Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62727

⸱

30 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathobiology, University of Guelph

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje >1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Streszczenie

Wektory wirusa związanego z adenowirusem (AAV) są jednymi z najbardziej zaawansowanych klinicznie wektorów terapii genowej, z trzema terapiami genowymi AAV zatwierdzonymi dla ludzi. Postęp kliniczny nowych zastosowań AAV obejmuje przejście od małych modeli zwierzęcych, takich jak myszy, do większych modeli zwierzęcych, w tym psów, owiec i naczelnych. Jednym z ograniczeń podawania AAV większym zwierzętom jest zapotrzebowanie na duże ilości wirusa o wysokim mianie. Chociaż hodowla komórek zawiesinowych jest skalowalną metodą produkcji wektorów AAV, niewiele laboratoriów badawczych ma sprzęt (np. bioreaktory) lub wie, jak wytwarzać AAV w ten sposób. Co więcej, miana AAV są często znacznie niższe, gdy są wytwarzane w zawiesinie komórek HEK 293 w porównaniu z przylegającymi komórkami HEK293. Opisano tutaj metodę wytwarzania dużych ilości AAV o wysokim mianie przy użyciu stosów komórek. Opisano również szczegółowy protokół miareczkowania AAV, a także metody walidacji czystości wektorów. Na koniec przedstawiono reprezentatywne wyniki ekspresji transgenu za pośrednictwem AAV w modelu owiec. Ten zoptymalizowany protokół produkcji wektorów AAV na dużą skalę w przylegających komórkach umożliwi laboratoriom biologii molekularnej postęp w testowaniu nowych terapii AAV na większych modelach zwierzęcych.

Wprowadzenie

Terapia genowa wykorzystująca wektory wirusa związanego z adenowirusem (AAV) poczyniła ogromne postępy w ciągu ostatnich trzech dekad1,2. Wykazana poprawa w zakresie różnych chorób genetycznych, w tym wrodzonej ślepoty, hemofilii oraz chorób układu mięśniowo-szkieletowego i ośrodkowego układu nerwowego, sprawiła, że terapia genowa AAV znalazła się w czołówce badań klinicznych3,4. W 2012 roku Europejska Agencja Leków (EMA) zatwierdziła Glyberę, wektor AAV1 wyrażający lipazę lipoproteinową (LPL) do leczenia niedoboru LPL, co czyni ją pierwszym pozwoleniem na dopuszczenie do obrotu terapii genowej w Europie lub Stanach Zjednoczonych5. Od tego czasu dwie dodatkowe terapie genowe AAV, Luxturna6 i Zolgensma7, otrzymały aprobatę FDA, a rynek ma się szybko rozwijać w ciągu najbliższych 5 lat, a do 2025 r. spodziewanych jest aż 10-20 terapii genowych8. Dostępne dane kliniczne wskazują, że terapia genowa AAV jest bezpieczną, dobrze tolerowaną i skuteczną metodą, co czyni ją jednym z najbardziej obiecujących wektorów wirusowych, z ponad 244 badaniami klinicznymi z udziałem AAV zarejestrowanymi w ClinicalTrials.gov. Rosnące zainteresowanie zastosowaniami klinicznymi z udziałem wektorów AAV wymaga solidnych i skalowalnych metod produkcji, aby ułatwić ocenę terapii AAV w dużych modelach zwierzęcych, ponieważ jest to krytyczny krok w procesie translacji9.

Dla produkcji wektorów AAV, dwoma głównymi wymaganiami są genom AAV i kapsyd. Genom typu dzikiego (wt)-AAV to jednoniciowy DNA o długości około 4,7 kb10. Genom wt-AAV składa się z odwróconych powtórzeń końcowych (ITR) znajdujących się na obu końcach genomu, które są ważne dla pakowania, oraz genów rep i cap11. Geny rep i cap, niezbędne do replikacji genomu, składania kapsydu wirusa i enkapsulacji genomu do kapsydu wirusa, są usuwane z genomu wirusa i dostarczane w trans do produkcji wektora AAV12. Usunięcie tych genów z genomu wirusa zapewnia miejsce dla terapeutycznych transgenów i wszystkich niezbędnych elementów regulatorowych, w tym promotora i sygnału poliA. ITR pozostają w genomie wektora, aby zapewnić prawidłową replikację genomu i enkapsulację wirusa13,14. Aby poprawić kinetykę ekspresji transgenu, genomy wektorów AAV można zaprojektować tak, aby były samokomplementarne, co łagodzi potrzebę konwersji z jednoniciowego na dwuniciowy DNA podczas replikacji genomu AAV, ale zmniejsza zdolność kodowania do ~2,4 kb15.

Poza projektem genomu AAV, wybór serotypu kapsydu określa tropizm tkanek i komórek wektora AAV in vivo2. Oprócz tropizmu tkankowego, wykazano, że różne serotypy AAV wykazują różną kinetykę ekspresji genów16. Na przykład Zincarelli i wsp.17 sklasyfikowali różne serotypy AAV na serotypy o niskiej ekspresji (AAV2, 3, 4, 5), serotypy o umiarkowanej ekspresji (AAV1, 6, 8) i serotypy o wysokiej ekspresji (AAV7 i 9). Podzielili również serotypy AAV na ekspresję o powolnym początku (AAV2, 3, 4, 5) lub ekspresję o szybkim początku (AAV1, 6, 7, 8 i 9). Te rozbieżne tropizmy i kinetyka ekspresji genów wynikają z różnic aminokwasów w białkach kapsydu, formacji białek kapsydu i interakcji z receptorami/koreceptorami komórek gospodarza18. Niektóre kapsydy AAV mają dodatkowe korzystne cechy, takie jak zdolność do przekraczania bariery krew-mózg po podaniu donaczyniowym (AAV9) lub rezydują w długowiecznych komórkach mięśniowych w celu trwałej ekspresji transgenu (AAV6, 6.2FF, 8 i 9)19,20.

Ten artykuł ma na celu opisanie opłacalnej metody produkcji wektorów AAV o wysokiej czystości, wysokim mianie, do wykorzystania w przedklinicznych dużych modelach zwierzęcych. Produkcja AAV przy użyciu tego protokołu odbywa się za pomocą transfekcji podwójnego plazmidu do przylegających ludzkich komórek embrionalnych nerek (HEK) 293 hodowanych w stosach komórkowych. Ponadto w badaniu opisano protokół oczyszczania chromatografii powinowactwa siarczanu heparyny, który może być stosowany do serotypów AAV zawierających domeny wiążące heparynę, w tym AAV2, 3, 6, 6,2FF, 13 i DJ21,22.

Dostępnych jest wiele systemów pakowania do produkcji wektorów AAV. Wśród nich zastosowanie dwuplazmidowych systemów kotransfekcji, w których geny Rep i Cap oraz geny pomocnicze Ad (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 i VA RNA) są zawarte w jednym plazmidzie (pHelper), ma pewne praktyczne zalety w porównaniu z powszechną metodą transfekcji trójplazmidowej (potrójnej), w tym obniżone koszty produkcji plazmidu23,24. Plazmid genomu AAV zawierający kasetę ekspresji transgenu (pTransgene) musi być otoczony przez ITR i nie może przekraczać ~ 4,7 kb długości. Transgen może mieć wpływ na miano i czystość wektora ze względu na potencjalne efekty cytotoksyczne podczas transfekcji. Ocena czystości wektorów została opisana w niniejszym dokumencie. Wektory wyprodukowane tą metodą, które dają 1 x 1013 vg / ml dla każdego, oceniano na modelach myszy, chomików i owiec.

Tabela 1: Skład wymaganych rozwiązań. Niezbędne informacje, w tym wartości procentowe i objętościowe, komponentów potrzebnych do różnych rozwiązań w całym protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Podwójna transfekcja plazmidowa komórek HEK293 w stosach komórkowych

  1. Rozmrozić krio-probówkę komórek HEK293 w łaźni z kuleczkami ustawionej na 37 °C.
    UWAGA: W czasie rozmrażania komórek należy wstępnie ogrzać kompletną pożywkę DMEM do 37 °C, aby zapobiec szokowi termicznemu podczas wysiewania. Należy upewnić się, że komórki mają niski numer pasażu, idealnie poniżej 20, aby zapewnić optymalny wzrost i wydajność transfekcji. Należy upewnić się, że komórki posiadają certyfikat braku zanieczyszczenia mycoplasma.
  2. Przenieść zawartość krio-probówki kroplami do probówki stożkowej 15 mL zawierającej 10 mL wstępnie ogrzanej kompletnej pożywki DMEM i odwirować komórki przy 500 x g przez 5 min.
  3. Odssać pożywkę, a następnie resuspendować komórki HEK293 w 20 mL wstępnie ogrzanej kompletnej pożywki DMEM. Wysiać komórki na płytkę 15 cm i inkubować w 37 °C, przy 5% CO2.
  4. Rozdzielić komórki z jednej płytki 15 cm na trzy w celu późniejszego wysiewu do komory hodowlanej.
    1. Po osiągnięciu przez komórki 80% konfluencji, odessać pożywkę i delikatnie przemyć płytkę 3 mL PBS, aby nie uszkodzić monowarstwy. Następnie odessać PBS i dodać 3 mL trypsyny.
    2. Inkubować przez 2 min w 37 °C, aż komórki odkleją się od płytki, a następnie zneutralizować trypsynę, dodając na płytkę 7 mL kompletnej pożywki DMEM.
    3. Zebrać całą pożywkę wraz z komórkami do probówki 15 mL i zgranulować komórki poprzez wirowanie przy 500 x g przez 5 min.
    4. Odssać nadsącz z probówki 15 mL i resuspendować osad komórkowy w 3 mL kompletnej pożywki DMEM. Dodać po 1 mL do każdej płytki 15 cm zawierającej 20 mL kompletnej pożywki DMEM; delikatnie poruszać płytkami, aby równomiernie rozprowadzić komórki, i inkubować w 37 °C, przy 5% CO2.
  5. Po osiągnięciu przez komórki 80% konfluencji, powtórzyć kroki 1.4.1 i 1.4.2. Zebrać nadsącz do probówek stożkowych 50 mL i delikatnie odwrócić probówkę, aby zapewnić homogeniczność zawiesiny komórkowej.
  6. Określić gęstość komórek, mieszając 10 µL próbek komórek z 10 µL błękitu trypanu i nakładając mieszaninę na szkiełko do liczenia komórek w celu analizy w liczniku komórek.
  7. Wymieszać 1 L wstępnie ogrzanej kompletnej pożywki DMEM z wymaganą ilością zawiesiny komórkowej, aby wysiać komorę hodowlaną (powierzchnia 6360 cm2) w zagęszczeniu 1 x 104 komórek/cm2. Wlać mieszaninę komórkową do komory hodowlanej i delikatnie obracać, aby równomiernie rozprowadzić komórki w każdej monowarstwie (Rycina 1), a następnie inkubować w 37 °C, przy 5% CO2.
  8. Oprócz komory hodowlanej, wysiać płytkę 15 cm w zagęszczeniu 1 x 104 komórek/cm2 jako referencję dla konfluencji.
  9. Po około 65-godzinnej inkubacji sprawdzić konfluencję na płytce referencyjnej — idealnie powinna wynosić ~80%-90%.
    ​UWAGA: Kompletną pożywkę DMEM do dodania do komory hodowlanej należy wstępnie ogrzać do 37 °C.

Przenoszenie pożywki do hodowli komórkowej, schemat wlewania do kolby, technika laboratorium biotechnologicznego, obchodzenie się z cieczami.
Rycina 1: Manipulacja zestawem warstwowym do wysiewania i transfekcji komórek. Aby wysiać komórki do zestawu warstwowego, należy zacząć od zdjęcia jednej z nasadek wentylacyjnych i wlania 1 L uprzednio ogrzanej pełnej pożywki DMEM z wymaganą ilością komórek HEK293 (A). Należy równomiernie rozprowadzić komórki i pożywkę, dokręcając obie nasadki wentylacyjne, a następnie zgromadzić całą pożywkę w narożniku zestawu za pomocą jednej z nasadek i ustawić go w tym narożniku (B), położyć zestaw warstwowy na boku (C), a następnie obrócić go o 90° (D) tak, aby otwory wentylacyjne znajdowały się u góry (E). Należy ostrożnie opuścić zestaw do normalnej pozycji poziomej i upewnić się, że wszystkie komory zestawu są całkowicie pokryte pożywką (F). Podczas transfekcji należy odkręcić obie nasadki wentylacyjne i powoli wylać starą pożywkę do sterylnego pojemnika na odpady, zapewniając równomierny przepływ, aby nie zaburzyć monowarstwy komórek (G). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przygotować mieszaninę polietylenoiminy (PEI)/DNA w stosunku stężeń 3:1 (w/w).
    1. Przygotować mieszaninę DNA w stożkowej probówce o pojemności 50 mL, dodając 475 µg pTrangene oraz 1425 µg pHelper do 40 mL pożywki z obniżoną zawartością surowicy, aby uzyskać stosunek pHelper:pTrangene 3:1.
      UWAGA: Kalkulator mieszaniny PEI/DNA znajduje się w Tabeli 2.
    2. Do pożywki z obniżoną zawartością surowicy i mieszaniny DNA dodać kroplowo 5,7 mL PEI (1 g/L). Następnie krótko wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: W trakcie inkubacji w temperaturze pokojowej mieszanina PEI/DNA stanie się lekko mętna.
  2. Po 8 min inkubacji PEI/DNA usunąć pożywkę z komory hodowli komórkowej.
    ​UWAGA: Należy poluzować obie pomarańczowe nakrętki, aby zapewnić płynny przepływ pożywki i uniknąć odrywania komórek.
  3. Dodać PEI/DNA do 1 L uprzednio ogrzanej pełnej pożywki DMEM i powoli wlać mieszaninę do wlotu komory hodowli komórkowej. Równomiernie rozprowadzić ciecz we wszystkich rzędach (Rysunek 1) i inkubować przez 72 h w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2.

2 Zbiór AAV i lizy chemicznej transfektowanych komórek HEK293

  1. Energicznie wstrząśnij komorą hodowli komórkowej, aby odczepić komórki, aż pożywka stanie się mętna od uwolnionych komórek, a następnie przelej zawiesinę do czterech probówek wirówkowych o pojemności 500 mL.
  2. Wiruj probówki przy 18,000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C, aby osadzić komórki. Przelej klarowny naddatek do butelki o pojemności 1 L wykonanej z kopoliestru politereftalanu etylenu (PETG).
    UWAGA: W przypadku braku dostępu do wirówki o wysokiej prędkości, wiruj przy 12,000 x g przez 40 min. Przy tej prędkości osad komórkowy może nie być zwarty i może przemieszczać się podczas znikania naddatku.
  3. Resuspenduj osady komórkowe w probówkach wirówkowych 500 mL w 50 mL buforu lizującego i inkubuj przez 60 min w temperaturze 37 °C.
  4. Wiruj probówki przy 18,000 x g przez 30 min, a następnie przenieś naddatek do tej samej butelki PETG o pojemności 1 L. Usuń osad z resztek komórkowych.
    ​UWAGA: Oczyść klarowny naddatek niezwłocznie lub przechowuj w temperaturze 4 °C do 72 h. W przypadku dłuższego przechowywania, przechowuj w temperaturze -80 °C. Nie przechowywać w temperaturze -20 °C.

3 Oczyszczanie wektorów AAV przy użyciu chromatografii powinowactwa do heparyny

  1. Wyjąć surowy lizat z temperatury -80 °C i pozostawić w temperaturze 4 °C przez noc w celu rozmrożenia. Po rozmrożeniu przefiltrować surowy lizat za pomocą filtra 0,22 µM.
  2. Aby pasywować koncentrator odśrodkowy, dodać 4 mL buforu do wstępnego przygotowania filtra do każdego używanego koncentratora odśrodkowego dla kolumny Heparin Sepharose. Pasywować koncentrator odśrodkowy w temperaturze pokojowej przez 2-8 h. Pasywację przeprowadzić bezpośrednio przed etapami oczyszczania.
  3. Przygotować układ drenów i pompę (Rysunek 2).
    1. Umieścić dren w pompie perystaltycznej i przepuścić 20 mL 1 M NaOH. Następnie przepuścić 50 mL wody klasy molekularnej, a potem 50 mL podstawowej pożywki DMEM.
    2. Podłączyć kolumnę Heparin Sepharose 5 mL do drenu i przepuścić 25 mL podstawowej pożywki DMEM w celu usunięcia konserwantu.
  4. Przepuścić 0,2 µM przefiltrowanego surowego lizatu przez kolumnę z szybkością przepływu 1-2 kropli/s.

Układ laboratoryjnej pompy perystaltycznej do transferu cieczy, niezbędny do eksperymentów chromatograficznych.
Rysunek 2: Układ pompy perystaltycznej do oczyszczania AAV. Poprowadź dren z surowego lizatu, przez pompę perystaltyczną, do kolumny z macierzą heparynową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

UWAGA: Należy dopilnować, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza i nie dopuścić do wyschnięcia kolumny, ponieważ mogłoby to uszkodzić kolumnę i uniemożliwić elucję AAV. W przypadku wyschnięcia kolumny należy ją wyrzucić i użyć nowej kolumny do pozostałej części lizatu surowego.

  1. Nanieś cały surowy lizat na kolumnę z heparyną i użyj następujących roztworów do płukania kolumny.
    1. Przepłucz kolumnę za pomocą 50 mL 1x zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) bez Mg2+ i Ca2+.
    2. Przepłucz kolumnę za pomocą 15 mL 0,5% N-lauroylosarkozyny w HBSS bez Mg2+ i Ca2+.
    3. Przepłucz kolumnę za pomocą 50 mL HBSS bez Mg2+ i Ca2+.
    4. Przepłucz kolumnę za pomocą 50 mL HBSS z Mg2+ i Ca2+
    5. Przepłucz kolumnę za pomocą 50 mL 200 mM NaCl/HBSS z Mg2+ i Ca2+.
    6. Przeprowadź elucję 5 x 5 mL (łącznie 25 mL) przy użyciu 300 mM NaCl/HBSS z Mg2+ i Ca2+ oraz oznacz frakcje elucyjne jako E1-E5 (każda frakcja ma objętość 5 mL).
  2. Koncentrowanie wirusa przy użyciu koncentratora odśrodkowego
    1. Wirować koncentrator odśrodkowy zawierający bufor do wstępnej obróbki z prędkością 900 x g przez 2 min. Odrzucić filtrat.
    2. Przepłukać filtr koncentratora odśrodkowego 4 mL HBSS z Mg2+ i Ca2+ i wirować przy 1000 x g przez 2 min; odrzucić filtrat.
    3. Dodać eluat E2 do koncentratora odśrodkowego. Wirować przy 1000 x g przez 5 min i odrzucić filtrat.
    4. Dokończyć dodawanie E2, a następnie dodać E3 do koncentratora odśrodkowego i wirować przy 1000 x g przez 5 min, aż objętość skoncentrowanego wirusa wyniesie około 1 mL.
      UWAGA: Należy unikać wirowania wektora w taki sposób, aby jego objętość spadła poniżej poziomu filtra. Nie koncentrować frakcji E1, E4 ani E5 w koncentratorze odśrodkowym, ponieważ zawierają one bardzo mało lub wcale wektora oraz zawierają zanieczyszczenia.
    5. Pobrać skoncentrowanego wirusa z koncentratora odśrodkowego za pomocą filtrowanej końcówki p200 i przenieść go do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 1,5 mL.
    6. Przepłukać koncentrator odśrodkowy 200 µL HBSS z Mg2+ i Ca2+, aby usunąć pozostały AAV z filtra. Intensywnie pipetować w górę i w dół wielokrotnie (przez ok. 30 s), aby oderwać wirusa przytwierdzonego do membrany, i przenieść go do probówki 1,5 mL z resztą wirusa. Dobrze wymieszać zawartość probówki.
    7. Odmierzyć alikwot 5 µL do ekstrakcji DNA i przechowywać oczyszczony wektor w temperaturze -80 °C.
  3. Przepłukać kolumnę za pomocą 25 mL 2 M NaCl. Następnie użyć 25 mL 0,1% Triton X-100, wstępnie podgrzanego do 37 °C, aby wypłukać kolumnę. Następnie przepłukać kolumnę za pomocą 50 mL sterylnej dH2O, a potem za pomocą 25 mL 20% etanolu.
  4. Upewnić się, że membrana kolumny jest całkowicie nasycona 20% etanolem, ponieważ jest to roztwór do przechowywania. Zamknąć kolumnę za pomocą dostarczonych zatyczek i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Przechowywać dreny w 1 M NaOH.
    ​UWAGA: Jeśli kolumny z heparyną sefarozą są odpowiednio czyszczone, mogą być używane wielokrotnie, do pięciu razy.

4 Ekstrakcja genomicznego DNA AAV

  1. Przygotować mieszaninę reakcyjną wymienioną w Tabeli 3 w probówce do PCR w celu przeprowadzenia traktowania DNazą.
KomponentObjętość
Oczyszczony wektor AAV5 μL
Bufor do DNazy 10x2 μL
DNaza1 μL
ddH2O2O12 μL
Objętość końcowa20 μL

Tabela 3: Skład mieszaniny roboczej (master mix) do obróbki DNazą. Zalecane składniki i objętości wymagane do obróbki wektorów wirusowych AAV DNazą podczas ekstrakcji DNA.

  1. Wymieszaj zawartość probówki PCR za pomocą vortexa, a następnie krótko odwiruj, aby zebrać ciecz na dnie.
  2. W termocyklerze inkubuj próbkę w temperaturze 37 °C przez 20 min, a następnie w 75 °C przez 15 min, aby termicznie inaktywować DNazę.
  3. Dodaj 5 µL Proteinazy K.
  4. W termocyklerze inkubuj próbkę w temperaturze 50 °C przez 60 min, a następnie w 95 °C przez 30 min, aby termicznie inaktywować Proteinazę K.
  5. Użyj zestawu do oczyszczania DNA, aby usunąć potencjalne zanieczyszczenia.
    UWAGA: Ten etap wykonano przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu do oczyszczania krwi i tkanek (Tabela Materiałów).
    1. Do probówki PCR zawierającej wektor traktowany DNazą/Proteinazą K dodaj 200 µL buforu AL (zestaw do oczyszczania krwi i tkanek, Tabela Materiałów).
    2. Wymieszaj zawartość probówki PCR za pomocą vortexa i inkubuj w temperaturze 56 °C przez 10 min w termocyklerze.
    3. Przenieś ciecz z probówki PCR do sterylnej kolumny wirówkowej umieszczonej w probówce zbiorczej.
    4. Do kolumny dodaj 200 µL 100% etanolu i wymieszaj dokładnie za pomocą vortexa.
    5. Wiruj przy 6,000 x g przez 1 min, a następnie odlej filtrat.
    6. Do kolumny wirówkowej dodaj 500 µL buforu AW1 (zestaw do oczyszczania krwi i tkanek, Tabela Materiałów).
    7. Wiruj przy 6,000 x g przez 1 min i odlej filtrat.
    8. Do kolumny wirówkowej dodaj 500 µL buforu AW2 (zestaw do oczyszczania krwi i tkanek, Tabela Materiałów).
    9. Wiruj przy 15,000 x g przez 3 min i odlej filtrat.
    10. Umieść kolumnę wirówkową w sterylnej probówce do wirowania o pojemności 1,5 mL i dodaj 200 µL buforu AE (zestaw do oczyszczania krwi i tkanek, Tabela Materiałów) bezpośrednio na membranę kolumny.
    11. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 min.
    12. Wiruj przy 6,000 x g przez 1 min, aby eluować DNA.
    13. Przechowuj DNA w temperaturze -20 °C.

5 Oznaczanie miana genomów wektora AAV za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy i sondy Simian Virus 40 (SV40)

UWAGA: Wszystkie prace związane z qPCR należy przeprowadzać w dygestorium do PCR, używając końcówek do pipet z filtrem, aby uniknąć zewnętrznego zanieczyszczenia DNA. Jeśli genom AAV nie koduje sekwencji polyA SV40, należy zastosować sondę przeciwko ITR opisaną w innym opracowaniu25. Należy upewnić się, że plasmidowe DNA wybrane jako standard zawiera sekwencję polyA SV40.

  1. Przygotowanie roztworu standardu zapasowego
    1. Rozcieńczyć zapasowy standard plazmidowego DNA (plazmid pTransgene zawierający sekwencję poliA SV40) do stężenia końcowego 10 µg/µL i przechowywać w temperaturze -20 °C w aliquotach o objętości 6 µL.
    2. Wyznaczyć liczbę kopii obecnych w standardzie plazmidowego DNA, korzystając z następującego kalkulatora online26.
      UWAGA: W celu zapewnienia jakości i prawidłowego stężenia należy użyć plazmidowego DNA do standardu pochodzącego od komercyjnego dostawcy. Należy przygotować dużą ilość standardu (np. 10 mL), aby umożliwić przeprowadzenie badań pomostowych podczas przejścia na nowo przygotowany standard.
  2. W probówce wirówkowej o pojemności 1,5 mL przygotować mieszaninę odczynników wymienioną w Tabeli 4 zarówno dla próbek, jak i dla standardu.
    UWAGA: Należy przygotować odpowiedni nadmiar master mixu. Sekwencje starterów/sond znajdują się w Tabeli 5.
KomponentObjętość
Uniwersalny master mix do qPCR (2X)10 μL
Woda klasy molekularnej4.5 μL
40x starter/sonda polyA SV400.5 μL
Objętość końcowa15 μL

Tabela 4: Mieszanina master mix do qPCR dla miareczkowania AAV. Zalecane składniki i objętości wymagane do qPCR DNA wyekstrahowanego z wektorów wirusowych AAV.

KomponentSekwencja
Starter forward5’-AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA-3’
Starter odwrotny5’-CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT-3’
Sonda/56-FAM/AGCATTTTT/Zen/TTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC/3IABkFQ

Tabela 5: Sekwencje starterów przeciwko sekwencji DNA polyA SV40. Sekwencje starterów i sondy użytych do miareczkowania qPCR, które wiążą się ze specyficznymi obszarami wektorów wirusowych AAV zawierających sekwencję polyA SV40.

  1. Wymieszaj master mix, pipetując go w górę i w dół.
  2. Przygotuj płytkę do rozcieńczeń.
    1. Używając przezroczystej płytki 96-dołkowej, przygotuj rozcieńczenia standardów i próbek; do każdego dołka w co drugiej kolumnie, zaczynając od kolumny 1 (kolumny 1, 3, 5, 7, 9 i 11), dodaj 45 µL wody klasy molekularnej.
    2. Do dołka A1 dodaj 5 µL standardu i wymieszaj pipetą.
    3. Używając nowej końcówki z filtrem, wykonaj rozcieńczenie 1/10, przenosząc ciecz z dołka A1 do B1.
    4. Kontynuuj serię rozcieńczeń 10-krotnych w dół kolumny, aż do osiągnięcia dołka G1.
    5. Do dołka H1 nie dodawaj niczego, ponieważ będzie on służył jako kontrola negatywna.
    6. Nanieś pierwszą próbkę (S1), dodając ją do dołka A3, tworząc rozcieńczenie 1/10. Wymieszaj tę mieszaninę pipetą i przenieś 5 µL do dołka B3. Po tym transferze wyrzuć końcówkę pipety.
    7. Używając nowej końcówki, wymieszaj roztwór w dołku B3 i przygotuj rozcieńczenie 1/100. Przenieś 5 µL tej mieszaniny do dołka C3 i po transferze wyrzuć końcówkę.
    8. Używając nowej końcówki, pipetuj roztwór w dołku C3 w górę i w dół, aby przygotować rozcieńczenie 1/1000. Wyrzuć końcówkę.
    9. Kontynuuj rozcieńczanie próbek, nie dodając żadnych materiałów do kolumn 2, 4, 6, 8, 10 ani 12.
    10. Po rozcieńczeniu wszystkich próbek wymieszaj zawartość dołków w kolumnie 1, a następnie przenieś 20 µL do kolumny 2.
    11. Powtórz tę czynność dla kolumn 3, 5, 7, 9 i 11, aby stworzyć powtórzenia dla każdego rozcieńczenia standardu i próbki. Układ płytki przedstawiono na Rysunku 3.
      UWAGA: Przy układzie płytki zgodnie z Rysunkiem 3, próbki rozcieńczone w rzędach G i H będą miały wykonane jedynie rozcieńczenia 1/10 i 1/100.

Seria rozcieńczeń na mikropłytce ilustrująca krzywą wzorcową, próbki i kontrole negatywne dla testu ELISA.
Rycina 3: Układ płytki do miareczkowania qPCR AAV. Kolor niebieski oznacza rozmieszczenie rozcieńczeń seryjnych wzorca; kolor zielony oznacza rozmieszczenie kontroli negatywnej; kolor fioletowy oznacza rozmieszczenie rozcieńczeń próbek. Każdy wzorzec, kontrola negatywna lub próbka są dodawane w powtórzeniach. W celu zilustrowania serii rozcieńczeń wzorca dodano przykładowe stężenia wzorca, a rozcieńczenia próbek zostały przypisane do odpowiednich dołków. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Miareczkowanie za pomocą qPCR opartego na detekcji polyA SV40
    1. Do każdego dołka białej płytki qPCR z półramką 96-dołkową dodać 15 µL master mixu do qPCR.
    2. Przenieść 5 µL każdej próbki z przezroczystej płytki 96-dołkowej do białej płytki qPCR z półramką 96-dołkową.
    3. Użyć pipety wielokanałowej, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie master mixu do qPCR z próbką.
    4. Uszczelnić płytkę folią uszczelniającą i wirować płytkę qPCR przy 1500 x g przez 30 s.
    5. Przeprowadzić reakcję qPCR na instrumencie do amplifikacji i detekcji PCR w czasie rzeczywistym dla płytek, stosując warunki sugerowane w Tabeli 6.
SekcjaCykleCzasTemperaturaOpis
Preinkubacja1x5 min95 °CDenaturacja DNA.
Amplifikacja38x15 s95 °CAmplifikacja DNA. Ustawienia mogą zostać zmodyfikowane w przypadku zastosowania alternatywnych starterów o innych temperaturach przyłączania.
60 s60 °C
Chłodzenie1x60 s40 °CChłodzenie płytki. Koniec procesu.

Tabela 6: Protokół termocyklera dla miareczkowania qPCR z wykorzystaniem sond hydrolizacyjnych.Zalecany protokół termocyklera do miareczkowania qPCR z wykorzystaniem sond w celu oznaczenia ilości oczyszczonego DNA wyekstrahowanego z wektorów AAV.

UWAGA: Arkusz roboczy do miareczkowania AAV metodą qPCR znajduje się w Tabeli 7.

  1. Analiza danych w celu określenia liczby kopii genomu AAV.
    1. Wypełnij komórki danych w arkuszu kalkulacyjnym (Tabela 7A) wartościami stężeń uzyskanymi z badania qPCR dla rozcieńczeń standardów oraz próbek.
    2. Wykorzystaj wartości stężeń z Tabeli 7A do wykreślenia krzywej wzorcowej (Tabela 7B).
      UWAGA: Krzywa wzorcowa zostanie przedstawiona jako logarytm naturalny (y = a ln(x) + b) wraz z efektywnością R2. Krzywa wzorcowa musi charakteryzować się efektywnością bliską 100 % oraz R2 bliskim 1,0 (≥0,99).
    3. Oblicz efektywność nachylenia, korzystając z tego kalkulatora online27.
      UWAGA: Akceptowalna efektywność mieści się w przedziale 90%–110%. Jeśli efektywność qPCR wykracza poza ten zakres, należy powtórzyć badanie qPCR.
    4. Wykorzystaj wartości stężeń z Tabeli 7A, aby obliczyć średnią z rozcieńczeń każdej próbki oraz wyznaczyć odchylenie standardowe dla każdej próbki (Tabela 7C).
      UWAGA: Należy wykluczyć rozcieńczenia próbek, które odbiegają od średniej rozcieńczeń danej próbki o więcej niż jedno odchylenie standardowe.
    5. Mnożąc średnie stężenie każdego rozcieńczenia przez czynnik rozcieńczenia, a następnie dzieląc wynik przez pięć, wyznacz liczbę genomów wektorowych (vg)/µL dla każdej próbki (Tabela 7C).
    6. Oblicz vg/mL każdej próbki, mnożąc średnią stężeń każdej próbki przez 80 000 (Tabela 7C).
    7. Oblicz średnią vg/mL z każdego rozcieńczenia, aby uzyskać końcową wartość vg/mL dla każdej próbki (Tabela 7C).
      ​UWAGA: Użytkownik musi podzielić średnie stężenie każdego rozcieńczenia przez czynnik pięć, aby uwzględnić 5 µL naniesionych do każdej studzienki podczas badania qPCR, w celu uzyskania stężenia w vg/µL. Czynnik 80 000 uwzględnia przejście od średniej wartości stężenia każdej próbki do vg/mL. Po pierwsze, średnią wartość stężenia każdej próbki należy pomnożyć przez 2, aby uwzględnić genomy jednoniciowe, ponieważ zestaw starter-sonda kwantyfikuje jedynie jednoniciowe DNA (ssDNA) o sensie dodatnim, a genom AAV występuje w przybliżonym stosunku 1:1 między ssDNA o sensie dodatnim a ujemnym25,28. Średnią wartość stężenia każdej próbki należy pomnożyć x40, aby uwzględnić rozcieńczenie próbki z 5 µL oczyszczonego wektora (sekcja 4.1) do 200 µL ekstrahowanego DNA (sekcja 4.6.12). Na koniec średnią wartość stężenia każdej próbki należy pomnożyć x1000, aby przeliczyć vg/µL na vg/mL.

6 Ocena jakości i czystości wektora

  1. Kontrola jakości – Western Blot
    1. Przygotować żel SDS PAGE 12%.
    2. Przeprowadzić elektroforezę w żelu poliakryloamidowym.
      UWAGA: Nanieść 6 x 1010 vg próbek na dołek.
    3. Przenieść białka na membranę z difluoridu poliwinylydenu (PVDF).
    4. Blokowanie membrany PVDF
      1. Wyjąć membranę z urządzenia do transferu i wypłukać w 0,1% PBST, aby usunąć luźny akryloamid.
      2. Umieścić membranę w roztworze blokującym na co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.
        UWAGA: Bufor blokujący można dodatkowo uzupełnić o 2% surowicy koziej.
    5. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym
      1. Odlać bufor blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe: mysie przeciwciało monoklonalne anty-AAV w rozcieńczeniu 1:200.
      2. Inkubować przez noc w 4 °C.
      3. Odlać przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć pięciokrotnie 0,1% PBST przez 5 min w temperaturze pokojowej przy mieszaniu.
    6. Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym
      1. Odlać roztwór piorący i dodać przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP, rozcieńczone 1:7500 w buforze blokującym, a następnie inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej przy mieszaniu.
      2. Odlać przeciwciało drugorzędowe i przemyć pięciokrotnie 0,1% PBST przez 5 min w temperaturze pokojowej przy mieszaniu.
      3. Przeprowadzić końcowe przemywanie w PBS w temperaturze pokojowej przy mieszaniu.
    7. Wykryć białka przy użyciu substratu do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL).
    8. Wykonać obrazowanie żelu w celu wizualizacji białek wirusowych (podjednostki VP1, VP2 i VP3) (Rysunek 4).

Żel SDS-PAGE pokazujący prążki białkowe dla wektorów wirusowych AAV6.2FF-hIgG01 do AAV6.2FF-hIgG04.
Rycina 4: Western blot pokazujący białka kapsydu AAV. Ścieżka A; drabinka MW, ścieżka B; AAV6.2FF-hIgG01, ścieżka C; AAV6.2FF-hIgG02, ścieżka D; AAV6.2FF-hIgG03 oraz ścieżka E; AAV6.2FF-hIgG04. Na odpowiednie ścieżki naniesiono 6 x 1010 vg każdego AAV6.2FF-hIgG. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Kontrola czystości – SDS-PAGE i barwienie Coomassie
    1. Przygotować żel do SDS-PAGE oraz próbki zgodnie z opisem w krokach 6.1.1 i 6.1.2.
    2. Utrwalić żel w roztworze utrwalającym przez 1 h lub przez noc przy łagodnym mieszaniu. Wymienić roztwór utrwalający raz w ciągu pierwszej godziny.
    3. Barwić żel w roztworze barwiącym przez 2-4 h przy łagodnym mieszaniu.
    4. Odbarwić żel za pomocą roztworu odbarwiającego. Odnawiać roztwór odbarwiający kilkakrotnie, aż tło żelu zostanie całkowicie odbarwione (4-24 h).
    5. Przechowywać odbarwiony żel w roztworze do przechowywania.
    6. Wykonać obrazowanie żelu, aby zwizualizować wszystkie białka zabarwione roztworem Coomassie.

Schemat elektroforezy żelowej; prążki białkowe VP1-VP3; metoda rozdziału; drabinka mas cząsteczkowych.
Rycina 5: Żel barwiony Coomassie. Ścieżka A; drabinka MW, ścieżka B; AAV6.2FF-hIgG01, ścieżka C; AAV6.2FF-hIgG02, ścieżka D; AAV6.2FF-hIgG03, ścieżka E; AAV6.2FF-hIgG04, ścieżka F; AAV6.2FF-hIgG05, oraz ścieżka G; AAV6.2FF-hIgG06. Na poszczególne ścieżki naniesiono 6 x 1010 vg każdego z wariantów AAV6.2FF-hIgG. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Alternatywny test kontroli czystości – test ELISA do wykrywania białek komórek gospodarza HEK293
    1. Przeprowadzić wykrywanie białek komórek gospodarza HEK293 za pomocą testu ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: W przypadku oczyszczonych próbek rAAV zastosować rozcieńczenia 5 x 10-2 oraz 1 x 10-3. Po dodaniu TMB do dołka inkubować w ciemności. Do analizy wyników nie można zastosować regresji liniowej.
    2. Zastosować analizę punkt po punkcie, metodę cubic spline lub dopasowanie logistyczne czteroparametrowe w celu interpolacji stężeń próbek nieznanych, a następnie pomnożyć wynik przez czynnik rozcieńczenia, aby określić pierwotne stężenie w próbce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeniesienie wyników z modeli małych gryzoni na modele większych zwierząt, a w konsekwencji do zastosowań klinicznych, stanowi znaczne wyzwanie ze względu na dużą ilość AAV wymaganą do transdukcji większych zwierząt i osiągnięcia efektów terapeutycznych. Aby porównać wydajność transdukcji racjonalnie zaprojektowanego kapsydu AAV6.2FF, u którego wcześniej wykazano 101-krotny wzrost wydajności transdukcji w komórkach mięśniowych myszy w porównaniu do AAV63, myszom, chomikom oraz jagniętom podano AA...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Produkcja rekombinowanych wektorów AAV (rAAV) opisana w tym artykule wykorzystuje powszechne materiały, odczynniki i sprzęt, które można znaleźć w większości laboratoriów i obiektów badawczych biologii molekularnej. Papier ten pozwala na uzyskanie przez czytelnik wysokiej jakości rAAV in vitro i in vivo . Przede wszystkim ten protokół produkcji rAAV, w porównaniu z bardziej żmudnymi protokołami obejmującymi oczyszczanie chlorkiem cezu, jest skuteczny i pozwala uniknąć stosowania ultrawirowania. Po trans...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Sarah K. Wootton jest wynalazcą w amerykańskim US10806802B2 patentowym kapsydu AAV6.2FF.

Podziękowania

Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas i Jacob G. E. Yates byli laureatami stypendiów studenckich Ontario Veterinary College oraz stypendiów dla absolwentów Ontario. Amira D. Rghei otrzymała stypendium Mitacs Accelerate Scholarshipship. Praca ta została sfinansowana przez Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant (#66009) oraz grant Collaborative Health Research Projects (partner NSERC) (#433339) dla SKW.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m filtrMillipore SigmaS2GPU05RE
0,25% TrypsynaFisher ScientificSM2001C
1-ButanolThermo Fisher ScientificA399-4UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice
10-komorowy stos komórekCorning3271
1L Butelka PETGThermo Fisher Scientific2019-1000
30% Akrylamid/Bis RoztwórBio-Rad1610158
96-dołkowa płytka przypodłogowaFroggaBioFS-96
Uszczelki samoprzylepneThermo Fisher Scientific08-408-240
Nadsiarczan amonu (APS)Bio-Rad161-0700UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić
rękawiczki Zestaw do oczyszczania krwi i tkanekQiagen69506Służy do oczyszczania DNA w sekcji 4.6 protokołu
Błękit bromofenolowyFisher ScientificB392-5UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawiczki
Naczynia do hodowli komórkowychGreiner bio-one7000232talerze 15 cm
Rurka stożkowa do hodowliThermo Fisher Scientific339650Rurka stożkowa 15 ml
Rurka stożkowa do hodowliFisher Scientific1495524050 ml probówka stożkowa
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z 1000 mg/L D-glukozy, L-glutaminąCytiva Life SciencesSH30022.01
ECL Western Blotting SubstrateThermo Fisher Scientific32209
EtanolGreenfieldP016EA95Rozcieńczyć alkohol etylowy (95% obj.) do 20% dla sekcji 3.7.4 i 70% dla sekcji 6.1.1.1
Surowica bydlęca dla płodu (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30396.03
Lodowaty kwas octowyFisher ScientificA38-500OSTROŻNOŚĆ. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice
GlycerolFisher ScientificBP229-1
GlycineFisher ScientificBP381-500
HBSS z Mg2+ i Ca2+Thermo Fisher ScientificSH302268.02
HBSS bez Mg2+ oraz Ca2+Thermo Fisher ScientificSH30588.02
Komórki HEK293Amerykańska kolekcja kultur tkankowychCRL-1573Po otrzymaniu rozmrozić komórki i hodowlę zgodnie z opisem w katalogu producenta s protokół. Gdy komórki zostaną zminimalizowane i dobrze rosną, zamroź podfrakcję na przyszłość w podwielokrotnościach i przechowuj w ciekłym azocie. Zawsze używaj komórek poniżej fragmentu numer 30. Po ponad 30-krotnym pasażowaniu wyhodowanych komórek zaleca się ponowne uruchomienie hodowli z przechowywanych podwielokrotności
HEK293 zestaw ELISA białka komórki gospodarzaCygnus TechnologiesF650SPostępuj zgodnie z wymaganiami producenta s instrukcje
Kolumna siarczanu heparynyCytiva Life Sciences17040703
KimwipeThermo Fisher ScientificKC34120
  L-glutamina (200 mM)Thermo Fisher ScientificSH30034.02
Poduszka podtrzymująca probówkę wirówkową o dużej objętościCorningCLS431124Poduszka nośna musi być używana z probówkami wirówkowymi o dużej objętości, chyba że wirnik wirówki ma odpowiednie poduszki z dnem w kształcie litery V
Probówki wirówkowe o dużej objętościCorningCLS431123-6EAProbówki wirówkowe 500 ml
MgCl2  Thermo Fisher Scientific7791-18-6
Probówka do mikrowirówekFisher Scientific05-408-129Probówka do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, sterylizuj przed użyciem
Woda o jakości molekularnejCytiva Life SciencesSH30538.03
Sól sodowa N-lauroilsarkozynySigma AldrichL5125UWAGA. Nosić rękawice
NaClThermo Fisher ScientificBP35810
Optimem, zredukowane podłoże surowicyThermo Fisher Scientific31985070
pipety PasteuraFisher Scientific13-678-20DSterylizować przed użyciem
PBS (10x)Thermo Fisher Scientific70011044Rozcieńczyć do 1x do stosowania na komórki
Roztwór penicyliny-streptomycynyCytiva Life SciencesSV30010
plazmid pHelperDe novo projekt lub uzyskany z repozytorium plazmidówNA
Umywalka na pipetyThermo Fisher Scientific13-681-502Zakup sterylnych misek pipetowych
Eter tert-oktylofenylowy glikolu polietylenowego (Triton X-100)Thermo Fisher Scientific9002-93-1UWAGA. Nosić rękawice
Polietylenina (PEI)Polyscience24765-1Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta s instrukcje do produkcji 1L roztworu. 0,22μ m filtrować i przechowywać w temperaturze 4° C
Polipropylenowa półspódniczka PCRFroggaBioWS-96
Polysorbate 20 (Tween 20)Thermo Fisher ScientificBP337-100UWAGA. Nosić rękawice
membrana z polifluorku winylidenu (PVDF)Cytiva Life Sciences10600023Do manipulacji używaj kleszczy. Nosić rękawice.
Przeciwciało pierwszorzędoweProgen65158
Drabinka białkowaFroggaBioPM008-0500
Proteinaza KThermo Fisher ScientificAM2546
plazmid pTrangeneDe novo projekt lub uzyskany z repozytorium plazmiduNAMusi zawierać poliA SV40 w genomie, aby był zgodny z miareczkowaniem AAV w sekcji 5.0
Rurka pompyCole-ParmerRK-96440-14Zoptymalizuj długość rurek i powstrzymywanie wirusa we frakcjach E1-E5
RQ1 Dnaza 10 Bufor reakcyjnyPromegaM6101Stosować przy stężeniu 10x w protokole z sekcji 4.0
RQ1 Dnaza bez rnazyPromegaM6101
Rozcieńczalnik próbkiCygnus TechnologiesI700Należy zakupić osobno do użytku z zestawem
ELISA białka komórki gospodarza HEK293Przeciwciało wtórne, HRPThermo Fisher ScientificG-21040
Odtłuszczone mleko w proszkuOxoidLP0033B
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Thermo Fisher Scientific28312UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice
Wodorotlenek sodu (NaOH)Thermo Fisher ScientificSS266-4
SV40 sonda startera polyAIDTUżyj sekwencji w tabeli X, aby uzyskać cytat z IDT do syntezy
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Thermo Fisher Scientific15524010UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice
Tris BaseFisher ScientificBP152-5
Trypan niebieskiBio-Rad1450021
Ultra-FilterMillipore SigmaUFC810024Ultra-4 Należy użyć urządzenia odśrodkowego 10K, ponieważ ma ono granicę masy cząsteczkowej 10000
Uniwersalny nukleaza do lizy komórekThermo Fisher Scientific88702
Uniwersalna mieszanka mistrzowska qPCRNEBM3003L
Whatman PaperMillipore SigmaWHA1001325
β-merkaptoetanolFisher Scientific21985023UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice
UWAGA:  Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać wskazówki dotyczące stosowania niebezpiecznych chemikaliów.

Bibliografia

  1. Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
  2. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  3. Nathwani, A. C., et al. Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).
  4. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  5. Ylä-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).
  6. FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss (2020).
  7. FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease (2020).
  8. Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics (2020).
  9. Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).
  10. Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).
  11. Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA. Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).
  12. Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).
  13. Ling, C. Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo. Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).
  14. Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).
  15. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  16. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLOS One. 8 (9), 76310(2013).
  17. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  18. Pillay, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor. Journal of Virology. 91 (18), (2017).
  19. Merkel, S. F. Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells. Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).
  20. van Lieshout, L. P., et al. A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).
  21. Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).
  22. Liu, J., Moon, Y. -A. Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression. Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).
  23. Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).
  24. Kimura, T., et al. Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Scientific Reports. 9 (1), 13601(2019).
  25. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  26. dsDNA copy number calculator. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html (2021).
  27. qPCR Efficiency Calculator - CA. , Available from: http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html (2021).
  28. Lamb, R. A., Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology. , Available from: https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication (1996).
  29. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  30. Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity. Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).
  31. Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
  32. Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570(2019).
  33. Backovic, A., et al. Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 124(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Produkcja wektorów AAVhodowla w systemie cell stackAAV o wysokim mianieadherentne komórki HEK293oczyszczanie na Sepharose z heparynączystość wektorów wirusowychekspresja transgenuprzedkliniczna terapia genowatransdukcja mięśni szkieletowych
Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.