Artykuł metodologiczny

Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro

DOI:

10.3791/62730

⸱

7 marca 2022

 ,  , 
1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine, 2Department of Pathology, Division of Microbiology and Immunology, University of Utah

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj udostępniamy protokół do badania potencjalnych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w rozwój komórek dendrytycznych (DC) za pomocą lentiwirusowej transdukcji shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown do różnicowania DC in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne (DC) są ważnymi komórkami prezentującymi antygen, które łączą wrodzoną i adaptacyjną odpowiedź immunologiczną. DC są niejednorodne i można je podzielić na konwencjonalne DC (cDC) i plazmocytoidalne DC (pDC). cDCs specjalizuje się w prezentowaniu antygenów naiwnym limfocytom T i aktywacji ich. Z drugiej strony, pDC mogą wytwarzać duże ilości interferonów typu I (IFN-I) podczas infekcji wirusowej. Specyfikacja DC występuje we wczesnym stadium komórek progenitorowych DC w szpiku kostnym (BM) i jest definiowana przez sieć czynników transkrypcyjnych (TF). Na przykład cDC o wysokiej ekspresji ID2, podczas gdy pDC o wysokiej ekspresji E2-2. Ponieważ identyfikowanych jest coraz więcej podzbiorów prądów stałych, rośnie zainteresowanie zrozumieniem konkretnych TF kontrolujących rozwój prądu stałego. W tym miejscu ustalamy metodę badań przesiewowych TF krytycznych dla różnicowania DC in vitro poprzez dostarczanie lentiwirusa przenoszącego krótkie RNA spinki do włosów (shRNA) do unieśmiertelnionej linii hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (iHSPC). Po selekcji i różnicowaniu in vitro, potencjał cDC i pDC stabilnych linii komórkowych knockdown jest analizowany za pomocą cytometrii przepływowej. Podejście to stanowi platformę do identyfikacji genów potencjalnie decydujących o losie DC od przodków in vitro.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DC są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i nabytej1. DC są głównie klasyfikowane w dwóch funkcjonalnie odrębnych populacjach, a mianowicie pDC i cDC. Ponadto cDC składają się z dwóch podzbiorów, a mianowicie cDC typu I i typu II lub cDC1s i cDC2s, odpowiednio2. pDC, wyrażające BST2, Siglec-H i pośrednie poziomy CD11c u myszy3,4, to komórki, które mogą wydzielać duże ilości IFN-I podczas stanu zapalnego i infekcji wirusowej5. Ze względu na ich silną zdolność do wytwarzania IFN-I, podejrzewa się również, że odgrywają kluczową rolę w postępie chorób autoimmunologicznych, w tym tocznia rumieniowatego układowego (SLE)6. cDC1s, zdefiniowane przez powierzchniową ekspresję XCR1, CD8a, CLEC9A i CD103 u myszy7, są wyspecjalizowane w aktywacji i polaryzacji cytotoksycznych limfocytów T CD8 + (CTL) poprzez krzyżową prezentację antygenu, inicjując w ten sposób odporność typu I w odpowiedzi na wewnątrzkomórkowe patogeny i raka8,9. Z drugiej strony, cDC2s, wyrażające CD11b i CD172α (znane również jako Sirpα) zarówno u ludzi, jak i myszy, mogą aktywować limfocyty T CD4 + i promować odpowiedź immunologiczną typu II przeciwko alergenom i pasożytom10, a także modulować odporność typu III po rozpoznaniu bakterii zewnątrzkomórkowych i mikrobioty11,12.

Dywersyfikacja DC jest określana przez grupę TF z hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w BM. E2-2 (kodowane przez Tcf4) jest głównym regulatorem różnicowania i funkcji pDCs13,14. W przeciwieństwie do tego, inhibitor wiązania DNA 2 (ID2) napędza specyfikację cDC i hamuje rozwój pDC poprzez blokowanie aktywności białka E15. Co więcej, rozwój cDC1 wymaga IRF8 i BATF3, podczas gdy różnicowanie cDC2 w dużym stopniu zależy od IRF416. Ostatnie prace badały heterogeniczność pDCs17 i cDC oraz ich regulację transkrypcji18. Ze względu na złożoność sieci DC istnieje niezaspokojona potrzeba ustanowienia platformy do identyfikacji innych TF kontrolujących rozwój i funkcjonalność DC.

Tutaj użyliśmy iHSPC, który został wygenerowany przez ekspresję regulowanej estrogenem translokacji jądrowej Hoxb8 w komórkach BM (zwanych również komórkami Hoxb8-FL)19. iHSPC mogą się namnażać i pozostawać w stadium niezróżnicowanym w obecności β-estradiolu i ligandu Flt3 (FL), podczas gdy zaczynają różnicować się w różne typy DC w obecności FL po odstawieniu β-estradiol19. Opierając się na tej funkcji, możemy strącić interesujące nas geny na etapie progenitorowym, a następnie zbadać wpływ na różnicowanie in vitro pDC i cDC. Dlatego metoda ta jest potężnym narzędziem do odkrywania genów, które regulują rozwój i funkcję DC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępowanie z lentiwirusem odbywa się zgodnie z przepisami Departamentu Zdrowia i Bezpieczeństwa Środowiskowego National Taiwan University College of Medicine.

1. Przygotowanie unieśmiertelnionych linii komórek macierzystych i progenitorowych (iHSPCs)

  1. Utrzymuj linię komórkową iHSPC w kompletnym pożywce RPMI 1640 zawierającej 100 ng / ml FL i 1 μM β-estradiolu.
  2. Przenikaj komórki w stosunku 1:10 co 3 dni.
    UWAGA: Przygotuj kompletną pożywkę RPMI 1640, uzupełniając ją 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 5 x 10-5 M β-merkaptoetanolu i 10 μg/ml gentamycyny. Rekombinowany mysi FL jest również dostępny na rynku.

2. Transdukcja lentiwirusowa

  1. Płytki iHSPC o gęstości 1 x 105 komórek/basenik na płytkach 12-dołkowych w 1 ml kompletnej pożywki zawierającej 100 ng/ml FL, 1 μM β-estradiolu i 8 μg/ml polibrenu.
    UWAGA: Stężenie polibrenu zależy od typu komórek i zwykle mieści się w zakresie 4-8 μg/ml.
  2. Dodaj lentiwirusa przenoszącego shRNA do każdej studzienki przy wielokrotności infekcji (MOI) 100,
    UWAGA: Wektorem lentiwirusowym jest pLKO.1-Puro ze znacznikiem selekcji puromycyny (Ryc. 1). Docelowe sekwencje shRNA przeciwko odpowiednio LacZ, Tcf4 i Id2 są wymienione w tabeli materiałów. MOI jest definiowany przez liczbę wirionów, które są dodawane na komórkę podczas infekcji.
    figure-protocol-1
  3. Obracać płytki w temperaturze 1 100 x g przez 90 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Infekcja wirowania odbywa się za pomocą wirnika kubełkowego z klapą.
  4. Inkubować płytkę zawierającą zakażone komórki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
    UWAGA: Jeśli komórki są wrażliwe na polibren, po infekcji spinowej odśwież je kompletną pożywką bez polibrenu.
  5. Odświeżyć komórki kompletną pożywką zawierającą 100 ng/ml FL i 1 μM β-estradiolu 24 godziny po zakażeniu.
  6. Dodaj 6 μg/ml puromycyny do pożywki, aby wybrać zakażone komórki po dodatkowych 24 godzinach
    UWAGA: Transdukowany wektor lentiwirusowy zwykle potrzebuje 48 godzin na ekspresję genów, w tym genu oporności na puromycynę. Upewnij się, że stężenie puromycyny jest zoptymalizowane dla każdej linii komórkowej.
  7. Odświeżaj pożywkę selekcyjną zawierającą 100 ng/ml FL, 1 μM β-estradiolu i 6 μg/ml puromycyny co 3 dni i utrzymuj komórki przez co najmniej tydzień, aby rozszerzyć stabilnie transdukowane komórki iHSPC.
    UWAGA: Selekcja Puromycyny zwykle zaczyna działać 48 godzin później, a okres selekcji zależy od typu komórek.

3. Pomiar skuteczności knockdown za pomocą odwrotnej transkrypcji i real-time PCR (RT-PCR)

  1. Wyekstrahuj całkowity RNA z 1 x 107 shLacZ, shTcf4 i shId2 stabilnych komórek iHSPC knockdown za pomocą komercyjnego odczynnika do ekstrakcji RNA i wytrącić RNA z warstwy wodnej izopropanolem, a następnie przemyć osad RNA 75% etanolem.
  2. Rozpuścić RNA (~ 5 μg) w 5 μl H2O poddanego działaniu DEPC i dostosować stężenie do 1 μg/μl.
  3. Pobrać 1-3 μg RNA, wymieszać z H2Opoddanym działaniu DEPC do końcowej objętości 17,4 μl, dodać 1 μl 1 jednostki/μl DNazy I wolnej od RNaz i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Ten etap polega na strawieniu genomowego DNA w próbkach RNA.
  4. Dodać 1 μl 20 mM EDTA do próbek RNA, inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut w celu inaktywacji DNazy I i natychmiast umieścić próbki RNA w temperaturze 4 °C.
  5. Do próbek RNA dodać 11,6 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 μl starterów oligonukleukleo(dT) (45 μM), 6 μl buforu 5x 1st nici, 3 μl dNTP (2 mM), 0,6 μl inhibitora RNazy (50 jednostek/μl) i 1 μl odwrotnej transkryptazy (200 jednostek/μl) i inkubować w temperaturze 40 °C przez 1 godzinę.
  6. Zatrzymać reakcję przez ogrzewanie w temperaturze 70 °C przez 10 minut i rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną 30 μlH2O.
  7. Pobrać 2 μl rozcieńczonej mieszaniny reakcyjnej RT jako matrycę DNA i amplifikować ją metodą PCR za pomocą starterów przeciwko Tcf4 lub Id2 (patrz Tabela 1 dla warunków termocyklera).
    UWAGA: Sekwencje starterów są zawarte w Tabeli materiałów.

4. Różnicowanie in vitro stabilnych linii komórkowych iHSPC knockdown

  1. Utrzymać stabilny pojedynczy knockdown LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) lub Id2 (shId2) w iHSPC w kompletnym pożywce zawierającej 100 ng / ml FL i 1 μM β-estradiolu.
  2. Zebrać shLacZ, shTcf4 i shId2 niezróżnicowane iHSPC do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 500 x g w celu osadzenia komórek.
  3. Odrzucić supernatant i dodać 10 ml PBS w celu przepłukania komórek. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  4. Ponownie zawiesić i wysiać komórki iHSPC o gęstości 2 x 105 komórek/ml na 12-dołkową płytkę w 1 ml kompletnej pożywki zawierającej tylko 100 ng/ml FL.
  5. Trzy dni później dodać 1 ml świeżej, kompletnej pożywki zawierającej 100 ng/ml FL.
  6. Przeanalizuj zróżnicowane komórki (shLacZ, shTcf4 i shId2 iHSPCs) za pomocą cytometrii przepływowej dwa dni później.

5. Analiza cytometryczna przepływowa zróżnicowanych DC

  1. Zebrać komórki do probówek o pojemności 1,5 ml, pipetując komórki w górę i w dół 2-3 razy na płytce i wirować przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Prądy stałe zróżnicowane in vitro będą nieznacznie przyczepiać się do płytek. Delikatne pipetowanie pomoże odzyskać DC z płytek.
  2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 μl buforu FACS. Następnie dodać 50 μl supernatantu hybrydomy anty-CD16/32 i inkubować przez 5-10 minut na lodzie.
    UWAGA: Przeciwciało blokujące Fc zapobiega niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z receptorami Fc ulegającymi ekspresji na niektórych komórkach szpikowych i limfocytach B i jest dostępne w handlu u różnych dostawców.
  3. Dodać przeciwciała sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym (0,04 μg dla każdego przeciwciała) bezpośrednio do komórek i inkubować przez 15 minut na lodzie w ciemności. Stosowane przeciwciała to APC/cy7 anty-mysie CD11c, FITC anty-mysie CD11b i PE anty-mysie B220.
    UWAGA: pDC są zdefiniowane jako CD11c+CD11b-B220+, a cDC są zdefiniowane jako CD11c+CD11b+B220-.
  4. Przemyć komórki 1 ml buforu FACS i odwirować przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze pokojowej.
  5. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu FACS i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazana jest mapa wektora lentiwirusowego pLKO.1-Puro (Rysunek 1). Po dostarczeniu lentiwirusa eksprymującego shRNA przeciwko LacZ (kontrola nieukierunkowana), Tcf4 i Id2 w iHSPC, skuteczność knockdown potwierdzona przez RT-qPCR ujawniła, że ekspresja Tcf4 była zmniejszona w shTcf4 iHSPC w porównaniu do shLacZ iHSPC (Figura 2A). Z drugiej strony, zmniejszoną ekspresję Id2 zaobserwowano również w shId2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wektory shRNA oparte na lentiwirusach są często wykorzystywane do wyciszania genów poprzez transdukcję wirusa do komórek i umożliwiają stabilną integrację z genomem gospodarza. Należy jednak wziąć pod uwagę różną wydajność transdukcji w różnych typach komórek i podjęto szereg podejść w celu przezwyciężenia tego problemu.

Polibren jest polimerem polikationowym, który może neutralizować ładunki na błonie komórkowej, zwiększając w ten sposób wiązanie wirionu z komórkami podczas transdukcji

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie techniczne od Dr. Tz-Ling Chen. Dziękujemy National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Tajwan) za dostarczenie lentiwirusa shRNA (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Prace te były wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 i MOST 109-2320-B-002-054-MY3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała
APC/Cy7 anty-mysie przeciwciało CD11cBiolegend117324(klon: N418)
FITC anty-mysie/ludzkie przeciwciało CD11bBiolegend101206(klon: M1/70)
PE anty-mysie/ludzkie B220 PrzeciwciałoBiolegend103208Klon: RA3-6B2)
Hodowla komórkowa
1,5 ml mikroprobówka  ExtraGeneTUBE-170-C
12-dołkowa płytka poddana kulturze tkankowejFalcon353043
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Corning35-010-CV
RPMI 1640 średniagibco11875-085
Odczynnik
β-estradiolSigma-AldrichE2758-250MG
β-merkaptoetanol (β-ME)Sigma-AldrichM6250
Bufor FACSdomowej robotyFormuła: 1xPBS + 0,5 %FBS + 0,1% NaN3
ligand Flt3 (FL)domowej roboty
PolybreneSigma-AldrichTR-1003-G
PuromycinInvivogenant-pr-1
TRIsureBIOLINEBIO-38032
shRNA (identyfikator sekwencji Taregt/klonu)Firma
shId2  (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)Konsorcjum RNAi (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)Konsorcjum RNAi (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)Konsorcjum RNAi (TRC)
(

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
  2. Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
  3. Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12. Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. -J. IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).
  6. Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).
  7. Durai, V., Murphy, K. M. Functions of murine dendritic cells. Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).
  8. Mashayekhi, M., et al. CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites. Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).
  9. Anderson, D. A., Dutertre, C. -A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
  10. Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
  11. Persson, E. K., et al. IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation. Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).
  12. Kumamoto, Y., et al. CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity. Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).
  13. Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
  14. Grajkowska, L. T., et al. Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification. Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).
  15. Jackson, J. T., et al. Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages. The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).
  16. Suzuki, S., et al. Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).
  17. Rodrigues, P. F., et al. Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells. Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).
  18. Brown, C. C., et al. Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity. Cell. 179 (4), 846-863 (2019).
  19. Redecke, V., et al. Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential. Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).
  20. Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection. Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).
  21. Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer. Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).
  22. Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).
  23. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
  24. Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information. Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).
  25. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hematopoetyczne kom rki progenitorowetransdukcja lentiwirusowar nicowanie in vitrocytometria przep ywowaczynniki transkrypcyjnekonwencjonalne kom rki dendrytyczneplazmacytoidalne kom rki dendrytyczne

Powiązane artykuły