Artykuł metodologiczny

Pobieranie tkanek i ekstrakcja RNA z ludzkiego stawu kolanowego z chorobą zwyrodnieniową stawów

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62718

⸱

22 lipca 2021

 ,  ,  , 
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

W tym artykule

Podsumowanie

Pierwotne tkanki uzyskane od pacjentów po całkowitej endoprotezoplastyce stawu kolanowego dostarczają eksperymentalnego modelu do badań nad chorobą zwyrodnieniową stawów z maksymalną kliniczną przekładalnością. Protokół ten opisuje, w jaki sposób identyfikować, przetwarzać i izolować RNA z siedmiu unikalnych tkanek kolana w celu wsparcia badań mechanistycznych w chorobie zwyrodnieniowej stawów u ludzi.

Streszczenie

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest przewlekłą i zwyrodnieniową chorobą stawów, najczęściej dotykającą kolano. Ponieważ obecnie nie ma lekarstwa, całkowita endoprotezoplastyka stawu kolanowego (TKA) jest powszechną interwencją chirurgiczną. Eksperymenty z wykorzystaniem pierwotnych tkanek ludzkiej choroby zwyrodnieniowej stawów uzyskanych z TKA dają możliwość zbadania mechanizmów chorobowych ex vivo. Podczas gdy wcześniej sądzono, że choroba zwyrodnieniowa stawów wpływa głównie na chrząstkę, obecnie wiadomo, że wpływa na wiele tkanek w stawie. Protokół ten opisuje selekcję pacjentów, przetwarzanie próbek, homogenizację tkanek, ekstrakcję RNA i kontrolę jakości (w oparciu o czystość, integralność i wydajność RNA) z każdej z siedmiu unikalnych tkanek w celu wsparcia badania mechanizmu choroby w stawie kolanowym. Za świadomą zgodą pobrano próbki od pacjentów poddawanych TKA z powodu choroby zwyrodnieniowej stawów. Tkanki zostały wypreparowane, umyte i przechowywane w ciągu 4 godzin od operacji poprzez błyskawiczne zamrażanie w celu utrwalenia RNA lub formaliny do histologii. Pobrano tkanki, w tym chrząstkę stawową, kość podchrzęstną, łąkotkę, podrzepkową poduszeczkę tłuszczową, więzadło krzyżowe przednie, błonę maziową i mięsień skośny obszerny przyśrodkowy. Protokoły ekstrakcji RNA zostały przetestowane dla każdego typu tkanki. Najbardziej znacząca modyfikacja dotyczyła metody dezintegracji stosowanej w przypadku tkanek twardych o niskiej liczbie komórek i wysokiej macierzy (uważanych za chrząstki, kości i łąkotki) w porównaniu ze stosunkowo wysokokomórkowymi tkankami miękkimi o niskiej macierzy (uważanymi za poduszeczkę tłuszczową, więzadła, błonę maziową i mięśnie). Stwierdzono, że proszkowanie jest odpowiednie dla tkanek twardych, a homogenizacja jest odpowiednia dla tkanek miękkich. Zaobserwowano skłonność niektórych osób do uzyskiwania wyższych wartości liczby integralności RNA (RIN) niż u innych osób w wielu tkankach, co sugeruje, że czynniki podstawowe, takie jak nasilenie choroby, mogą wpływać na jakość RNA. Zdolność do izolowania wysokiej jakości RNA z pierwotnych tkanek ludzkiej choroby zwyrodnieniowej stawów stanowi fizjologicznie istotny model dla wyrafinowanych eksperymentów z ekspresją genów, w tym sekwencjonowania, które mogą prowadzić do wglądu klinicznego, który jest łatwiej przekładany na pacjentów.

Wprowadzenie

Kolano to największy staw maziowy w ludzkim ciele, składający się ze stawu piszczelowo-udowego między kością piszczelową a kością udową oraz stawu rzepkowo-udowego między rzepką a kością udową1. Kości w kolanie są wyściełane chrząstką stawową i wspierane przez różne tkanki łączne, w tym łąkotki, tłuszcz, więzadła i mięśnie, a błona maziowa otacza cały staw, tworząc jamę wypełnioną płynem maziowym1,2,3 (Rysunek 1). Zdrowe kolano funkcjonuje jako ruchomy przegub zawiasowy, który umożliwia ruch bez tarcia w płaszczyźnie czołowej1,3. W stanach patologicznych ruch może stać się ograniczony i bolesny. Najczęstszą chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego jest choroba zwyrodnieniowa stawów (OA)4. Wiadomo, że różne czynniki ryzyka predysponują do rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów, w tym między innymi starszy wiek, otyłość, płeć żeńska, urazy stawów i genetyka5,6. Obecnie szacuje się, że w USA jest 14 milionów osób z objawową chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego, przy czym częstość występowania wzrasta ze względu na rosnący wiek populacji i wskaźniki otyłości7,8. Początkowo uważana za chorobę chrząstki, obecnie jest rozumiana jako choroba całego stawu9. Do powszechnie obserwowanych zmian patologicznych w chorobie zwyrodnieniowej stawów należą: erozja chrząstki stawowej, tworzenie się osteofitów, pogrubienie kości podchrzęstnej oraz zapalenie błony maziowej9,10. Ponieważ nie jest znane lekarstwo na chorobę zwyrodnieniową stawów, leczenie koncentruje się przede wszystkim na leczeniu objawów (np. bólu)11,12, a gdy choroba zwyrodnieniowa stawów postępuje do końcowego stadium, często zaleca się operację wymiany stawu13.

Operacje wymiany stawu mogą być częściową lub całkowitą wymianą stawu kolanowego, z całkowitą endoprotezoplastyką stawu kolanowego (TKA) obejmującą wymianę całego stawu piszczelowo-udowego i stawu rzepkowo-udowego. Od 2020 roku w USA każdego roku wykonywanych jest około 1 miliona TKAs14. Podczas TKA chirurg ortopeda wykonuje resekcję górnej części płaskowyżu piszczelowego i dolnych kłykci kości udowej (Rysunek 2A, 2B) w celu dopasowania implantów protetycznych. Czasami błędnie interpretowane przez pacjentów, w TKA tylko 8-10 mm jest wycinane od końca każdej kości, która jest następnie pokrywana lub ponownie wynurzana metalem. Umieszczona wkładka polietylenowa tworzy powierzchnię nośną (tj. wyściółkę) między dwoma metalowymi implantami. Ponadto kilka elementów tkanek miękkich stawu jest całkowicie lub częściowo wycinanych, aby uzyskać prawidłową równowagę stawu. Wśród tych tkanek znajdują się łąkotki przyśrodkowe i boczne (Ryc. 2C), poduszeczka tłuszczowa podrzepkowa (Ryc. 2D), więzadło krzyżowe przednie (ACL; Rysunek 2E), błona maziowa (Rycina 2F) i mięsień skośny obszerny przyśrodkowy (VMO; Rysunek 2G)15. Chociaż TKAs są zazwyczaj skuteczne w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów, około 20% pacjentów zgłasza nawrót bólu po operacji16. Wraz z wysokimi kosztami i względną inwazyjnością zabiegu, ograniczenia te wskazują na potrzebę dalszych badań w celu zidentyfikowania alternatywnych metod leczenia w celu złagodzenia postępu choroby zwyrodnieniowej stawów.

Aby zbadać mechanizmy chorobowe w chorobie zwyrodnieniowej stawów, które mogą stanowić nowe możliwości interwencji terapeutycznej, można użyć systemów eksperymentalnych, w tym komórek, eksplantatów tkanek i modeli zwierzęcych. Komórki są zwykle hodowane w monowarstwie i pochodzą z pierwotnych tkanek ludzkich lub zwierzęcych (np. chondrocytów wyizolowanych z chrząstki) lub komórek unieśmiertelnionych (np. ATDC517 i CHON-00118). Chociaż komórki mogą być przydatne do manipulowania zmiennymi eksperymentalnymi w kontrolowanym środowisku hodowli, nie rejestrują warunków naturalnego stawu, o których wiadomo, że wpływają na fenotypy komórek19. Aby lepiej podsumować złożoną kaskadę chemicznej, mechanicznej i międzykomórkowej komunikacji leżącej u podstaw choroby zwyrodnieniowej stawów, alternatywę znaleziono w pierwotnych próbkach tkanek ludzkich lub zwierzęcych, zarówno świeżych, jak i hodowanych ex vivo jako eksplantaty, w celu zachowania struktury tkankowej i mikrośrodowiska komórki20. W celu zbadania stawu in vivo przydatne są również małe (np. mouse21) i duże (np. horse22) modele zwierzęce pod kątem choroby zwyrodnieniowej stawów (np. poprzez indukcję chirurgiczną, zmiany genetyczne lub starzenie się). Jednak translacja z tych modeli na chorobę ludzką może być ograniczona między innymi przez różnice anatomiczne, fizjologiczne i metaboliczne23. Biorąc pod uwagę zalety i wady systemów eksperymentalnych, kluczowe zalety specyficzności gatunkowej i utrzymania niszy zewnątrzkomórkowej oferowanej przez pierwotne ludzkie tkanki zwyrodnieniowe zwyrodnieniowe zwiększają potencjał translacyjny wyników badań.

Pierwotne ludzkie tkanki zwyrodnieniowe stawów można łatwo uzyskać po TKA, co sprawia, że wysoka częstotliwość TKAs jest cennym źródłem do badań. Wśród potencjalnych zastosowań eksperymentalnych znajdują się ekspresja genów i analizy histologiczne. Aby zdać sobie sprawę z potencjału pierwotnych tkanek ludzkiej choroby zwyrodnieniowej stawów dla tych i innych podejść badawczych, należy wziąć pod uwagę następujące kluczowe kwestie. Po pierwsze, wykorzystanie próbek od pacjentów podlega regulacjom etycznym, a protokoły muszą być zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB)24. Po drugie, nieodłączna heterogeniczność pierwotnych tkanek chorobowych człowieka oraz wpływ zmiennych, takich jak między innymi wiek i płeć, stwarzają potrzebę starannej selekcji pacjentów (tj. stosowania kryteriów kwalifikacyjnych) i interpretacji danych. Po trzecie, unikalne właściwości biologiczne różnych tkanek w stawie (np. niska komórkowość chrząstki i łąkotki25) mogą stanowić wyzwanie podczas eksperymentów (np. izolowanie wysokiej jakości i ilości RNA). Niniejszy raport odnosi się do tych rozważań i przedstawia protokół selekcji pacjentów, przetwarzania próbek, homogenizacji tkanek, ekstrakcji RNA i kontroli jakości (tj. oceny czystości i integralności RNA; Rysunek 3) zachęcanie do wykorzystywania pierwotnych tkanek ludzkiej choroby zwyrodnieniowej stawów w środowisku naukowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół badania został zatwierdzony i zgodny z wytycznymi instytucjonalnymi ustalonymi przez Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB #13995).

1. Wybór pacjenta

  1. Zidentyfikuj pacjentów spośród tych, u których zaplanowano TKA u chirurga ortopedy.
  2. Wyboru pacjentów należy dokonać na podstawie kryteriów kwalifikacji określonych w protokole badania. Przykłady kryteriów włączenia obejmują ukończone 18 lat i potwierdzoną diagnozę choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego. Przykładami kryteriów wykluczenia są poddanie się częściowej wymianie stawu kolanowego lub potwierdzona diagnoza reumatoidalnego zapalenia stawów.
  3. Skontaktuj się z pacjentami w celu uzyskania świadomej zgody przed zabiegiem.

2. Przetwarzanie próbki (dla RNA)

UWAGA: Przeprowadź wszystkie procesy przetwarzania tkanek w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II i postępuj zgodnie z technikami sterylnymi. Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne) podczas przetwarzania próbek ludzkich. Podczas TKA wytwarzanych jest kilka fragmentów kości, duża ilość kości/chrząstki będzie potencjalnie dostępna do rozwarstwienia. Ze względu na postęp choroby, zwyrodnienie chrząstki stawowej może być bardziej nasilone w niektórych częściach kości, co można uwzględnić w projekcie eksperymentalnym. Tylko tkanki, które wymagają elektrokoagulacji do resekcji, mają termiczne uszkodzenie krawędzi, a skoordynowany wysiłek chirurgiczny jest podejmowany w celu pozyskania większości tkanek za pomocą skalpela, aby zminimalizować uszkodzenia. Wycięte tkanki muszą być przez cały czas nawodnione sterylnym PBS.

  1. Zdezynfekuj wszystkie powierzchnie robocze i sprzęt za pomocą 70% etanolu, środka odkażającego RNazy, wody uzdatnionej DEPC i ponownie 70% etanolu. Wytrzyj resztki płynu czystymi, niestrzępiącymi się chusteczkami. Kleszcze, obcinacze do kości i skalpele są sterylizowane w autoklawie lub moczone w 70% etanolu przez co najmniej 10 minut przed użyciem. Utrzymuj sprzęt zanurzony w 70% etanolu, gdy nie jest używany natychmiast.
  2. Wstępnie oznacz co najmniej trzy kriowiale zanonimizowaną nazwą próbki i podwielokrotnym numerem dla każdej tkanki (np. TKA-1 Chrząstka 1).
    1. Zidentyfikuj każdy typ tkanki z próbki na podstawie różnic w rozmiarze, kształcie, kolorze i teksturze, jak pokazano i opisano w Rysunek 2. Zidentyfikuj chrząstkę (Rysunek 2A strzałka), kość (Rysunek 2B strzałka), łąkotkę (Rysunek 2C), podrzepkową poduszkę tłuszczową (Rysunek 2D), więzadło krzyżowe przednie (Rysunek 2E), błonę maziową (Rysunek 2F) i mięsień skośny obszerny przyśrodkowy (Rysunek 2G).
  3. Odizoluj chrząstkę stawową.
    1. Wybierz część kości z minimalną degradacją chrząstki.
    2. Za pomocą skalpela nr 10 przeciąć chrząstkę tak daleko, jak to możliwe, aby wyciąć całą grubość warstwy chrząstki.
      UWAGA: Skalpel nr 10 przeniknie tylko do chrząstki, a nie do kości.
    3. Wykorzystując całą grubość chrząstki, rozetnij trzy kostki o średnicy 5 mm.
  4. Odizoluj kość podchrzęstną.
    1. Użyj tego samego odcinka kości, z którego pobrano chrząstkę.
    2. Za pomocą skalpela nr 10 zeskrob wszelkie pozostałe chrząstki i resztki tkanek z powierzchni kości.
    3. Przytrzymaj część kości do cięcia kleszczami i użyj noży do kości, aby przeciąć trzy kostki o średnicy 5 mm.
  5. Odizoluj łąkotkę.
    1. Zidentyfikuj stosunkowo nieuszkodzoną część łąkotki przyśrodkowej lub bocznej.
    2. Za pomocą skalpela nr 10 i kleszczy rozetnij trzy kostki o średnicy 5 mm.
  6. Wyizoluj podrzepkową poduszeczkę tłuszczową.
    1. Za pomocą skalpela nr 10 i kleszczy pokrój żółtą część tkanki na trzy równej wielkości i jednorodne porcje (~500 mg każda).
  7. Odizoluj więzadło krzyżowe przednie (ACL).
    1. Za pomocą skalpela nr 10 i kleszczy rozetnij trzy kostki o średnicy 5 mm.
  8. Wyizoluj błonę maziową.
    1. Za pomocą skalpela nr 10 i kleszczy odizoluj różową komórkową część błony tak bardzo, jak to możliwe, zeskrobując tkankę tłuszczową.
    2. Rozciąć trzy równej wielkości i jednorodne porcje (~200 mg każda).
  9. Wyizoluj mięsień obszerny przyśrodkowy skośny (VMO).
    1. Za pomocą skalpela nr 10 i kleszczy usuń tkankę tłuszczową z próbki, pozostawiając tylko czerwoną tkankę mięśniową.
    2. Przeanalizuj trzy kostki o średnicy 5 mm.
      UWAGA: Początkowy rozmiar tkanki ogranicza wielkość porcji.
  10. Opłucz porcje tkanek sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości lub zanieczyszczenia.
  11. Aby wykonać histologię, należy ustalić każdą część tkanki zgodnie z opisem w części 3.
  12. Aby przeprowadzić ekstrakcję RNA, należy pokroić każdą z trzech porcji tkanki na mniejsze kawałki (kostki ~1-2 mm).
    1. Przenieś mniejsze kawałki do kriowialu o pojemności 2 ml, szczelnie zabezpiecz nakrętki, błyskawicznie zamroź, zanurzając w ciekłym azocie na 30 s, a następnie przenieś do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania (do 4 miesięcy testowane w obecnym protokole). Powtórzyć tę czynność dla wszystkich podwielokrotności wszystkich tkanek.
    2. Przejdź do Homogenizacji tkanek zgodnie z opisem w części 4.

3. Przetwarzanie próbki (do histologii)

UWAGA: Formalina jest niebezpieczną substancją chemiczną, stosuje się ją tylko w dygestoriach chemicznych.

  1. Napełnij wstępnie oznakowane probówki stożkowe o pojemności 15 ml 10% roztworem formaliny.
  2. Za pomocą kleszczy przenieś wycinek tkanki do probówek wypełnionych formaliną.
  3. Utrwal tkanki w formalinie przez 1 tydzień w temperaturze pokojowej, potrząsając/mieszając, jeśli to możliwe.
  4. Po 1 tygodniu wyrzuć formalinę do odpowiedniego pojemnika na odpady chemiczne, spłucz chusteczki PBS, a następnie przenieś do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 70% etanolu do długotrwałego przechowywania w temperaturze 4 °C, aż próbki zostaną osadzone do podziału.
    UWAGA: Tylko w przypadku kości/chrząstki należy przeprowadzić odwapnienie w następujący sposób.
  5. Po 1 tygodniu wyrzuć formalinę do odpowiedniego pojemnika na odpady chemiczne i spłucz chusteczki PBS.
  6. Przenieś tkankę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 45 ml 10% roztworu EDTA (pH 7,4).
  7. Jeśli wstrząsanie/mieszanie nie jest możliwe, odwróć probówki 10-15 razy raz dziennie.
  8. Wyrzuć i zastąp roztwór EDTA raz w tygodniu.
    1. Dwa razy w tygodniu testuj teksturę za pomocą narzędzia (np. szpatułki) lub palca w rękawiczce, aby potwierdzić odwapnienie, obserwując deformację po przyłożeniu nacisku. Czas potrzebny do odwapnienia tkanki kostnej będzie się różnić w zależności od próbki od 4 do 6 tygodni.
  9. Po odwapnieniu przepłukać tkankę PBS i przenieść do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 70% etanolu w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze 4 °C do momentu osadzenia próbek w celu podzielenia na sekcje.

4. Homogenizacja tkanek

UWAGA: Protokół wykorzystuje niebezpieczny fenol. Praca z fenolem musi być wykonywana w dygestoriach chemicznych.

UWAGA: Dokładnie oczyść wszystkie urządzenia i powierzchnie, które mają być używane 70% etanolem (moczyć przez minimum 10 minut), następnie odkaż RNaza (moczyć przez minimum 10 minut), spłucz wodą uzdatnioną przez DEPC, wytrzyj czystym, niestrzępiącym się ręcznikiem papierowym, a następnie ponownie spryskaj lub namocz 70% etanolem.

  1. Homogenizacja tkanek twardych (chrząstka stawowa, kość podchrzęstna, łąkotka)
    1. Przed homogenizacją schłodź moździerz, tłuczek i szpatułkę za pomocą ciekłego azotu. Muszą one być przechowywane w jak najniższej temperaturze, aby zapobiec rozmrożeniu próbki.
    2. Próbki należy przetwarzać pojedynczo, utrzymując pozostałe próbki w temperaturze -80 °C do momentu ich użycia.
    3. Przenieść próbkę tkanki do zaprawy za pomocą schłodzonej szpatułki; wlać dodatkowy ciekły azot na wierzch tkanki i pozostawić do odparowania. Zmiażdż tkankę za pomocą tłuczka. Kilkakrotnie dodawaj więcej ciekłego azotu do próbki tkanki, pozwól mu odparować, a następnie kontynuuj mielenie tłuczkiem, aby uzyskać drobny proszek.
    4. Po sproszkowaniu tkanki w jak największym stopniu przenieś ją do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      1. Wstępnie schładzaj probówki, zanurzając je w ciekłym azocie na 30 s przed transferem tkanek.
    5. Dodać 1 ml roztworu kwasu, guanidyny-fenolu do każdej probówki i trzymać na lodzie.
    6. Powtórzyć kroki 4.1.3-4.1.5 dla każdej próbki tkanek twardych.
    7. Po każdej chusteczce wyczyść moździerz, tłuczek i szpatułkę 70% etanolem, środkiem odkażającym RNaza, wodą uzdatnioną DEPC i dodatkowo namocz w 70% etanolu. Wytrzyj resztki płynu czystą, niestrzępiącą się chusteczką.
    8. Próbki należy inkubować na lodzie przez dodatkowe 20 minut.
  2. Homogenizacja tkanek miękkich (poduszeczka tłuszczowa podrzepkowa, ACL, błona maziowa, VMO)
    1. Zdezynfekuj homogenizator, uruchamiając rurki z 70% etanolem, odkażaczem RNazy, wodą uzdatnioną DEPC i dodatkowym 70% płukaniem etanolem, każda przez 30 sekund. Wytrzyj resztki płynu czystą, niestrzępiącą się chusteczką. Powtórzyć tę czynność między każdą próbką.
    2. Wstępnie oznacz probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml dla każdej próbki. Do każdej probówki dodać 1 ml roztworu kwasu, guanidyny i fenolu.
      1. Pracuj na jednej próbce na raz, pozostawiając inne próbki do przetworzenia w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    3. Przenieść tkankę do wstępnie znakowanej probówki o pojemności 5 ml z kwasem, guanidyny-fenolem.
    4. Homogenizuj tkanki w impulsach 30 s, utrzymując na lodzie podczas i między impulsami. Powtarzaj, aż tkanka wizualnie się rozpuści lub maksymalnie przez pięć impulsów 30 s.
      UWAGA: Niektóre tkanki włókniste (np. mięśnie) mogą nie ulegać całkowitej homogenizacji.
    5. Inkubować rozpuszczoną tkankę na lodzie i przejść do następnej próbki.
      1. Wyczyść homogenizator zgodnie z opisem w kroku 4.2.1. Upewnij się, że kawałki tkanek nie pozostały w zębach sondy; W razie potrzeby usuń sterylnymi kleszczami.
    6. Po homogenizacji wszystkich próbek, inkubować na lodzie w kwasie-guanidyno-fenolu przez dodatkowe 20 minut.
    7. Przenieść próbki z probówek okrągłodennych do wstępnie oznakowanych i schłodzonych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.

5. Ekstrakcja RNA z tkanek

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje niebezpieczne substancje chemiczne, takie jak fenol, chloroform i izopropanol. Całą pracę należy wykonywać w dygestorium chemicznym.

UWAGA: Sprzęt i odczynniki są zarezerwowane tylko do pracy z RNA i muszą być odpowiedniej klasy chemicznej do zastosowań molekularnych (tj. sterylne, wolne od nukleaz). Protokół ten zastępuje zarówno części 4.1, jak i 4.2 protokoły homogenizacji tkanek. Dokładnie wyczyść wszystkie urządzenia i powierzchnie, które mają być używane, 70% etanolem (moczyć przez co najmniej 10 minut), a następnie przeprowadzić odkażanie RNazą (moczyć przez co najmniej 10 minut). Spłucz wodą uzdatnioną DEPC, wytrzyj pozostałą ciecz czystym, niestrzępiącym się ręcznikiem papierowym, a następnie ponownie spryskaj lub namocz 70% etanolem.

  1. Odwirować probówki do mikrowirówek o sile 10000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia zanieczyszczeń.
  2. Przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: W przypadku tkanek tłuszczowych warstwa lipidowa czasami będzie obecna na górze. Unikaj przenoszenia tego poprzez przekłuwanie warstwy z boku rurki końcówką pipety.
  3. Do każdej próbki dodać 200 μl chloroformu na 1 ml roztworu kwasowo-guanidynowo-fenolowego. Potrząsaj energicznie probówkami ręcznie przez 30 sekund, aby wymieszać. Następnie inkubować na lodzie przez 2 minuty.
  4. Odwirować próbki o masie 10000 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po odwirowaniu utworzą się trzy warstwy: faza wodna zawierająca RNA, interfaza białego DNA i różowa faza białkowa na dole.
  5. Przenieść ~500 μL górnej, wodnej fazy do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Nie zakłócaj interfazy i frakcji białkowych. Przechowywać te fazy w temperaturze -80 °C do przyszłej izolacji DNA lub białka.
  6. Dodać równą objętość roztworu kwasu-guanidyny-fenolu do przeniesionej fazy wodnej, wymieszać, odwracając probówkę 8-10 razy. Inkubować probówkę na lodzie przez 20 minut.
  7. Do każdej próbki dodać 200 μl chloroformu na 1 ml roztworu kwasowo-guanidynowo-fenolowego. Wstrząsaj energicznie ręcznie przez 30 sekund, aby wymieszać, a następnie inkubuj na lodzie przez 2 minuty.
  8. Odwirować próbki przy 10000 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Przenieść <500 μl fazy wodnej do świeżej probówki do mikrowirówki, uważając, aby nie zanieczyścić próbki innymi fazami.
    UWAGA: Pozostałe fazy należy wyrzucić odpowiednimi metodami usuwania materiałów niebezpiecznych.
  10. Do każdej próbki dodać równą objętość (jako fazę wodną) 100% izopropanolu. Wymieszaj, odwracając rurkę 8-10 razy. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
    1. Dodaj 1 μl kostrącu glikogenu do każdej próbki, aby pomóc w zlokalizowaniu osadu RNA po odwirowaniu.
  11. Odwirować próbki o masie 12000 x g przez 25 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Zlokalizuj granulkę w probówce (jeśli używasz współrecipitantu, będzie ona niebieska). Ostrożnie odlej supernatant.
  13. Umyj osad, dodając 1 ml lodowatego 75% etanolu do każdej próbki, przekręć wir, aby usunąć osad z dna probówki.
    UWAGA: Przygotuj 75% etanolu, używając czystego etanolu o czystości cząsteczkowej i wody wolnej od nukleaz
    14. .
  14. Wirować przy 7000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odlać sklarowany nad osadem.
  15. Powtórz kroki 5.13 i 5.14 jeszcze dwa razy.
  16. Szybkie wirowanie (<2000 x g przez 5 s), aby sprowadzić resztki płynu na dno tuby. Użyj pipety P20, aby usunąć resztki etanolu z dna probówek.
    1. Unikać dotykania osadu RNA końcówką pipety. Zmieniaj końcówki między próbkami.
  17. Przy otwartych nakrętkach probówek suszyć próbki na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    UWAGA: Pellet może stać się przezroczysty po wyschnięciu. Upewnienie się, że wszystkie resztki etanolu odparowały, poprawi czystość RNA.
  18. Dodaj 25 μl wody wolnej od nukleaz do każdej probówki, aby rozpuścić osad.
  19. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  20. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać RNA.
  21. Podwielokrotność 5 μl próbki do świeżej probówki w celu przeprowadzenia analizy w ramach kontroli jakości (część 6). Pozostałe 20 μl należy przechowywać w temperaturze -80 °C do oznaczania ekspresji genów.

6. Kontrola jakości

  1. Określić stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Określić integralność RNA za pomocą urządzenia do elektroforezy zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Rozcieńczyć RNA, aby mieścił się w zakresie granic wykrywalności chipa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Siedem unikalnych tkanek ludzkiego stawu kolanowego jest dostępnych do pobrania od pacjentów poddawanych TKA z powodu choroby zwyrodnieniowej stawów (Rysunek 1). W tym protokole każda z tych tkanek została zidentyfikowana i przetworzona w ciągu 4 godzin od chirurgicznego usunięcia (Ryc. 2). Postępując zgodnie z krokami opisanymi w Rysunek 3, porcje każdej tkanki zostały utrwalone formaliną w celu oceny histologicznej (Rysunek 4), podczas gdy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony protokół okazał się skuteczny w przypadku pobrania siedmiu pierwotnych tkanek ludzkiej choroby zwyrodnieniowej stawów w celu ekstrakcji RNA (Tabela 1) i przetwarzania histologicznego (Figura 4). Przed pobraniem próbek od pacjentów konieczne jest ustalenie protokołu zatwierdzonego przez IRB, najlepiej we współpracy z chirurgiem lub zespołem chirurgicznym. Zastosowanie ustandaryzowanego protokołu pobierania próbek (np. resekcja ze spójnych lokalizacji in situ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują uczestnikom badania, dzięki którym te badania były możliwe i dedykują ten raport nowym naukowcom w dziedzinie choroby zwyrodnieniowej stawów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlEppendorf05 402Sterylne, bez nukleaz. Zarezerwowane tylko do pracy z RNA.
10% FormalinCardinal HealthC4320-101Przechowywać w szafce chemicznej, gdy nie jest używany.
100% chloroform (klasa biologii molekularnej)Fisher ScientificICN19400290Sterylny, bez nukleaz. Zarezerwowany tylko do pracy z RNA, przechowuj w komorze chemicznej, gdy nie jest używany.
100% etanol (klasa biologii molekularnej)Fisher ScientificBP2818500Sterylny, wolny od nukleaz. Zarezerwowane tylko do pracy z RNA, podczas rozcieńczania należy użyć DEPC/wody wolnej od nukleaz
100% Isopropanol (klasa biologii molekularnej)Fisher ScientificAC327272500Sterylny, wolny od nukleaz. Zarezerwowany tylko do pracy z RNA, przechowuj w komorze chemicznej, gdy nie jest używany.
100% odczynnik AlcoholCardinal HealthC4305Rozcieńczony do 70% z dH2O do celów czyszczenia.
Sterylne naczynia hodowlane 15 cmThermo Scientific12-556-003Sterylne, bez nukleaz.
Probówki polipropylenowe (Falcon) 15 mlFisher Scientific14 959 53ASterylne, wolne od nukleaz.
2 ml kriowiale (z gwintem zewnętrznym)Fisher Scientific10 500 26Sterylne, bez nukleaz.
Probówki okrągłodenne 5 mlCorning352052Sterylne, bez nukleaz. Zarezerwowane tylko do pracy z RNA.
Probówki polipropylenowe (Falcon) 50 mlFisher Scientific12 565 271Sterylne, wolne od nukleaz.
BioanalizatorAgilentG2939BADo pomiaru integralności RNA.
Gabinet bezpieczeństwa biologicznego Ogólnysprzęt
laboratoryjny Obcinacze do kościFisher Scientific08 990Sterylizowane 70% EtOH.
Wyciąg chemiczny Ogólnysprzęt
laboratoryjny Skalpele jednorazowe (nr 10)Thermo Scientific3120032Sterylne, bez nukleaz.
EDTALife Technologies15-576-02810% roztwór z dH2O.
KleszczeKażdy sprzedawcasterylizowany 70% EtOH.
Glycoblue CoprecipitantFisher ScientificAM9516Zarezerwowany wyłącznie do pracy z RNA, przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
KimwipesFisher Scientific06-666
Ciekły azotDowolny sprzedawca
Ciekły azot DewarOgólny sprzęt laboratoryjny
Moździerz i tłuczekDowolny dostawcaZarezerwowane tylko do pracy z RNA, sterylizowane zgodnie z protokołem.
Spektrofotometr NanodropThermo ScientificND-2000Do pomiarów czystości i wydajności RNA.
Woda wolna od nukleaz/uzdatniona DEPCFisher ScientificSterylna, bez nukleaz. Zarezerwowane tylko do pracy z RNA.
PBS (sterylne)Gibco20 012 050Sterylne, wolne od nukleaz.
Pipety (2 i mikro; L, 20 i mikro; L, 200 i mikro; L, 1000 i mikro; L) & wskazówkiDowolny sprzedawcaSterylne, wolne od nukleaz.
Zestaw miRNA Plasma/Serum Zaawansowany zestawQiagen217204
Wirówka z chłodzeniem 5810REppendorf22625101
RNAlaterThermo Scientific50 197 8158Sterylne, wolne od nukleaz.
RNAse Away/RNAseZapFisher Scientific
7002
Szpatułka (rozmiar półmikro)Dowolny dostawcaZarezerwowane tylko do pracy z RNA.
Homogenizator tkankowyPro Scientific01-01200Zarezerwowany tylko do pracy z RNA, sterylizowany zgodnie z protokołem.
Odczynnik TRIzolFisher Scientific15 596 026Sterylne, wolne od nukleaz. Zarezerwowane tylko do pracy z RNA.
.

Bibliografia

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  2. Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
  3. Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. Anatomy, Hinge Joints. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  4. Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044(2017).
  5. Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
  6. O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
  7. Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
  8. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  9. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  10. McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
  11. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
  12. Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
  13. Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
  14. Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
  15. Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  16. Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
  17. Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
  18. Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180(2014).
  19. Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
  20. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
  21. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  22. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
  23. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
  24. Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32(2015).
  25. Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7(2010).
  26. Anatomy & Physiology, Connexions. OpenStax College. , Available from: http://cnx.org/content/col11496/1.6/ (2021).
  27. Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
  28. Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
  29. Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
  30. Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
  31. Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
  32. Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  33. Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
  34. Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443(2017).
  35. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
  36. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249(2020).
  37. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  38. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
  39. Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zwyrodnienie stawu kolanowegohomogenizacja tkanekludzki staw kolanowychrz stka stawowako podchrz stnatkanka kotkiekspresja gen wzamra anie b yskawicznebarwienie histologiczne

Powiązane artykuły