Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Skalowalny model do badania skutków obrażeń spowodowanych siłą u dorosłych danio pręgowanych

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62709

⸱

31 maja 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Zebrafish Research, University of Notre Dame, 3Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Notre Dame

W tym artykule

Podsumowanie

Zmodyfikowaliśmy model spadku masy Marmarou dla dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać szeroki zakres patologii po uszkodzeniu mózgu (TBI) i mechanizmy leżące u podstaw późniejszej regeneracji neuronów. Ten model TBI jest skalowalny, indukuje łagodne, umiarkowane lub ciężkie TBI i podsumowuje niejednorodność obrażeń obserwowaną u ludzi.

Streszczenie

urazowe urazy mózgu (TBI) są najczęstszą formą urazów głowy, które obejmują różne nasilenia i skutkują złożonymi i niejednorodnymi skutkami ubocznymi. Chociaż nie ma mechanizmu zastępowania lub regeneracji utraconych neuronów po TBI u ludzi, danio pręgowany posiada zdolność do regeneracji neuronów w całym ciele, w tym w mózgu. Aby zbadać zakres patologii wykazywanych u danio pręgowanego po TBI i zbadać mechanizmy leżące u podstaw późniejszej neuronalnej odpowiedzi regeneracyjnej, zmodyfikowaliśmy powszechnie stosowany spadek masy ciała gryzoni Marmarou do stosowania u dorosłych danio pręgowanego. Nasz prosty model TBI z siłą jest skalowalny, indukując łagodne, umiarkowane lub ciężkie TBI i podsumowuje wiele fenotypów obserwowanych po TBI u ludzi, takich jak napady kontaktowe i pourazowe, obrzęki, krwiaki podtwardówkowe i śródmózgowe oraz zaburzenia poznawcze, z których każdy objawia się w sposób zależny od ciężkości urazu. Następstwa TBI, które zaczynają pojawiać się w ciągu kilku minut od urazu, ustępują i wracają do prawie nieuszkodzonego poziomu kontrolnego w ciągu 7 dni po urazie. Proces regeneracji rozpoczyna się już po 48 godzinach od urazu (hpi), a szczytową proliferację komórek obserwuje się po 60 hpi. W ten sposób nasz model TBI siły danio pręgowanego wytwarza charakterystyczne pierwotne i wtórne patologie TBI urazów podobne do ludzkiego TBI, co pozwala na badanie początku i progresji choroby, a także mechanizmów regeneracji neuronów, które są unikalne dla danio pręgowanego.

Wprowadzenie

Urazowe urazy mózgu (TBI) są globalnym kryzysem zdrowotnym i główną przyczyną śmierci i niepełnosprawności. W Stanach Zjednoczonych około 2,9 miliona ludzi doświadcza TBI każdego roku, a w latach 2006-2014 śmiertelność z powodu TBI lub następstw TBI wzrosła o ponad 50%1. Jednak TBI różnią się etiologią, patologią i obrazem klinicznym, głównie ze względu na mechanizm urazu (MOI), który również wpływa na strategie leczenia i przewidywane rokowanie2. Chociaż TBI mogą wynikać z różnych MOI, są one głównie wynikiem urazu penetrującego lub narzędzia. Urazy penetrujące stanowią niewielki procent TBI i generują ciężkie i ogniskowe urazy, które są zlokalizowane w bezpośrednich i otaczających przebitych obszarach mózgu3. W przeciwieństwie do tego, TBI siły są bardziej powszechne w populacji ogólnej, obejmują zakres nasileń (łagodne, umiarkowane i ciężkie) i powodują rozproszone, niejednorodne i globalne uszkodzenie wpływające na wiele obszarów mózgu1,4,5.

Danio pręgowany (Danio rerio) został wykorzystany do zbadania szerokiego zakresu neurologicznych urazów obejmujących ośrodkowy układ nerwowy (OUN)6,7,8,9. Danio pręgowany posiada również, w przeciwieństwie do ssaków, wrodzoną i silną reakcję regeneracyjną na naprawę uszkodzeń OUN10. Obecne modele urazów danio pręgowanego wykorzystują różne metody urazów, w tym penetrację, wycięcie, zniewagę chemiczną lub fale ciśnienia11,12,13,14,15,16. Jednak każda z tych metod wykorzystuje MOI, który jest rzadko doświadczany przez populację ludzką, nie jest skalowalny w zakresie ciężkości obrażeń i nie odnosi się do heterogeniczności lub zależnej od ciężkości następstw TBI zgłaszanych po TBI siły. Czynniki te ograniczają wykorzystanie modelu danio pręgowanego do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw patologii związanych z najczęstszą postacią TBI w populacji ludzkiej (łagodne urazy siłą).

Naszym celem było opracowanie szybkiego i skalowalnego modelu TBI z siłą, który umożliwia badanie patologii urazów, progresji następstw TBI i wrodzonej reakcji regeneracyjnej. Zmodyfikowaliśmy powszechnie używany spadek wagi gryzonia Marmarou17 i zastosowaliśmy go do dorosłego danio pręgowanego. Ten model daje powtarzalny zakres nasileń od łagodnego, umiarkowanego do ciężkiego. Model ten podsumowuje również wiele aspektów patologii TBI u ludzi, w sposób zależny od nasilenia, w tym drgawki, obrzęki, krwiaki podtwardówkowe i śródmózgowe, śmierć komórek neuronalnych i deficyty poznawcze, takie jak zaburzenia uczenia się i pamięci. Dni po urazie patologie i deficyty ustępują, wracając do poziomów przypominających nieuszkodzone kontrole. Ponadto ten model danio pręgowanego wykazuje silną reakcję na proliferację i regenerację neuronów w całej neuroosi w odniesieniu do ciężkości urazu.

Tutaj podajemy szczegóły dotyczące przygotowania i indukcji urazu, punktacji napadów pourazowych, oceny urazów naczyniowych, instrukcji dotyczących przygotowania sekcji mózgu, podejść do ilościowego określania obrzęku oraz wglądu w reakcję proliferacyjną po urazie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Rybki danio zostały wyhodowane i utrzymywane w ośrodku Zebrafish na Uniwersytecie Notre Dame w centrum Freimann Life Sciences Center. Metody opisane w niniejszej pracy zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Notre Dame.

1. Model urazowego uszkodzenia mózgu

  1. Dodaj 1 mL 2-fenoksyetanolu do 1 L wody systemowej (60 mg Instant Ocean w 1 L dejonizowanej wody RO).
  2. Przygotuj napowietrzany zbiornik regeneracyjny zawierający 2 L wody systemowej w temperaturze pokojowej.
  3. Wybierz pożądaną masę kulki łożyskowej oraz pożądaną długość i średnicę rurki stalowej lub plastikowej i wyznacz energię oraz siłę uderzenia.
    UWAGA: Rurka powinna mieć średnicę wewnętrzną umożliwiającą przejście kulki łożyskowej bez zmiany jej toru lub prędkości ruchu.
    1. Wyznacz energię kinetyczną w momencie uderzenia:
      Wzór na energię kinetyczną KE=mgh, edukacja z zakresu fizyki, wyjaśnienie konwersji energii
      Gdzie, KE = energia kinetyczna, m = masa (w kg), g = siła grawitacji, h = wysokość (w m) od punktu zrzutu do ryby.
      UWAGA: Pozwala to wyznaczyć energię kinetyczną w J. Pomnóż wartość przez 1 000, aby otrzymać wynik w mJ. KE opiera się na obiekcie przyspieszającym, co ma miejsce w przypadku upuszczenia kulki łożyskowej z pozycji spoczynkowej.
    2. Wywołaj łagodne TBI (miTBI), używając stalowej lub plastikowej rurki o długości 7,62 cm, która kończy się 1,5 cm nad płytką na czaszce danio pręgowanego (całkowita odległość 9,1 cm) oraz kulki łożyskowej o masie 1,5 g (średnica 6,4 mm). Generuje to energię kinetyczną wynoszącą 1,33 mJ. Empirycznie ustalono, że uszkodzenie to jest równoważne miTBI w oparciu o kluczowe markery patofizjologiczne TBI, takie jak uszkodzenia naczyniowe, tworzenie się krwiaków podtwardówkowych/wewnątrzczaszkowych, śmierć komórek neuronalnych oraz zaburzenia poznawcze, które w dużej mierze odzwierciedlały doniesienia dotyczące populacji ludzkiej w sposób zależny od stopnia nasilenia urazu.
    3. Oblicz energię kinetyczną miTBI = Wzór na równowagę statyczną, obliczanie pracy w milijulach, równanie konwersji energii.
    4. Wywołaj umiarkowane TBI (moTBI), używając stalowej lub plastikowej rurki o długości 12,7 cm, która kończy się 1,5 cm nad płytką na czaszce danio pręgowanego (całkowita odległość 14,2 cm) oraz kulki łożyskowej o masie 1,5 g (średnica 6,4 mm), co generuje energię kinetyczną wynoszącą 2,08 mJ.
    5. Oblicz energię kinetyczną moTBI = Wzór na równowagę statyczną; obliczanie energii; równania fizyczne; masa, grawitacja, wysokość.
    6. Wywołaj ciężkie TBI (sTBI), używając stalowej lub plastikowej rurki o długości 7,62 cm, która kończy się 1,5 cm nad płytką na czaszce danio pręgowanego (całkowita odległość 9,1 cm) oraz kulki łożyskowej o masie 3,3 g (średnica 8,38 mm), co generuje energię kinetyczną wynoszącą 2,94 mJ.
    7. Oblicz energię kinetyczną sTBI =  Obliczenia równowagi statycznej, wzór pokazujący konwersję energii potencjalnej na milijule.
  4. Wypełnij szalkę Petriego plasteliną (Rysunek 1, krok 1) i za pomocą tępego narzędzia (np. grzbietu pęsety) utwórz wypukłą platformę (5 cm x 1,5 cm) z dodatkowej plasteliny (Rysunek 1, krok 2).
    1. Użyj żyletki, aby podzielić wypukłą platformę wzdłuż na dwie w przybliżeniu równe połowy (Rysunek 1, krok 3, czerwona przerywana linia). Uformuj obie połowy w kanał mieszczący długość dorosłej ryby (Rysunek 1, krok 4). Użyj dodatkowej plasteliny do zbudowania ścianek, które zabezpieczą ok. 2/3 ciała ryby, pozostawiając odsłoniętą głowę.
    2. Uformuj niewielkie podparcie w obszarze odsłoniętej głowy, prostopadle do ścianek, aby podtrzymać głowę i uniknąć jej rotacji lub odrzutu podczas urazu (Rysunek 1, krok 4).
      UWAGA: Kanał powinien być wystarczająco głęboki, aby utrzymać rybę w pozycji grzbietem do góry, ale nadal powinien pozwalać głowie spoczywać powyżej otaczającej plasteliny. Dodatkowo podparcie głowy powinno mengikutić naturalną krzywiznę ryby, podtrzymując dolną szczękę i skrzela.
    3. Upewnij się, że opadający ciężarek nie jest blokowany przez ścianki kanału (Rysunek 1, krok 4).
  5. Wykonaj stalowy dysk o średnicy 3 mm, używając mini dziurkacza i blachy stalowej o grubości 22 g. Każdy dysk można wykorzystać wielokrotnie.
  6. Zanurz jedną rybę w zlewce z 50-100 mL 2-fenoksyetanolu w stężeniu 1:1000 (1 mL/1 L, 0,1%) i pozostaw do czasu, aż przestanie reagować na uciśnięcie ogona.
  7. Umieść rybę grzbietem do góry w formach z plasteliny wewnątrz kanału tak, aby ciało było zabezpieczone z boków, a na głowie umieść stalowy dysk o średnicy 3 mm i grubości 22 g, centrując go nad pożądanym punktem uderzenia (Rysunek 1, krok 5).
    1. Upewnij się, że ryba jest ustawiona jak najbardziej prostopadle, aby uniknąć przechylenia głowy na jedną stronę, co mogłoby spowodować nierównomierne uderzenie.
  8. Zamocuj rurkę stalową lub plastikową, używając standardowego statywu z obejmą, tak aby dół rurki znajdował się 1,5 cm nad głową danio pręgowanego (Rysunek 1, krok 6). Upewnij się, że rurka jest prosta.
    1. Spójrz przez rurkę i upewnij się, że jest ona wyrównana nad stalową płytką.
  9. Upuść kulkę łożyskową (1,5 g dla łagodnego i umiarkowanego TBI oraz 3,3 g dla ciężkiego TBI) z określonej wysokości (opisanej w krokach 1.3.3-1.3.5) przez rurkę na stalową płytkę umieszczoną nad pożądanym obszarem neuroanatomicznym (np. móżdżkiem, Rysunek 1, krok 5), aby wywołać TBI z urazem tępym o pożądanym stopniu nasilenia. Umieść ranną rybę w zbiorniku regeneracyjnym w celu monitorowania.
    UWAGA: W zależności od stopnia nasilenia urazu może dojść do śmierci lub wystąpienia napadów toniczno-klonicznych. Jeśli ryby nie reagują przez dłuższy czas po TBI, użyj pipety transferowej lub pęsety, aby ucisnąć ogon i ocenić reakcję bólową.

2. Ocena napadów drgawek po TBI u dorosłych rybek danio pręgowanych

  1. Zanurz rybę w środku znieczulającym i wykonaj uraz zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, a następnie umieść ranną rybę w napowietrzanym zbiorniku regeneracyjnym zawierającym 2 L wody systemowej.
  2. Obserwuj ryby pod kątem wystąpienia jakichkolwiek oznak napadów potraumatycznych bezpośrednio po umieszczeniu ich w zbiorniku regeneracyjnym. Wyznacz czas obserwacji (np. 1 h) i zapisz całą aktywność napadową, w tym ocenę napadu (opisaną poniżej), czas trwania każdego napadu oraz odsetek ryb, u których wystąpiły napady (Ryc. 2A).
    UWAGA: Napady mogą wystąpić natychmiast po urazie, a także godziny lub dni po TBI. Napady mogą utrzymywać się długoterminowo, a jedna ryba może przejść wiele napadów. Ustalenie czasu obserwacji wynoszącego 1 h lub więcej pozwoli na uzyskanie dobrej reprezentacji ogólnej tendencji częstości występowania napadów.
  3. Oceń stan ryb, korzystając z wytycznych Mussulini18 dotyczących fenotypów napadów u dorosłych danio pręgowanych.
    ​UWAGA: Bez użycia oprogramowania do śledzenia trudne jest obiektywne ocenienie napadów o wyniku poniżej 3. Dlatego w przypadku oceny przeprowadzanej bez użycia oprogramowania należy zapisywać jedynie wyniki napadów równe 3 lub wyższe.

3. Disekcja mózgu

  1. Uśmierć ryby w roztworze 2-fenoksyetanolu o stężeniu 1:500 (2 mL/1 L, 0.2%), aż do ustania ruchów skrzelowych i braku reakcji na uciśnięcie płetwy, w pożądanym punkcie końcowym.
  2. Wypełnij szalkę Petriego plasteliną i utwórz niewielki otwór, aby podeprzeć ciało podczas sekcji.
  3. Umieść rybę grzbietem do góry w formie z plasteliny. Wbij jedną szpilkę sekcyjną w linii środkowej w połowie długości ciała ryby oraz drugą szpilkę ok. 5 mm za podstawą głowy.
  4. Pod stereomikroskopem rozetnij tępym narzędziem nerw wzrokowy za pomocą pęsety Dumont #5 i usuń oczy (Rysunek 2A).
  5. Ustaw rybę tak, aby koniec rostralny był najdalej podczas obserwacji przez mikroskop (Rysunek 2B).
    UWAGA: Kolejne kroki są przeznaczone dla osób praworęcznych. Osoby leworęczne mogą preferować wykonanie poniższych czynności w orientacji lustrzanej.
  6. Używając pęsety #5, powoli wsuń jeden koniec pęsety pod prawą płytkę ciemieniową, wykonując celowy ruch nożycowy w kierunku końca rostralnego, a następnie usuń prawą płytkę ciemieniową i czołową (Rysunek 2C).
    1. Trzymaj pęsetę pod kątem 45° lub mniejszym, aby uniknąć przebicia mózgu podczas sekcji.
  7. Obróć rybę o 90˚ zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Wsuń jeden koniec pęsety #5 pod lewą płytkę ciemieniową i stosując ten sam ruch nożycowy, usuń lewą płytkę ciemieniową i czołową, odsłaniając całą grzbietową stronę mózgu (Rysunek 2D,E).
  8. Tępym narzędziem przetnij szczękę za pomocą pęsety #5. Zachowaj cebulki węchowe i nie uszkadzaj ich, jeśli jest to obszar zainteresowania.
  9. Usuń prawą pokrywę, przedpokrywę, międzyoperkulum i podpokrywę za pomocą pęsety #5 (Rysunek 2F).
  10. Tępym narzędziem wyreseknuj muskulaturę na końcu ogonowym otworu czaszki, używając pęsety #5, aby odsłonić rdzeń kręgowy.
  11. Tępym narzędziem przetnij rdzeń kręgowy pęsetą #5. Ostrożnie wsuń pęsetę pod mózg i delikatnie wyjmij go z czaszki.
    UWAGA: Nigdy nie ściskaj mózgu. Używaj pęsety, aby „podtrzymać” mózg lub wyreseknuj tkanki ku dołowi i wykorzystaj odsłonięty rdzeń kręgowy jako punkt podparcia do manipulacji mózgiem.
  12. Utrwal usunięte mózgi w mieszaninie 9 części 100% etanolu i 1 części 37% formaldehydu przez noc w temperaturze 4°C na platformie kołyszącej.

4. Badania nad obrzękiem mózgu u ryb zebrafish

  1. Zanurzyć ryby w anestetyku i zadać im obrażenia zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1, a następnie pozostawić ryby w zbiorniku regeneracyjnym do czasu, aż zaczną swobodnie pływać.
  2. Po zadaniu obrażeń umieścić ryby z powrotem w normalnych warunkach bytowania na 1 dzień.
  3. Po upływie wyznaczonego czasu przeprowadzić eutanazję ryb w roztworze 2-fenoksyetanolu w stężeniu 1:500.
  4. Wypreparować cały mózg lub obszar zainteresowania zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 3 i natychmiast umieścić mózg w małym naczynku do ważenia.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas przenoszenia mózgu, używając pęsety precyzyjnej, aby delikatnie położyć go w naczyniu do ważenia, unikając nakłuwania lub zdrapywania tkanki, co mogłoby doprowadzić do jej utraty.
  5. Oznaczyć (grupa obrażeń i numer mózgu) oraz wytarować dodatkowe małe naczynko do suszenia i ważenia na wadze. W celu uzyskania dokładnego pomiaru należy użyć wagi o rozdzielczości minimum 0.001 g.
  6. Przenieść mózg do wytarowanego naczynka do suszenia i zapisać masę mokrą mózgu. Ułożyć mózgi płasko w naczyniu, stroną grzbietową do góry.
  7. Umieścić naczynko do suszenia wraz z mózgiem w piecu do hybrydyzacji ustawionym na 60 °C na 8 h.
  8. Po wysuszeniu mózg może przywrzeć do naczynka, co może utrudnić jego usunięcie i przeniesienie do nowego, wytarowanego małego naczynka do ważenia. Należy unikać ściskania mózgu pęsetą, ponieważ może to doprowadzić do uszkodzenia wysuszonego organu i utraty tkanki. Zamiast tego należy złożyć końcówki pęsety precyzyjnej i, zaczynając od strony brzusznej mózgu, podważyć go ruchem ku górze.
  9. Wyznaczyć zawartość wody w każdym mózgu, korzystając ze wzoru (Rysunek 4):
    Wzór na zawartość wody, % Zawartość Wody=(masa mokra-masa sucha)/masa mokra*100, równowaga statyczna.

5. Markowanie proliferacji komórkowej wzdłuż neuroosi i przygotowanie utrwalonej tkanki.

  1. Przygotować 10 mM 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) w 2 mL ddH2O.
  2. Zanurzyć od 3 do 4 ryb jednocześnie w 50-100 mL 2-fenoksyetanolu w stężeniu 1:1000 (1 mL/1 L, 0,1%) w celu znieczulenia, aż ryby przestaną reagować na uciśnięcie ogona, w wybranym punkcie czasowym po urazie (zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1).
  3. Wyciąć częściowe otwory w mokrej gąbce i umieszczać w nich po jednej rybie, stroną brzuszną do góry.
  4. Za pomocą igły 30 G wstrzyknąć ~40 µL 10 mM EdU do ciała ryby. Przenieść rybę do zbiornika przechowawczego wypełnionego wodą systemową.
    UWAGA: Można przeprowadzać wielokrotne iniekcje w różnych punktach czasowych, aby oznakować większą liczbę proliferujących komórek; może to być konieczne, jeśli wymagany jest okres pogoni (chase period) dłuższy niż 1 tydzień.
  5. Pobrać mózgi zgodnie z opisem w sekcji 3 i umieścić je grupowo w szklanej fiolce o pojemności 5 mL zawierającej 2 mL mieszaniny 9 części 100% etanolu i 1 części 37% formaldehydu. Utrwalać mózgi w temperaturze 4 °C na platformie kołyszącej.
    UWAGA: Platforma kołysząca lub wytrząsarka zapobiega osiadaniu mózgów na dnie oraz zwijaniu się telencefalonu w przypadku całych mózgów.
  6. Rehydratyzować mózgi w tej samej szklanej fiolce, w której były utrwalane, przeprowadzając płukanie w malejącej serii stężeń etanolu: 75%, 50% i 25% przez 15 min każde, a następnie płukać przez 1,5 h w 5% sacharozy/PBS na kołysarce w temperaturze pokojowej. Przechowywać mózgi w szklanej fiolce przez noc w 30% sacharozy/PBS w temperaturze 4° C na platformie kołyszącej.
  7. Wyjąć mózgi z 30% sacharozy/PBS i przenieść je pęsetą do płytki 12-dołkowej (jedna grupa badawcza na dołek), w której dołki wypełnione są roztworem w stosunku 2:1 (2 części medium do mrożenia tkanek i 1 część 30% sacharozy/PBS). Inkubować mózgi przez noc w temperaturze 4 °C na platformie kołyszącej.
  8. Przenieść mózgi do kolejnego rzędu dołków w płytce 12-dołkowej, zanurzając je w 100% TFM na 2-24 h w temperaturze 4 °C.
  9. Użyć uchwytu do kriotomu, aby zatopić mózgi w TFM w pożądanej orientacji na suchym lodzie.
  10. Wykonać kriosiekcjonowanie (przekroje o grubości 16 μm) i zebrać sekcje na szkiełkach dodatnio naładowanych. Suszyć szkiełka na ogrzewaczu do szkiełek przez 1 h, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C lub kontynuować procedurę immunohistochemiczną.
  11. Stworzyć barierę hydrofobową na szkiełku wokół sekcji tkankowych i pozostawić do wyschnięcia na ogrzewaczu do szkiełek przez 20 min.
  12. Krótko płukać szkiełka w PBS przez 5 min, a następnie dwukrotnie w PBS-Tween 20 (0,05%) po 10 min każde.
  13. Przeprowadzić detekcję EdU przy użyciu zestawu EdU Cell Proliferation Kit zgodnie z instrukcjami producenta.
  14. Przeanalizować szkiełka i skwantyfikować fluorescencyjnie oznakowane komórki EdU przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego. Aby wyraźnie rozróżnić poszczególne komórki, wymagany będzie obiektyw o powiększeniu minimum 40x.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przygotowanie zestawu do indukowania urazów umożliwia szybki i prosty sposób zadawania skalowalnego urazu tępego TBI u dorosłych danio pręgowanych. Stopniowany stopień nasilenia w tym modelu urazów dostarcza kilku łatwo identyfikowalnych wskaźników skuteczności urazu, przy czym uraz naczyniowy jest jedną z najłatwiejszych do rozpoznania i najbardziej prominentnych patologii (Rycina 3). Szczep ryb użyty podczas indukowania urazu może sprawić, że wskaźnik ten będzie łatwiejszy lub trudniejszy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badania nad neurotraumą i związanymi z nią następstwami od dawna koncentrują się na tradycyjnych, nieregenerujących się modelach gryzoni20. Dopiero w najnowszych badaniach zastosowano różne formy uszkodzenia OUN w modelach regeneracyjnych 9,11,13,14,21. Modele te, choć wnikliwe, są ograniczone albo przez zastosowanie metody urazów rzadk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratorium Hyde za ich wnikliwe dyskusje, technikom Centrum Nauk Przyrodniczych Freimann za opiekę i hodowlę danio pręgowanego oraz University of Notre Dame Optical Microscopy Core/NDIIF za korzystanie z instrumentów i ich usługi. Praca ta była wspierana przez Centrum Badań nad Danio Pręgowanym na Uniwersytecie Notre Dame, Centrum Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej na Uniwersytecie Notre Dame oraz granty z National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Stypendium Strażników Wolności (JTH) oraz Stypendium Pata Tillmana (JTH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-fenoksyetanolSigma Alderich77699
#00 śrutRemingtonRMS237703,3 g do
śrutuRemingtonRMS237761,5 g waga do miTBI/moTBI
#5 Kleszcze DumontaWPI14098
5-etynylo-2'-deoksyurydynaLife TechnologiesA10044EdU
Szklana fiolka o pojemności 5 mlVWR66011-063
Zestaw do proliferacji komórek Click-iT EdULife TechnologiesC10340
CytoOne 12-dołkowa płytkaUSA ScientificCC7682-7512
Instant OceanInstant OceanSS15-10
frost dodatnio naładowane szkiełkaVWR48311-703
Super PAP Pen Liquid BlockerTed Pella22309
Środek do zamrażania tkanekVWR15148-031
sTBI#3 Super

Bibliografia

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths-United States, 2014. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , (2019).
  2. Galgano, M., et al. Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors. Cell transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).
  3. Santiago, L. A., Oh, B. C., Dash, P. K., Holcomb, J. B., Wade, C. E. A clinical comparison of penetrating and blunt traumatic brain injuries. Brain injury. 26 (2), 107-125 (2012).
  4. Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31 (6), 379-387 (2016).
  5. Faul, M., Xu, L., Wald, M., Coronado, V. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths. , (2010).
  6. Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
  7. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159(2019).
  8. Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445(2016).
  9. Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
  10. Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  11. Alyenbawwi, H., et al. Seizures are a druggable mechanistic link between TBI and subsequent tauopathy. eLife. 10, 58744(2021).
  12. Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelia-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
  13. McCutcheon, V., et al. A novel model of traumatic brain injury in adult zebrafish demonstrates response to injury and treatment comparable with mammalian models. Journal of Neurotrauma. 34 (7), 1382-1393 (2017).
  14. Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
  15. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
  16. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  17. Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
  18. Mussulini, B. H., et al. Seizures induced by pentylenetetrazole in the adult zebrafish: a detailed behavioral characterization. PloS One. 8 (1), 54515(2013).
  19. Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  20. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injuries. Nature Reviews Neuroscience. 14, 128-142 (2013).
  21. Amamoto, R., et al. Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury. eLife. 5, 13998(2016).
  22. Yamamoto, S., Levin, H., Prough, D. Mild, moderate and severe: terminology implications for clinical and experimental traumatic brain injury. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 672-680 (2008).
  23. Lund, S., et al. Moderate traumatic brain injury, acute phase course and deviations in physiological variables: an observational study. Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation and Emergency Medicine. 24, 77(2016).
  24. Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14 (5), 506-517 (2015).
  25. Ruff, R. M., et al. Recommendations for diagnosing a mild traumatic brain injury: a National Academy of Neuropsychology education paper. Archives of Clinical Neuropsychology: The Official Journal of the National Academy of Neuropsychologists. 24 (1), 3-10 (2009).
  26. Ganz, J., Brand, M. Adult neurogenesis in fish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (7), 019018(2016).
  27. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295, 263-277 (2006).
  28. Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Review of Visual Science. 6, 171-193 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Uraz czaszkowo-mózgowymodel TBI u rybek zebrafishregeneracja neuronalnamodel upadku z wysokościproliferacja komórekuszkodzenie naczynioweznakowanie EdUsekcja mózgu
Skalowalny model do badania skutków obrażeń spowodowanych siłą u dorosłych danio pręgowanych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.