Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany system O9-1/Hydrogel do badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62693

⸱

13 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center at Houston, 3SEM AFM Core in the Houston Methodist Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Szczegółowe protokoły krok po kroku są opisane tutaj do badania sygnałów mechanicznych in vitro przy użyciu multipotencjalnych komórek grzebienia nerwowego O9-1 i hydrożeli poliakrylamidowych o różnej sztywności.

Streszczenie

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to embrionalne komórki multipotencjalne kręgowców, które mogą migrować i różnicować się w szeroki wachlarz typów komórek, które dają początek różnym organom i tkankom. Sztywność tkanki wytwarza siłę mechaniczną, fizyczną wskazówkę, która odgrywa kluczową rolę w różnicowaniu NCC; Mechanizm ten pozostaje jednak niejasny. Opisana tutaj metoda dostarcza szczegółowych informacji na temat zoptymalizowanej generacji hydrożeli poliakrylamidowych o różnej sztywności, dokładnego pomiaru takiej sztywności oraz oceny wpływu sygnałów mechanicznych w komórkach O9-1, linii NCC, która naśladuje NCC in vivo.

Sztywność hydrożelu została zmierzona za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) i wskazała różne poziomy sztywności. NCC O9-1 hodowane na hydrożelach o różnej sztywności wykazywały różną morfologię komórek i ekspresję genów włókien stresowych, co wskazywało na różne efekty biologiczne spowodowane mechanicznymi zmianami sygnału. Co więcej, ustalono, że zmiana sztywności hydrożelu zaowocowała skutecznym systemem in vitro do manipulowania sygnalizacją mechaniczną poprzez zmianę sztywności żelu i analizę regulacji molekularnej i genetycznej w NCC. NCC O9-1 mogą różnicować się w szeroki zakres typów komórek pod wpływem odpowiednich pożywek różnicujących, a manipulowanie sygnałami chemicznymi in vitro jest wygodne. Dlatego ten system in vitro jest potężnym narzędziem do badania roli sygnalizacji mechanicznej w NCC i jej interakcji z sygnałami chemicznymi, co pomoże naukowcom lepiej zrozumieć molekularne i genetyczne mechanizmy rozwoju grzebieni nerwowych i chorób.

Wprowadzenie

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to grupa komórek macierzystych podczas embriogenezy kręgowców o niezwykłej zdolności do migracji i przyczyniania się do rozwoju różnych organów i tkanek. NCC mogą różnicować się w różne typy komórek, w tym neurony czuciowe, chrząstki, kości, melanocyty i komórki mięśni gładkich, w zależności od lokalizacji pochodzenia osiowego i lokalnych wytycznych środowiskowych NCC1,2. Dzięki zdolności do różnicowania się w szeroki wachlarz typów komórek, nieprawidłowości genetyczne, które powodują rozregulowanie na dowolnym etapie rozwoju grzebienia nerwowego (NC), mogą prowadzić do wielu chorób wrodzonych2. Na przykład zaburzenia podczas powstawania, migracji i rozwoju NCC prowadzą do zaburzeń rozwojowych znanych zbiorczo jako neurokrystopatie1,3. Choroby te obejmują zarówno wady twarzoczaszki spowodowane niepowodzeniem w tworzeniu NCC, takie jak zespół Treachera Collinsa, jak i rozwój różnych nowotworów spowodowanych zdolnością migracji przerzutowej NCC, jak widać w czerniaku3,4,5,6. W ciągu ostatnich kilku dekad naukowcy dokonali niezwykłych odkryć na temat roli i mechanizmów NCC w rozwoju i chorobach, przy czym większość ustaleń koncentruje się na sygnałach chemicznych7,8. Ostatnio wykazano, że sygnały mechaniczne odgrywają krytyczną, ale słabo poznaną rolę w rozwoju NCC9,10.

Sygnały środowiskowe NCC odgrywają kluczową rolę podczas ich rozwoju, w tym regulację różnicowania NCC na różne typy komórek. Sygnały środowiskowe, np. wskazówki fizyczne, wpływają na kluczowe zachowania i reakcje komórkowe, takie jak dywersyfikacja funkcjonalna. Mechanotransdukcja pozwala komórkom wyczuwać i reagować na te sygnały w celu utrzymania różnych procesów biologicznych2. NCC są otoczone przez sąsiednie komórki i różne substraty, takie jak macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), która może powodować bodźce mechaniczne w celu utrzymania homeostazy i przystosowania się do zmian poprzez determinację losu, proliferację i apoptozę11. Mechanotransdukcja rozpoczyna się w błonie plazmatycznej, gdzie występuje komponent czuciowy mechanicznych bodźców zewnątrzkomórkowych, co skutkuje wewnątrzkomórkową regulacją komórki12. Integryny, zrosty ogniskowe i połączenia błony plazmatycznej przekazują sygnały mechaniczne, takie jak siły ścinające, naprężenia i sztywność otaczających substratów, na sygnały chemiczne w celu wytworzenia odpowiedzi komórkowych12. Przekazywanie sygnałów chemicznych z błony komórkowej do końcowej regulacji komórkowej odbywa się za pośrednictwem różnych szlaków sygnałowych w celu sfinalizowania procesów niezbędnych dla organizmu, takich jak różnicowanie.

Kilka badań sugeruje, że mechaniczna sygnalizacja ze sztywności podłoża odgrywa rolę w różnicowaniu komórek13,14. Na przykład wcześniejsze badania wykazały, że mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) hodowane na miękkich podłożach o sztywności podobnej do tkanki mózgowej (w zakresie 0,1-1,0 kPa) powodowały różnicowanie komórek neuronalnych15,16. Jednak więcej MSCs różnicuje się w komórki podobne do miocytów, gdy są hodowane na podłożach o natężeniu 8-17 kPa, naśladując sztywność mięśni, podczas gdy różnicowanie podobne do osteoblastów zaobserwowano, gdy MSCs hodowano na sztywnych podłożach (25-40 kPa)15,16. Znaczenie mechanotransdukcji podkreślają nieprawidłowości i nieprawidłowości w mechanicznym szlaku sygnałowym, które potencjalnie prowadzą do poważnych wad rozwojowych i chorób, w tym raka, chorób układu krążenia i osteoporozy17,18,19. W nowotworach normalna tkanka piersi jest miękka, a ryzyko raka piersi wzrasta w sztywnej i gęstej tkance piersi, środowisku bardziej zbliżonym do guzów piersi15. Dzięki tej wiedzy wpływ sygnalizacji mechanicznej na rozwój NCC można badać poprzez prostą manipulację sztywnością substratu za pomocą systemu in vitro, co zapewnia dalsze korzyści i możliwości w zrozumieniu podstaw progresji i etiologii choroby związanej z NC.

Aby zbadać wpływ sygnałów mechanicznych na NCC, stworzyliśmy efektywny system in vitro dla NCC oparty na optymalizacji wcześniej opublikowanych metod i ocenie reakcji NCC na różne sygnały mechaniczne20,21. Opracowano szczegółowy protokół przygotowania różnej sztywności hydrożelu i oceny wpływu sygnalizacji mechanicznej w NCC. Aby to osiągnąć, NCC O9-1 są wykorzystywane jako model NC do badania efektów i zmian w odpowiedzi na sztywne i miękkie hydrożele. NCC O9-1 to stabilna linia komórkowa NC wyizolowana z zarodka myszy (E) w 8,5 dniu. O9-1 NCC naśladują NCC in vivo, ponieważ mogą różnicować się w różne typy komórek pochodzących z NC w zdefiniowanych mediach różnicujących22. Aby zbadać sygnalizację mechaniczną NCC, wyprodukowano podłoże matrycowe o regulowanej elastyczności z różnych stężeń roztworów akrylamidu i bis-akrylamidu, aby osiągnąć pożądaną sztywność, skorelowaną ze sztywnością podłoża biologicznego20,21,23. Aby zoptymalizować warunki podłoża matrycowego dla NCC, w szczególności komórek O9-1, dokonano modyfikacji na podstawie wcześniej opublikowanego protokołu20. Jedną ze zmian wprowadzonych w tym protokole była inkubacja hydrożeli w kolagenie I, rozcieńczonych w 0,2% kwasie octowym zamiast 50 mM HEPES, w temperaturze 37 °C przez noc. Niskie pH kwasu octowego prowadzi do jednorodnego rozmieszczenia i większej inkorporacji kolagenu I, co pozwala na bardziej równomierne przyłączanie białka ECM24. Ponadto przed przechowywaniem hydrożeli w inkubatorze zastosowano kombinację surowicy końskiej i płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w stężeniach odpowiednio 10% i 5% w roztworze soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS). Surowica końska była stosowana jako dodatkowy suplement do FBS ze względu na jej zdolność do promowania proliferacji i różnicowania komórek w stężeniu 10%25.

Dzięki tej metodzie, środowisko biologiczne zostało naśladowane przez powłokę białkową ECM (np. Kolagen I), aby stworzyć dokładne środowisko in vitro dla NCC do wzrostu i przetrwania20,21. Sztywność przygotowanych hydrożeli analizowano ilościowo za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM), dobrze znanej techniki obrazowania modułu sprężystości26. Aby zbadać wpływ różnych poziomów sztywności na NCC, komórki O9-1 typu dzikiego hodowano i przygotowywano na hydrożelach do barwienia immunofluorescencyjnego (IF) aktyną nitkowatą (F-aktyna), aby pokazać różnice w adhezji komórek i morfologii w odpowiedzi na zmiany sztywności substratu. Korzystając z tego systemu in vitro, naukowcy będą mogli badać rolę sygnalizacji mechanicznej w NCC i jej interakcję z innymi sygnałami chemicznymi, aby lepiej zrozumieć związek między NCC a sygnalizacją mechaniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie hydrożelu

UWAGA: Wszystkie kroki muszą być wykonane w kapturze do hodowli komórkowych, który został zdezynfekowany etanolem i wysterylizowany ultrafioletem (UV) przed użyciem, aby zachować sterylność. Narzędzia, takie jak pęseta i pipety, należy spryskać etanolem. Roztwory buforowe muszą być również sterylnie przefiltrowane.

  1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych aminozelanem
    1. Umieść żądaną liczbę szklanych szkiełek nakrywkowych na kawałku chusteczki laboratoryjnej.
      UWAGA: Przygotuj dodatkowe 3-4 szkiełka nakrywkowe, aby zapewnić wystarczającą ilość zapasowych zapasów, ponieważ łatwo się łamią. Różne materiały szklanych szkiełek nakrywkowych zapewnią różną kompatybilność wysiewu i mocowania komórek. Lepiej jest określić, który typ najlepiej pasuje do eksperymentu przed rozpoczęciem eksperymentów (patrz Tabela materiałów).
    2. Użyj palnika alkoholowego lub palnika Bunsena, aby wysterylizować każde szkiełko nakrywkowe, przepuszczając je tam iz powrotem przez płomień (30 s w przypadku eksperymentów z testami białka). Umieść każde szklane szkiełko nakrywkowe na chusteczce laboratoryjnej, aby ostygło.
    3. Gdy szklane szkiełka nakrywkowe ostygną, przenieś je na szalkę Petriego wyłożoną parafilmem, aby zapobiec poślizgowi.
      UWAGA: Jeśli szkiełka nakrywkowe nie są wystarczająco chłodne, ciepło resztkowe stopi parafilm na zrazach, czyniąc je bezużytecznymi.
    4. Przykryj szkiełka nakrywkowe około 200 μl i 800 μl 0,1 M NaOH na szkiełko nakrywkowe odpowiednio 12 mm i 25 mm i pozostaw na 5 minut. Następnie odessać 0,1 M NaOH i pozostawić szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu przez kolejne 5 minut, aby utworzyć równomierny film.
    5. Po wysuszeniu szkiełek nakrywkowych należy odpipetować około 80 μl i 150 μl 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTS) dla szkiełek nakrywkowych o średnicy odpowiednio 12 mm i 25 mm. Należy uważać, aby nie rozlać roztworu na parafilm. Pozostaw roztwór na 5 minut.
    6. Odessać jak najwięcej APTS i pozostawić resztki APTS do wyschnięcia przez 5 minut. Dobrze wypłukać szkiełka nakrywkowe, zanurzając je w sterylnym, dejonizowanym (DI)H2Otrzy razy na 5 minut za każdym razem.
      UWAGA: Jeśli szklane szkiełka nakrywkowe nie zostaną dobrze wypłukane, pozostały APTS powoduje niepożądane reakcje z aldehydem glutarowym, powodując tworzenie się białego osadu i powodując bezużyteczność szkiełek nakrywkowych.
    7. Przenieś szkiełka nakrywkowe na nową szalkę Petriego reaktywną stroną skierowaną do góry. Dodać tyle 0,5% aldehydu glutarowego do szalki Petriego, aby całkowicie pokryć szkiełka nakrywkowe i pozostawić szkiełka nakrywkowe na 30 minut.
    8. Odessać 0,5% aldehydu glutarowego i ponownie przepłukać szkiełka nakrywkowe w DIH 2O jeden raz przez 3 minuty. Przed użyciem należy ustawić szkiełka nakrywkowe reaktywną stroną do góry na chusteczce laboratoryjnej lub czystej szalce Petriego do całkowitego wyschnięcia na powietrzu.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać; szkiełka nakrywkowe należy umieszczać w sterylnym DIH 2O do czasu użycia.
  2. Przygotowanie silikonowanych szkiełek nakrywkowych
    1. Umieścić taką samą liczbę szkiełek nakrywkowych, jak szkiełka nakrywkowe pokryte aminozelanem (etap 1.1.1) na szalce Petriego wyłożonej parafilmem.
    2. Odpipetować 40 μl lub 150 μl dla szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm i 25 mm odpowiednio z dichlorometylosilanu (DCMS) na jedną stronę szkiełka nakrywkowego i pozostawić roztwór na 5 minut.
    3. Odessać pozostały roztwór ze szkiełka nakrywkowego, umyć w sterylnym DIH 2O raz przez 1 minutę i umieścić reaktywne szkiełka nakrywkowe stroną zadrukowaną do góry na chusteczce laboratoryjnej do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przed przejściem do następnego kroku.
  3. Przygotowanie hydrożeli
    1. Zmieszać akrylamid, bis-akryloamid i DIH2Ow probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby przygotować 500 μl roztworów o różnej sztywności (patrz tabela 1). Wiruj roztwór przez 30 sekund, aby dokładnie go wymieszać.
    2. Działając szybko, dodaj 10% roztwór nadsiarczanu amonu (APS) i tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do probówki i ponownie zwiruj roztwory, aby wymieszać roztwory.
      UWAGA: Przygotuj świeży 10% APS i pozostaw go na lodzie lub zamroź do jednorazowych porcji ze względu na wrażliwy cykl zamrażania/rozmrażania.
    3. Pobrać pipetą około 33 μl lub 100 μl roztworu na wysuszone szkiełka nakrywkowe pokryte aminozylanem o średnicy 12 mm lub 25 mm (sekcja 1.1).
    4. Za pomocą zakrzywionej pęsety natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe nasączone DCMS na wierzchu roztworu żelu, tak aby strona poddana działaniu środka dotykała roztworu żelu, umieszczając w ten sposób roztwór żelu między szkiełkiem nakrywkowym poddanym działaniu DCMS a szkiełkiem nakrywkowym pokrytym aminozelanem.
    5. Pozostawić roztwór żelu do polimeryzacji przez 5-15 minut, aktywnie monitorując polimeryzację żelu pozostałego roztworu w probówce.
    6. Po polimeryzacji żelu oddziel szkiełko nakrywkowe nasączone DCMS zakrzywioną pęsetą lub żyletką, pozostawiając żel przymocowany do oryginalnego szkiełka nakrywkowego pokrytego aminozelanem.
    7. Natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe z dołączonym hydrożelem w przeznaczonej do tego celu płytce 4-dołkowej/24-dołkowej i 6-dołkowej pokrytej 500 μl i 2 ml sterylnego PBS lub DI H2O dla szkiełek nakrywkowych odpowiednio 12 mm i 25 mm, aby zapobiec wysychaniu żelu.
    8. Powtórzyć kroki 1.3.4–1.3.7 dla wszystkich szkiełek nakrywkowych.
    9. Zanurz hydrożele w sterylnym PBS lub DIH2O na 30 minut, aby usunąć nadmiar roztworu akrylamidu. Przechowywać hydrożele w sterylnym PBS lub DIH 2O w temperaturze 4 °C do zatrzymania zabiegu w tym miejscu.
    10. W ciemnym pomieszczeniu przygotować mieszaninę 6-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino)heksanianu sulfosukcynimidylu (sulfo-SANPAH), mieszając 2,5 ml 50 mM kwasu 2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowego(HEPES) (pH = 8,5) z 25 μl 50 μg/ml sulfo-SANPAH w stożkowej probówce, owiniętej folią aluminiową w celu ochrony przed światłem. Użyj pipety, aby dobrze wymieszać roztwór przed użyciem.
      UWAGA: objętość 2,5 ml roztworu sulfo-SANPAH wystarcza na około dwadzieścia pięć hydrożeli o średnicy 12 mm lub pięć hydrożeli o średnicy 25 mm.
    11. Odessać PBS lub DIH2O z płytki studzienki. Dodać około 100 μl lub 500 μl dla szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm i 25 mm roztworu sulfo-SANPAH (etap 1.3.10) w celu przykrycia żelu. Upewnij się, że roztwór całkowicie pokrywa żel.
      UWAGA: Dostosuj siłę ssania podciśnienia, aby zapobiec rozerwaniu lub zakłóceniu hydrożeli przez dużą siłę.
    12. Umieść żele z roztworem pod światłem UV o mocy 15 W, 365 nm na 10 minut, bez przykrycia, aby zminimalizować zakłócenia światła UV reagującego z sulfo-SANPAH.
    13. Odessać nadmiar sulfo-SANPAH, przechylając płytkę, aby zebrać jak najwięcej roztworu. Umyj żel za pomocą 50 mM HEPES dwa do trzech razy.
    14. Dodać 500 μl i 2 ml dla żeli 12 mm i 25 mm odpowiednio 50 mg/ml kolagenu I rozcieńczonego w 0,2% kwasie octowym do każdej studzienki zawierającej hydrożel. Pozostawić żele do inkubacji przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5%CO2.
      UWAGA: Rozcieńczyć kolagen I w 0,2% kwasie octowym zamiast 50 mM HEPES, aby promować jednorodne rozmieszczenie i przyleganie kolagenu I.
    15. Odessać kolagen I i umyć żele sterylnym PBS trzy razy, aby usunąć nadmiar kolagenu I przez 5 minut przy każdym myciu. Hydrożele inkubować w PBS z 10% surowicą końską, 5% FBS przez 2 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
      UWAGA: Dodatek 10% surowicy końskiej sprzyja większej proliferacji w porównaniu do stosowania tylko FBS, jak to miało miejsce w poprzedniej publikacji.
    16. Zassać pożywkę. Do każdej studzienki dodać 500 ml sterylnie przefiltrowanego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (P/S). Żele należy przechowywać w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 do czasu, gdy będą gotowe do hodowli komórkowej.
    17. Po przygotowaniu rozłóż około 1,5 × 104 komórek O9-1/cm2 w pożywce podstawowej w szalkach hodowlanych. Inkubować komórki przez 2 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Sprawdź komórki pod kątem zbieżności, aby upewnić się, że komórki są wystarczająco połączone z żelami i że liczba komórek jest wystarczająca przed pobraniem do analizy.
      UWAGA: Zapoznaj się z wcześniej opublikowanym protokołem, aby zapoznać się z krokami odzyskiwania, przechodzenia i zbierania komórek O9-120.
    18. Przejdź do sekcji 2, 3 lub 4 w celu dalszej analizy hydrożeli.

2. Ilościowa analiza sztywności za pomocą AFM

  1. Uruchom komputer systemu AFM, a następnie sterownik AFM (patrz tabela materiałów).
  2. Zamontuj wspornik AFM na uchwycie sondy AFM. Użyj kulistego wspornika z kulką krzemionkową 0,5 μm zamontowaną na końcu wspornika (wspornik ze sferyczną kulistą kulą).
    UWAGA: W przypadku sztywniejszych hydrożeli, takich jak 10 kPa, 20 kPa i 40 kPa, zastosowano sztywniejszą sondę o stałej sprężystości 0,24 N/m. Do bardziej miękkich hydrożeli, takich jak 0,5 kPa i 1 kPa, zastosowano bardziej miękką sondę o stałej sprężystości 0,059 N/m.
  3. Ustaw oprogramowanie AFM w trybie kontaktowym.
  4. Zamontuj płytkę krzemową na stoliku na próbkę AFM, aby zebrać krzywe siły, klikając przycisk Zaangażuj, aby wspornik dotknął podłoża krzemowego, generując w ten sposób krzywe siły.
  5. Użyj powyższych krzywych siły (2.4) do kalibracji, kliknij Kalibruj w oprogramowaniu sterującym, aby uzyskać średnią stałą sprężystości wspornika w warunkach strojenia termicznego i zapisz skalibrowane wartości w oprogramowaniu sterującym.
  6. Zamontuj próbki, umieszczając szkiełko nakrywkowe z dołączonym hydrożelem na szalce Petriego o średnicy 60 mm na stoliku skanującym AFM. Dodaj 3 ml PBS do naczynia przed przeprowadzeniem pomiarów, aby zapobiec wysychaniu żelu.
  7. Ustaw AFM tak, aby działał w trybie kontaktowym (płyn), aby rozpocząć pomiar. Zaczepić kulkę kulistą, aby w sposób ciągły dotykać i podnosić z próbki żelu.
  8. Ustawić wspornik tak, aby jego próg ugięcia pozostał na poziomie 10 nm. Utrzymuj rozmiar zagłębiania skośnego sondy na poziomie 10 μm. Następnie zapisz krzywe siły jak w kroku 2.4.
  9. Uzyskaj co najmniej 20 krzywych siły z co najmniej 3 do 10 różnych miejsc na powierzchni hydrożelu.
  10. Oblicz średni moduł Younga wynoszący ~20 krzywych siły dla każdego miejsca za pomocą oprogramowania do obrazowania i analizy AFM. Użyj wydłużonych krzywych siły rampy i modelu zlinearyzowanego (sferycznego). Obliczyć średnią ze wszystkich plamek dla każdej próbki, aby uzyskać końcową sztywność.
    UWAGA: Moduł Younga i powiązane dane (tj. odchylenia standardowe) są automatycznie zapisywane jako arkusz kalkulacyjny.
  11. Powtórzyć kroki 2.6-2.10 dla wszystkich próbek.

3. Molekularna analiza sztywności za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego

  1. Użyj pęsety, aby przetransportować szkiełko nakrywkowe na nową płytkę, aby zminimalizować fałszywe sygnały z komórek wyhodowanych bezpośrednio na płytce. Przemyć komórki trzykrotnie 500 μl sterylnego PBS w celu usunięcia martwych komórek i pozostałej pożywki hodowlanej.
  2. Utrwal komórki za pomocą 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, bez zakłóceń. Następnie ponownie umyj komórki trzy razy, używając 500 μl PBS/studzienkę przez 2 minuty każda.
    UWAGA: Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu zatrzymania zabiegowego.
  3. Potraktuj komórki 500 μl 0,1% Triton X-100 przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj komórki trzykrotnie 500 μl PBS/studzienkę.
  4. Zablokuj komórki 250 μl 10% surowicy osła (rozcieńczonej w PBS i 0,1% Tween 20) na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Inkubować komórki z 250 μl przeciwciał pierwszorzędowych przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie przemyj komórki trzykrotnie 500 μl PBS/studzienkę przez 5 minut każda.
    UWAGA: W tym eksperymencie zastosowano anty-winkulinę (Vcl) (1:250) i anty-AP2 alfa (1:250) i rozcieńczono je w 10% surowicy osła.
  6. Inkubować komórki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi i / lub falloidyną używaną do barwienia F-aktyny w rozcieńczeniu 1:400 w 250 μl 10% surowicy osła przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS przez 5 minut każda.
    UWAGA: Falloidyna o długości fali 568 nm może być inkubowana z przeciwciałami drugorzędowymi o długości fali 488 nm lub 647 nm lub samodzielnie.
  7. Inkubować komórki z 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, rozcieńczenie 1:1000) w 250 μl PBS przez 10 minut, a następnie ponownie przemywać PBS przez 2 minuty.
  8. Dodaj 3-4 krople podłoża montażowego do każdej studzienki. Przechowuj próbki w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny przed obrazowaniem, aby upewnić się, że podłoże mocujące jest prawidłowo ustawione.
  9. Uchwyć obrazy co najmniej 3 losowych ramek na próbkę hydrożelu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, tworząc pojedyncze i połączone kanały.

4. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)

  1. Przenieś hydrożele z przylegającymi komórkami w celu zebrania RNA na nową płytkę, aby zminimalizować niepożądane RNA z komórek przyczepionych do płytki komórkowej. Przemyj komórki trzykrotnie PBS, aby usunąć martwe komórki i pożywkę hodowlaną.
  2. Wyodrębnij całkowite mRNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA. Wykonaj odwrotną transkrypcję RNA do cDNA za pomocą supermiksu z odwrotną transkrypcją, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Wykonać RT-qPCR ze starterami dla Vcl jako markera sztywności do wyboru i przeanalizować metodą 2-ΔΔCT.
    UWAGA: Sekwencja startera Vcl: Naprzód 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; rewers 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przygotowanie hydrożelu i ocena sztywności za pomocą AFM oraz modelu Hertza
W niniejszym materiale przedstawiono szczegółowy protokół wytwarzania hydrożeli poliakrylamidowych o różnej sztywności poprzez regulację stosunku akrylamidu do bis-akrylamidu. Hydrożele poliakrylamidowe nie nadają się jednak do adhezji komórek ze względu na brak białek ECM. W związku z tym sulfo-SANPAH, pełniący rolę łącznika, wiąże się kowalencyjnie z hydrożelami i reaguje z aminami pierwszorzędowymi białek ECM, co umożliw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Celem obecnego badania jest dostarczenie skutecznego i wydajnego systemu in vitro , aby lepiej zrozumieć wpływ sygnałów mechanicznych na NCC. Oprócz postępowania zgodnie z wyżej wymienionym protokołem krok po kroku, naukowcy muszą pamiętać, że na hodowlę komórkową NCC O9-1 ma wpływ rodzaj szklanych szkiełek nakrywkowych używanych do przygotowania hydrożeli. Na przykład zauważono, że komórki wysiane na określonym typie szklanego szkiełka nakrywkowego (patrz Tabela materiałów) przetrwały i dobrze ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy dr Ana-Marii Zaske, operatorce Atomic Force Microscope-UT Core w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego, za wkład w ten projekt. Dziękujemy również J. Wangowi za źródła finansowania z National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 i R01HL142704).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
12 mm #1 Corning 0211 Szkiełko nakrywkoweChemglass Naukiprzyrodnicze CLS-1763-012
2% Bis-AkrylamidSigma AldrichM1533
Płytka 24-dołkowaGreiner Bio-one662165
25 mm #1 Corning 0211 Szkiełko nakrywkoweChemglass Nauki przyrodniczeCLS-1763-025
3-aminopropylotrietoksysilan (APTS)Sigma AldrichA3648
4-dołkowa płytka do hodowli komórkowychThermo Scientific179830
4% ParaformaldehydSigma AldrichJ61899-AP
40% AkrylamidSigma AldrichA4058
50% aldehyd glutarowySigma AldrichG7651
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowejGreiner Bio-one657160
Wspornik AFM (kulista kula)Oprogramowanie Novascan
AFMKatalizator NanoScopeModel: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo FisherA12379
Nadsiarczan amonu (APS)Sigma Aldrich248614Proszek
anty-AP-2 i alfa; PrzeciwciałoSanta Cruzsc-12726
Przeciwciało anty-WinkulinyAbcamab129002
Mikroskopia sił atomowych (AFM) Bioskop KatalizatorBruker Corporation
Kolagen typu I (100mg)Corning354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)Thermo FisherD1306
Dichloromethylsilan (DCMS)Sigma Aldrich440272
Serum osłaSigma AldrichD9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Corning35-010-CV
Mikroskop fluorescencyjnyLeicaModel DMi8
Montaż Fluoromount-G średniSouthernBiotech0100-35
HEPESSigma AldrichH3375Proszek
Serum dla koniCorning35-030-CI
iScript Odwrotna transkrypcja SupermixBio-Rad1708841
Antybiotyk penicylinowo-streptomycynowyThermo Fisher15140148
RNeasy micro kitQiagen74004
Sterylny 1x PBSHycloneSH30256.02
Sterylna woda dejonizowanaHardy DiagnosticsU284
sulfo-SANPAHThermo Fisher22589
SYBR zielonyApplied Biosystems4472908
TEMEDSigma AldrichT9281
Triton X-100Sigma AldrichX100
Tween 20Sigma AldrichP9416

Bibliografia

  1. Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
  2. Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
  3. Watt, K. E. N., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. Trainor, P. A. , Academic Press. 361-394 (2014).
  4. Lavelle, C. L. B. Applied oral physiology. , Butterworth-Heinemann. (1988).
  5. Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
  6. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  7. Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  8. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
  9. Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
  10. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  11. Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
  12. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  13. Lu, Y. -B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
  14. Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  15. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  16. Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335(2007).
  17. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  18. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  19. Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10, Unit 10.16 (2010).
  21. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089(2010).
  22. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  23. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  24. Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108(2019).
  25. Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
  26. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281(2019).
  27. Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
  28. Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
  29. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
  30. Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257(2018).
  31. Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
  32. Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
  33. Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
  34. Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
  35. Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
  36. Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
  37. Kuo, J. -C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
  38. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346(2018).
  39. Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
  40. Lin, Y. -C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918(2010).
  41. Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
  42. Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
  43. McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
  44. Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15(2015).
  45. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  46. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  47. Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  48. Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
  49. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  50. Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , Academic Press. 363-373 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sztywno hydro elusygnalizacja mechanicznakom rki O9 1hydro ele poliakryloamidowemikroskopia si atomowychr nicowanie kom rekbarwienie immunofluorescencyjneekspresja w kien stresowychadhezja ogniskowa

Powiązane artykuły