Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro

Podsumowanie

Tutaj udostępniamy protokół do badania potencjalnych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w rozwój komórek dendrytycznych (DC) za pomocą lentiwirusowej transdukcji shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown do różnicowania DC in vitro.

Streszczenie

Komórki dendrytyczne (DC) są ważnymi komórkami prezentującymi antygen, które łączą wrodzoną i adaptacyjną odpowiedź immunologiczną. DC są niejednorodne i można je podzielić na konwencjonalne DC (cDC) i plazmocytoidalne DC (pDC). cDCs specjalizuje się w prezentowaniu antygenów naiwnym limfocytom T i aktywacji ich. Z drugiej strony, pDC mogą wytwarzać duże ilości interferonów typu I (IFN-I) podczas infekcji wirusowej. Specyfikacja DC występuje we wczesnym stadium komórek progenitorowych DC w szpiku kostnym (BM) i jest definiowana przez sieć czynników transkrypcyjnych (TF). Na przykład cDC o wysokiej ekspresji ID2, podczas gdy pDC o wysokiej ekspresji E2-2. Ponieważ identyfikowanych jest coraz więcej podzbiorów prądów stałych, rośnie zainteresowanie zrozumieniem konkretnych TF kontrolujących rozwój prądu stałego. W tym miejscu ustalamy metodę badań przesiewowych TF krytycznych dla różnicowania DC in vitro poprzez dostarczanie lentiwirusa przenoszącego krótkie RNA spinki do włosów (shRNA) do unieśmiertelnionej linii hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (iHSPC). Po selekcji i różnicowaniu in vitro, potencjał cDC i pDC stabilnych linii komórkowych knockdown jest analizowany za pomocą cytometrii przepływowej. Podejście to stanowi platformę do identyfikacji genów potencjalnie decydujących o losie DC od przodków in vitro.

Wprowadzenie

DC są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i nabytej¹. DC są głównie klasyfikowane w dwóch funkcjonalnie odrębnych populacjach, a mianowicie pDC i cDC. Ponadto cDC składają się z dwóch podzbiorów, a mianowicie cDC typu I i typu II lub cDC1s i cDC2s, odpowiednio². pDC, wyrażające BST2, Siglec-H i pośrednie poziomy CD11c u myszy^3,4, to komórki, które mogą wydzielać duże ilości IFN-I podczas stanu zapalnego i infekcji wirusowej⁵. Ze względu na ich silną zdolność do wytwarzania IFN-I, podejrzewa się również, że odgrywają kluczową rolę w postępie chorób autoimmunologicznych, w tym tocznia rumieniowatego układowego (SLE)⁶. cDC1s, zdefiniowane przez powierzchniową ekspresję XCR1, CD8a, CLEC9A i CD103 u myszy⁷, są wyspecjalizowane w aktywacji i polaryzacji cytotoksycznych limfocytów T CD8 ⁺ (CTL) poprzez krzyżową prezentację antygenu, inicjując w ten sposób odporność typu I w odpowiedzi na wewnątrzkomórkowe patogeny i raka^8,9. Z drugiej strony, cDC2s, wyrażające CD11b i CD172α (znane również jako Sirpα) zarówno u ludzi, jak i myszy, mogą aktywować limfocyty T CD4 ⁺ i promować odpowiedź immunologiczną typu II przeciwko alergenom i pasożytom¹⁰, a także modulować odporność typu III po rozpoznaniu bakterii zewnątrzkomórkowych i mikrobioty^11,12.

Dywersyfikacja DC jest określana przez grupę TF z hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w BM. E2-2 (kodowane przez Tcf4) jest głównym regulatorem różnicowania i funkcji pDCs^13,14. W przeciwieństwie do tego, inhibitor wiązania DNA 2 (ID2) napędza specyfikację cDC i hamuje rozwój pDC poprzez blokowanie aktywności białka E¹⁵. Co więcej, rozwój cDC1 wymaga IRF8 i BATF3, podczas gdy różnicowanie cDC2 w dużym stopniu zależy od IRF4¹⁶. Ostatnie prace badały heterogeniczność pDCs¹⁷ i cDC oraz ich regulację transkrypcji¹⁸. Ze względu na złożoność sieci DC istnieje niezaspokojona potrzeba ustanowienia platformy do identyfikacji innych TF kontrolujących rozwój i funkcjonalność DC.

Tutaj użyliśmy iHSPC, który został wygenerowany przez ekspresję regulowanej estrogenem translokacji jądrowej Hoxb8 w komórkach BM (zwanych również komórkami Hoxb8-FL)¹⁹. iHSPC mogą się namnażać i pozostawać w stadium niezróżnicowanym w obecności β-estradiolu i ligandu Flt3 (FL), podczas gdy zaczynają różnicować się w różne typy DC w obecności FL po odstawieniu β-estradiol¹⁹. Opierając się na tej funkcji, możemy strącić interesujące nas geny na etapie progenitorowym, a następnie zbadać wpływ na różnicowanie in vitro pDC i cDC. Dlatego metoda ta jest potężnym narzędziem do odkrywania genów, które regulują rozwój i funkcję DC.

Protokół

Postępowanie z lentiwirusami odbywa się zgodnie z przepisami Departamentu Zdrowia i Bezpieczeństwa Środowiska Wydziału Medycznego Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego.

1. Przygotowanie unieśmiertelnionych linii komórek macierzystych i progenitorowych krwiotwórczych (iHSPCs)

1. Hodować linię komórkową iHSPC w pełnej pożywce RPMI 1640 zawierającej 100 ng/mL FL oraz 1 µM β-estradiolu.
2. Przesiewać komórki w stosunku 1:10 co 3 dni.
   ​UWAGA: Pełną pożywkę RPMI 1640 przygotować poprzez uzupełnienie o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 x 10^-5 M β-merkaptoetanol oraz 10 µg/mL gentamycyny. Rekombinowany mysi FL jest również dostępny w sprzedaży.

2. Transdukcja lentiwirusowa

1. Wysiać iHSPCs z gęstością 1 x 10⁵ komórek/dołek w płytkach 12-dołkowych w 1 mL pożywki kompletnej zawierającej 100 ng/mL FL, 1 µM β-estradiol oraz 8 µg/mL polybrene.
   UWAGA: Stężenie polybrene zależy od typu komórek i zazwyczaj mieści się w zakresie 4-8 µg/mL.
2. Do każdego dołka dodać lentiwirusa niosącego shRNA przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 100.
   UWAGA: Wektorem lentiwirusowym jest pLKO.1-Puro z markerem selekcyjnym puromycyną (Rycina 1). Sekwencje docelowe shRNA skierowanych odpowiednio przeciwko LacZ, Tcf4 oraz Id2 są wymienione w Tabeli materiałów. MOI jest definiowane jako liczba wirionów dodanych na jedną komórkę podczas infekcji.
   
3. Wirować płytki z prędkością 1,100 x g przez 90 min w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Infekcję wspomaganą wirowaniem (spin infection) przeprowadza się przy użyciu rotora z koszyczkami wahadłowymi.
4. Inkubować płytkę z zainfekowanymi komórkami przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
   UWAGA: Jeśli komórki są wrażliwe na polybrene, należy wymienić pożywkę na pożywkę kompletną bez polybrene po zakończeniu wirowania.
5. Wymienić pożywkę na pożywkę kompletną zawierającą 100 ng/mL FL i 1 µM β-estradiol 24 h po infekcji.
6. Po kolejnych 24 h dodać do pożywki 6 µg/mL puromycyny w celu wyselekcjonowania zainfekowanych komórek.
   UWAGA: Ekspresja genów z transdukowanego wektora lentiwirusowego, w tym genu oporności na puromycynę, trwa zazwyczaj 48 h. Należy upewnić się, że stężenie puromycyny jest zoptymalizowane dla każdej linii komórkowej.
7. Wymieniać pożywkę selekcyjną zawierającą 100 ng/mL FL, 1 µM β-estradiol oraz 6 µg/mL puromycyny co 3 dni i hodować komórki przez co najmniej jeden tydzień, aby namnożyć stabilnie transdukowane komórki iHSPC.
   ​UWAGA: Selekcja puromycyną zazwyczaj zaczyna działać po 48 h, a czas trwania selekcji zależy od typu komórek.

3. Pomiar wydajności wyciszenia za pomocą odwrotnej transkrypcji i PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR)

1. Wyizoluj całkowite RNA z 1 x 10⁷ shLacZ, shTcf4, oraz shId2 stabilne wyciszenie genów w komórkach iHSPC przy użyciu komercyjnego odczynnika do ekstrakcji RNA i wytrącanie RNA z warstwy wodnej izopropanolem, a następnie przemywanie osadu RNA 75% etanolem.
2. Rozpuścić RNA (~ 5 µg) z 5 µL z wody H2O traktowanej DEPC₂i dostosować stężenie do 1 µg/µL.
3. Pobrać 1-3 µg RNA, wymieszać z H2O traktowaną DEPC₂do uzyskania objętości końcowej wynoszącej 17.4 µL, dodać 1 µL z 1 jednostki/µL DNazę I wolną od RNaz i inkubować przez 20 min w 37 °C.
   UWAGA: Ten etap służy do trawienia DNA genomowego w próbkach RNA.
4. Dodaj 1 µL 20 mM EDTA do próbek RNA, inkubować w 65 °C przez 10 min w celu inaktywacji DNazy I, a następnie bezzwłocznie umieścić próbki RNA w 4 °C.
5. Dodaj 11.6 µL mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 µL starterów oligo(dT) (45 µM), 6 µL z 5x 1^{Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.} bufor do oddzielania nici, 3 µL dNTP (2 mM), 0.6 µL inhibitora RNazy (50 jednostek/µL) i 1 µL odwróconej transkryptazy (200 j./µL) do próbek RNA i inkubować w 40 °C przez 1 h.
6. Zatrzymać reakcję, podgrzewając do 70 °C przez 10 min, a następnie rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną za pomocą 30 µL wodoru₂O.
7. Pobierz 2 µL rozcieńczonej mieszaniny reakcyjnej RT jako matrycy DNA i poddać ją amplifikacji PCR z wykorzystaniem starterów przeciwko Tcf4 lub Id2 (patrz Tabela 1 (dla parametrów termocyklera).
   UWAGA: Sekwencje starterów znajdują się w Tabela materiałów.

4. Różnicowanie in vitro stabilnych linii komórkowych iHSPC z wyciszeniem genów

1. Utrzymać stabilne pojedyncze wyciszenie genów LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) lub Id2 (shId2) w iHSPC w pełnej pożywce zawierającej 100 ng/mL FL i 1 µM β-estradiolu.
2. Zebrać niedróżnicowane iHSPC shLacZ, shTcf4 i shId2 do probówki o pojemności 15 mL i odwirować przez 5 min przy 500 x g w celu sformowania osadu komórkowego.
3. Odlać supernatant i dodać 10 mL PBS, aby wypłukać komórki. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.
4. Resuspendować i wysiać komórki iHSPC w gęstości 2 x 10⁵ komórek/mL do płytki 12-dołkowej w 1 mL pełnej pożywki zawierającej wyłącznie 100 ng/mL FL.
5. Po trzech dniach dodać 1 mL świeżej pełnej pożywki zawierającej 100 ng/mL FL.
6. Dwa dni później przeanalizować zróżnicowane komórki (iHSPC shLacZ, shTcf4 i shId2) metodą cytometrii przepływowej.

5. Analiza cytometryczna z przepływem komórek zróżnicowanych komórek DC

1. Przenieść komórki do probówek 1,5 mL, pipetując je 2-3 razy w górę i w dół w płytce, a następnie odwirować przez 5 min przy 500 x g w temperaturze pokojowej (RT).
   UWAGA: Komórki DC różnicowane in vitro będą lekko przywierać do płytek. Ostrożne pipetowanie pomoże w odzyskaniu komórek DC z płytek.
2. Odlać supernatant i resuspendować komórki w 50 µL buforu FACS. Następnie dodać 50 µL supernatantu hybrydomy anty-CD16/32 i inkubować przez 5-10 min na lodzie.
   UWAGA: Przeciwciało blokujące Fc zapobiega niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał do receptorów Fc wykazujących ekspresję na niektórych komórkach mieloidalnych i limfocytach B; jest ono dostępne komercyjnie u różnych dostawców.
3. Dodać przeciwciała sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym (0,04 µg dla każdego przeciwciała) bezpośrednio do komórek i inkubować przez 15 min na lodzie w ciemności. Użyte przeciwciała to APC/cy7 anty-mysi CD11c, FITC anty-mysi CD11b oraz PE anty-mysi B220.
   UWAGA: Komórki pDC definiuje się jako CD11c⁺CD11b^-B220⁺, a komórki cDC jako CD11c⁺CD11b⁺B220^-.
4. Przemyć komórki 1 mL buforu FACS i odwirować przez 5 min przy 500 x g w RT.
5. Resuspendować komórki w 100 µL buforu FACS i analizować metodą cytometrii przepływowej.

Wyniki

Przedstawiono mapę wektora lentiwirusowego pLKO.1-Puro (Rysunek 1). Po dostarczeniu do iHSPC lentiwirusa wykazującego shRNA przeciwko LacZ (kontroli nietargetującej), Tcf4 oraz Id2, efektywność knockdownu potwierdzona za pomocą RT-qPCR wykazała, że ekspresja Tcf4 była zmniejszona w shTcf4 iHSPC w porównaniu do shLacZ iHSPC (Rysunek 2A). Z kolei zmniejszona ekspresja Id2 została również zaobserwowana ...

Dyskusja

Wektory shRNA oparte na lentiwirusach są często wykorzystywane do wyciszania genów poprzez transdukcję wirusa do komórek i umożliwiają stabilną integrację z genomem gospodarza. Należy jednak wziąć pod uwagę różną wydajność transdukcji w różnych typach komórek i podjęto szereg podejść w celu przezwyciężenia tego problemu.

Polibren jest polimerem polikationowym, który może neutralizować ładunki na błonie komórkowej, zwiększając w ten sposób wiązanie wirionu z komórkami podczas transdukcji

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciała
APC/Cy7 anty-mysie przeciwciało CD11c	Biolegend	117324	(klon: N418)
FITC anty-mysie/ludzkie przeciwciało CD11b	Biolegend	101206	(klon: M1/70)
PE anty-mysie/ludzkie B220 Przeciwciało	Biolegend	103208	Klon: RA3-6B2)
Hodowla komórkowa
1,5 ml mikroprobówka	ExtraGene	TUBE-170-C
12-dołkowa płytka poddana kulturze tkankowej	Falcon	353043
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Corning	35-010-CV
RPMI 1640 średnia	gibco	11875-085
Odczynnik
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758-250MG
β-merkaptoetanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250
Bufor FACS	domowej roboty		Formuła: 1xPBS + 0,5 %FBS + 0,1% NaN3
ligand Flt3 (FL)	domowej roboty
Polybrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
Puromycin	Invivogen	ant-pr-1
TRIsure	BIOLINE	BIO-38032
shRNA (identyfikator sekwencji Taregt/klonu)	Firma
shId2  (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	Konsorcjum RNAi (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	Konsorcjum RNAi (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	Konsorcjum RNAi (TRC)

(