Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie wypławków jajnika do analizy ultrastrukturalnej i barwienia przeciwciał

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62713

⸱

10 września 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Howard Hughes Medical Institute, 3Department of Human Genetics, University of California Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia kroki podjęte w celu przeprowadzenia sekcji jajników u wypławków słodkowodnych, Schmidtea mediterranea. Wypreparowane jajniki są kompatybilne z barwieniem immunologicznym przeciwciał i analizą ultrastrukturalną z transmisyjną mikroskopią elektronową w celu zbadania biologii komórek jajowych i komórek somatycznych, zapewniając głębię i jakość obrazowania, które wcześniej były niedostępne.

Streszczenie

Dostęp do komórek rozrodczych pozwala na badanie rozwoju komórek rozrodczych, mejozy i rekombinacji. Biotyp płciowy wypławka słodkowodnego, Schmidtea mediterranea, jest potężnym modelem bezkręgowców do badania specyfikacji epigenetycznej komórek rozrodczych. W przeciwieństwie do dużej liczby jąder i męskich komórek rozrodczych, wypławki jajowe są stosunkowo trudne do zlokalizowania i zbadania, ponieważ są tylko dwa jajniki, każdy z 5-20 oocytami. Głębsza lokalizacja w obrębie wypławka i brak ochronnych tkanek nabłonkowych również utrudniają bezpośrednią sekcję jajników wypławkowych.

Ten protokół wykorzystuje krótki krok fiksacji, aby ułatwić lokalizację i rozbiór wypławków jajników do dalszej analizy w celu przezwyciężenia tych trudności. Wypreparowany jajnik nadaje się do badania ultrastrukturalnego za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i barwienia immunologicznego przeciwciał. Technika preparacji opisana w tym protokole pozwala również na eksperymenty z zaburzeniami genów, w których jajniki są badane w różnych warunkach interferencji RNA (RNAi). Bezpośredni dostęp do nienaruszonych komórek rozrodczych w jajniku osiągnięty dzięki temu protokołowi znacznie poprawi głębokość i jakość obrazowania oraz umożliwi komórkowe i subkomórkowe badanie biologii oocytów.

Wprowadzenie

Anatomia płaska została zbadana za pomocą TEM w wielu tkankach1,2,3,4,5,6. Niewiele uwagi poświęcono jednak jajnikom czy oocytom. Niedostatek literatury na temat oocytów wynika częściowo z trudności w dostępie do tych komórek, co sprawia, że biologia wypławków oocytów jest w dużej mierze niezbadana. Narzędzia molekularne odkryły wiele mechanizmów regulacyjnych rozwoju jajników u wypławków za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Wszystkie te eksperymenty przeprowadzano na całych robakach lub wycinkach histologicznych całych robaków. Protokoły barwienia przeciwciał i hybrydyzacji in situ na całych robakach obejmują rozległe etapy wybielania, mycia i oczyszczania tkanek, które są czasochłonne i zajmą kilka dni.

Ogólnym celem opisanej tutaj metody jest zapewnienie dostępu do nienaruszonych, wypreparowanych wybrzuszeń jajników i oocytów, co usunie konieczność wybielania lub cięcia histologicznego i skróci czas mycia i oczyszczania tkanek w barwieniu przeciwciał i hybrydyzacji in situ. Wypreparowane jajniki poprawią również penetrację sondy lub przeciwciał oraz zwiększą głębokość i jakość obrazowania w mikroskopach świetlnych i elektronowych. Dostęp do wypreparowanych jajników i oocytów umożliwia prowadzenie badań w zakresie biologii komórki w rozdzielczości komórkowej i subkomórkowej z całymi, nienaruszonymi oocytami. Niedawne badanie na wypreparowanych jajnikach wypławkowych po raz pierwszy scharakteryzowało mejozę wypławków oocytów za pomocą TEM i mikroskopii konfokalnej21. Prace dostarczyły kompleksowego opisu nowego zjawiska zachodzącego podczas mejozy, zwanego pęcherzykiem otoczki jądrowej.

Tutaj prezentujemy szczegółowe procedury w sekcji wypławków jajników. Etap fiksacji był wystarczający, aby zachować strukturę komórek jajnika do preparacji i dalszej manipulacji (tj. przetwarzania do analizy TEM i mikroskopu świetlnego). Biorąc pod uwagę ich podobieństwo w budowie ciała i architekturze tkanek, protokół ten powinien być również szeroko informacyjny dla badania oocytów i ich jąder u kilku innych gatunków Platyhelminthes (np. rodzaju Dugesia lub Polycelis). Protokół ten jest prawdopodobnie nieistotny dla Macrostomum lignano ze względu na ich małe rozmiary i prawie przezroczystą architekturę ciała, co pozwoli na bezpośrednią obserwację jajnika i oocytów22,23,24. Obszar ciała, w którym znajdują się jajniki, jest bardziej rozpoznawalny optycznie (np. ciemniejszy pigment lub jaśniejszy pigment) u niektórych gatunków (np. Dugesia ryukyuensis9,25) niż S. mediterranea. Badania na tych gatunkach mogą w mniejszym stopniu opierać się na przedstawionych tutaj wytycznych dotyczących lokalizacji jajników u S. mediterranea, ale wykorzystują warunki fiksacji i rozwarstwienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie

  1. Przygotuj robaki: karmić wypławki płciowe dwa razy w tygodniu organiczną pastą z wątroby, aby osiągnąć dojrzałość płciową.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, takie robaki są większe niż 1 cm długości i mają gonopory za ujściem gardła.
  2. Przygotuj rozwiązania.
    1. Przygotuj następujące odczynniki: 16% paraformaldehyd (PFA); 50% wodny roztwór aldehydu glutarowego (GA); N-acetylo-L-cysteina (NAC); 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 i 2 mM KH2PO4.
    2. Rozcieńczyć 50% GA i 16% PFA PBS do końcowej mieszaniny 2,5% GA i 2% PFA. Rozcieńczyć 16% PFA z PBS do końcowego stężenia 4% PFA.
    3. Rozpuścić 5 g NAC w 100 ml PBS, aby uzyskać 5% roztwór roboczy.

2. Pobieranie jajników

  1. Dojrzałe płciowo robaki należy potraktować 5% NAC w naczyniu w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    UWAGA: Duże robaki mogą się zwijać. Do spłaszczenia robaków można użyć szczotek lub końcówek do pipet. Użyta ilość 5% NAC jest minimalna, wystarczająca, aby pokryć powierzchnię szalki Petriego.
  2. Zastąp NAC 10 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu i utrwal robaki na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu wstrząsając. Rozpocznij preparację 10 minut po dodaniu 4% PFA i przeprowadź sekcję w 4% PFA, gdy robaki są naprawiane.
  3. Obserwuj pigmentację nabłonka, aby zlokalizować brzuszne sznury nerwowe, które pojawiają się jako dwie linie o jaśniejszej pigmentacji biegnące od przednich zwojów głowowych w kierunku ogona.
  4. Zlokalizuj jajniki.
    UWAGA: Jajnik znajduje się tuż obok rdzenia nerwowego po stronie przyśrodkowej (Ryc. 1A). Polegaj na pigmentacji nabłonka, aby zlokalizować położenie jajnika w kierunku przednim i tylnym. Idealnie, pigmentacja nabłonka brzusznego w okolicy jajnika jest jaśniejsza niż otaczające obszary. U niektórych robaków pigmentacja nabłonka brzusznego nie zapewnia wystarczającej pewności. Robaki te można wyrzucić, ponieważ niektóre mogą nie mieć dobrze rozwiniętych jajników.
  5. Zweryfikuj położenie jajników, gdy przypuszczalne jajniki zostaną zlokalizowane przez pigmentację.
    UWAGA: Po pierwsze, jajniki znajdują się z tyłu zwojów głowowych. Po drugie, ciemne jądra są boczne w stosunku do powierzchni grzbietowej powyżej jajnika. Jajniki znajdują się przed najbardziej przednim jądrem (Ryc. 1B). Czasami płaty jąder są umieszczone na poziomie jajników lub nieco przed nimi.
  6. Użyj dwóch noży chirurgicznych, aby przeciąć tylną i przednią część dwóch jajników (Rysunek 1C), aby całkowicie usunąć przednie i tylne fragmenty robaka. Użyj jednego noża, aby zakotwiczyć robaka i wyczyść drugi nóż używany do wykonywania nacięć.
  7. Wytnij środkową linię fragmentu jajnika, aby oddzielić dwa jajniki. Odwróć fragment, aby mieć brzuszną stronę do dołu.
  8. Oderwij tkankę grzbietową, aby odsłonić jelito (Rysunek 1D) za pomocą dwóch par spiczastych pęset (typ 5-SA).
    UWAGA: Jajnik w kształcie kopuły znajduje się pod gałęziami jelit
    9. .
  9. Delikatnie usuń gałęzie jelita znajdujące się nad tkankami brzusznymi za pomocą końcówki pęsety lub miękkiej szczoteczki, aby odsłonić jajnik (Rysunek 1E).
  10. Usuń otaczające tkanki, aby usunąć jajnik (Rysunek 1F, G).
  11. Wyjmij jajniki i przenieś je do probówki o pojemności 1,5 ml w celu przemycia 1 ml PBS.

3. Fiksacja dla TEM

  1. Myj jajniki w PBS przez 10 minut, delikatnie potrząsając. Trzymaj rurki w pozycji pionowej i pozwól jajnikom opaść na dno pod wpływem grawitacji. Powtórz pranie raz.
    UWAGA: Jeśli jajniki nie toną, delikatnie wiruj przez 15 s za pomocą mini-wirówki stołowej (maksymalna prędkość 2000 × g).
  2. Zastąp PBS 2% PFA/2.5% GA/PBS.
  3. Utrwalić próbki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce z prędkością 40 obr./min.
  4. Przechowywać próbki w utrwalaczu w temperaturze 4 °C przez noc na wytrząsarce z prędkością 40 obr./min.

4. Przetwarzanie próbek dla TEM

  1. Umyj jajniki w PBS 3 razy po 10 minut każdy.
  2. Umyj jajniki w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O) 3 razy po 10 minut każdy.
  3. Po utrwaleniu jajników w 2% wodnym roztworze OsO4 przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Na tym etapie pojemniki na próbki muszą być uszczelnione parafilmem. Przygotować 2% OsO4 z wodą uzdatnioną metodą odwróconej osmozy (patrz Tabela Materiałów).
  4. Przepłukać próbki środkiem ddH2O 3 razy po 10 minut każda.
  5. Wstępnie wybarwić jajniki w 2% wodnym octanie uranylu (UA) przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Roztwór UA należy przefiltrować przed użyciem; Unikaj światła podczas barwienia en bloc. Przygotować 2% OsO4 z wodą uzdatnioną metodą odwróconej osmozy (patrz Tabela Materiałów).
  6. Przepłukać próbki w ddH2O 4 razy, delikatnie mieszając, po 10 minut każda.
  7. Odwodnić jajniki w stopniowanej serii etanolowej (30%, 50%, 70%, 95% i dwa razy 100%, 10 min każdy roztwór), a następnie zrównoważyć je w dwóch inkubacjach (10 min) w tlenku propylenu.
  8. W celu infiltracji żywicą należy inkubować próbki w mieszaninie 50% tlenku propylenu/50% ciekłej żywicy epoksydowej przez noc w temperaturze 4 °C. Próbki infiltrować 100% żywicą epoksydową z 3 zmianami (1 h każda zmiana) z delikatnym mieszaniem.
  9. Zanurz jajniki w 100% żywicy epoksydowej i polimeryzuj żywicę w temperaturze 60 °C przez 48 godzin.

5. Ultramikrotomia

  1. Przycinanie blokowe i kontrola próbek za pomocą mikroskopu świetlnego
    1. Przytnij bloki próbki do kształtu piramidy za pomocą żyletki.
    2. Ciąć odcinki o grubości 1-2 μm za pomocą noża szklanego lub diamentowego.
    3. Przenieś sekcje na szkiełko z kroplą wody, a następnie podgrzej szkiełko na płycie grzejnej, aż sekcje spłaszczą się i przylgną do powierzchni szkiełka podczas parowania wody.
    4. Przykryj sekcje kroplą 1% błękitu toluidynowego O i podgrzej je na gorącej płycie przez ~10 s. Opłucz szkiełko bieżącą wodą, a następnie pozostaw do wyschnięcia. Sprawdź skrawki pod zwykłym mikroskopem świetlnym.
  2. Cięcie, zbieranie i barwienie ultracienkich sekcji.
    1. Ciąć ultracienkie odcinki o grubości 50-70 nm za pomocą noża diamentowego. Przenieś sekcje z łodzi wodnej z nożem na siatkę lub jednoszczelinowe siatki miedziane.
    2. Zabarwić sekcje w 2% UA przez 8 min. Myć kratki w ruchu ddH2O przez 30 s.
    3. Skrawki należy barwić 1% roztworem ołowiu przez 6 minut. Myć sekcje w działaniu ddH2O przez 1 minutę i wysuszyć na powietrzu.

6. Gromadzenie i analiza danych

  1. Zbieraj dane TEM za pomocą odpowiedniego oprogramowania, np. Digital Micrograph (więcej szczegółów w Tabeli materiałów).
  2. Eksploatacja oscyloskopu przy napięciu 80 kV. Włóż siatkę próbki do oscyloskopu, gdy próżnia jest gotowa.
  3. Włącz wiązkę, klikając Światło w menu. Obracaj pokrętłem intensywności na lewym panelu sterowania, aż czas automatycznej ekspozycji wyniesie ~1 s. Kliknij Start Acquire, aby uzyskać ostateczny obraz.
  4. Twórz trójwymiarowe modele elektromagnetyczne przy użyciu pakietu do przetwarzania, modelowania i wyświetlania obrazów typu open source (IMOD).

7. Barwienie przeciwciał

  1. Umyj wypreparowane jajniki (krok 2.16) w probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml z 1 ml 1x PBS uzupełnionym 0,5% Triton X-100 (PBST). Umieść probówki na wytrząsarce w celu mieszania przy 40 obr./min przez 10 min. Pozwól rurkom stać w stojaku, a jajniki opadają grawitacyjnie. Zastąp pranie świeżym PBST i powtórz dwukrotnie.
  2. Trawić tkanki za pomocą 2 μg/ml proteinazy K i 0,1% dodecylosiarczanu sodu przez 10 minut w temperaturze pokojowej w PBST.
  3. Przepłukać strawione jajniki w PBST trzy razy przez 10 minut każde płukanie.
  4. Inkubować jajniki z 10% surowicą końską w PBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe od 1 do 100 w roztworze blokującym (10% surowicy końskiej w PBS z 0,5% Triton X-100). Jajniki należy inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
  6. Umyj jajniki w PBST trzy razy przez 10 minut każde płukanie.
  7. Inkubować jajniki z przeciwciałami drugorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając. Rozcieńczyć wszystkie przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:300 w roztworze blokującym.
  8. Umyj jajniki w PBST trzy razy, upewniając się, że pierwsze i trzecie płukanie trwa 10 minut. Wybarwić jądra jajników za pomocą Hoechst 33342 w rozcieńczeniu 1:300 w PBST przez 30 minut w temperaturze pokojowej w drugim płukaniu.
  9. Zamontuj jajniki na szkiełkach.
    UWAGA: Mocowanie zapobiegające blaknięciu może być używane do przedłużania sygnałów fluorescencyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu została opisana przez Guo i współpracowników21. Kluczem do udanej dysekcji jest prawidłowa identyfikacja pigmentacji jajników oraz punktów orientacyjnych dotyczących ich położenia. Strategia tej metody polega na przejściu od orientacji w szerokim obszarze do zlokalizowania konkretnego miejsca. Aby to osiągnąć, należy w pierwszej kolejności opierać się na wzorach pigmentacji grzbietowej i brzusznej (Rycina 1A,B

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Te oparte na fiksacji procedury preparowania wypławków jajników ułatwią zrozumienie mejozy oocytów, a także rozwoju i regeneracji jajników. Rozmiary oocytów i ich somatycznych komórek podporowych mogą wynosić od 20 μm do 50 μm. Metody oparte na rozbiorach zapewnią dostęp do nienaruszonych komórek pojedynczego jajnika, którego nie można osiągnąć metodą sekcji lub całościowym montowaniem. Protokół ten ułatwi badanie nienaruszonej anatomii wypławków jajnika i biologii komórek jajowych w rozdzielczości komórkowej i subkomórk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca była wspierana przez Instytut Medyczny Howarda Hughesa (LK i ASA) oraz Fundację Helen Hay Whitney (LHG).

Dostęp do oryginalnych danych leżących u podstaw tego manuskryptu można uzyskać w Repozytorium Oryginalnych Danych Stowers pod adresem http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16% paraformaldehydMikroskopia elektronowa Nauki15710Klasa EM
2% Wodnamikroskopia elektronowa19152
50% aldehyd glutarowyMikroskopia elektronowa Nauki16320
Mikrografia cyfrowaGatan Inc.Wersja 2.33.97.1, zbieranie danych TEM
Żywica EponMikroskopia elektronowa Nauki14120Embed 812 Zestaw, płyn, żywica epoksydowa
EtanolTed Pella19207Denaturowany
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Surowica końskaSigmaH1138
Octan ołowiuMikroskopia elektronowa Nauki
MilliQ wodauzdatniona metodą odwróconej osmozy
N-acetylo-L-cysteinaSigmaA7250
ParafilmsigmaP7793
Prolong Diamond Anti Blaknięcie MountantThermo Fisher ScientificP36965
Tlenek propylenuMikroskopia elektronowa Nauki75569Klasa EM
  Proteinaza KThermo Fisher Scientific25530049
Błękit toluidynowy OMikroskopia elektronowa Nauki92319
Transmisyjny mikroskop elektronowyFEITecnai G2 Spirit BioTWIN
Octan uranyluMikroskopia elektronowa 541093
OsO4 Nauki klasy EM 6080564

Bibliografia

  1. Brubacher, J. L., Vieira, A. P., Newmark, P. A. Preparation of the planarian Schmidtea mediterranea for high-resolution histology and transmission electron microscopy. Nature Protocols. 9 (3), 661-673 (2014).
  2. Carpenter, K. S., Morita, M., Best, J. B. Ultrastructure of the photoreceptor of the planarian Dugesia dorotocephala. I. Normal eye. Cell Tissue Research. 148 (2), 143-158 (1974).
  3. Ishii, S. The ultrastructure of the protonephridial flame cell of the freshwater planarian Bdellocephala brunnea. Cell Tissue Research. 206 (3), 441-449 (1980).
  4. Morita, M., Best, J. B., Noel, J. Electron microscopic studies of planarian regeneration: I. Fine structure of neoblasts in Dugesia dorotocephala. Journal of Ultrastructure Research. 27 (1), 7-23 (1969).
  5. Hyman, L. H. The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. 2, 550(1951).
  6. Higuchi, S., et al. Characterization and categorization of fluorescence activated cell sorted planarian stem cells by ultrastructural analysis. Development, Growth & Differentiation. 49 (7), 571-581 (2007).
  7. Chong, T., Stary, J. M., Wang, Y., Newmark, P. A. Molecular markers to characterize the hermaphroditic reproductive system of the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 11, 69(2011).
  8. Handberg-Thorsager, M., Salo, E. The planarian nanos-like gene Smednos is expressed in germline and eye precursor cells during development and regeneration. Development Genes and Evolution. 217 (5), 403-411 (2007).
  9. Kobayashi, K., et al. The identification of D-tryptophan as a bioactive substance for postembryonic ovarian development in the planarian Dugesia ryukyuensis. Scientific Reports. 7, 45175(2017).
  10. Maezawa, T., et al. Planarian D-amino acid oxidase is involved in ovarian development during sexual induction. Mechanisms of Development. 132, 69-78 (2014).
  11. Rouhana, L., Tasaki, J., Saberi, A., Newmark, P. A. Genetic dissection of the planarian reproductive system through characterization of Schmidtea mediterranea CPEB homologs. Developmental Biology. 426 (1), 43-55 (2017).
  12. Sato, K., et al. Identification and origin of the germline stem cells as revealed by the expression of nanos-related gene in planarians. Development, Growth & Differentiation. 48 (9), 615-628 (2006).
  13. Tharp, M. E., Collins, J. J., Newmark, P. A. A lophotrochozoan-specific nuclear hormone receptor is required for reproductive system development in the planarian. Developmental Biology. 396 (1), 150-157 (2014).
  14. Wang, Y., Zayas, R. M., Guo, T., Newmark, P. A. nanos function is essential for development and regeneration of planarian germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5901-5906 (2007).
  15. Zhang, S., et al. A nuclear hormone receptor and lipid metabolism axis are required for the maintenance and regeneration of reproductive organs. bioRxiv. , 279364(2018).
  16. Saberi, A., Jamal, A., Beets, I., Schoofs, L., Newmark, P. A. GPCRs direct germline development and somatic gonad function in planarians. PLoS Biology. 14, 1002457(2016).
  17. Steiner, J. K., Tasaki, J., Rouhana, L. Germline defects caused by Smed-boule RNA-interference reveal that egg capsule deposition occurs independently of fertilization, ovulation, mating, or the presence of gametes in planarian flatworms. PLoS Genetics. 12, 1006030(2016).
  18. Iyer, H., Issigonis, M., Sharma, P. P., Extavour, C. G., Newmark, P. A. A premeiotic function for boule in the planarian Schmidtea mediterranea. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3509-3518 (2016).
  19. Rouhana, L., Vieira, A. P., Roberts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. PRMT5 and the role of symmetrical dimethylarginine in chromatoid bodies of planarian stem cells. Development. 139 (6), 1083-1094 (2012).
  20. Wang, Y., Stary, J. M., Wilhelm, J. E., Newmark, P. A. A functional genomic screen in planarians identifies novel regulators of germ cell development. Genes & Development. 24 (18), 2081-2092 (2010).
  21. Guo, L., et al. Subcellular analyses of planarian meiosis implicates a novel, double-membraned vesiculation process in nuclear envelope breakdown. bioRxiv. , 620609(2019).
  22. Grudniewska, M., et al. Transcriptional signatures of somatic neoblasts and germline cells in Macrostomum lignano. Elife. 5, 20607(2016).
  23. Wudarski, J., et al. The free-living flatworm Macrostomum lignano. Evodevo. 11, 5(2020).
  24. Wudarski, J., et al. Efficient transgenesis and annotated genome sequence of the regenerative flatworm model Macrostomum lignano. Nature Communications. 8 (1), 2120(2017).
  25. Maezawa, T., Sekii, K., Ishikawa, M., Okamoto, H., Kobayashi, K. Reproductive and Developmental Strategies: The Continuity of Life. Kobayashi, K., Kitano, T., Iwao, Y., Kondo, M. , Springer. Japan, Tokyo. 175-201 (2018).
  26. Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F., Sanchez Alvarado, A. Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11861-11865 (2003).
  27. Orii, H., Mochii, M., Watanabe, K. A simple "soaking method" for RNA interference in the planarian Dugesia japonica. Development Genes and Evolution. 213 (3), 138-141 (2003).
  28. Rouhana, L., et al. RNA interference by feeding in vitro-synthesized double-stranded RNA to planarians: methodology and dynamics. Developmental Dynamics. 242 (6), 718-730 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biologia oocyt wtransmisyjna mikroskopia elektronowainterferencja RNArozw j kom rek zarodkowychbarwienie immunofluorescencyjneSchmidtea mediterranealokalizacja kom rek zarodkowych
Rozwarstwienie wypławków jajnika do analizy ultrastrukturalnej i barwienia przeciwciał
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.