu (patrz Protokół Uzupełniający 2).
  2. Zaimportuj dane do arkusza kalkulacyjnego.
  3. Uporządkuj dane w 12 kolumnach: Czas (w min) i sygnał mV dla każdego z 11 kanałów przetwornika ciśnienia. Pierwsze dziesięć kanałów odpowiada dziesięciu eksperymentalnym konfiguracjom ASOC. Końcowy sygnał przetwornika jest przeznaczony dla czujnika otwartego na powietrze jako kanał sterujący, aby potwierdzić, że sygnał mV nie zmienił się z powodu zmian sygnału wejściowego. Wykres kanału kontrolnego w funkcji czasu, aby potwierdzić, że sygnał mV był spójny przez cały czas.
  4. Przelicz sygnały mV dla dziesięciu kanałów na mmHg za pomocą równań przecięcia nachylenia wygenerowanych na podstawie początkowej kalibracji każdego czujnika (patrz Protokół uzupełniający 4).
  5. Wykreśl czas (przelicz na dni, aby uprościć interpretację danych) w stosunku do każdego z dziesięciu kanałów, aby określić, jak IOP zmieniało się w przebiegu eksperymentu.
  6. Określ średnie wartości IOP w kluczowych punktach danych, aby łatwiej porównać wartości między nimi i jak są one zmieniane przed i po indukcji urazu OG. Średnia 2-3 godzina danych dla każdego 24-godzinnego interwału w celu określenia IOP każdego dnia ASOC.
    UWAGA: Reprezentatywne wyniki IOP są pokazane w Rysunek 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obrazy uzyskane za pomocą optycznej koherentnej tomografii (OCT) dla oczu z indukowanym urazem OG przedstawiono, aby zilustrować wygląd prawidłowo przeprowadzonej indukcji urazu. Rycina 3 przedstawia obrazy tkanki AS w grupie kontrolnej oraz w grupie z urazem OG bezpośrednio po urazie i 72 h później. Przedstawiono dwa widoki: obrazy przekroju poprzecznego przez miejsce urazu oraz rzuty maksymalnej intensywności (MIPs) z góry, aby zwizualizować powierzchnię obrazu. W oczach kontrolnych nie st...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieją krytyczne kroki związane z platformą urazów ASOC OG, na które należy zwrócić uwagę, aby zwiększyć prawdopodobieństwo sukcesu podczas korzystania z tej metodologii. Po pierwsze, podczas rozwarstwienia przedniego odcinka zachowanie siatki beleczkowej jest niezbędne, ale trudne do prawidłowego wykonania. Jeśli TM zostanie zakłócona, oko nie utrzyma ciśnienia fizjologicznego i nie spełni kryteriów kwalifikacyjnych do użytku eksperymentalnego. Zaleca się, aby najpierw przećwiczyć proces preparacji w normalnych warunk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów. Poglądy wyrażone w tym artykule są poglądami autora (autorów) i nie odzwierciedlają oficjalnej polityki ani stanowiska Departamentu Medycznego Armii Stanów Zjednoczonych, Departamentu Armii, Departamentu Obrony ani rządu USA.

Podziękowania

Ten materiał jest oparty na pracy wspieranej przez Departament Obrony Stanów Zjednoczonych poprzez umowę międzyagencyjną (#19-1006-IM) z programem pozyskiwania Tymczasowych Napraw Rogówki (United States Army Medical Materiel Development Agency).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10-32 Wtyczka prosta z poliwęglanu, łącznik rurowy z gwintem zewnętrznymMcMaster-Carr51525K431
10-32 Śruba z gniazdowym, ½ "McMaster-Carr92196A269
Strzykawka 10 mlBD302995
Strzykawka 20 mlBD302830
Anti-AntiGibco15240-096
Końcówka kulowa L kluczMcMaster-Carr5020A25
BetadineFisher ScientificNC1696484
BD  Intramedic  PE 160 RurkaFisher Scientific14-170-12E
Waciki bawełnianePuritan25-8061WC
DMEM mediaATCC30-2002
FBSATCC30-2020
Szczypce drobnoziarnisteWorld Precision Instruments15914
GauzeCovidien8044
GentamycynaGibco15710-064
GlutamaxGibco35050-061
O-ring silikonowy wysokotemperaturowy, szerokość 2 mm, średnica wewnętrzna4 mm McMaster-Carr5233T47
Duże kleszczeWorld Precision Instruments500365
Duże nożyczki chirurgiczneWorld Precision Instruments503261
Kleszczyki o średnich zębachWorld Precision Instrumenty501217
Gwóźdź (przedmiot do nakłucia)McMaster-Carr97808A503
Nylonowe filtry strzykawkoweFisher09-719C
PBSGibco10010-023
Szalka Petriego (100 mm)FisherFB0875713
Poliwęglan, trójdrożny, kran z gwintem męskim  Luer  zamekFisherNC9593742
ŻyletkaFisher12-640
Stal nierdzewna 18 G  90 stopni  igła dozująca kątowaMcMaster-Carr75165A81
Stal nierdzewna 18 G prosta i frac12; '’ igła dozującaMcMaster-Carr75165A675
Sterylne zlewki 100 ml z pokrywkamiVWR15704-092
Vannas  nożyczkiŚwiat Instrumenty PrecyzyjneWP5070

Bibliografia

  1. Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005. American Journal of Preventive Medicine. 38, 1 Suppl 78-85 (2010).
  2. Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. M. Multi-Battle domain-perspective in military medical simulation trauma training. Journal of Trauma & Treatment. 06 (04), (2017).
  3. Riesberg, J., Powell, D., Loos, P. The loss of the golden hour. Special Warfare. , 49-51 (2017).
  4. Townsend, S., Lasher, W. The US Army in Multi-Domain Operations 2028. (525-3-1), US Army. (2018).
  5. Blanch, R. J., Bishop, J., Javidi, H., Murray, P. I. Effect of time to primary repair on final visual outcome after open globe injury. The British Journal of Ophthalmology. 103 (10), 1491-1494 (2019).
  6. Lesniak, S. P., et al. Characteristics and outcomes of delayed open globe repair. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (14), 4954(2012).
  7. Loporchio, D., Mukkamala, L., Gorukanti, K., Zarbin, M., Langer, P., Bhagat, N. Intraocular foreign bodies: A review. Survey of Ophthalmology. 61 (5), 582-596 (2016).
  8. Jonas, J. B., Budde, W. M. Early versus late removal of retained intraocular foreign bodies. Retina. 19 (3), Philadelphia, Pa. 193-197 (1999).
  9. Watson, P. G., Jovanovik-Pandova, L. Prolonged ocular hypotension: would ciliary tissue transplantation help. Eye. 23 (10), 1916-1925 (2009).
  10. Snider, E. J., et al. Development and characterization of a benchtop corneal puncture injury model. Scientific Reports. 10 (1), 4218(2020).
  11. Snider, E. J., et al. An open-globe porcine injury platform for assessing therapeutics and characterizing biological effects. Current Protocols in Toxicology. 86 (1), 98(2020).
  12. Snider, E. J., Cornell, L. E., Gross, B., Zamora, D. O., Boice, E. N. Assessment of commercial off-the-shelf tissue adhesives for sealing military relevant corneal perforation injuries. Military Medicine. , (2021).
  13. Snider, E. J., Boice, E. N., Butler, J. J., Gross, B., Zamora, D. O. Characterization of an anterior segment organ culture model for open globe injuries. Scientific Reports. 11 (1), 8546(2021).
  14. Erickson-Lamy, K., Rohen, J. W., Grant, W. M. Outflow facility studies in the perfused human ocular anterior segment. Experimental Eye Research. 52 (6), 723-731 (1991).
  15. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. The effect of organ culture on human trabecular meshwork. Experimental Eye Research. 49 (1), 113-127 (1989).
  16. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  17. Snider, E. J., et al. Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles. Scientific Reports. 8 (1), 12251(2018).
  18. Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure. Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).
  19. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous humor dynamics: A review. The Open Ophthalmology Journal. 4, 52-59 (2010).
  20. Snider, E. J., et al. Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (3), 18(2021).
  21. Ren, H., Wilson, G. Apoptosis in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (6), 1017-1025 (1996).
  22. Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4°C. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2827-2832 (1999).
  23. Crespo-Moral, M., García-Posadas, L., López-García, A., Diebold, Y. Histological and immunohistochemical characterization of the porcine ocular surface. PLOS One. 15 (1), e0227732(2020).
  24. Wilson, S. E., Medeiros, C. S., Santhiago, M. R. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after prk and other corneal injuries. Journal of Refractive Surgery. 34 (1), Thorofare, NJ. 59-64 (2018).
  25. Auw-Haedrich, C., et al. Immunohistochemical expression of epithelial cell markers in corneas with congenital aniridia and ocular cicatrizing pemphigoid. Acta Ophthalmologica. 89 (1), 47-53 (2011).
  26. Lyngholm, M., et al. Immunohistochemical markers for corneal stem cells in the early developing human eye. Experimental Eye Research. 87 (2), 115-121 (2008).
  27. Bandamwar, K. L., Papas, E. B., Garrett, Q. Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells. Contact Lens & Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).
  28. Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (14), 6496(2011).
  29. Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. R. Measurement of outflow facility using iPerfusion. PLoS One. 11 (3), (2016).
  30. Weichel, E. D., Colyer, M. H., Ludlow, S. E., Bower, K. S., Eiseman, A. S. Combat ocular trauma visual outcomes during operations iraqi and enduring freedom. Ophthalmology. 115 (12), 2235-2245 (2008).
  31. Colyer, M. H., et al. Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom. Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).
  32. Geggel, H. S., Maza, C. E. Anterior stromal puncture with the Nd:YAG laser. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 31 (8), 1555-1559 (1990).
  33. Matthews, A., et al. Indentation and needle insertion properties of the human eye. Eye. 28 (7), 880-887 (2014).
  34. Rau, A., et al. The mechanics of corneal deformation and rupture for penetrating injury in the human eye. Injury. 49 (2), 230-235 (2018).
  35. Agrawal, R., Ho, S. W., Teoh, S. Pre-operative variables affecting final vision outcome with a critical review of ocular trauma classification for posterior open globe (zone III) injury. Indian Journal of Ophthalmology. 61 (10), 541(2013).
  36. Knyazer, B., et al. Prognostic factors in posterior open globe injuries (zone-III injuries). Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (9), 836-841 (2008).
  37. Tan, J., et al. C3 Transferase-Expressing scAAV2 Transduces Ocular Anterior Segment Tissues and Lowers Intraocular Pressure in Mouse and Monkey. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 17, 143-155 (2020).
  38. Bhattacharya, S. K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGFβ2 Treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).
  39. Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes. Scientific Reports. 10 (1), 2905(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Otwarty uraz ga ki ocznejmonitorowanie skuteczno ci terapeutycznejci nienie wewn trzga kowestan nab onka rog wkiporcine model okaoptyczna koherentna tomografiaywotno tkanekindukcja urazu k utegobiomateria y terapeutyczne
Platforma hodowli narządów w przednim segmencie do śledzenia urazów na otwartej kuli i wyników terapeutycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.