Artykuł metodologiczny

Obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62725

⸱

20 listopada 2021

 ,  ,  , 
1College of Pharmacy, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia kroki do pozyskiwania i analizy fluorescencyjnych obrazów wapnia z perycytów otaczających mózg oraz danych o przepływie krwi z pobliskich naczyń krwionośnych u znieczulonych myszy. Techniki te są przydatne do badań nad fizjologią komórek szkieletowych i mogą być dostosowane do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki.

Streszczenie

Ostatnie postępy w biologii białek i genetyce myszy umożliwiły pomiar wewnątrzkomórkowych fluktuacji wapnia w komórkach mózgowych in vivo i skorelowanie ich z lokalną hemodynamiką. Protokół ten wykorzystuje transgeniczne myszy, które zostały przygotowane z przewlekłym oknem czaszkowym i wyrażają genetycznie kodowany wskaźnik wapnia, RCaMP1.07, pod promotorem aktyny α mięśni gładkich, aby specyficznie znakować komórki ścienne, takie jak komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych i perycyty otaczające. Przedstawiono kroki, jak przygotować cewnik do żyły ogonowej do dożylnego wstrzyknięcia barwników fluorescencyjnych w celu śledzenia przepływu krwi, a także jak mierzyć hemodynamikę wapnia w perycytach mózgu i miejscowych naczyń krwionośnych (średnica, prędkość czerwonych krwinek itp.) za pomocą dwóch mikroskopii fotonowych in vivo przez okno czaszkowe u myszy znieczulonych ketaminą/ksylazyną. Na koniec przedstawiono szczegółowe informacje na temat analizy fluktuacji wapnia i filmów przepływu krwi za pomocą algorytmów przetwarzania obrazu opracowanych przez Barretta i in. 2018, z naciskiem na to, w jaki sposób procesy te można dostosować do innych danych obrazowania komórkowego.

Wprowadzenie

Unaczynienie ośrodkowego układu nerwowego składa się z przenikających tętniczek, naczyń włosowatych i żyłek wstępujących. W ramach tej sieci komórki ścienne, takie jak komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych, otaczają tętniczki i perycyty, rozszerzają procesy komórkowe wzdłuż pierwszych gałęzi tętniczek i naczyń włosowatych1. Wydaje się, że perycyty pełnią kilka ról w mózgu, w tym utrzymanie bariery krew-mózg1,2, migracja i ruchliwość3, potencjalne właściwości komórek macierzystych i regulacja przepływu krwi w mózgu4,5,6. Wiele funkcjonalnych ról perycytów zostało powiązanych z fluktuacjami wewnątrzkomórkowego wapnia, które mogą regulować rozszerzanie lub kurczenie się tych komórek4,5,6.

Kilka ostatnich badań ustaliło kryteria identyfikacji różnych typów perycytów mózgu7,8. Komórki ścienne w pierwszych 4 gałęziach tętniczek penetrujących otaczają perycyty w oparciu o ekspresję białka kurczliwego α aktyny mięśni gładkich (αSMA) i ich wystających, jajowatych somatów z procesami, które owijają się wokół naczyń krwionośnych7,8,9. Aby zobrazować fluktuacje wapnia w otaczających perycytach, protokół ten wykorzystuje nową transgeniczną linię myszy, Acta2-RCaMP1.07, znaną również jako Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. Myszy te wykazują ekspresję czerwonego, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia, RCaMP1.07, w komórkach eksprymujących αSMA (komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych i perycyty otaczające powłokę). Kolonie hodowlane są utrzymywane poprzez krzyżowanie zwierząt niebędących nosicielami z hemizygotami. RCaMP1.07 jest czerwonym białkiem fluorescencyjnym z domeną wiążącą kalmodulinę, która zwiększa fluorescencję podczas wiązania z wewnątrzkomórkowym calcium10,11. Protokół ten określa etapy połączonego obrazowania wapnia perycytów otaczających i pomiarów przepływu krwi za pomocą dwóch mikroskopii fotonowych, w tym procedury wstrzykiwania barwników fluorescencyjnych do żył ogonowych, akwizycję obrazu mikroskopowego u znieczulonych myszy oraz analizę danych za pomocą platform programistycznych (Rysunek 1). Techniki te są przydatne w rozwiązywaniu problemów dotyczących fizjologii komórek szkieletowych, ale można je dostosować do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki w mózgu lub innym układzie narządów.

10-miesięczna samica myszy Acta2-RCaMP1.07 została użyta do eksperymentu przedstawionego w tym artykule. Mysz przeszła operację przewlekłego okna czaszkowego i głowy po implantacji dwa miesiące wcześniej. Szczegóły dotyczące protokołu chirurgicznego zostały omówione w poprzednich badaniach12,13 a podobne procedury zostały przeprowadzone w innych wcześniej opublikowanych protokołach14,15. Naczynia krwionośne są znakowane zielonym fluoresceiną-dekstranem (70 000 MW, roztwór anionowy, 2,5% w/v) wstrzykiwanym dożylnie. Barwnik ten jest opłacalny i łatwo dostępny ze źródeł komercyjnych, ale ma szersze spektrum emisji, które może pokrywać się z emisją RCaMP i przebijać podczas akwizycji obrazu mikroskopowego. Kroki do rozmieszania widmowego są opisane w sekcji 4 poniżej, aby obejść ten zakaz, ale można również zastosować inne zielone barwniki o węższych widmach emisyjnych, takie jak te oparte na EGFP.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt doświadczalnych opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Manitoba, który jest zarządzany przez Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Przygotowanie i przygotowanie procedury

UWAGA: Do wstrzyknięcia cewnika do żyły ogonowej wymagane są następujące elementy: strzykawki z insuliną, 15-centymetrowy kawałek rurki PE10, igły 30 G, gaza, sól fizjologiczna, kleszcze, zielony barwnik dekstranowy fluoresceiny, szczypce i nożyczki. Należy również przygotować igłę ze znieczuleniem ketaminą/ksylazyną, która zostanie wstrzyknięta przed sesją obrazowania.

KRYTYCZNE: Wszystkie materiały i sprzęt w Krokach 1 i 2 muszą być wysterylizowane przed użyciem przez autoklawowanie lub płukanie 70% etanolem. Jeśli szczypiec nie można odpowiednio wysterylizować, zaleca się użycie pary dużych uchwytów na igły. Montaż cewnika należy wykonać za pomocą szczypiec i kleszczy, aby uniknąć przypadkowych nakłuć igły.

  1. Wytnij około 15-20 cm rurki polietylenowej, PE10 (średnica wewnętrzna 28 mm; średnica zewnętrzna 61 mm).
  2. Napełnij strzykawkę insulinową 27 G 0,9% soli fizjologicznej i zasznuruj igłę strzykawki na końcówce rurki polietylenowej. Przepchnij sól fizjologiczną przez rurkę, upewniając się, że nie ma wycieków.
  3. Za pomocą szczypiec zegnij igłę 30 G (0,3 mm x 25 mm) w przód iw tył, aż pęknie z piasty. Igła musi być czysta, bez zagięć.
  4. Trzymając igłę kleszkami, ostrożnie włóż igłę do końca rurki PE10, która jest przymocowana do strzykawki wypełnionej solą fizjologiczną i usuń pęcherzyki powietrza. To jest cewnik do wstrzykiwań.
  5. Przed wstrzyknięciem przefiltrować 30 μl 2,5% (w/v) dekstranu fluoresceinowego przez filtr 13-25 μm.
  6. Napełnić kolejną strzykawkę insulinową 30 μl porcji dekstranu i upewnić się, że w napełnionej strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.

2. Wstrzyknięcie żyły ogonowej

  1. Znieczulić mysz izofluranem (4% indukcji, 1,5% leczenia podtrzymującego) lub ketaminy/ksylazyny (60 mg/kg; 10 mg/kg; i.p.) i nałożyć żel nawilżający do oczu. Ketamina/ksylazyna jest zalecana do bardziej stabilnych pomiarów przepływu krwi podczas obrazowania, a dawkę można zwiększyć do 90 mg/kg; 10 mg/kg ketaminy/ksylazyny w przypadku dłuższych sesji obrazowania.
  2. Gdy mysz znajdzie się na chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia, umieść rękawicę wypełnioną ciepłą wodą na ogonie, aby rozszerzyć żyłę boczną.
  3. Zdejmij rękawicę po 30 s i wyczyść ogon etanolem.
  4. Umieść ogon między kciukiem a środkowym palcem. Naciskaj palcem wskazującym na ogon, aby rozszerzyć żyłę. Drugą ręką podnieś igłę cewnika za pomocą kleszczy, kierując ramkę do góry w kierunku sufitu.
  5. Po oczyszczeniu ogona 70% etanolem, płynnie, włóż igłę do żyły pod kątem 0° i delikatnie wstrzyknij sól fizjologiczną przez cewnik, aby upewnić się, że igła jest prawidłowo umieszczona.
    UWAGA: Jeśli nie ma oporu na tłoku i nie ma obrzęku ogona, oznacza to, że igła znajduje się w żyle. W przypadku znacznego oporu lub obrzęku igłę należy usunąć. Kroki 2.2-2.5 można powtórzyć do 3 razy z każdej strony ogona, wymieniając igłę 30G na końcu cewnika co drugą próbę, aż do prawidłowego umieszczenia.
  6. Gdy igła znajdzie się w żyle, zamienić strzykawkę z solą fizjologiczną na końcu cewnika na strzykawkę zawierającą dekstran fluoresceinowy (krok 1.6). Powoli wstrzyknąć dekstran do rurki cewnika, upewniając się, że do rurki nie dostały się pęcherzyki. Jeśli widoczny jest pęcherzyk powietrza, odetnij rurkę zawierającą pęcherzyk, aby ją usunąć i ponownie założyć strzykawkę.
  7. Po wstrzyknięciu całego dekstranu (30 μl podwielokrotności) należy wyjąć strzykawkę i zastąpić ją strzykawką z solą fizjologiczną. Wstrzyknąć pozostały dekstran z rurki do myszy, aż w probówce nie pozostanie żaden barwnik.
  8. Wyjmij igłę z ogona i uciskaj gazą przez 10-30 s, aż krwawienie ustanie.
    KRYTYCZNE: Jeśli po 6 próbach wstrzyknięcie żyły ogonowej nie powiedzie się, zwierzę powinno zostać zobrazowane podczas kolejnej sesji. Również całkowita objętość (sól fizjologiczna i dekstran) wstrzyknięta myszowi nie powinna przekraczać 100 μl.

3. Mikroskopia dwufotonowa

  1. Skupienie się na oknie czaszki
    UWAGA: Podczas zbierania danych należy stosować znieczulenie ketaminą/ksylazyną, ponieważ ma ono mniejsze działanie naczyniowe (rozszerzenie naczyń krwionośnych) niż izofluran. W przypadku stosowania izofluranu w powyższych krokach, przed obrazowaniem należy wstrzyknąć myszy ketaminę/ksylazynę i.p. (zalecana dawka opisana powyżej).
    1. Przymocuj mysz za pomocą przez słupek głowy do platformy z poduszką grzewczą pod mikroskopem.
    2. Nałóż smar do oczu myszy.
    3. Wyczyść okno czaszki za pomocą wilgotnych aplikatorów dentystycznych. Upewnij się, że nie pozostały żadne cząstki, które mogłyby zakłócać proces obrazowania.
    4. Nałóż żel ultradźwiękowy na okno.
    5. Ustaw ostrość przez obiektyw mikroskopu dwufotonowego, aż pod oknem będzie można zobaczyć naczynia krwionośne.
    6. Sprawdź oddech myszy i upewnij się, że poduszka grzewcza zapewnia wystarczające wsparcie temperatury.
  2. Akwizycja obrazu
    UWAGA: Mikroskop dwufotonowy użyty w tym eksperymencie ma przestrajalny laser Ti-Sapphire do wzbudzenia fluorescencji za pomocą komórki Pockel, która kontroluje ilość lasera docierającego do próbki. Emitowane światło jest dzielone przez dichroik długoprzepustowy 565 na dwie lampy fotopowielacza GaAsP (PMT) z filtrem pasmowo-przepustowym 595/50 (czerwony) i filtrem pasmowo-przepustowym 525/70 (zielony) do detekcji.
    Procedury opisane w krokach od 3.2 do 3.4 są wykonywane przy użyciu specjalnego oprogramowania mikroskopu dwufotonowego z tego protokołu (patrz tabela materiałów). Kroki te można dostosować do innego oprogramowania i sprzętu mikroskopowego.
    1. Przy wyłączonych światłach w pomieszczeniu ustaw żądaną długość fali w oprogramowaniu mikroskopu na 990 nm, aby wzbudzić zarówno RCaMP, jak i fluoresceinę-dekstran, klikając pole lasera 2-P.
    2. Ustaw moc lasera, klikając sekcję Power/Gain box/Lasers i dostosowując napięcie ogniwa Pockels 1 na 30% lub wartość 300 w skali 1000. Moc lasera, która dociera do próbki przy tym ustawieniu, została wcześniej określona na ~30 mW.
    3. Ustaw czułość detektora PMT, klikając sekcję Power/Gain box/PMTs i dostosowując wartość do 700-800.
      UWAGA: Wartości te można regulować w stosunku do intensywności próbki fluorescencyjnej i należy je wyzerować przed włączeniem świateł w pomieszczeniu.
    4. Przejdź do sekcji Rozdzielczość obrazu i kliknij rozdzielczość 512 x 512, aby uzyskać większy rozmiar obrazu.
    5. Kliknij 2-P Laser/Otwórz, aby otworzyć migawkę lasera 2-P.
    6. Przejdź do sekcji Skanowanie i kliknij przycisk Live Scan (Skanowanie na żywo).
      UWAGA: Skanowanie na żywo z tymi parametrami i wyższą rozdzielczością można zobaczyć dodatnie komórki muralowe RCaMP i fluorescencyjnie znakowane osocze krwi. Jeśli sygnał jest słaby, wartość pockel można zwiększać, aż obraz będzie wyraźny.
      KRYTYCZNE: W powierzchownych warstwach tkanek moc lasera nie powinna przekraczać 50 mW, czyli około 600 w ustawieniach komórek Pockelsa w tym przykładzie.
  3. Uzyskanie głębokości stosu komórek ściennych i sieci naczyniowej
    UWAGA: Zaleca się nabycie stosu głębokości w celu prawidłowego zlokalizowania perycytów w sieci naczyniowej. Perycyty otaczające są zlokalizowane na pierwszej do czwartej gałęzi od tętniczki penetrującej7,8,9. Oprogramowanie mikroskopowe wykorzystywane w tym protokole określa stosy głębokości jako "serię Z".
    1. Przesuwając obiektyw mikroskopu w płaszczyźnie X, Y i Z, zlokalizuj dużą tętnicę na powierzchni mózgu w oparciu o znakowanie komórek mięśni gładkich RCaMP.
    2. Kliknij pole Z-Series.
    3. Skoncentruj się na górnej części tkanki w pobliżu naczyń krwionośnych, ustaw ją jako punkt zerowy i górę stosu serii Z, klikając sekcję Bieżąca seria Z / pozycja początkowa [μm]. Kliknij pole z czterema czarnymi paskami i jednym czerwonym paskiem na górze.
    4. Skoncentruj się w tkance na żądanej głębokości i ustaw ją jako spód stosu, klikając sekcję Bieżąca seria Z/pozycja zatrzymania [μm]. Kliknij pole z czterema czarnymi paskami i jednym czerwonym paskiem na dole.
    5. Ustaw grubość każdej płaszczyzny obrazu (rozmiar kroku) na 1-2 μm, wpisując żądaną wartość w polu poniżej przycisku "Rozmiar kroku" (przycisk Rozmiar kroku jest zlokalizowany w sekcji Seria Z/Bieżąca seria Z). Spowoduje to zdefiniowanie liczby obrazów, które są pobierane w stosie.
    6. Ustaw moc lasera tak, aby rosła wykładniczo, gdy mikroskop przesuwa się głębiej w stosie, klikając pole Kompensacja lasera/PMT i wybierając opcję Relative (Exponential Gradient).
    7. Nazwij plik, wybierz folder, aby go zapisać i kliknij Start Z-series.
    8. Po pobraniu otwórz serię Z w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.
    9. Połącz dwa kanały jako kolorowe obrazy i przeskanuj stos w poszukiwaniu interesujących perycytów i naczyń krwionośnych, klikając w polu Obraz | Kolor | Podział kanałów; Obraz | Kolor | Scalanie kanałów.
    10. Wybierz obszary zainteresowania (ROI), które zawierają perycyty i zapisz pozycje, aby pomóc zlokalizować te miejsca ponownie w przyszłych sesjach obrazowania.
  4. Akwizycja filmu z obrazowania wapnia w serii T (czas)
    1. Używając stosu głębokości i ROI z góry jako odniesienia, przesuwaj obiektyw mikroskopu w osiach X, Y i Z w trybie skanowania na żywo, aż zostanie znaleziony interesujący perycyt.
    2. Aby zebrać film ze zdarzeniami wapniowymi w perycytach, zwiększ liczbę klatek na sekundę (>10 klatek na sekundę), przechodząc do sekcji Rozdzielczość obrazu i klikając pole 128x128.
    3. Ustaw czas trwania obrazowania na 60 s, klikając pole T-series i wprowadzając czas w polu czasu trwania.
    4. Obok pola Zapisz ścieżkę kliknij przycisk z trzema kropkami, aby zaktualizować ścieżkę zapisu o unikalną nazwę pliku.
    5. Powiększ optycznie naczynie, aby uwzględnić niższą rozdzielczość i uzyskać bliższy widok perycytu, dostosowując wartość w sekcji Zoom optyczny [mag].
    6. Zdobądź serię T, klikając przycisk Rozpocznij serię T.
  5. Pomiary hemodynamiki za pomocą kymogramów (skany liniowe)
    1. Ustaw ostrość na interesującym Cię naczyniu w rozdzielczości 512 x 512 pikseli w trybie Live Scan.
    2. Aby zmierzyć średnicę naczynia krwionośnego i prędkość czerwonych krwinek, kliknij na Line Scan, aby rozpocząć jednowymiarowe skanowanie za pomocą mikroskopu.
    3. Ustaw czas trwania skanowania (30-60 s) w milisekundach.
    4. Narysuj linię, która przecina interesujące Cię naczynie na pół i przesuwa się równolegle wzdłuż naczynia. Spowoduje to wygenerowanie kimografu średnicy naczynia po lewej stronie i smug czerwonych krwinek przemieszczających się przez naczynie po prawej stronie.
      UWAGA: Wiele naczyń krwionośnych można mierzyć tą samą linią, o ile znajdują się one w tej samej płaszczyźnie obrazowania.
    5. Nazwij plik i kliknij przycisk Rozpocznij linie, aby pobrać dane.

4. Analiza obrazu

  1. Analiza filmu wapniowego.
    UWAGA: Protokół ten przedstawia kroki do rozmieszania spektralnego (Rysunek 2) oraz dwie różne metody analizy zdarzeń wapniowych w perycytach przy użyciu ręcznych, ręcznie wybieranych ROI (Rysunek 3) i zautomatyzowanej, opartej na aktywności selekcji ROI (Rysunek 4) < sup class="xref">16,< sup class="xref">17. W celu wykrycia i sklasyfikowania pików sygnału ze znormalizowanym śladem wapnia z każdego ROI, dane są filtrowane długoprzepustowo i pasmowo-przepustowe, co pomaga wygładzić dane do oszacowania amplitudy i szerokości, a także zidentyfikować piki o różnych kształtach: pojedyncze szczyty, wiele pików i plateau (Rysunek 3B). Parametry tej analizy można zoptymalizować w celu wykrywania różnych typów dynamicznych sygnałów komórkowych. Poniższe kroki będą wymagały użycia oprogramowania do przetwarzania obrazu i oprogramowania do programowania z pakietami przetwarzania obrazu, które zawierają różne kody do analizy filmów wapniowych, jak wspomniano powyżej. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać pełną listę programów i pakietów używanych w tym protokole. Za pomocą tych pakietów można importować dane obrazowania z różnych typów mikroskopów, zachowując metadane z obrazów.
    UWAGA: Kroki 4.1.1-4.1.7 opisują, jak ręcznie wybierać ROI w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu do późniejszego wykorzystania w metodzie ręcznej analizy wapnia (krok 4.1.16)
    1. Załaduj obrazowanie wapnia serii T do oprogramowania do przetwarzania obrazu, przeciągając plik .xml na pasek narzędzi oprogramowania. Kliknij pole OK.
    2. Weź średnią ze stosu (średnia ze stosu jest oznaczona jako "projekcja Z" przez oprogramowanie do przetwarzania obrazu). Można to zrobić, klikając Obraz | Stosy | Projekcja Z na pasku narzędzi.
    3. Utwórz kolorowy obraz z obu kanałów, jak w kroku 3.3.9.
    4. Otwórz okno Menedżer ROI, klikając w polu Analizuj | Narzędzia | ROI Manager lub po prostu naciśnięcie litery "T" na klawiaturze.
    5. Wybierz narzędzie wielokąta, klikając kształt wielokąta na pasku narzędzi oprogramowania do przetwarzania obrazu i obrysuj widoczne struktury otaczające perycyty, takie jak soma i wyrostki.
    6. Kliknij przycisk Dodaj znajdujący się w oknie Menedżer ROI, aby dodać wybrane ROI w menedżerze ROI.
    7. Nadaj każdemu interesującemu regionowi unikalną nazwę, klikając przycisk Zmień nazwę i zapisz je jako folder zip, który można później załadować w oprogramowaniu do programowania, klikając Więcej>> | zapisz.
      UWAGA: Kroki 4.1.8-4.1.14 opisują, jak zaimportować wapń z serii T do platformy programowania i jak rozmieszać różne fluorofory wykryte przez mikroskopowe PMT do różnych kanałów (Rysunek 2).
    8. Otwórz oprogramowanie do programowania i upewnij się, że foldery pakietów przetwarzania obrazu znajdują się na ścieżce (patrz Spis materiałów).
    9. Zaimportuj wapń T-series do oprogramowania do programowania, wywołując funkcję BioFormats w oknie poleceń platformy programistycznej, która automatycznie otwiera okno wyboru pliku.
    10. Zdefiniuj, co ma być na każdym kanale, wprowadzając żądany numer. W tym przykładzie dane Kanał 1 odpowiedź=6 (cellular_signal), Kanał 2 odpowiedź=1 (blood_plasma).
    11. Wykreśl dane w postaci filmu w oprogramowaniu do programowania, aby ułatwić wizualizację, wywołując funkcję wykresu.
    12. W celu usunięcia zielonej fluorescencji z dekstranu fluoresceiny, która przenika do czerwonego kanału RCaMP, należy rozdzielić kanały w pakiecie przetwarzania obrazu, wywołując funkcję unmix_chs w oknie poleceń platformy programistycznej.
    13. Wybierz region, który zawiera tylko fluorescencję z tego fluoroforu w kanale 1, taki jak RCaMP w tym przypadku.
    14. Wybierz region, który zawiera tylko fluorescencję z fluoroforu 2, taki jak fluoresceina w osoczu krwi w tym przykładzie.
    15. Wybierz obszar tła, który nie ma fluorescencji z żadnego fluoroforu. W ten sposób generowana jest spektralna matryca wkładu, która jest stosowana do każdego piksela w każdym kanale. Znacząco poprawia lokalizację sygnału RCaMP, co poprawi wykrywanie zdarzeń wapniowych w tych strukturach.
      UWAGA: Jak wspomniano powyżej, istnieje wiele sposobów analizowania danych obrazowania wapnia w pakietach przetwarzania obrazu. Kroki 4.1.16-4.1.23 opisują metodę analizy zdarzeń wapniowych otaczających okołocyty przy użyciu ręcznych, ręcznie wybranych ROI.
    16. Uruchom analizę sygnalizacji komórkowej na niezmieszanym filmie wapniowym, wywołując funkcję CellScan w oknie poleceń platformy programistycznej.
    17. Kod zapyta "Której metody wykrywania ROI chcesz użyć?". Wpisz cyfrę 2, aby załadować ręcznie wybrane ROI na platformę programowania.
    18. Załaduj interesujące Cię obszary z folderu zip, które zostały wcześniej ręcznie wybrane z perycytów (Krok 4.1.6).
    19. Kod zapyta "Jaki jest współczynnik skali?". Określ współczynnik skali dla ręcznie wybranych ROI w odniesieniu do analizowanej serii obrazów i wpisz numer skali. W tym przykładzie współczynnik skali wynosi 1, ponieważ nie trzeba zmieniać rozmiaru ROI, ponieważ zostały wybrane na obrazach o wymiarach 128x128 pikseli, czyli tej samej rozdzielczości, co oryginalny film wapniowy.
    20. Wygeneruj wykresy każdego zwrotu z inwestycji i znormalizowanych śladów wapnia w różnych kolorach ( Rysunek 3A), wywołując funkcje procesu i wykresu w oknie poleceń.
    21. Jeśli kod nie wykrywa większości zdarzeń wapnia w poszczególnych śladach, zmodyfikuj wbudowane parametry w polu optymalizacji konfiguracji, wywołując funkcję opt_config i dostosowując wartości, takie jak zmniejszenie progu dla danych filtrowanych krótkoprzepustowo do trzykrotności odchylenia standardowego okresu linii bazowej, czyli pierwszych 30 ramek serii T.
    22. Wybierz przycisk Proces w polu optymalizacji, aby zastosować nowe parametry.
      UWAGA: W celu wykrycia i sklasyfikowania sygnałów, znormalizowany ślad wapnia jest filtrowany długoprzepustowo i pasmowo, co pomaga wygładzić dane do oszacowania amplitudy i szerokości, ale także określić, czy sygnały są pojedynczymi pikami, wieloma pikami czy plateau (Rysunek 3B).
    23. Dane wyjściowe można przedstawić w postaci pliku .csv, który zawiera informacje przestrzenne o obszarach zainteresowania i szczytach, które zostały zidentyfikowane przez wywołanie funkcji output_data w oknie polecenia. Nadaj plikowi unikalną nazwę do dalszej analizy w programie statystycznym.
      UWAGA: Kroki 4.1.24-4.1.31 opisują metodę analizy zdarzeń wapniowych w perycytach przy użyciu analizy ROI opartych na aktywności.
    24. Powtórz kroki 4.1.8.-4.1.16, aby zaimportować film wapniowy, rozdzielić kanały i wywołać funkcję CellScan na platformie programowania.
    25. Kod zapyta "Której metody wykrywania ROI chcesz użyć?". Wpisz cyfrę 6, aby wybrać automatyczną identyfikację obszaru zainteresowania na podstawie aktywności i zmiany fluorescencji w 3 wymiarach (x, y i czas; "algorytm 3D FLIKA").
    26. Wykreśl przetworzone wyniki, aby wyświetlić zidentyfikowane obszary zainteresowania jako różne kolory, wywołując proces i kreśl funkcje w oknie polecenia. Każdy ROI jest rozróżniany w czasie i przestrzeni i reprezentowany jako nałożona maska (Rysunek 4).
    27. Jeśli algorytm nie wykrywa ROI, które są wyraźnie widoczne gołym okiem, zmodyfikuj wbudowane parametry w polu optymalizacji, wywołując funkcję opt_config i dostosowując wartości, takie jak zwiększenie filtra Gaussa, który wygładza dane w czasie (o 2 s) i zmniejszenie progu znajdowania ROI do 3-krotności odchylenia standardowego linii bazowej.
    28. Wybierz przycisk procesu w polu optymalizacji, aby zastosować nowe parametry. W procesie optymalizacji należy zidentyfikować więcej ROI (Rysunek 4B).
    29. Wykreśl ROI w formie filmu, aby wyraźnie zidentyfikować obszary aktywności (oznaczone kolorami tęczy), zmieniając tryb domyślnego pola na film w oknie optymalizacji w celu dalszej wizualizacji.
    30. Wyprowadź dane jako plik csv, wywołując funkcję output_data w oknie polecenia. Plik ten można dalej analizować w programie statystycznym.
      UWAGA: Parametry analizy można dostosować tak, aby pasowały do dowolnego typu dynamicznego sygnału komórkowego (stosunek wapnia, FRET itp.). Wszystkie powyższe kroki można zautomatyzować za pomocą prostego kodu programowania, aby przetworzyć wsadowo wiele filmów wapniowych przy tych samych ustawieniach.
  2. Analiza przepływu krwi za pomocą skanu liniowego.
    1. Zaimportować plik danych kimografu ze skanowaniem liniowym uzyskany w sekcji 3.5 do oprogramowania do programowania.
    2. Kod zapyta "Co jest pokazane na kanale 1 i 2?". Zdefiniuj, co ma być na każdym kanale, gdy zostaniesz o to poproszony. W tym przykładzie Kanał 1 jest pusty (typ 0), a Kanał 2 jest blood_plasma (typ 1).
    3. Uruchom funkcję analizy średnicy podczas skanowania linii, wywołując funkcję LineScanDiam, która otwiera okno wyboru obszaru odpowiadającego średnicy na wykresie kimograficznym (Rysunek 5B, po lewej).
    4. Narysuj ramkę poza granicami fluorescencji kimografu, która odpowiada średnicy naczynia.
    5. Przetwarzaj tę klasę danych, wywołując funkcję procesu, aby zmierzyć pełną szerokość przy połowie maksimów dla średnicy naczynia i wygenerować wykres (Rysunek 5C) z funkcją wykresu.
    6. Wyprowadź dane jako plik csv, wywołując funkcję output_data w oknie polecenia. Plik ten może być dalej analizowany w programie statystycznym.
    7. Uruchom analizę transformacji prędkości radonu, wywołując funkcję LineScanVel, która otwiera okno wyboru obszaru odpowiadającego prędkości RBC na kimografie (Rysunek 5B, po prawej).
    8. Narysuj ramkę wewnątrz obramowania fluorescencji kimografu, która odpowiada prędkości naczynia.
    9. Przetwarzaj tę klasę danych, wywołując funkcję procesu w celu obliczenia prędkości, strumienia i gęstości liniowej czerwonych krwinek na podstawie kąta smug we fluorescencji. Wygeneruj wykres (Rysunek 5D) za pomocą funkcji wykresu.
    10. Wyprowadź dane jako plik csv, wywołując funkcję output_data w oknie polecenia. Plik ten można dalej analizować w programie statystycznym.
      UWAGA: Kymografy muszą mieć wyraźną fluorescencję z dobrze zdefiniowanymi krawędziami między czarnymi spacjami, aby analiza średnicy i prędkości była dokładna (Rysunek 5A, B). Bardzo ważne jest, aby precyzyjnie narysować linie ortogonalne i równoległe, w przeciwnym razie wiarygodna analiza kymogramów nie będzie możliwa. Podobnie jak w przypadku analizy wapnia z algorytmami przetwarzania obrazu, parametry do obliczeń średnicy i prędkości można zoptymalizować.

Wyniki

Fluroscyna-dekstran posiada szerokie widmo emisji, które może przenikać do kanału czerwonego, wpływając na detekcję RCaMP w perycytach otaczających (Ryc. 2A). Rozdzielenie spektralne (spectral unmixing) po akwizycji danych w programie komputerowym redukuje przenikanie fluoresceiny (Ryc. 2B, dół), co poprawia detekcję sygnału wapniowego w kolejnych etapach analizy.

Analiza wapnia z wykorzystaniem algorytmów przetwarzania obrazu zastosowanych w niniejszym protokole umożliwia zastosowanie kilku różnych podejść do identyfikacji ROI oraz wewnątrzkomórkowych fluktuacji wapnia (tzn. sygnałów wapniowych). Ręczny wybór struktur komórkowych pozwala na wykrycie fluktuacji wapnia w tych obszarach (Rycina 3A), w tym różnych rodzajów szczytów sygnału, takich jak szczyty pojedyncze i wielokrotne, po przefiltrowaniu znormalizowanych śladów wapniowych filtrem dolnoprzepustowym i pasmowo-przepustowym (Rycina 3B). Dodatkowo ROI są identyfikowane poprzez grupowanie aktywnych pikseli, w których intensywność fluorescencji zmienia się w czasie, przy użyciu algorytmów przetwarzania obrazu opracowanych przez Ellefsen i wsp. 201416 oraz Barrett i wsp. 201817 (Rycina 4). Metodę tę można zastosować do dowolnego dynamicznego sygnału komórkowego poprzez dostosowanie parametrów czasu, progu oraz parametrów przestrzennych tak, aby objęły one oczekiwaną wielkość i kształt sygnału. Obniżenie progu identyfikacji sygnału pozwala na znalezienie większej liczby obszarów zainteresowania (Rycina 4B).

Wyraźne i przejrzyste kymografy hemodynamiczne mogą być analizowane w celu pomiaru średnicy oraz prędkości RBC w naczyniach krwionośnych w pobliżu otaczających je perycytów (Rycina 5A, B). Średnicę oblicza się na podstawie pełnej szerokości połówkowej maksimum fluorescencji (Rycina 5C). Prędkość RBC szacuje się na podstawie smug powstałych z nieoznakowanych RBC, gdzie kąt jest wprowadzany do transformaty Radona w celu obliczenia prędkości, strumienia (komórki/s) oraz gęstości liniowej (komórki/mm; Rycina 5D). Kymografy słabej jakości, w których występuje nasycenie fluorescencji, niski stosunek sygnału do szumu lub przemieszczenie pola obrazowania (Rycina 6A), generują niewiarygodne wykresy z punktami błędów (czerwone krzyżyki) w miejscach, gdzie dane nie mogą zostać określone (Rycina 6B, C). Jakość pozyskanych danych jest kluczowa dla uzyskania poprawnego wyniku, a przestrzeganie kroków opisanych w niniejszym protokole zapewnia dobre rezultaty.

figure-results-1
Rysunek 1. Podsumowanie protokołu.Protokół przedstawia kroki służące do pozyskiwania i analizy fluorescencyjnych obrazów wapnia z perycytów otaczających mózg oraz danych o przepływie krwi z pobliskich naczyń krwionośnych u znieczulonych myszy. Protokół podzielony jest na 4 etapy. 1) Przygotowanie procedury: konfiguracja sprzętu i przygotowanie cewnika; 2) Iniekcja do żyły ogonowej; 3) Pozyskiwanie danych za pomocą mikroskopii dwufotonowej; 4) Analiza danych z wykorzystaniem algorytmów przetwarzania obrazu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2Odmieszanie spektralne fluoroforów. A) Reprezentatywny obraz średni perycyta otaczającego naczynie krwionośne z ekspresją RCaMP oraz naczynia krwionośnego znakowanego dekstranem z fluoresceiną, uzyskany z akwizycji serii T. Pasek skali= 10 µmB) Góra: Przy analizie poszczególnych kanałów widoczne jest przenikanie sygnału z kanału 2 do kanału 1 (po lewej). Dół: Po odsplątaniu spektralnym (spectral unmixing) przenikanie sygnału uległo zmniejszeniu, a sygnał z RCaMP jest bardziej wyraźny w strukturze perycyta. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji, kliknij tutaj.

figure-results-3
Rysunek 3Ręcznie wybrane obszary zainteresowania (ROI) i zoptymalizowane przebiegi stężeń wapnia. A) Wyznaczone w użytym oprogramowaniu do przetwarzania obrazów obszary zainteresowania (kształty tęczowe) mogą służyć do identyfikacji przebiegów sygnału wapnia. B) Piki sygnałów z znormalizowanych przebiegów są identyfikowane poprzez filtrowanie danych filtrem dolnoprzepustowym i pasmowym. Próg sygnału zdefiniowano jako 3-krotność odchylenia standardowego okresu bazowego (pierwsze 30 klatek), a każdy pik powyżej tego progu uznano za sygnał (dolny przebieg). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rysunek 4. Zautomatyzowane, oparte na aktywności ROI do analizy wapnia. Te same dane przeanalizowano przy progu wynoszącym 7-krotność odchylenia standardowego linii bazowej (A) oraz 3-krotność odchylenia standardowego linii bazowej (B). Obniżenie progu identyfikacji aktywnych pikseli pozwala na wykrycie większej liczby ROI (B) oraz szczytów sygnału (wykres kołowy) w obrębie perycytów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5Pomiary hemodynamiczne kymograficzne. A) Przykład skanu liniowego przez naczynie. B) Przykład wyraźnych kymografów dla średnicy (lewo) i prędkości (prawo). Czarne smugi w prawym pasie fluorescencji odpowiadają erytrocytom. C) Analiza średnicy z wyraźnymi fluktuacjami wazomotorycznymi. D) Analiza prędkości z wykresami, gdzie oś Y = strumień erytrocytów (komórki/s), gęstość liniowa (komórki/mm), prędkość (mm/s), kąt smugi (stopnie), stosunek sygnału do szumu (jednostki umowne, a.u.), a oś X = czas (s). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rysunek 6. Przedstawienie pomiarów hemodynamicznych o niskiej jakości. A) Przykłady niskiej jakości kymografów z nasyceniem fluorescencji, słabym stosunkiem sygnału do szumu lub przesunięciem pola obrazowania podczas akwizycji. B i C) Wykresy danych dotyczących średnicy i prędkości, analogiczne do Rysunku 7, zawierające punkty błędne (czerwone kropki) wynikające z niskiej jakości kymografów. (obraz E, oś Y=średnica (µm), oś X=czas (sec); obraz F, oś Y=strumień RBC (cells/s), gęstość linii (cells/mm), prędkość (mm/s), kąt smugi (degree), stosunek sygnału do szumu (a.u.), oś X=czas (sec). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Obecna metoda dostarcza szczegółowych informacji na temat wstrzykiwania żyły ogonowej myszy za pomocą cewnika, akwizycji obrazu za pomocą mikroskopu dwufotonowego dla stosów głębokości, filmów sygnalizacji wapniowej komórek, tworzenia kymografów hemodynamicznych oraz analizy wapniowej i hemodynamicznej za pomocą naszych algorytmów przetwarzania obrazu17 (Figura 1). Techniki te mają kilka zalet, które poprawiają wyniki obrazowania in vivo i skracają czas, zasoby i stres zwierząt podczas sesji. Po pierwsze, użycie cewnika do wstrzykiwania żyły ogonowej zapewnia większą kontrolę nad igłą, strzykawką i ilością substancji wstrzykiwanej do krążenia myszy. Dodatkowo zapobiega wstrzykiwaniu barwnika w tkankę ogona, oszczędzając drogie odczynniki. Po drugie, używamy transgenicznych myszy, które wykazują ekspresję genetycznie kodowanych czujników wapnia w osłonie perycytów i pokazują, jak zlokalizować je w sieci naczyniowej mózgu za pomocą głębokościowego stosu z, co ułatwia identyfikację i relokację komórek w kolejnych sesjach obrazowania w dłuższej perspektywie. Jest to ważny czynnik w badaniach perycytów i zapewnia prawidłową klasyfikację komórek 6,7. Po trzecie, podajemy nasze parametry do zbierania filmów wapniowych i hemodynamicznych danych ze skanowania liniowego, które są dobrym punktem wyjścia do pomiaru dynamicznych sygnałów komórkowych. Na koniec przedstawiamy nasze algorytmy przetwarzania obrazu17, kompleksowy zestaw narzędzi do przetwarzania obrazu, który zawiera wiele podejść do wstępnego przetwarzania obrazu (takich jak rozmieszanie widmowe), analiza obrazu wapnia i analiza hemodynamiczna (średnica, prędkość itp.). Algorytmy te mogą generować wykresy w celu szybkiej i łatwej wizualizacji danych, jednocześnie minimalizując poziom wiedzy użytkownika wymaganej do analizy wyników. Co więcej, można go zautomatyzować za pomocą kilku wierszy kodu, aby szybko przetwarzać wsadowo wiele zestawów danych o tych samych parametrach. Może to potencjalnie poprawić wizualizację danych i czas zainwestowany przez badacza.

Kluczem do zebrania dobrych danych obrazowania wapnia jest dostosowanie mocy lasera i ustawień PMT w celu uzyskania wyraźnego sygnału fluorescencji, ale także zbieranie danych z wystarczającą liczbą klatek na sekundę, aby uchwycić całe zdarzenie wapniowe. Dane w tym protokole zostały pozyskane z prędkością 10-11 klatek na sekundę, co pozwala uchwycić wolniejsze oscylacje wapnia w perycytach osłonki. Istnieje również kilka kroków podczas analizy, które mogą poprawić wynik analizy. Po pierwsze, rozmieszanie widmowe jest korzystne, jeśli widma emisyjne fluoroforów w znacznym stopniu się pokrywają (ryc. 2). Fluoresceina-dekstran został użyty w tym protokole, ponieważ jest to opłacalny i dostępny na rynku koniugat dekstranu, który jest powszechnie stosowany do pomiarów hemodynamicznych5. Dezmiksowanie spektralne pomaga oczyścić dane w celu lepszego wykrywania sygnałów wapniowych, ale można również zastosować alternatywne fluorofory o węższych widmach emisyjnych. Po drugie, ręczny wybór struktur komórkowych jako ROI (ryc. 3) jest przydatny do klasyfikowania zdarzeń wapniowych w różnych regionach subkomórkowych, takich jak soma lub gałęzie procesu. Wybór zwrotu z inwestycji na podstawie aktywności (ryc. 4)16 dostarcza więcej informacji przestrzennych i czasowych na temat poszczególnych zdarzeń związanych z wapniem. Może to być pomocne przy określaniu częstotliwości zdarzeń wapniowych na danym obszarze lub propagacji zdarzeń do innych obszarów komórkowych. Wykorzystanie oprogramowania programistycznego do analizy danych obrazowych może zaoszczędzić badaczom wiele godzin czasu podczas przetwarzania wsadowego, ale wymaga pewnej początkowej inwestycji czasowej w dostosowanie parametrów w celu uzyskania optymalnych wyników. Najważniejszymi czynnikami są oczekiwany rozmiar (wμm2) obszaru aktywnego, a także czas trwania sygnału (należy określić minimalny czas sygnału i maksymalny czas sygnału). Badacze muszą najpierw przeanalizować kilka przykładowych filmów z serii T, aby jak najlepiej określić, które parametry pasują do ich danych. Wreszcie, słabej jakości dane uzyskane pod mikroskopem mogą znacznie utrudnić analizę wapnia i hemodynamiki (ryc. 6). Dlatego na początku należy zadbać o optymalizację ustawień akwizycji mikroskopu. Mając na uwadze te czynniki, protokół ten można dostosować do obrazowania wapnia lub analizy innych dynamicznych sygnałów komórkowych (np. fluorescencyjnego sodu, potasu, metabolitów lub wahań napięcia) w innych tkankach lub typach komórek.

Istnieje kilka ograniczeń tego protokołu. Po pierwsze, dane są zbierane w znieczuleniu, które wpływa na aktywność mózgu i może wpływać na przepływ krwi. Podobne obrazowanie można wykonać u obudzonych myszy, które są szkolone do akceptowania fiksacji głowy w celu uzyskania bardziej fizjologicznych rezultatów. Dodatkowo należy pamiętać, że 2-wymiarowe obrazy trójwymiarowej komórki i naczynia krwionośnego zbieramy in vivo. Dlatego możemy uchwycić tylko frakcję zdarzeń wapniowych w tych komórkach lub przepływ krwi w jednej sekcji naczynia krwionośnego na raz.

Innym ograniczeniem, na które należy zwrócić uwagę, jest to, że dwufotonowe obrazowanie wapnia jest wrażliwe na artefakty ruchu, w których ruch do i z płaszczyzny ogniskowej może być mylony z wahaniami wapnia. Protokół ten został wykonany w znieczuleniu, co ogranicza ruch zwierzęcia; Jednak artefakty ruchowe mogą być wprowadzane przez częstość oddechów myszy, tętno, możliwy obrzęk tkanek, a w przypadku poszycia perycytów, skurcz naczyń lub wazomotorię 4,6,18,19. Artefakty ruchu można złagodzić za pomocą kilku strategii. Pakiety przetwarzania obrazu używane w tym protokole obejmują opcjonalny krok korekcji ruchu, który wykorzystuje silnik konwolucyjny 2D do wyrównania obrazów w serii T w oparciu o widzialne unaczynienie13,17. Klatki ze znaczącymi zmianami w płaszczyźnie ogniskowej są identyfikowane przez ten algorytm i mogą być wyłączone z analizy. Dodatkowo możliwe jest stosowanie strategii statystycznych w ramach pakietów przetwarzania obrazowania, takich jak wskaźnik Z podczas generowania śladów fluorescencyjnych w celu normalizacji fluktuacji wapnia wywołanych ruchem20. Najbardziej niezawodnym podejściem do uwzględnienia artefaktów ruchu w obrazowaniu dwufotonowym jest połączenie ekspresji dwóch wskaźników fluorescencyjnych w tej samej komórce, takich jak wskaźnik wapnia (np. GCaMP) i reporter fluorescencyjny (np. mCherry), który jest niezależny od wapnia. Wahania w reporterze fluorescencyjnym można następnie przypisać ruchowi i są one odejmowane od sygnału wskaźnika wapnia w celu normalizacji artefaktów ruchu.

Celem tego protokołu jest zapewnienie jasnego zrozumienia, w jaki sposób zbierać optymalne dane dotyczące obrazowania wapnia i przepływu krwi in vivo oraz przedstawienie nowych metod i narzędzi analitycznych, które naukowcy mogą wdrożyć w celu poprawy swoich wyników. Techniki te można zastosować do badania roli różnych populacji perycytów w kontroli przepływu krwi lub w różnych stanach chorobowych mózgu. Te parametry obrazowania mogą być również wykorzystywane do badania przepływu wapnia i krwi w innych typach komórek i układach narządów, a podobne zasady mają zastosowanie do innych technik obrazowania dynamicznego, które są możliwe dzięki innym genetycznie kodowanym czujnikom, poza wapniem.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

J. Meza jest wspierany przez stypendia z Mitacs i Research Manitoba. Fundusze na te prace zostały zapewnione przez Canadian Institutes for Health Research, Research Manitoba, Manitoba Medical Service Foundation, fundusze na rozpoczęcie działalności z University of Manitoba i Brain Canada za pośrednictwem Canada Brain Research Fund, przy wsparciu finansowym Health Canada i Azrieli Foundation. Poglądy wyrażone w niniejszym dokumencie niekoniecznie reprezentują poglądy Ministra Zdrowia lub Rządu Kanady.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Acta2-RCaMP1.07The Jackson Laboratory28345W protokole wideo użytym modelem zwierzęcym jest samica myszy w wieku 10 miesięcy, 1 dzień.
Pakiet aplikatorów (zwykłych)BiscoX-80250P
BioFormats dla MATLABNANAOkreślany w tym protokole jako "pakiety do przetwarzania obrazu".  Dostępne w: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/
CHIPS MATLAB toolboxNANAZdefiniowane w tym protokole jako "algorytmy przetwarzania obrazu". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: rozszerzalny zestaw narzędzi do komórkowej i hemodynamicznej analizy obrazu dwufotonowego. Neuroinformatyka. 2018; 16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Dostępne w: https://github.com/EIN-lab/CHIPS
Clear Ultrasound Gel, HealthCarePlusUGC250
, fluoresceina, 70 000 MW, anionowyThermo Fisher ScientificD1823
Dextran, Texas Red, 70 000 MW, neutralnyThermo Fisher ScientificD1830
Eye Lube PlusOptixcareNA
FIDŻIObraz JNAOkreślany w tym protokole jako "oprogramowanie procesora obrazu".  Dostępne w: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GCaMP6sfl/flPlatforma
University of ZurichNA
Ketamina (Narketan 100 mg/mL)Vetoquinol440893
MATLAB R2020bNAOkreślany w tym protokole jako "platforma programistyczna". Dostępne w: https://www.mathworks.com/downloads/
Igła 0,3 mm x 25 mmObiektyw BD PrecisionGlide305128
XLUMPLFLN20XWOlympusNAhttps://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/
PDGFRβ-CreERT2Rurka polietylenowa Jackson Laboratory30201
, PE10 ID 28mm (0.11") OD 61mm (.024”)BD Intramedic427401
Widok preriiMikroskopia fluorescencyjna BrukerNAhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html
Ultima Mikroskop wielofotonowy in vitroMikroskopia fluorescencyjna BrukerNA
https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html Podgrzewacz pod zbiornikiemReptitherm UHE169064
Ksylazyna (Rompun 20 mg/ml)Bayer HealthCare2169592
Dextran o średniej lepkości mocująca słupki do kierowania Jackson Laboratory

Bibliografia

  1. Armulik, A., Genové, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  2. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  3. Berthiaume, A. -A., et al. Dynamic remodeling of pericytes in vivo maintains capillary coverage in the adult mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
  4. Rungta, R. L., Chaigneau, E., Osmanski, B. -F. F., Charpak, S. Vascular compartmentalization of functional hyperemia from the synapse to the pia. Neuron. 99 (2), 362-375 (2018).
  5. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nature Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
  6. Gonzales, A. L., et al. Contractile pericytes determine the direction of blood flow at capillary junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 27022-27033 (2020).
  7. Hartmann, D. a, et al. Pericyte structure and distribution in the cerebral cortex revealed by high-resolution imaging of transgenic mice. Neurophotonics. 2 (4), 041402(2015).
  8. Grant, R. I., et al. Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (3), 411-425 (2017).
  9. Hill, R. A., Tong, L., Yuan, P., Murikinati, S., Gupta, S., Grutzendler, J. Regional blood flow in the normal and ischemic brain is controlled by arteriolar smooth muscle cell contractility and not by capillary pericytes. Neuron. 87 (1), 95-110 (2015).
  10. 28345 - STOCK Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J. Jackson Laboratory. , Available from: https://www.jax.org/strain/028345 (2021).
  11. Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials. PLoS ONE. 7 (7), (2012).
  12. Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
  13. Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
  14. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. JoVE. (12), e680(2008).
  15. Lin, X., et al. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. JoVE. (143), e56297(2019).
  16. Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).
  17. Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. L., Holub, M., Weber, B. CHIPS: an extensible toolbox for cellular and hemodynamic two-photon image analysis. Neuroinformatics. 16, 145-147 (2018).
  18. Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (1), 55-60 (2014).
  19. Nilsson, H., Aalkjaer, C. Vasomotion: mechanisms and physiological importance. Molecular interventions. 3 (2), 79-89 (2003).
  20. Rungta, R. L., et al. Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex. Communications Biology. , (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia dwufotonowaokno czaszkowewska nik wapniowypomiar przep ywu krwipr dko erytrocyt walgorytmy przetwarzania obrazumi nie g adkie naczy krwiono nych

Powiązane artykuły