Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Biodrukowanie 3D mysich astrocytów korowych do inżynierii tkanki neuronalnej

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62691

⸱

16 lipca 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy metodę biodruku 3D mysich astrocytów korowych do biofabrykacji tkanek podobnych do neuronów w celu zbadania funkcjonalności astrocytów w ośrodkowym układzie nerwowym i mechanizmów obejmujących komórki glejowe w chorobach neurologicznych i leczeniu.

Streszczenie

Astrocyty to komórki glejowe pełniące istotną rolę w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), w tym wsparcie i funkcjonalność neuronów. Komórki te reagują również na urazy nerwowe i działają w celu ochrony tkanki przed zdarzeniami zwyrodnieniowymi. Badania in vitro nad funkcjonalnością astrocytów są ważne dla wyjaśnienia mechanizmów związanych z takimi zdarzeniami i przyczyniają się do opracowania terapii leczenia zaburzeń neurologicznych. Protokół ten opisuje metodę biofabrykacji struktury podobnej do tkanki neuronalnej bogatej w astrocyty poprzez biodrukowanie biotuszu 3D z astrocytami. W tej pracy wykorzystano biodrukarkę 3D opartą na wytłaczaniu, a astrocyty wyekstrahowano z kory mózgowej szczeniąt myszy C57Bl / 6. Biotusz przygotowano przez zmieszanie astrocytów korowych z pasażu 3 do roztworu biomateriału składającego się z żelatyny, żelatyny-metakryloylu (GelMA) i fibrynogenu, uzupełnionego lamininą, który zapewniał optymalne warunki biodrukowania. Warunki biodruku 3D zminimalizowały stres komórkowy, przyczyniając się do wysokiej żywotności astrocytów podczas procesu, w którym 74,08% ± 1,33% komórek było zdolnych do życia zaraz po biodrukowaniu. Po 1 tygodniu inkubacji żywotność astrocytów znacznie wzrosła do 83,54% ± 3,00%, co wskazuje, że konstrukt 3D stanowi odpowiednie mikrośrodowisko do wzrostu komórek. Skład biomateriału umożliwił przyłączanie się komórek i stymulował zachowanie astrocytarne, przy czym komórki wykazywały ekspresję specyficznego markera astrocytów – kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) i posiadały typową morfologię astrocytów. Ten powtarzalny protokół zapewnia cenną metodę biofabrykacji 3D tkanki neuronalnej bogatej w astrocyty, która przypomina natywne mikrośrodowisko komórek, przydatną dla naukowców, którzy chcą zrozumieć funkcjonalność astrocytów i ich związek z mechanizmami zaangażowanymi w choroby neurologiczne.

Wprowadzenie

Astrocyty są najliczniejszym typem komórek w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i odgrywają kluczową rolę w homeostazie mózgu. Oprócz trwałego wsparcia neuronalnego, astrocyty są odpowiedzialne za modulowanie wychwytu neuroprzekaźników, utrzymywanie integralności bariery krew-mózg i regulację synaptogenezy neuronalnej1,2. Astrocyty odgrywają również istotną rolę w zapaleniu OUN, reagując na urazy mózgu w procesie, który prowadzi do astrocytowej reaktywności lub reaktywnej astroglejozy3,4, tworząc bliznę glejową, która uniemożliwia wystawienie zdrowych tkanek na czynniki zwyrodnieniowe5. To zdarzenie powoduje zmiany w ekspresji, morfologii i funkcji genów astrocytów6,7. Dlatego badania nad funkcjonalnością astrocytów są pomocne w opracowywaniu terapii leczenia zaburzeń neurologicznych.

Modele in vitro są kluczowe dla badania mechanizmów związanych z urazami neurologicznymi, i chociaż udało się przeprowadzić udaną izolację i dwuwymiarową (2D) hodowlę astrocytów korowych 8, ten model nie zapewnia realistycznego środowiska, które naśladuje natywne zachowanie komórek i odtwarza złożoność mózgu9. W warunkach 2D słabe wsparcie mechaniczne i biochemiczne, niskie interakcje komórka-komórka i komórka-matryca oraz spłaszczenie komórek prowadzące do braku polaryzacji podstawno-wierzchołkowej, wpływają na dynamikę sygnalizacji komórkowej i wyniki eksperymentalne, prowadząc do zmiany morfologii komórki i ekspresji genów, co upośledza odpowiedź na leczenie10. Dlatego tak ważne jest opracowanie alternatyw, które zapewnią bardziej realistyczne środowisko neuronowe, mając na celu przełożenie wyników na praktykę kliniczną.

Trójwymiarowa (3D) hodowla komórek reprezentuje bardziej zaawansowany model, który podsumowuje z większą wiernością cech narządów i tkanek, w tym CNS11. Jeśli chodzi o hodowlę glejową, modele 3D przyczyniają się do utrzymania morfologii astrocytów, polaryzacji podstawno-wierzchołkowej komórki i sygnalizacji komórkowej12,13. Technologia biodruku 3D pojawiła się jako potężne narzędzie do biofabrykacji żywych tkanek 3D w kontrolowany sposób poprzez wykorzystanie komórek i biomateriałów do odtworzenia struktury i właściwości tkanek natywnych. Zastosowanie tej technologii doprowadziło do znacznej poprawy przewidywania wyników i przyczyniło się do rozwoju medycyny regeneracyjnej stosowanej w CNS14,15,16.

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje izolację i hodowlę astrocytów korowych. Protokół wyszczególnia również powtarzalną metodę biodruku astrocytów osadzonych w żelatynie/żelatynie metakryloylu (GelMA)/fibrynogenu, uzupełnionej lamininą. W tej pracy wykorzystano biodrukarkę opartą na ekstruzji do wydrukowania składu biomateriału zawierającego astrocyty korowe o gęstości 1 x 106 komórek/ml. Naprężenia ścinające bioprinting zostały zminimalizowane poprzez kontrolowanie prędkości drukowania, a astrocyty wykazały wysoką żywotność po procesie. Biodrukowane konstrukty hodowano przez 1 tydzień, a astrocyty były w stanie rozprzestrzeniać się, przyłączać i przetrwać w hydrożelu, utrzymując morfologię astrocytów i wyrażając specyficzny marker glejowego fibrylarnego białka kwaśnego (GFAP)4.

Ta procedura jest kompatybilna z napędzanymi tłokiem biodrukarkami opartymi na wytłaczaniu i może być używana do biodruku astrocytów pochodzących z różnych źródeł. Zaproponowany tutaj biodrukowany model 3D nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań inżynierii neuronowej, takich jak badania mechanizmów związanych z funkcjonowaniem astrocytów w zdrowych tkankach oraz zrozumienie postępu patologii neurologicznych i rozwój leczenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt były zgodne z międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt w badaniach (http://www.iclas.org) i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki w Badaniach Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019/ 9292090519).

1. Sekcja mózgu myszy

  1. Przenieś 10 ml zimnego buforowanego roztworu soli Hanks (HBSS) do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm, a 1 ml do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml. Przygotować jedną mikroprobówkę na zwierzę.
    UWAGA: Zarówno naczynie hodowlane, jak i mikroprobówkę muszą być trzymane na lodzie.
  2. Przygotuj pożywkę do hodowli astrocytów przy użyciu DMEM F12 + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2% glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny (P / S). Wysterylizuj pożywkę, filtrując za pomocą filtra 0,2 μm.
  3. Eutanazja szczeniąt myszy C57Bl/6 (dzień po urodzeniu 1) poprzez ścięcie głowy za pomocą ostrych nożyczek operacyjnych. Za pomocą kleszczy pociągnij skórę i odsłoń czaszkę. Upewnij się, że zarówno nożyczki, jak i kleszcze są wysterylizowane 70% etanolem.
  4. Wytnij czaszkę od otworu wielkiego do czubka głowy wzdłuż płaszczyzny strzałkowej za pomocą ostrych nożyczek z zakrzywioną końcówką.
    UWAGA: Upewnij się, że tkanka mózgu nie jest uszkodzona.
  5. Za pomocą szpatułki uprzednio wysterylizowanej etanolem 70% wyjmij mózg z jamy czaszki i umieść go w naczyniu hodowlanym zawierającym 10 ml zimnego HBSS.
  6. Umieść naczynie hodowlane zawierające mózg pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą dwóch kleszczyków z końcówkami usuń opony mózgowe z mózgu (Ryc. 1).
  7. Oddziel korę mózgową od reszty mózgu, delikatnie odsuwając ją od linii środkowej mózgu za pomocą szpatułki.
  8. Zebrać obie korowe części ciała i natychmiast przenieść je do tej samej mikroprobówki zawierającej 1 ml zimnego HBSS.

2. Izolacja i hodowla astrocytów

  1. Pod wpływem przepływu laminarnego pokrój tkankę korową na małe kawałki za pomocą zakrzywionych mikronożyczek i umyj je 1 ml HBSS, pipetując w górę iw dół 3x. Poczekaj, aż tkanka się uspokoi. Usuń HBSS i dodaj nowy HBSS, powtarzając proces jeszcze dwa razy.
  2. Usunąć HBSS i inkubować tkankę z 1 ml 0,05% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 5 min.
    UWAGA: W tym momencie wystarczające jest tylko trawienie trypsyną.
  3. Mechanicznie rozdzielić tkankę, delikatnie pipetując w górę i w dół 15x.
    UWAGA: Całkowitą dysocjację tkanki obserwuje się poprzez wzrost zmętnienia zawiesiny i brak dużych fragmentów tkanki w zawiesinie.
  4. Przenieś roztwór do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, zneutralizuj aktywność trypsyny, dodając równą objętość FBS i przefiltruj roztwór w filtrze siatkowym o wielkości 0,4 μm w celu usunięcia niezdysocjowanych fragmentów.
  5. Przemyć filtr 1 ml pożywki dla astrocytów, zebrać zawiesinę komórkową, która przeszła przez sitko, i odwirować ją przez 5 minut w temperaturze 200 x g i temperaturze 25 °C. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i zawiesić osad w 1 ml pożywki hodowlanej astrocytów.
  6. Przenieść zawiesinę komórkową do kolby hodowlanej T25, uzupełnić objętość pożywki do 3,5 ml i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Upewnij się, że po 24 godzinach komórki przylegają. Następnie wymień pożywkę i zmieniaj ją co 3 dni.
  8. Po 7 dniach usuń mikroglej i oligodendrocyty z hodowli, myjąc komórki 2 ml 1x PBS.
  9. Zastąp roztwór PBS pożywką hodowlaną astrocytów i pozostaw kolbę hodowlaną w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min na noc.
    UWAGA: Astrocyty tworzą zlewającą się monowarstwę w ciągu około 10-12 dni hodowli.

3. Synteza żelatyny metakryloylu (GelMA)

  1. Odważyć 10 g żelatyny otrzymanej ze skóry świni i rozpuścić w 100 ml PBS, pozostawiając roztwór mieszany na płycie grzewczej z prędkością 240 obr./min i w temperaturze 50 °C aż do całkowitego rozpuszczenia.
  2. Pod maską dodać 2 ml bezwodnika metakrylowego (MA) w celu uzyskania niskiego stopnia funkcjonalizacji i pozostawić emulsję żelatynową mieszającą się z prędkością 240 obr./min i 50 °C przez 2 godziny
    UWAGA: Zwrot wskazujący rodzaj zagrożenia: H302 + H332 (działa szkodliwie po połknięciu lub wdychaniu ), H311 (działa toksycznie w kontakcie ze skórą), 314 (powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu), 315 (działa drażniąco na skórę), H317 (może powodować reakcję alergiczną skóry), H318 (powoduje poważne uszkodzenie oczu), 331 (działa toksycznie w następstwie wdychania), H332 (działa szkodliwie w następstwie wdychania), H335 (może powodować podrażnienie dróg oddechowych). Wskazówki dotyczące obchodzenia się z produktem: P261 (unikać wdychania pyłu/dymu/gazu/mgły/par/rozpylonej cieczy), P305 + P351 + P338 + P310 (W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjmij soczewki kontaktowe, jeśli są i są łatwe do usunięcia. Kontynuuj płukanie. Natychmiast skontaktuj się z OŚRODKIEM ZATRUĆ/lekarzem), P301 + P312 + P330 (W PRZYPADKU POŁKNIĘCIA: Zadzwoń do OŚRODKA ZATRUĆ/lekarza, jeśli źle się czujesz. Wypłukać usta).
    UWAGA: Dodawaj MA bardzo powoli, kropla po kropli.
  3. Rozcieńczyć roztwór żelatyny-MA w 100 ml podgrzanego PBS (50 °C) do uzyskania 200 ml końcowej objętości i pozostawić roztwór mieszać przy 240 obr./min i 50 °C przez 10 minut.
  4. Odetnij ~20 cm membrany dializacyjnej (odcięcie molekularne 12-14 kDa) i namocz ją w wodzie dejonizowanej, aż stanie się miękka.
    UWAGA: Napełnij membrany wodą dejonizowaną, aby upewnić się, że nie ma ani defektów.
  5. Za pomocą lejka przenieść roztwór żelatyny-MA do membran.
    UWAGA: Zamknij obie strony, pozostawiając dodatkową przestrzeń w środku, aby umożliwić mieszanie.
  6. Umieścić membrany zawierające roztwór żelatyny-MA w pojemniku z 2 litrami wody destylowanej do dializy, pozostawiając je mieszane w temperaturze 40 °C przez 5 dni (500 obr./min).
    UWAGA: Przykryj pojemnik, aby uniknąć parowania wody.
  7. Zmieniaj wodę destylowaną dwa razy dziennie. Za każdym razem odwróć membrany do góry nogami w celu homogenizacji.
  8. Piątego dnia zmieszać 200 ml podgrzanej ultraczystej wody (40 °C) z dializowaną żelatyną-MA i mieszać przez 15 minut w temperaturze 40 °C.
  9. Przenieść roztwór żelatyny-MA do 50 ml stożkowych probówek o objętości do 25 ml i pozostawić probówki w temperaturze -80 °C na 2 dni.
    UWAGA: Przechowuj probówki poziomo, aby ułatwić liofilizację.
  10. Zamrożone roztwory należy liofilizować przez 3-5 dni i przechowywać liofilizowany GelMA w chronionym miejscu przed wilgocią.

4. Przygotowanie biotuszu

UWAGA: Aby uzyskać 1 ml biotuszu, zaleca się wyprodukowanie co najmniej 3 ml roztworu biomateriału, ponieważ mogą wystąpić straty podczas filtracji.

  1. Przygotowanie roztworu fibrynogenu
    1. Przygotować roztwór soli fizjologicznej (NaCl 0,9%) w wodzie dejonizowanej i rozpuścić 10 mg fibrynogenu z osocza bydlęcego w 1 ml roztworu soli fizjologicznej, aby uzyskać stężenie 10 mg/ml.
      UWAGA: Ponieważ fibrynogen adsorbuje się ze szkłem, nie należy używać szklanych kolb do przygotowania roztworu fibrynogenu.
    2. Pozostawić roztwór pod mieszaniem w temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozpuszczenia fibrynogenu.
      UWAGA: Do rozpuszczenia fibrynogenu należy użyć systemu obrotowego umieszczonego w piekarniku w temperaturze 37 °C. Odpowiednie jest również mieszanie magnetyczne (180 obr./min) fibrynogenu na płycie grzejnej w temperaturze 37 °C. W tych warunkach 10 mg/ml fibrynogenu rozpuszcza się po około 40 minutach.
  2. Przygotowanie roztworu żelatyny/GelMA
    1. Odważyć 0,12 g żelatyny i dodać ją do 1,9 ml podgrzanego PBS (40 °C) do uzyskania końcowego stężenia 4% (w/v) żelatyny. Wir ułatwiający rozpuszczanie.
    2. Przechowywać emulsję w temperaturze 40 °C aż do całkowitego rozpuszczenia.
    3. Odważyć 0,06 g liofilizowanego GelMA i przenieść do roztworu żelatyny do uzyskania końcowego stężenia 2% (w/v) GelMA. Wir ułatwiający rozpuszczanie.
    4. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 40 °C aż do całkowitego rozpuszczenia.
  3. Przygotowanie biotuszu z żelatyny/GelMA/fibrynogenu z ładunkiem astrocytów
    1. Odpipetować 0,9 ml roztworu fibrynogenu o stężeniu 10 mg/ml i przenieść do roztworu żelatyny/GelMA, aby uzyskać końcowe stężenie 3 mg/ml fibrynogenu.
    2. Odważyć 0,015 g fotoinicjatora (PI) i przenieść do roztworu żelatyny/GelMA/fibrynogenu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5% (w/v) PI. Wymieszaj roztwór, obracając probówkę w górę i w dół i utrzymuj ją w temperaturze 40 °C, chroniąc przed światłem, aby uniknąć degradacji PI.
      UWAGA: Biotusz należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny.
    3. Pod przepływem laminarnym przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Roztwór biomateriału powinien mieć temperaturę 37-40 °C, aby umożliwić filtrację.
    4. Przenieść 980 μl roztworu biomateriału do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    5. Rozcieńczyć lamininę w roztworze soli fizjologicznej, aby otrzymać roztwór podstawowy 100 μg/ml.
    6. Pobrać pipetą 20 μl lamininy i przenieść do probówki zawierającej biotusz, aby uzyskać końcowe stężenie 2 μg/ml lamininy.
    7. Mieszaj delikatnie, pipetując w górę i w dół, unikając pęcherzyków. Jeśli pozostaną jakiekolwiek pęcherzyki, odwirować stożkową probówkę o masie 200 x g przez 2 minuty. Przechowywać biotusz w temperaturze 37 °C, aż zostanie zmieszany z komórkami.
    8. Trypsynizuj pierwszorzędowe astrocyty 0,05% trypsyny przez 5 min.
      UWAGA: Użyj astrocytów z przejść od 1 do 3.
    9. Zneutralizuj aktywność trypsyny za pomocą FBS w stosunku 1:1 i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować przy 200 x g przez 5 minut.
    10. Policz komórki i przenieś 1 x 106 komórek do innej stożkowej probówki. Odwirować przy 200 x g przez 5 minut.
    11. Usunąć supernatant pozostawiając niewielką objętość (~200 μl) w celu zawieszenia osadu komórkowego, delikatnie stukając w spód stożkowej rurki.
    12. Przenieść 1 ml roztworu żelatyny/GelMA/fibrynogenu do probówki zawierającej komórki i delikatnie pipetować w górę i w dół do homogenizacji, uzyskując końcowe stężenie 1 x 106 komórek/ml.

5. Przygotowanie rozwiązania sieciującego

  1. Rekonstytucja trombiny
    1. Przygotować podstawowy roztwór trombiny 100 j./ml w sterylnej wodzie dejonizowanej z 0,1% (w/v) albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Zapas w mikroprobówkach w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Ponieważ trombina adsorbuje się na szkle, nie należy używać szklanych kolb do przygotowania roztworu podstawowego lub przechowywania podwielokrotności.
  2. Przygotowanie roztworu trombiny-CaCl2
    1. Pobrać pipetą 100 μl roztworu podstawowego trombiny i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 8,9 ml sterylnej wody dejonizowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 1 j./ml trombiny.
    2. Przygotować 10% (w/v) roztwór CaCl2 w wodzie dejonizowanej i wysterylizować za pomocą filtra 0,2 μm.
    3. Przenieść 1,1 ml 10% roztworu CaCl2 do stożkowej probówki zawierającej trombinę, w celu uzyskania końcowego stosunku 1:9 (CaCl2 do trombiny).
      UWAGA: Przygotuj roztwór sieciujący w woluminie, który ma być użyty w eksperymencie, unikając przechowywania.

6. Biodrukowanie biotuszu z ładunkiem astrocytów za pomocą biodrukarki opartej na ekstruzji

  1. Projektowanie tkanki nerwowej
    1. Korzystając z kodu G: skonstruuj siatkę o wymiarach 6 x 6 mm (kształt kwadratowy) z odległością 1 mm między każdą linią drukowaną na osi X i Y oraz 6 warstwami na osi Z (0,2 mm między każdą linią); ustaw wyciągnięcie (E) na 0,01 mm, zwiększając 0,001 mm na każdej nowej warstwie osi Z; i ustaw prędkość drukowania (F) na 400 mm/min (informacje dodatkowe).
  2. Konfiguracja biodrukarki
    1. Wystaw maszynę na działanie promieni UV przez 15 minut, a następnie przetrzyj ją etanolem 70%.
    2. Włącz biodrukarkę za pomocą wyłącznika zasilania. Podłącz urządzenie do komputera za pomocą USB. Otwórz oprogramowanie sterujące, aby podłączyć je do biodrukarki i załaduj projekt pliku.
  3. Przygotowanie strzykawki do biodruku
    1. Przenieś biotusz z żelatyną/GelMA/fibrynogenem z astrocytami do plastikowej strzykawki o pojemności 5 ml za pomocą pipety 1,000 μl.
      UWAGA: Przenoś powoli, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
    2. Podłączyć sterylną igłę 22 G do strzykawki.
      UWAGA: Pozostawić strzykawkę w temperaturze 4°C na 2 minuty.
    3. Podłącz strzykawkę do głowicy drukującej biodrukarki i ręcznie przepłucz biotusz, aby usunąć pozostałe pęcherzyki.
  4. Bioprinting
    UWAGA: Bioprinting został wykonany na zewnątrz okapu laminarnego.
    1. Umieść naczynie hodowlane o średnicy 35 mm na stole do biodrukarki i umieść igłę w odległości 0.1 mm od powierzchni szalki hodowlanej, aby umożliwić ruch igły.
      UWAGA: Do każdego biodruku należy użyć jednej płytki hodowlanej o średnicy 35 mm.
    2. Naciśnij przycisk Drukuj.
    3. Po zakończeniu bioprintingu upewnij się, że strzykawka odsuwa się od naczynia. Następnie zamknij naczynie hodowlane i przygotuj się do procesu sieciowania.
      UWAGA: Biodrukowanie jednego konstruktu trwa około 1 min i 10 s.
  5. Sieciowanie biodrukowanego konstruktu i kultury
    1. Umieść naczynie hodowlane w świetle UV o mocy 2 mW/cm2 przez 2 x 60 s (góra idół) w celu sieciowania GelMA.
    2. Pod przepływem laminarnym przenieś biodrukowany konstrukt na 24-dołkową płytkę za pomocą sterylnej szpatułki.
    3. Dodać 500 μl roztworu trombiny/CaCl2 i pozostawić na 30 minut, aby umożliwić sieciowanie fibryny.
    4. Usunąć roztwór sieciujący i przemyć konstrukt 2 ml PBS 1x. Następnie zastąpić PBS 1 ml pożywki hodowlanej astrocytów i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co 3 dni.

7. Ocena żywotności astrocytów

  1. Żywotność astrocytów z nadrukiem biologicznym
    1. Przenieś biodrukowany konstrukt do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm za pomocą szpatułki.
    2. Umyj konstrukcję 1 ml 1x PBS.
    3. Umieść 100 μl żywego/martwego odczynnika na konstrukcie i utrzymuj go w temperaturze 37 °C przez 30 minut, chroniąc go przed światłem.
    4. Usuń żywy/martwy odczynnik i przemyj konstrukt 1 ml 1x PBS.
    5. Przenieś próbkę do naczynia konfokalnego za pomocą szpatułki i obserwuj komórki w konstrukcji pod mikroskopem konfokalnym przy użyciu wzbudzenia 488 i 570 nm w celu uzyskania obrazów.
      UWAGA: Użyj powiększenia 10x, aby uzyskać ogólną wizualizację komórek w konstrukcji.
    6. Upewnij się, że próbka jest płaska. W razie potrzeby nałożyć szkiełko nakrywkowe na próbkę, aby zwiększyć płaskość.
      UWAGA: Podczas obrazowania upewnij się, że naczynie konfokalne jest dobrze uszczelnione, aby zapobiec wysychaniu próbki.
    7. Oblicz liczbę żywych (zielonych) i martwych (czerwonych) za pomocą oprogramowania obliczeniowego.
  2. Żywotność hodowli astrocytów 2D
    1. Zasiać 0,5 x 106 astrocytów (pasaż 1-3) w naczyniu konfokalnym o średnicy 35 mm, dodać pożywkę dla astrocytów i inkubować je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Gdy komórki zlewają się, usuń pożywkę hodowlaną i przemyj 1 ml 1x PBS.
    3. Umieść 200 μl żywego/martwego odczynnika i trzymaj naczynie w temperaturze 37 °C przez 30 minut, chroniąc je przed światłem.
    4. Usuń odczynnik Live/Dead i umyj komórki 1 ml 1x PBS.
    5. Zabierz szalkę do mikroskopu konfokalnego sprzężonego z kamerą cyfrową i użyj wzbudzenia 488 i 570 nm do uzyskania obrazu.
    6. Oblicz liczbę żywych (zielonych) i martwych (czerwonych) za pomocą oprogramowania obliczeniowego.

8. Barwienie immunologiczne astrocytów

  1. Barwienie kwaśnych białek fibrylarnych glejowych (GFAP) biodrukowanych astrocytów 3D
    UWAGA: Aby zbadać obecność innych markerów komórkowych, należy odpowiednio zmienić przeciwciało pierwszorzędowe.
    1. Usuń pożywkę ze studzienki i umyj konstrukt 1 ml 3x PBS.
    2. Dodać 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS do studzienki aż do całkowitego przykrycia konstrukcji i pozostawić na 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    3. Usuń PFA i umyj konstrukcję 1 ml 3x PBS.
      UWAGA: Procedura ta może zostać wstrzymana na kilka miesięcy, jeśli jest przechowywana w PBS w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że płytka studzienki jest uszczelniona, aby uniknąć parowania PBS.
    4. Badać próbkę glicyną o stężeniu 0,1 mol/l przez 5 minut.
    5. Myć 1 ml 1x PBS przez 5 min.
    6. Próbkę należy przepuszczać za pomocą PBS zawierającego 0,1% Triton X-100 i 10% FBS przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C w mieszaniu orbitalnym.
    7. Inkubować konstrukt z anty-GFAP kurczaka (rozcieńczenie przeciwciała pierwotnego 1:500) w temperaturze 4 °C przez noc.
    8. Odessać przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć próbkę 1 ml PBS przez 5 minut, 3 razy.
      UWAGA: Przeciwciało pierwszorzędowe może być wielokrotnie używane, jeśli jest przechowywane w temperaturze 4 °C.
    9. Inkubować próbkę z antykurczakiem sprzężonym z fluorem Alexa 488 (rozcieńczenie przeciwciała drugorzędowego 1:500) i 1 μg/ml DAPI przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C pod mieszaniem orbitalnym.
      UWAGA: Utrzymuj sample przed światłem.
    10. Przemyć próbkę 1 ml PBS przez 5 minut, 3 razy.
    11. Przenieść konstrukcję do czaszy konfokalnej 35 mm.
      UWAGA: Upewnij się, że naczynie jest dobrze uszczelnione, aby zapobiec wysychaniu sample .
  2. Barwienie kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) w hodowli astrocytów 2D
    1. Zasiać 0,5 x 106 astrocytów (pasaż 1-3) w naczyniu konfokalnym o średnicy 35 mm, dodać pożywkę dla astrocytów i inkubować je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Gdy komórki zlewają się, usuń pożywkę hodowlaną i umyj je 1 ml 1x PBS.
    3. Powtórz kroki 8.1.2-8.1.10.
  3. Barwienie cytoszkieletu astrocytów
    1. Powtórz kroki 8.1.1-8.1.6.
    2. Dodać 200 μl z 50 μg/ml sprzężonego fluorescencyjnie roztworu falloidyny w PBS i 1 μg/ml DAPI na konstrukt.
    3. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C w warunkach mieszania orbitalnego, chroniąc próbkę przed światłem.
    4. Przemyć próbkę 1 ml PBS przez 5 minut 3 razy i przenieść konstrukt do naczynia konfokalnego za pomocą szpatułki.
      UWAGA: Upewnij się, że naczynie jest dobrze uszczelnione, aby zapobiec wysychaniu sample .

9. Obrazowanie konfokalne

  1. Zabierz szalki do mikroskopu konfokalnego sprzężonego z kamerą cyfrową do obrazowania (wzbudzenie 359, 488 i 570 nm).
  2. Użyj powiększenia 10x dla ogólnej wizualizacji i 40 lub 63x dla powiększonych obrazów komórek.
    UWAGA: Upewnij się, że próbka jest płaska. W razie potrzeby umieść szkiełko nakrywkowe na próbce, aby zwiększyć płaskość.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem niniejszej pracy było opracowanie tkanki przypominającej tkankę nerwową z wykorzystaniem technologii biodruku 3D do warstwowego nanoszenia bioatramentu z żelatyny/GelMA/fibrynogenu zawierającego pierwotne astrocyty. Astrocyty zostały wyekstrahowane i wyizolowane z kory mózgu młodych myszy (Ryc. 1), a następnie dodane do składu biomateriału, co umożliwiło biofabrykację żywej konstrukcji 3D.

Projekt wspomagany komputerowo (CAD) został opracowany przy użyciu G-...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technologia biodruku 3D pojawiła się jako alternatywa biofabrykacji, która umożliwia inżynierię wyrafinowanych konstruktów, które strukturalnie i fizjologicznie przypominają rodzime tkanki22, w tym mózg23. Biofabrykacja tkanek podobnych do neuronów pozwala na natywne modelowanie mikrośrodowiska in vitro , które jest ważnym narzędziem do zrozumienia mechanizmów komórkowych i molekularnych związanych z rozwojem i leczeniem wielu chorób wpływających na OUN

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundację Badawczą São Paulo (FAPESP), granty o numerach 2018/23039-3 i 2018/12605-8; Krajowa Rada Rozwoju Nauki i Technologii (CNPq), numery grantów 465656/2014-5 i 309679/2018-4; i Koordynacji na rzecz Doskonalenia Kadr Szkolnictwa Wyższego (CAPES), kod finansowy 001.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Biodrukarka3D Biotechnologia 3D RozwiązaniaBiodrukarka na bazie wytłaczania
Kleszcze z końcówkąIntegra Miltex6--30Kleszcze do preparacji mózgu wcześniej sterylizowane
Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich9048-46-8Bez proteazy, bez kwasów tłuszczowych, zasadniczo bez globuliny
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
Kolba do hodowli komórkowychFisher Scientific156340Kolba do hodowli T25
Sitko do komórekCorning Incorporated352340Sitko do komórek 40 &mikro; m
Mikroskop konfokalnyLeicaConfocal TCS SP8 w połączeniu z systemem konfokalnym Olympus FluoView 300
Rurki stożkoweThermo Scientific339651, 339652Sterylne probówki 15 ml i 50 ml
DAPIAbcamab224589DAPI roztwór barwiący
DMEM/F12Gibco; Life Technologies Corporation12500062DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium / Ham's F12 50/50 Mix) z rurką L-glutaminy
DyalisisSigma-AldrichD9527Granica masy cząsteczkowej = 14 kDa
EtanolFisher Scientific64-15-5Odczynnik klasy
Płodowa surowica bydlęcaGibco; Life Technologies Corporation12657011Research Grade
FibrinogenSigma-Aldrich9001-32-5Fibrynogen krystaliczny w proszku z osocza bydlęcego
ŻelatynaSigma-Aldrich9000-70-8Żelatyna w proszku ze skóry świni
GlicynaSigma-Aldrich56-40-6Glicyna w proszku
Hanks Buforowany roztwór soli (HBSS)Gibco; Life Technologies Corporation14175095Bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej
L-GlutaminaSigma-Aldrich56-85-9L-Glutamina krystaliczna w proszku
LamininSigma-Aldrich114956-81-9Laminina 1-2 mg/ml L in 50 mM Tris-HCl
Zestaw do obrazowania żywych komórekThermo ScientificR37601Zielona fluorescencja w żywych komórkach (ex/em 488 nm/515 nm). Czerwona fluorescencja w martwych komórkach (ex/em 570 nm/602 nm)
Bezwodnik metakrylowySigma-Aldrich760-93-0Do preparatu GelMA
MikroprobówkiCorning IncorporatedMCT-150-CMikroprobówki 1,5 ml
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
Igła 22GFisher ScientificNC1362045Sterylna igła
Działanie nożyczkiIntegra Miltex05--02Ostre nożyczki do preparacji mózgu uprzednio sterylizowane
ParaformaldehydSigma-Aldrich30525-89-4Proszek paraformaldehydu
Penicylina/StreptomycynaGibco; Life Technologies Corporation15070063Pen Strep (5,000 jednostek/ml penicyliny; 5,000 ug/ml Streptomycyny)
szalka PetriegoCorning Incorporated430591, 430588Sterylne szalki Petriego 35 i 100 mm
PhalloidinAbcamab176753iFluor 488
FotoinicjatorSigma-Aldrich106797-53-92-Hydroksy-4′-(2-hydroksyetoksy)-2- sól fizjologiczna fosforanu metylopiofenonu
(PBS)Gibco; Life Technologies Corporation10010023PBS 1 x, klasa hodowlana, bez wapnia, bez magnezu
Poli-L-lizynaSigma-Aldrich25988-63-0Bromowodorek poli-L-lizyny mol wt 30 000-70 000
Pierwszorzędowe antociałoAbcamab4674Kurczak poliklonalny do GFAP
Przeciwciało drugorzędoweAbcamab150176Alexa fluor 594
szpatułka przeciw kurczakomMiltexV973-70Numer 24 szpatułka cementowa wcześniej sterylizowana
StereomikroskopFisherbrand3000038Mikroskop do preparacji mózgu
Strzykawka 5 mlBD1222C84Sterylna strzykawka
Filtr strzykawkowy 2 i mikro; mFisher Scientific09-740-105Filtr polipropylenowy do sterylizacji
TrombinSigma-Aldrich9002--04-4Trombiny w proszku krystalicznym z osocza bydlęcego
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1Klasa laboratoryjna
Trypsin-EDTAGibco; Life Technologies Corporation15400054Trypsyna bez czerwieni fenolowej 1 x rozcieńczona w roztworze PBS
VerseneGibco; Life Technologies Corporation15040066Roztwór Versene (0,48 mM) sformułowany jako 0,2 g EDTA(Na4) na litr
PBS Płytka studzienkowaThermo Scientific144530Sterylna płytka 24-dołkowa

Bibliografia

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114(2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079(2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414(2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401(2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h, Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848(2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001(2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036(2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517(2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619(2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757(2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

In ynieria tkanki nerwowejbioatrament astrocytarnybiodruk ekstruzyjnyglia lityczne bia ko kwa nerusztowanie biomateria owetest ywotno ci kom rekmikroskopia immunofluorescencyjnamorfologia astrocyt w
Biodrukowanie 3D mysich astrocytów korowych do inżynierii tkanki neuronalnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.