Skuteczna metoda ukierunkowanej indukcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Summary

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w funkcjonalne komórki podobne do hepatocytów (HLC) poprzez ciągłe uzupełnianie Activiny A i CHIR99021 podczas różnicowania hESC do ostatecznej endodermy (DE).

Abstract

Potencjalne funkcje komórek podobnych do hepatocytów (HLC) pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) są bardzo obiecujące dla zastosowań w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków. Przedstawiono tutaj wydajną i powtarzalną metodę różnicowania hESC na funkcjonalne HLC. Ustanowienie linii endodermy jest kluczowym krokiem w różnicowaniu się do HLC. Naszą metodą regulujemy kluczowe szlaki sygnałowe poprzez ciągłe uzupełnianie aktywiny A i CHIR99021 podczas różnicowania hESC w ostateczną endodermę (DE), a następnie generowanie komórek progenitorowych wątroby, a na końcu HLC o typowej morfologii hepatocytów w metodzie etapowej z całkowicie zdefiniowanymi odczynnikami. Otrzymane za pomocą tej metody HLC pochodzące z hESC wyrażają markery specyficzne dla danego etapu (w tym albuminę, receptor jądrowy HNF4α i polipeptyd kotransportujący taurocholan sodu (NTCP)) i wykazują szczególne cechy związane z dojrzałymi i funkcjonalnymi hepatocytami (w tym barwienie zielenią indocyjaninową, magazynowanie glikogenu, barwienie hematoksyliną-eozyną i aktywność CYP3) i mogą stanowić platformę do rozwoju zastosowań opartych na HLC w badaniu chorób wątroby.

Introduction

Wątroba jest organem wysoce metabolicznym, który pełni kilka ról, w tym odtlenianie, magazynowanie glikogenu oraz wydzielanie i syntezę białek¹. Różne patogeny, leki i dziedziczność mogą powodować patologiczne zmiany w wątrobie i wpływać na jej funkcje^2,3. Hepatocyty, jako główna jednostka funkcjonalna wątroby, odgrywają ważną rolę w sztucznych systemach wspomagania wątroby i eliminacji toksyczności leków. Jednak zasoby pierwotnych ludzkich hepatocytów są ograniczone w terapii komórkowej, a także w badaniach nad chorobami wątroby. Dlatego opracowanie nowych źródeł funkcjonalnych ludzkich hepatocytów jest ważnym kierunkiem badań w dziedzinie medycyny regeneracyjnej. Od 1998 roku, kiedy to powstały hESCs⁴, hESC są szeroko rozważane przez badaczy ze względu na ich doskonały potencjał różnicowania (mogą różnicować się w różne tkanki w odpowiednim środowisku) i wysoki stopień samoodnawialności, a tym samym stanowią idealne komórki źródłowe dla biosztucznych wątrob, przeszczepów hepatocytów, a nawet inżynierii tkankowej wątroby⁵.

Obecnie efektywność różnicowania wątroby można znacznie zwiększyć poprzez wzbogacenie endodermy⁶. W różnicowaniu linii komórek macierzystych w endodermę, poziomy szlaków sygnalizacyjnych transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) i szlaków sygnałowych WNT są kluczowymi czynnikami na etapie tworzenia endodermy. Aktywacja wysokiego poziomu sygnalizacji TGF-β i WNT może sprzyjać rozwojowi endoderm^7,8. Aktywina A to cytokina należąca do nadrodziny TGF-β. Dlatego aktywina A jest szeroko stosowana w indukcji endodermy ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i hESCs^9,10. GSK3 jest kinazą białkową serynowo-treoninową. Naukowcy odkryli, że CHIR99021, specyficzny inhibitor GSK3β, może stymulować typowe sygnały WNT i może promować różnicowanie komórek macierzystych w określonych warunkach, co sugeruje, że CHIR99021 ma potencjał do indukowania różnicowania komórek macierzystych w endodermie ^11,12,13.

Tutaj przedstawiamy efektywną i powtarzalną metodę skutecznego indukowania różnicowania hESC w funkcjonalne HLC. Sekwencyjne dodawanie aktywiny A i CHIR99021 wytworzyło około 89,7±0,8% komórek SOX17 (marker DE). Po dalszym dojrzewaniu in vitro, komórki te wykazywały ekspresję markerów specyficznych dla wątroby i wywierały morfologię podobną do hepatocytów (w oparciu o barwienie hematoksyliną i eozyną (H & E)) oraz funkcje, takie jak wychwyt zieleni indocyjaninowej (ICG), magazynowanie glikogenu i aktywność CYP3. Wyniki pokazują, że za pomocą tej metody hESC można z powodzeniem różnicować w dojrzałe funkcjonalne HLC i mogą one stanowić podstawę do badań związanych z chorobami wątroby i badań przesiewowych leków in vitro.

Protocol

1. Utrzymanie komórek macierzystych

UWAGA: Opisany poniżej protokół konserwacji komórek dotyczy linii komórkowej hES03 utrzymywanej w przylegającej monowarstwie. W przypadku wszystkich poniższych protokołów zawartych w tym manuskrypcie, komórki powinny być traktowane pod komorą bezpieczeństwa biologicznego.

1. Przygotować 1x pożywkę do hodowli komórek macierzystych mTesR, rozcieńczając 5x pożywkę uzupełniającą do pożywki podstawowej mTesR.
2. Przygotować 30 pożywek Matrigel z kwalifikacją hESC, rozcieńczając 5 ml Matrigelu z kwalifikacją hESC z 5 ml DMEM/F12 na lodzie. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Przygotować 1x pożywkę Matrigel z kwalifikacją hESC, rozcieńczając 33,3 μl 30x Matrigel z kwalifikacją hESC z 1 ml DMEM/F12.
4. Sterylne 6-dołkowe płytki poddane kulturze tkankowej pokryć wcześniej 1 ml 1x Matrigel z kwalifikacją hESC w każdym dołku i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) na co najmniej 30 minut przed użyciem.
5. Rozmrażać kriokonserwowane hESC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3 minuty bez wstrząsania. Następnie natychmiast przenieść komórki przez pipetowanie do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml wstępnie podgrzanej pożywki mTesR o temperaturze 37 °C, delikatnie pipetować w górę i w dół 2 razy.
6. Odwirować hESC przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
7. Odessać supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 1 ml pożywki mTesR.
8. Odessać pożywkę DMEM/F12 z płytki i zasiać komórki w dołku na płytce 6-dołkowej o gęstości 1 x 10⁵ komórek w 2 ml mTesR.
9. Inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ i utrzymywać komórki, codziennie zastępując je podgrzaną pożywką mTesR. Przejdź komórki przy około 70-80% zbiegu lub gdy kolonie komórkowe zaczną się stykać.

2. Przejście i różnicowanie komórek macierzystych

1. W przypadku komórek pasażujących należy zassać pożywkę i inkubować komórki w ilości 1 ml roztworu enzymatycznego na studzienkę (np. Accutase przez 5 minut w temperaturze 37 °C). Następnie przenieść komórki przez pipetowanie do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml DMEM/F12 podgrzanej do temperatury 37 °C.
2. Odwirować komórki przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
3. Odessać pożywkę i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki mTesR.
4. Przygotować płytki 24-dołkowe, pokrywając je wcześniej 250 μl 1x pożywki Matrigel z kwalifikacją hESC. Nasiona hESC, jak opisano powyżej, o gęstości 1 - 1,5 x 10⁵ komórek na studzienkę w 500 μl pożywki mTesR.
5. Pozostawić komórki do inkubacji przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO_{2 .}

3. Formacja DE

1. Przygotować roztwory podstawowe 100 μg/ml aktywiny A z DPBS zawierającym 0,2% BSA i 3 mM CHIR99021 z DMSO.
2. Przygotuj podstawową pożywkę różnicującą Etap I, uzupełniając pożywkę RPMI o 1x B27.
3. Dodać aktywinę A do końcowego stężenia 100 ng/ml i CHIR99021 do końcowego stężenia 3 μM w odpowiedniej objętości podgrzanej pożywki podstawowej do różnicowania etapu I.
4. Odessać pożywkę mTesR z komórek i zastąpić pożywką różnicującą etapu I zawierającą dodane czynniki różnicujące (np. 0,5 ml na dołek 24-dołkowej płytki).
5. Pozostawić komórki do inkubacji przez 3 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO_{2 ,} zastępując codziennie pożywki etapu I świeżo dodanymi czynnikami różnicującymi (dni 0-2).
   UWAGA: Po 3 dniach różnicowania zróżnicowane komórki powinny wyrażać markery komórek DE, takie jak FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 i FOXA1 (minimum 80% SOX17 potrzebne do kontynuacji).

4. Różnicowanie komórek progenitorowych wątroby

1. Przygotować podstawowe podłoża różnicujące etapu II, rozpuszczając zastępczą surowicę nokautującą (KOSR) do końcowego stężenia 20% w Knock Out DMEM.
2. Przygotować pożywkę różnicującą etapu II zawierającą 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1x roztwór aminokwasów endogennych (NEAA), 100 μM 2-merkaptoetanolu i 1x penicylinę/streptomycynę (P/S) do odpowiedniej objętości KOSR/knockout DMEM.
3. W 3 dniu różnicowania odessać pożywkę i zastąpić pożywką etapu II (np. 0,5 ml na dołek z płytki 24-dołkowej). Następnie inkubować przez 24 godziny.
4. W 4 dniu różnicowania odessać pożywkę i zastąpić pożywką etapu II (np. 1 ml na dołek z płytki 24-dołkowej).
5. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień (wymień pożywkę w 6 dniu).
   UWAGA: Po 8 dniach różnicowania zróżnicowane komórki powinny wykazywać ekspresję odpowiednich markerów komórek progenitorowych wątroby, takich jak HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (minimum 80% HNF4α potrzebne do postępowania).

5. Różnicowanie hepatocytów

1. Przygotować 10 μg/ml czynnika wzrostu hepatocytów (HGF), 20 μg/ml roztworów podstawowych onkostatyny (OSM) z DBPS (zawierającymi 0,2% BSA) i przefiltrować z membraną filtracyjną 0,22 μm.
2. Przygotować pożywkę podstawową do różnicowania etapu III (pożywka HepatoZYME-SFM (HZM) uzupełniona 10 μM hydrokortyzonem-21-hemibursztynianem i 1x P/S).
3. Dodać HGF do końcowego stężenia 10 ng/ml i OSM do końcowego stężenia 20 ng/ml do odpowiedniej objętości podgrzanego podłoża różnicującego etapu III.
4. W 8 dniu różnicowania odessać pożywkę etapu II z komórek i zastąpić pożywką etapu III (np. 1 ml na dołek płytki 24-dołkowej).
5. Pozostawić komórki do inkubacji przez 10 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO_{2 ,} zmieniając pożywkę etapu III co drugi dzień ze świeżo dodanymi czynnikami różnicującymi (dni 8-18).
   UWAGA: Po 18 dniach różnicowania zróżnicowane komórki powinny wykazywać ekspresję charakterystycznych markerów hepatocytów, takich jak AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Odsetek komórek albuminowo-dodatnich zwykle wynosi ponad 90%.

6. Izolacja RNA, synteza cDNA i analiza RT-qPCR

1. Odessać pożywkę z komórek i dodać odpowiednią ilość odczynnika RNAiso Plus (np. 0,3 ml na dołek płytki 24-dołkowej). Zebrać supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml i odstawić w temperaturze pokojowej na 5 minut.
2. Dodać 60 μl odczynnika chloroformowego i pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut. Następnie odwirować przy 12 000 x g przez 15 minut.
3. Zebrać 125 μl supernatantu i przenieść go do innej probówki wirówkowej. Dodać 160 μl izopropanolu, dobrze wymieszać i odstawić w temperaturze pokojowej na 10 minut.
4. Wirować przy 12 000 x g przez 10 min.
5. Usunąć sklarowany osad, dodać 75% etanolu do wytrąconego roztworu i odwirować przy 7 500 x g przez 5 minut.
6. Po wysuszeniu w temperaturze pokojowej dodaj 40 μl wody uzdatnionej DEPC do rozpuszczenia. W przypadku qPCR należy dokonać odwrotnej transkrypcji 2 μg całkowitego RNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji zgodnie z protokołem producenta.
7. Wykonaj RT-qPCR przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta.
8. Normalizuj ekspresję genów w stosunku do nieindukowanych komórek macierzystych i określ zmienność fałdowania po normalizacji do GAPDH.

7. Immunofluorescencyjna walidacja różnicowania

1. Przygotuj 1x bufor płuczący PBST, dodając 0,1% Tween-20 do PBS.
2. Odessać pożywkę z przylegających komórek i krótko przemyć PBS w temperaturze RT na wytrząsarce.
3. Odessać PBS i inkubować komórki z 500 μl lodowatego metanolu na dołek 24-dołkowej płytki w celu utrwalenia komórek w temperaturze -20 °C przez noc.
4. Usunąć metanol i przemyć komórki 3 razy PBS na wytrząsarce przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej.
5. Blokuj komórki z 500 μL 5% BSA przygotowane w PBS przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
6. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w stosunku 1: 200 w tym samym roztworze, który jest używany do blokowania.
7. Inkubować utrwalone komórki w 300 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
8. Po całonocnej inkubacji przemywać komórki 3 razy PBST przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
9. Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała w roztworze blokującym w stosunku 1:1000.
10. Inkubować w 300 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych, chronionego przed światłem, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
11. Odessać roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemywać komórki 3 razy PBST przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
12. Inkubować komórki z 300 μl 1 μg/ml DAPI przez 3-5 minut, a następnie dwukrotnie przemyć PBST.
13. Po odessaniu PBST należy dodać odpowiednią ilość PBS do wykonania zdjęć pod mikroskopem fluorescencyjnym.

8. Analiza Western blot

1. Przygotuj 1x TBST bufor do płukania, dodając 0,1% Tween-20 do soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS).
2. Przygotuj bufor do elektroforezy SDS-PAGE i zachodni bufor transferowy przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta.
3. Rozpuść całkowite białko komórkowe (40 μg) na 10% żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanu sodu i uruchom w buforze do elektroforezy SDS-PAGE przy stałym prądzie 15 mA przez około 2 godziny.
4. Przenieść żel na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) przy stałym prądzie 300 mA przez 2 godziny w niskiej temperaturze.
   UWAGA: Czas pracy i czas transferu mogą się różnić w zależności od używanego sprzętu oraz rodzaju i procentowej zawartości żelu.
5. Zablokować membranę 3% BSA przygotowanym w TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
6. Inkubować w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczenie 1:1000) przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
7. Po całonocnej inkubacji przemyć błonę bibułkową 3 razy TBST przez 15 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
8. Inkubować w drugorzędowym roztworze przeciwciał (rozcieńczenie 1:2000) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
9. Odrzucić roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemyć membranę 3 razy TBST, za każdym razem przez 15 minut, w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
10. Wizualizacja pasm immunoreaktywnych za pomocą odczynnika chemiluminescencyjnego, a następnie autoradiografii. Użyj β-aktyny jako kontroli załadunku.

9. Wychwyt zieleni indocyjaninowej

1. Przygotować 200 mg/ml roztworu podstawowego zieleni indocyjaninowej w DMSO.
2. Przygotować roztwór roboczy, uzupełniając pożywkę różnicującą etapu III roztworem zieleni indocyjaninowej do końcowego stężenia 1 mg/ml.
3. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 1-2 godziny.
4. Odessać pożywkę i przemyć komórki 3 razy PBS.
5. Zdjęcie pod mikroskopem.

10. Barwienie kwasem okresowym Schiffa (PAS) i barwienie Hematoksyliną-Eozyną (H&E)

1. Odessać pożywkę z przylegających komórek i krótko przemyć dwukrotnie PBS.
2. W celu utrwalenia komórek należy odessać PBS i inkubować komórki z lodowatym metanolem w temperaturze -20 °C przez noc.
3. Wizualizacja magazynowania glikogenu przez barwienie PAS i obserwowanie komórek dwujądrowych przez barwienie H i E za pomocą zestawu zgodnego z instrukcjami producenta.
4. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

11. Test aktywności CYP

1. Zmierzyć aktywność CYP450 za pomocą dostępnych na rynku testów komórkowych (testy P450-Glo) zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Do testowania użyj trzech niezależnych powtórzeń. Dane są reprezentowane jako średnia ± SD.

Results

Schemat ideowy indukcji HLC z hESC oraz reprezentatywne obrazy jasnego pola każdego etapu różnicowania są pokazane w Rysunek 1. W etapie I aktywinę A i CHIR99021 dodawano na 3 dni, aby skłonić komórki macierzyste do wytworzenia komórek endodermy. W stadium II komórki endodermy różnicowały się w komórki progenitorowe wątroby po leczeniu pożywką różnicującą przez 5 dni. W stadium III wczesne hepatocyty dojrzały i zróżnicowały się w HLC po 10 dniach w HGF i OSM (Figura 1A). ...

Discussion

W tym miejscu przedstawiamy metodę krokową, która indukuje HLC z hESC w trzech etapach. W pierwszym etapie aktywinę A i CHIR99021 wykorzystano do różnicowania hESC w DE. W drugim etapie wykorzystano KO-DMEM i DMSO do różnicowania DE w komórki progenitorowe wątroby. W trzecim etapie zastosowano HZM plus HGF, OSM i sól sodową 21-hemibursztynianu hydrokortyzonu w celu dalszego różnicowania komórek progenitorowych wątroby w HLC.

Podczas korzystania z protokołu należy wziąć pod uwagę następujące kr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-merkaptoetanol	Sigma	M7522	Do różnicowania progenitorów wątroby
488 znakowana koza przeciwko myszy IgG	ZSGB-BIO	ZF-0512	Dla IF, drugie przeciwciało
488 znakowane koza przeciwko królikowi IgG	ZSGB-BIO	ZF-0516	Dla IF, drugie przeciwciało
Accutase	Stem Cell Technologies	7920	Do pasażu komórkowego
Aktywina A	peproTech	120-14E	Do ostatecznego tworzenia endodermy
Anty albumina (ALB)	Sigma-Aldrich	A6684	Dla IF i WB, pierwszorzędowe przeciwciało
Anti - Human Oct4	Abcam	Ab19587	Dla IF, pierwszorzędowe przeciwciało
Anty-&alfa;-Fetoprotein (AFP)	Sigma-Aldrich	A8452	Dla IF i WB, pierwszorzędowe przeciwciało
Anti-SOX17	Abcam	ab224637	Dla IF, pierwszorzędowe przeciwciało
Anty-hepatocyty Czynnik jądrowy 4 alfa (HNF4α)	Sigma-Aldrich	SAB1412164	Dla IF, pierwszorzędowe przeciwciało
B-27 Suplement	Gibco	17504-044	Do definitywnego tworzenia endodermy
BSA	Beyotime	ST023-200g	Do blokowania komórek
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046	Do definitywnego tworzenia endodermy
DAPI	Beyotime	C1006	Do barwienia jądrowego
DEPC-water	Beyotime	R0021	Do rozpuszczania RNA
DM3189	MCE	HY-12071	Do ostatecznego tworzenia endodermy
DMEM/F12	Gibco	11320-033	Do hodowli komórkowych
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879	Do różnicowania progenitorów wątroby
DPBS	Gibco	14190-144	Do hodowli komórkowych
GlutaMAX	Gibco	35050-061	Do różnicowania progenitorów wątroby
H& Zestaw do barwienia E	Beyotime	C0105S	dla H& Barwienie E Czynnik
wzrostu hepatocytów (HGF)	peproTech	100-39	Do różnicowania hepatocytów
HepatoZYME-SFM (HZM)	Gibco	17705-021	Do różnicowania hepatocytów
Hydrokortyzon-21-hemibursztynian	Sigma-Aldrich	H4881	Do różnicowania hepatocytów
Indocyanine	Sangon Biotech	A606326	Do barwienia indocyjaniny
Knock Out DMEM	Gibco	10829-018	Do różnicowania progenitorów wątroby
Knock Out SR Multi-Species	Gibco	A31815-02	Do różnicowania progenitorów wątroby
Matrigel z kwalifikacją hESC	Corning	354277	Do hodowli komórkowych
MEM NeAA	Gibco	11140-050	Do różnicowania progenitorów wątroby
mTesR 5X Suplement	Stem Cell Technologies	85852	Do hodowli komórkowych
mTesR Basal Medium	Stem Cell Technologies	85851	Do hodowli komórkowych
Oncostatin (OSM)	peproTech	300-10	Do różnicowania hepatocytów
P450 - CYP3A4 (Lucyferin - PFBE)	Promega	V8901	Do aktywności CYP450
Zestaw do barwienia PAS	Solarbio	G1281	Do barwienia PAS
Pióro/paciorkowiec	Gibco	15140-122	Do różnicowania komórek
Peroksydaza sprzężona z kozą anty-mysią IgG	ZSGB-BIO	ZB-2305	Dla WB, drugie przeciwciało
Bufor rozcieńczający przeciwciała pierwotne dla  Western Blot	Beyotime	P0256	Do pierwotnego rozcieńczania przeciwciał
Zestaw ReverTraAce qPCR RT	TOYOBO	FSQ-101	Do syntezy cDNA
RNAiso Plus	TaKaRa	9109	Do izolacji RNA
RPMI 1640	Gibco	11875093	Do ostatecznego tworzenia endodermy
Mleko odtłuszczone	Sangon Biotech A600669		Do przygotowania drugiego przeciwciała
SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742	Do analizy RT-PCR
Torin2	MCE	HY-13002	Do ostatecznego tworzenia endodermy
Tween	Sigma-Aldrich	WXBB7485V	Do przygotowania buforu myjącego