Large-Scale Multi-Omimic Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Wytyczne dotyczące przygotowania i normalizacji próbek

Podsumowanie

W tym protokole prezentujemy zoptymalizowany przepływ pracy, który łączy w sobie efektywne i szybkie przygotowanie wielu próbek. Ponadto udostępniamy przewodnik krok po kroku, jak zmniejszyć odchylenia analityczne w celu wysokoprzepustowej oceny metabolicznych badań GWAS.

Streszczenie

Zarówno chromatografia gazowa-spektrometria mas (GC-MS), jak i chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LC-MS) są szeroko stosowanymi metodami metabolomicznymi do wykrywania i ilościowego określania setek tysięcy cech metabolitów. Jednak zastosowanie tych technik do dużej liczby próbek podlega bardziej złożonym interakcjom, szczególnie w przypadku badań asocjacyjnych całego genomu (GWAS). Protokół ten opisuje zoptymalizowany przepływ pracy metabolicznej, który łączy wydajne i szybkie przygotowanie próbek z analizą dużej liczby próbek dla gatunków roślin strączkowych. Ta nieznacznie zmodyfikowana metoda ekstrakcji została początkowo opracowana do analizy tkanek roślinnych i zwierzęcych i opiera się na ekstrakcji w eterze metylowo-tert-butylowym: rozpuszczalniku metanolowym, aby umożliwić wychwytywanie metabolitów polarnych i lipidowych. Ponadto udostępniamy przewodnik krok po kroku dotyczący redukcji zmian analitycznych, które są niezbędne do wysokoprzepustowej oceny wariancji metabolicznej w GWAS.

Wprowadzenie

Podejścia "omiczne" na dużą skalę umożliwiły analizę złożonych systemów biologicznych^1,2,3 oraz dalsze zrozumienie związku między genotypami a wynikającymi z nich fenotypami⁴. Metabolomika z wykorzystaniem ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UHPLC-MS) i GC-MS umożliwiła wykrycie wielu cech metabolitów, z których tylko niektóre są w pewnym stopniu opisane, co skutkuje wysokim odsetkiem nieznanych metabolitów. Złożone interakcje można badać, łącząc metabolomikę na dużą skalę z podstawową zmiennością genotypową zróżnicowanej populacji⁵. Jednak obsługa dużych zestawów próbek jest z natury związana z różnicami analitycznymi, co zniekształca ocenę wariancji metabolicznej dla dalszych procesów. W szczególności główne problemy prowadzące do różnic analitycznych opierają się na wydajności maszyny i instrumentalnym dryfie w czasie⁶. Integracja zmienności między partiami jest trudna, a szczególnie problematyczna w przypadku analizy ustrukturyzowanych populacji roślin na dużą skalę. Zaproponowano wiele procedur normalizacji w celu skorygowania różnic niebiologicznych, np. użycie wewnętrznych, zewnętrznych i znakowanych izotopami wzorców wewnętrznych w celu skorygowania błędów analitycznych, z których każdy jest z natury związany ze znanymi problemami i pułapkami^7,8,9,10.

Oprócz zmienności analitycznej, wybór protokołów ekstrakcji zazwyczaj różni się w zależności od metody analitycznej. Docelowo pożądane jest obniżenie kosztów materiałowych i robocizny oraz konieczności wykorzystania kilku podwielokrotności tej samej próbki do różnych procesów analitycznych poprzez zastosowanie metod ekstrakcji opartych na separacji faz. Metody te zostały po raz pierwszy wprowadzone przy użyciu chloroformu: rozpuszczalników metanol/woda do frakcjonowania związków polarnych i hydrofobowych¹¹.

Ten protokół opisuje szybki potok o wysokiej przepustowości dla platformy multi-omicznej do profilowania zarówno metabolitów polarnych, jak i lipidów w gatunkach roślin strączkowych. Ponadto pokazano, w jaki sposób te zestawy danych można odpowiednio skorygować pod kątem zmienności analitycznej i znormalizować przed integracją informacji genotypowych w celu wykrycia loci cech ilościowych metabolitów (QTL) za pomocą GWAS.

Protokół

1. Projekt eksperymentalny i uprawa roślin

UWAGA: Ustawienie eksperymentu w zależności od hipotezy eksperymentalnej, np. użycie dużej populacji GWAS zmniejsza konieczność wielokrotnych powtórzeń, ponieważ testy statystyczne będą wykonywane na podstawie haplotypów wszystkich indywidualnych SNP, a nie akcesji. W przeciwieństwie do tego, wielokrotne powtórzenia są niezbędne w innych podejściach eksperymentalnych. Podczas przygotowywania eksperymentu należy wziąć pod uwagę następujące punkty.

1. Uwzględnij wystarczającą liczbę powtórzeń biologicznych, w zależności od hipotezy eksperymentalnej.
2. Randomizuj kontrpróby biologiczne blokowo, aby zmniejszyć lokalne odchylenia środowiskowe podczas uprawy, np. w szklarni, na polu.
3. Zadbaj o odpowiednią pielęgnację rośliny podczas wzrostu. Traktuj rośliny jednorodnie, aby zmniejszyć odchylenia.

2. Przygotowanie biologicznego materiału roślinnego

1. Przygotowanie do zbiorów
   1. Oznaczyć probówki do zbierania (20 ml) zawierające dwa metalowe kulki o średnicy 5 mm i dwie o średnicy 8 mm do homogenizacji. Napełnij dewara ciekłym azotem.
      UWAGA: Rośliny powinny znajdować się w fazie wegetatywnej do zbioru świeżych liści i tkanek korzeniowych.
2. Pobieranie próbek biologicznych przez błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie. Zbieraj tak szybko, jak to możliwe, aby wykluczyć wpływ oscylacji okołodobowych na metabolizm podczas dłuższych okresów zbiorów^12,13. Zebrane świeże tkanki liści i korzeni należy przechowywać w celu dalszego przetwarzania w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Cięcie liści do błyskawicznego zamrażania nie powinno trwać dłużej niż kilka sekund, ponieważ po rozszczepieniu liści aktywne procesy biologiczne zmieniłyby profile metaboliczne z powodu zranienia. W przypadku korzeni należy je wstępnie oczyścić, myjąc wodą przed błyskawicznym zamrożeniem w ciekłym azocie. Nadmiar wody na powierzchni korzenia należy wchłonąć chusteczką papierową. Suszone nasiona można przechowywać w temperaturze pokojowej; Nie jest wymagane zamrażanie w ciekłym azocie.
3. Zmiel tkankę za pomocą młynka do bibułek.
   1. Wstępnie schłodzić uchwyty probówek w ciekłym azocie przez kilka minut, aby utrzymać niską temperaturę podczas mielenia tkanki.
   2. Próbki biologiczne należy transportować w urządzeniu Dewara zawierającym azot po wyjęciu ich z zamrażarki o temperaturze -80 °C.
   3. Zmielić tkanki do uzyskania jednorodnego proszku; stosować 25 Hz przez 1 minutę i powtórzyć po zamrożeniu w ciekłym azocie, jeśli tkanka nie jest jednorodnie zmielona.
4. Do mielenia suszonych nasion umieść je w naczyniu do mielenia z metalowym koralikiem o średnicy 15 mm. Używaj tej samej częstotliwości i czasu, jak wspomniano w 2.3.3.
   UWAGA: Czyste i wstępnie schłodzone moździerze i tłuczki mogą być używane, jeśli młynek do mieszania tkanek jest niedostępny.
5. Wstępnie oznaczone probówkami wirówkowymi o pojemności 2 ml z bezpiecznym zamkiem. Zważyć 50 mg z błędem ±5 mg świeżego materiału roślinnego przy użyciu wagi analitycznej. Wstępnie schłodzić narzędzia używane do przenoszenia materiału roślinnego w ciekłym azocie. Upewnij się, że materiał roślinny pozostaje zamrożony podczas procesu ważenia.
   UWAGA: Nie wystawiaj świeżego materiału roślinnego zbyt długo na działanie temperatury pokojowej, ponieważ procesy biologiczne są aktywowane przez wzrost temperatury, zmieniając profile metaboliczne¹⁴.
6. Generowanie dodatkowych próbek do kontroli jakości (QC) poprzez zebranie części każdej próbki i zważenie 50 mg z błędem ±5 mg połączonego świeżego materiału roślinnego do wstępnie schłodzonych probówek wirówkowych o pojemności 2 ml z bezpiecznym zamkiem.
   UWAGA: Zaleca się co najmniej trzy próbki kontroli jakości na każde 60 próbek. Próbki kontroli jakości są niezbędne do dalszej korekty, normalizacji i analiz
.

3. Odczynniki ekstrakcyjne

1. Świeże tkanki, np. liście i korzenie
   UWAGA: Ekstrakcja próbki jest oparta na wcześniej opisanym protokole¹⁵. Protokół ten został zmodyfikowany w oparciu o obecne potrzeby, np. wiele tkanek, różne standardy wewnętrzne i eksperymenty na dużą skalę. Dodatkowo, wszystkie wymienione poniżej głośności i ustawienia instrumentów są dostosowane do wewnętrznych jednostek analitycznych. Użytkownicy protokołu powinni dostosować je do swojej jednostki analitycznej i próbek biologicznych, w oparciu o próbki testowe.
   1. Mieszanina ekstrakcyjna 1 (EM1): eter metylowo-tert-butylowy (MTBE)/metanol (MeOH) (3:1 v/v)
      1. Przygotować mieszaninę MTBE/MeOH w stosunku 3:1. Na 100 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego wymieszaj 75 ml MTBE z 25 ml MeOH w czystej szklanej butelce.
         UWAGA: Z rozpuszczalnikami należy obchodzić się ostrożnie w dygestorium przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego.
      2. Dodać 45 μl 1,2-diheptadecanoilo-sn-glycero-3-fosfocholiny (1 mg/ml w chloroformie) jako wzorzec wewnętrzny do analizy lipidów na podstawie UHPLC-MS, 400 μl rybitolu (1 mg/ml w wodzie) jako wzorzec wewnętrzny do analizy na podstawie GC-MS i 125 μl izowiteksyny (1 mg/ml w MeOH/woda (1:1 v/v)) do analizy metabolitów na podstawie UHPLC-MS.
         UWAGA: Dodanie wzorców wewnętrznych jest konieczne do normalizacji po analizie zgodnie z potrzebami analitycznymi. Ponieważ na każdą próbkę potrzeba 1 ml EM1, należy przygotować roztwór podstawowy zgodnie z wielkością próbki doświadczalnej, który powinien być użyty w całym doświadczeniu. EM1 musi być przechowywany w temperaturze -20 °C. Sprawdzić, czy w badanych gatunkach nie ma zastosowanego wzorca wewnętrznego i nie nakłada się na siebie z innymi związkami. Można zastosować kilka standardów; Wybór wzorców wewnętrznych w tym protokole został oparty na wcześniejszych testach z wykorzystaniem ekstraktów z fasoli zwyczajnej¹⁶.
   2. Mieszanina ekstrakcyjna 2 (EM2) woda/ metanol (MeOH) (3:1 v/v)
      1. W przypadku 100 ml EM2 dodaj 75 ml podwójnie destylowanej wody i 25 ml MeOH do czystej szklanej butelki.
      2. Dodać 500 μl EM2 na próbkę i przygotować roztwór podstawowy zgodnie z wielkością próbki doświadczalnej, który powinien być użyty w całym doświadczeniu. Przechowywać EM2 w temperaturze 4 °C.
2. Suszone nasiona
   1. Mieszanina ekstrakcyjna 3 (EM3) metanol (MeOH)/ woda (7:3 v/v)
      1. Na 100 ml EM3 dodaj 70 ml MeOH i 30 ml podwójnie destylowanej wody do czystej szklanej butelki. Przygotować 1 ml EM3 dla każdej próbki.
      2. Dodać 400 μl rybitolu (1 mg/ml w wodzie) jako wzorce wewnętrzne do analizy na podstawie GC-MS i 125 μl izowiteksyny (1 mg/ml w MeOH/woda (1:1 v/v)) do analizy metabolitów na bazie UHPLC-MS.
         UWAGA: Przygotuj roztwór podstawowy zgodnie z wielkością próbki doświadczalnej i użyj go do całego eksperymentu. Przechowywać EM3 w temperaturze 4 °C.

4. Pobieranie próbek

1. Świeże tkanki, np. liście i korzenie
   1. Przygotować trzy probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml z bezpiecznym zamknięciem dla każdej próbki. Utrzymuj EM1 w systemie chłodzenia cieczą o temperaturze -20 °C. Przenieść świeże próbki z zamrażarki w temperaturze -80 °C do suchego lodu lub ciekłego azotu na czas transportu. Dodać 1 ml wstępnie schłodzonego EM1 do każdej porcji 50 mg i krótko odwirować przed umieszczeniem na lodzie.
   2. Próbki inkubować na wytrząsarce orbitalnej o masie 800 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   3. Sonikować próbki w chłodzonej lodem kąpieli sonizacyjnej przez 10 minut.
   4. Dodaj 500 μl EM2 za pomocą pipety wielokanałowej, aby uniknąć zmian w dodawanych objętościach.
   5. Próbki należy krótko zmieszać w celu wymieszania mieszanin ekstrakcyjnych przed odwirowaniem w temperaturze 11 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Po rozdzieleniu faz przenieś 500 μl górnej fazy zawierającej lipidy do wstępnie znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z bezpiecznym zamknięciem. Usuń resztę górnej fazy.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas przenoszenia, ponieważ ta górna faza ma wysokie ciśnienie pary i ma tendencję do wyciekania z pipety.
   7. Przenieść 150 μl i 300 μl dolnych polarnych i półpolarnych faz zawierających metabolity w dwóch probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml typu safe-lock używanych odpowiednio do analizy GC-MS i UHPLC-MS.
   8. Zagęścić wszystkie wyekstrahowane frakcje, pozwalając rozpuszczalnikom odparować bez podgrzewania, używając koncentratora próżniowego i przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Suszone nasiona
   1. Przygotować dwie probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml z bezpiecznym zamknięciem dla każdej próbki. Trzymaj EM3 na lodzie. Umieścić metalowy koralik o średnicy 5 mm w podwielokrotnościach próbki.
   2. Dodać 1 ml EM3 do każdej podwielokrotności 50 mg i homogenizować próbki w temperaturze 25 Hz przez 2-3 minuty przed umieszczeniem ich na lodzie.
   3. Sonikować próbki w chłodzonej lodem kąpieli sonizacyjnej przez 10 minut.
   4. Próbki należy krótko wirować przed odwirowaniem w temperaturze 11 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Przenieść 150 μl i 300 μl supernatantu do dwóch probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml z bezpiecznym zamknięciem, używanych odpowiednio do analizy GC-MS i UHPLC-MS.
   6. Zagęścić wszystkie wyekstrahowane frakcje, pozwalając rozpuszczalnikom odparować bez podgrzewania, używając koncentratora próżniowego i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Opierając się na doświadczeniu, użytkownikom zaleca się wykonanie kroku 4.2 dla analizy metabolitów półpolarnych i pochodnych metabolitów w suszonych nasionach. Wykonać etap ekstrakcji 4.1 w celu analizy lipidów suszonych nasion.

5. Analiza lipidów za pomocą UHPLC-MS

1. Wysuszone frakcje lipidowe zawiesić ponownie w 250 μl acetonitrylu:2-propanolu (7:3, obj./obj.).
2. Sonikować fazę lipidową przez 5 minut, odwirowywać przy 11 200 × g przez 1 minutę.
3. Przenieść 90 μl supernatantu do szklanej fiolki z pojemnikiem na LC-MS.
4. Wstrzyknąć 2 μl ekstraktów do LC-MS.
5. Przeprowadzić frakcjonowanie lipidów na kolumnie C₈ z odwróconymi fazami, utrzymywanej w temperaturze 60 °C, pracującej z przepływem 400 μl/min ze stopniowymi zmianami eluentu A i B, jak pokazano w tabeli 1. Uzyskaj widma masowe w trybie jonizacji dodatniej o zakresie mas 150-1 500 m/z.
6. Do wszystkich dziennych partii należy dołączyć kilka próbek kontroli jakości oraz ślepą próbę, aby zapewnić korektę na odchylenia analityczne. Losowe próbki blokowe w kolejności sekwencyjnej.

6. Analiza metabolitów polarnych i półpolarnych za pomocą UHPLC-MS

1. Ponownie zawiesić wysuszoną fazę polarną w 180 μl metanolu klasy UHPLC: woda (1:1 v/v).
2. Sonikować fazę polarną przez 2 min, odwirowywać przy 11 200 × g przez 1 min.
3. Przenieść 90 μl supernatantu do szklanej fiolki z pojemnikiem na LC-MS.
4. Wstrzyknąć 3 μl ekstraktów do LC-MS.
5. Frakcjonowanie metabolitów przeprowadzić na kolumnie z odwróconą fazą C₁₈ utrzymywanej w temperaturze 40 °C, pracującej przy przepływie 400 μl/min ze stopniowymi zmianami eluentu A i B, jak pokazano w tabeli 1. Uzyskaj widma masowe w zakresie mas 100-1,500 m/z w pełnym skanowaniu MS i fragmentacji wszystkich jonów (AIF) wywołanej wysokoenergetyczną dysocjacją kolizyjną (HCD) 40 keV.
   UWAGA: Użyj obu trybów jonizacji. Jednak ze względu na ograniczoną pojemność podczas uruchamiania dużej liczby próbek, uruchom próbki testowe w obu trybach jonizacji, aby określić preferowany tryb jonizacji.
6. Do wszystkich dziennych partii należy dołączyć kilka próbek kontroli jakości oraz ślepą próbę, aby zapewnić korektę na odchylenia analityczne. Losowe próbki blokowe w kolejności sekwencyjnej.
7. Uruchom kontrolę jakości w puli w zależności od danych MS² zarówno w trybie jonizacji ujemnej, jak i dodatniej. Uzyskane widma masowe należy wykorzystać w późniejszym kroku (8.5) do adnotacji.

7. Analiza derywatyzowanych metabolitów za pomocą GC-MS^17,18

UWAGA: Analiza derywatyzowanych metabolitów opiera się na wcześniej opisanym protokole¹⁷. Wszystkie odczynniki do derywatyzacji należy przechowywać w dygestorium. Upewnij się, że N-metylo-N-(trimetylosililo)trifluoracetamid (MSTFA) nie ma kontaktu z wodą i wilgocią.

1. Odczynnik do derywatyzacji 1 (DR1)
   1. Rozpuścić chlorowodorek metoksyaminy w pirydynie, aby uzyskać stężenie 30 mg/ml DR1. Na każdą próbkę należy użyć 40 μl DR1. Przygotować roztwór podstawowy zgodnie z wielkością próbki i przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Odczynnik do derywatyzacji 2 (DR2)
   1. Rozpuścić MSTFA w 20 μl estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) na 1 ml MSTFA. Na każdą próbkę należy użyć 70 μl DR2. Przygotować roztwór podstawowy zgodnie z wielkością próbki. Przechowywać MSTFA w temperaturze 4 °C, a FAME w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: FAME obejmują metylokaprylan, pelargonian metylu, metylokaprynian, metylolaurynian, mirystynian metylu, palmitynian metylu, stearynian metylu, metyloikozanian, metylodkozanian, ester metylowy kwasu lignocerynowego, heksakozanian metylu, metylokratakozanian i ester metylowy kwasu triakontańskiego, które rozpuszcza się w CHCl₃ w stężeniu 0,8 μl/ml lub 0,4 mg/ml odpowiednio dla wzorców ciekłych lub stałych.
3. Ponownie wysuszyć osad z fazy polarnej (przechowywany w temperaturze -80 °C) za pomocą koncentratora próżniowego przez 30 minut, aby uniknąć jakichkolwiek zakłóceń_H2Opowstających podczas przechowywania z rozpuszczalnikami używanymi do dalszej derywatyzacji.
4. Dodać 40 μl DR1.
5. Wytrząsać próbki o temperaturze 950 × g przez 2 godziny w temperaturze 37 °C za pomocą wytrząsarki orbitalnej, a następnie krótko odwirować ciecz.
6. Dodać 70 μl DR2.
7. Wytrząsać ponownie w temperaturze 950 × g przez 30 minut w temperaturze 37 °C za pomocą wytrząsarki orbitalnej.
8. Odwirować krótko w temperaturze pokojowej przed przeniesieniem 90 μl do szklanych fiolek w celu analizy GC-MS.
9. Wstrzyknąć 1 μl do GC-MS w trybie bezpodziałowym, w zależności od stężenia metabolitów, przy stałym przepływie helu w postaci gazu nośnego wynoszącym 2 ml/min. Temperaturę wtrysku ustawia się na 230 °C za pomocą 30-metrowej kolumny kapilarnej MDN-35.
   UWAGA: Dodatkowe informacje, np. gradient temperatury, można znaleźć w Tabeli 1. Zakres masy jest ustawiony na 70-600 m/z przy 20 skanach/min. Uwzględnij tryby dzielone, aby umożliwić ilościowe określenie przypuszczalnych związków przeciążających, oszczędzając koszty i czas na ponowną derywatyzację ekstraktu w takich przypadkach.
10. Do wszystkich dziennych partii należy dołączyć kilka próbek kontroli jakości oraz ślepą próbę, aby zapewnić korektę na odchylenia analityczne. Prawidłowo losowo dobieraj próbki blokowo w kolejności sekwencyjnej.

8. Przetwarzanie chromatogramów i adnotacja złożona

1. Filtruj szum chemiczny, definiując progi intensywności. Uwzględnij wszystkie próbki kontroli jakości podczas przetwarzania chromatogramów.
   UWAGA: W przypadku danych o dużej skali filtrowanie szumów ma kluczowe znaczenie dla skrócenia czasu obliczeń i mocy obliczeniowej.
2. Wyrównaj chromatogramy, definiując przesunięcie czasu retencji. Należy sprawdzić chromatogramy z każdej partii, aby ocenić zmienność wewnątrz- i międzyseryjną.
3. Wykonaj wykrywanie piku w zależności od kształtu piku, np. wysokości i szerokości dla obliczeń pełnej szerokości przy połowie maksimum (FWHM).
4. Grupowanie izotopów w celu redukcji nadmiarowych sygnałów i odfiltrowania singletonów.
   UWAGA: Szczegółowe informacje na temat oprogramowania używanego do przetwarzania chromatogramów można znaleźć w Tabeli materiałów. Dostępne są szczegółowe protokoły dotyczące przetwarzania chromatogramów przy użyciu różnych ogólnodostępnych narzędzi programowych, np. MS-DIAL, MetAlign, MzMine i Xcalibur^19,20,21.
5. Użyj danych ddMS² próbki QC w puli do adnotacji złożonej. Oceń strukturę molekularną, określając masę monoizotopową i obserwując powszechne ubytki obojętne, znane naładowane aglikony i różne typy rozszczepienia, np. homolityczne lub heterolityczne^16,22.
6. W celu raportowania danych dotyczących metabolitów należy postępować zgodnie z zaleceniami opisanymi w Fernie et al. 2011²³.
   UWAGA: Do analizy danych metabolomicznych można wykorzystać różne podejścia do metabolomiki obliczeniowej^24,25,26.

9. Normalizacja dużego zbioru danych metabolomicznych

1. Sprawdź rozkład wzorców wewnętrznych i znormalizuj, korygując odpowiedź jednego lub wielu wzorców wewnętrznych.
2. Skorygować natężenia pików uzyskane z chromatogramu na dokładnej masie próbki, dzieląc natężenia pików przez podaną masę próbki homogenizowanej z kroku 2.5.
3. Skorygowano dryft intensywności w seriach wielostronicowych. Wykonaj metody korekcji oparte na kontroli jakości, takie jak lokalnie szacowane wygładzanie wykresu rozrzutu (LOESS)²⁷ przy użyciu R.
   UWAGA: Dostępnych jest kilka narzędzi i pakietów, które rozwiązują problem dryfu wydajności MS podczas pozyskiwania całych partii^28,29.
4. Zapewnij normalny rozkład cech przez transformację danych, np. transformacja Boxa-Coxa³⁰ przy użyciu funkcji boxcox() z pakietu R MASS do przeprowadzenia GWAS.
5. Wykonaj skalowanie danych, np. skalowanie Pareto, dla analizy wielowymiarowej, aby zapewnić prawidłowe ważenie związków o niskiej zawartości sup³¹.
   UWAGA: Jeśli to możliwe, wykonaj test odzyskiwania, aby uniknąć efektów matrycy, np. tłumienie jonów¹⁴.

10. Badania asocjacyjne całego genomu (GWAS)³²

1. Wywołaj polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) lub warianty strukturalne (SV) z danych sekwencjonowania^33,34.
2. Filtruj dane genotypowe pod kątem częstości występowania małych alleli (MAF) < 5% i współczynnika braków >10%, aby uniknąć błędu o niskiej częstotliwości, używając Tassel³⁵.
3. Oblicz najlepsze liniowe nieobciążone przewidywania (BLUP) dla każdej znormalizowanej cechy na podstawie powtórzeń eksperymentalnych, aby wyeliminować odchylenia wynikające z czynników środowiskowych (efektów losowych) za pomocą pakietu R Ime4³⁶.
4. Użyj BLUP każdej funkcji z osobna, aby wykonać GWAS przy użyciu pakietu rMVP w R³⁷.
   UWAGA: Każda cecha metabolomiczna jest tutaj postrzegana jako indywidualny samodzielny fenotyp.
5. Podczas wykonywania GWAS należy skorygować strukturę populacji za pomocą analizy głównych składowych (PCA) i tożsamości według stanu (IBS) lub vanRaden, aby zminimalizować efekty zakłócające. Ponadto rozważ użycie mieszanego modelu liniowego (MLM) lub mieszanego modelu z wieloma miejscami (MLMM), ponieważ modele mieszane zawierają stałe i losowe efekty.

11. Wykrywanie QTL

1. Sprawdź SNP wykazujące znaczące powiązanie, biorąc pod uwagę wykresy Manhattanu, w celu obliczenia nierównowagi sprzężeń (LD) w celu określenia leżącego u podstaw regionu genetycznego. Wykonaj obliczenia LD za pomocą mapy cieplnej LD w pakiecie R lub Frędzla 5.
2. Sprawdź powiązane SNP pod kątem wielkości efektu na cechę, badając poziomy cech pod kątem zmian statystycznych między haplotypami, aby znaleźć potencjalne przyczynowe SNP, np. SNP prowadzące do zmiany aminokwasu w sekwencji kodującej białko, co może wyjaśnić zmienność fenotypową.
   UWAGA: Ponieważ asocjacje SNP-cechy niekoniecznie dają związek przyczynowy, kluczowe znaczenie ma określenie regionu genomu. Tożsamość złożona na podstawie adnotacji cech może ogromnie pomóc w znalezieniu odpowiednich genów kandydujących w określonym regionie genomu. Sugerujemy połączenie wszystkich wykrytych QTL związanych z określonymi związkami na mapie plejotropowej, aby podkreślić regiony genetyczne³⁸, jak pokazano w Rysunek 4. W celu walidacji genów kandydujących można zastosować kilka podejść (patrz dyskusja).

Wyniki

Udane eksperymenty GWAS w zakresie metabolomiki powinny rozpocząć się od odpowiedniego projektu eksperymentalnego, po którym następuje zbieranie, ekstrakcja, pozyskiwanie i przetwarzanie próbek, jak pokazano w Rysunek 1. W tym protokole metoda MTBE¹⁵ została użyta do ekstrakcji i analizy setek metabolitów należących do kilku klas związków. Chromatografia zależy w dużym stopniu od właściwości zastosowanej kolumny, jak również mieszanin elucyjnych. Rysunek 2 pokazuje chromatogramy próbek QC, wskazujące na wzór elucji niektórych głównych klas lipidów w tym systemie analitycznym. Nachylenia zastosowane dla każdej peronu podano w tabeli 1. Duży nacisk położono na radzenie sobie z błędami systemowymi w eksperymentach na dużą skalę. Wykonywanie metabolomiki na dużą skalę jest nieodłącznie związane z błędami systemowymi. W celu demonstracji przeanalizowaliśmy dane lipidomiczne dotyczące kilku popularnych gatunków fasoli. Tabela uzupełniająca 1 zawiera wyekstrahowane surowe dane lipidomiczne uzyskane po przetworzeniu chromatogramu przy użyciu oprogramowania wskazanego w tabeli materiałów. Przestrzeganie tego protokołu pozwoliło nam obejść główne problemy związane z danymi omicznymi, zwłaszcza podczas obsługi dużych zestawów prób. Procedura normalizacji zapewnia dokładną korektę błędów analitycznych w poszczególnych partiach, jak pokazano na rysunku Rysunek 3. Chociaż zwiększenie liczby próbek kontroli jakości zwiększyłoby moc normalizacji, nie zawsze jest to wykonalne ze względu na ograniczenia kosztowe i czasowe. W przypadku wysokoprzepustowej metabolomiki GWAS z nieukierunkowanymi cechami metabolicznymi konieczne jest odpowiednie zilustrowanie większej liczby powiązań cecha-marker. Mapa plejotropowa³⁸ łącząca wiele wyników GWAS może być wykorzystana do podkreślenia regionów genomu, z którymi powiązanych jest kilka cech (Rysunek 4).

Rysunek 1: Schemat blokowy GWAS opartego na metabolomice w roślinach. W lewym panelu przedstawiono kilka kroków, począwszy od projektu eksperymentalnego, aż do wykrycia QTL. W prawym panelu pokazanych jest wiele rysunków wspierających kilka kroków wymienionych w lewym panelu. Zaczynając od prawego górnego rogu, (1) sugerowana sekwencja próbek jest pokazana dla LC-MS, (2) wstępne i końcowe wykresy wyników PCA, w tym reprezentatywny rozkład cech przed i po przetwarzaniu, z kolorem czerwonym oznaczającym intensywność próbki QC, oraz (3) wykres Manhattan ze znaczącymi powiązaniami, do których wygenerowano rozkłady LD i haplotypów. Skróty: GWAS = badania asocjacyjne całego genomu; QTL = loci cech ilościowych; PCA = analiza składowych głównych; QC = kontrola jakości; LD = nierównowaga wiązania; MS = spektrometria mas; LC-MS = chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas; GC-MS = chromatografia gazowa-spektrometria mas; LOESS = lokalnie szacowane wygładzanie wykresu rozrzutu; MLM/MLMM = mieszany model liniowy/model mieszany z wieloma locusami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przetwarzanie chromatogramu. Dwa chromatogramy kontroli jakości (pik podstawowy; dane dotyczące lipidów) z różnych partii pokazują zmienność pod względem partii dla niektórych klas lipidów w zbiorczych próbkach kontroli jakości. Cztery główne klasy lipidów są oznaczone odpowiednimi oknami elucyjnymi w wewnętrznym systemie LC-MS. Chromatogramy zostały wyeksportowane z MzMine²¹. Skróty: QC = kontrola jakości; LC-MS = chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Korekta błędu systematycznego. Analiza głównych składowych pozyskanych danych lipidomicznych, przed (po lewej, dane surowe) i po korekcie pod kątem błędów systemowych (po prawej, lessy okresowe). Dolne panele ilustrują rozkład cech (Cluster_00005) w próbkach (n = 650) i partiach (n = 10) przed (po lewej) i po (po prawej) korekcie w celu uzyskania zmienności analitycznej. Skróty: PCA = analiza głównych składowych; QC = kontrola jakości; LOESS = lokalnie szacowane wygładzanie wykresu rozrzutu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Mapa plejotropowa ilustrująca połączone wyniki GWAS. Mapa plejotropowa podkreśla regiony w całym genomie, które są związane z kilkoma cechami. Liczby na zewnętrznych pierścieniach wskazują odpowiadające im chromosomy. Każdy circlet reprezentuje indywidualną cechę z jej znacząco powiązanymi SNP. Kolory reprezentują różne klasy złożone (szary = klasa związku 1; zielony = klasa związku 2; fioletowy = klasa złożona 3; żółty = klasa złożona 4). W przypadku międzyzłożonych powiązań klasowych z tym samym regionem genomowym geny są wyróżnione. Wewnętrzne szare kółko pokazuje sumę wszystkich istotnych SNP związanych z określoną pozycją genomową. Skojarzenia pokazane na tym rysunku są sztucznie generowane tylko w celach ilustracyjnych. Skróty: GWAS = badania asocjacyjne całego genomu; SNP = polimorfizmy pojedynczego nukleotydu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

górę

Ustawienia UHPLC-MS dla lipidów
Czas [min]	Eluent A do B [%]*	Informacje
0 - 1.00	45 % w stosunku do	Eluent A: 1% 1MNH 4-octan, 0,1% kwas octowy w wodzie (klasa UHPLC)
godz. 13.00 - 4.00	lg 45% - 25% A	Eluent B: 1% 1MNH 4-Acetate, 0.1% kwas octowy w acetonitrylu/2-propanolu 7:3 (klasa UHPLC)
godz. 4.00 - 12.00	lg 25% - 11% A	Przepływ: 400 μL/min
12.00 - 15.00	lg 11% - 0% A	Objętość iniekcji: 2 μL
godz. 15.00 - 19.50	cw 0% A
godz. 19.50-19.51	0% - 45% A
godz. 19.51-24.00	Korektor 45%
Ustawienia UHPLC-MS/MS dla metabolitów polarnych i półpolarnych
Czas [min]	Eluent A i B [%]*	Informacje
0 - 1.00	99% w	Eluent A: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie (klasa UHPLC)
godz. 1.00 - 11.00	lg 99% -60% A	Eluent B: 0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu (klasa UHPLC)
11.00 - 13.00	lg 60% - 30% A	Przepływ: 400 μL/min
13.00 - 15.00	lg 30% - 1% A	Objętość iniekcji: 3 μL
godz. 15.00 - 16.00	cw 1% A
godz. 16.00 - 17.00	lg 1% - 99% A
17.00 - 20.00	ekwiwalent 99% A
Ustawienia GC-MS dla derywatyzowanych metabolitów
Czas [min]	Temperatura [°C]	Informacje
0 - 2.00	Rozdział 85	Gaz nośny: Hel
godz. 2.00 - 18.66	LG 80 - 330	Przepływ: 2 mL/min
w godzinach 18.66 - 24.66	Zobacz materiał CW 330	Gradient temperatury: 15 °C/min
Godzina 24,66	szybkie chłodzenie	Objętość iniekcji: 1 μL

Tabela 1: Ustawienia gradientu dla każdej z platform analitycznych⁷. Skróty: lg = gradient liniowy; cw = mycie kolumny; eq = równowaga; UHPLC-MS = ultra-wysokosprawna chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas; UHPLC-MS/MS = ultra-wysokosprawna chromatografia cieczowa - tandemowa spektrometria mas; GC-MS = chromatografia gazowa-spektrometria mas. * = wartość procentowa odpowiada eluentowi A; pozostała wartość procentowa odpowiada eluentowi B.

Tabela uzupełniająca 1: Surowe dane lipidomiczne. Wskazuje szczytowe intensywności dla każdego z wykrytych klastrów w każdej próbce. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Zarówno GC-MS, jak i LC-MS są szeroko stosowanymi narzędziami do profilowania złożonych mieszanin różnych klas metabolitów. Obsługa dużych zbiorów danych za pomocą tych narzędzi jest z natury związana ze zmiennością niebiologiczną, np. zmiennością analityczną, która zakłóca i zniekształca interpretację wyników. Protokół ten przedstawia solidny i wysokowydajny potok ekstrakcji do kompleksowego profilowania metabolicznego w celu wyeliminowania zmienności pochodzenia niebiologicznego i przeprowadzenia badań "omicznych" na dużą skalę. Objętości i stężenia użyte w tym protokole zostały dostosowane do gatunków roślin strączkowych w różnych tkankach. Parametry te można jednak nieznacznie zmodyfikować i wykorzystać do dużych próbek metabolicznych innych gatunków roślin.

Poprzednio^{opisane ekstrakcje} na bazie MTBE można wykorzystać do analizy derywatyzowanych metabolitów, metabolitów półpolarnych i lipidów. Można to rozszerzyć na ekstrakcje białek i hormonów roślinnych³⁹, które były poza zakresem tego protokołu. Inne protokoły ekstrakcji opierają się na mieszaninach dichlorometanu: etanol^40,41. Spośród tych protokołów ekstrakcji, protokół ekstrakcji MTBE:metanol stanowi korzystną i mniej niebezpieczną alternatywę dla istniejących protokołów ekstrakcji na bazie chloroformu⁴² i nie prowadzi do powstania osadu białkowego jako interfazy między fazą polarną i lipidową. Ponadto metody MTBE zostały już wykorzystane w kilku badaniach dla różnych próbek biologicznych 43,44,45.

W protokole omówiono kilka kluczowych kroków, które mogą prowadzić do potencjalnej zmienności podczas obsługi dużej liczby próbek, np. podczas zbioru^12,13, ekstrakcji¹⁴, a także randomizacji⁴⁶. Ponadto istnieją dodatkowe kwestie, które nie zostały omówione w tym protokole, a które należy wziąć pod uwagę, aby zapewnić wysokiej jakości dane metabolomiczne, np. efekt matrycy i supresja jonów¹⁴.

Moc metod normalizacji opartych na kontroli jakości z natury zależy od liczby próbek kontroli jakości w każdej partii. Jak wspomniano wcześniej, chociaż zwiększenie liczby zwiększyłoby moc, zmienność wewnątrzpartiowa kontroli jakości jest stosunkowo marginalna w porównaniu ze zmiennością międzypartiową w tych systemach analitycznych, jak pokazano na rysunku 3. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją inne metody normalizacji oparte na kontroli jakości, takie jak usuwanie błędów systemowych przy użyciu lasu losowego (SERRF), które, jak wykazano, przewyższają większość innych metod normalizacji, takich jak stosunek partii, normalizacja przy użyciu optymalnego wyboru wielu standardów wewnętrznych (NOMIS) i normalizacja ilorazu probabilistycznego (PQN)⁴⁷. Jednak SERRF opiera się na wielu próbkach kontroli jakości w każdej partii, np. co dziesiąta próbka, co nie jest możliwe w przypadku obsługi dużej liczby próbek. Główną zaletą normalizacji opartej na kontroli jakości w porównaniu z innymi metodami opartymi na danych lub wewnętrznych standardach jest to, że zachowuje ona podstawową zmienność biologiczną, jednocześnie dostosowując się do niepożądanej zmienności technicznej²⁸. Czytelnicy mogą zapoznać się z niniejszym przeglądem na temat postępowania z wariantem²⁸.

Jednym z głównych problemów w GWAS jest odsetek wyników fałszywie dodatnich, które powstają głównie z powodu powiązania stron przyczynowych i nieprzyczynowych^48,49. Po drugie, konserwatywne podejścia do korekty statystycznej, np. Bonferroni i FDR, korygują liczbę niezależnych testów, która nie jest równa liczbie oznaczonych SNP w GWAS ze względu na powiązanie między bliższymi SNP^50,51 Dlatego rzeczywista liczba niezależnych testów jest często niższa. Innym sposobem na obniżenie konserwatywnego progu statystycznego byłoby zmniejszenie liczby testowanych SNP używanych do GWAS w oparciu o rozpad sprzężeń w zdefiniowanych regionach genomu⁵². Zintegrowana z GWAS, wysokoprzepustowa platforma metabolomiczna opisana w tym protokole ma szeroki zakres zastosowań. W szczególności przyczyni się to do poprawy hodowli roślin uprawnych poprzez zmianę składu metabolitów/lipidów na poziomie pożądanym przemysłowo i żywieniowo. Ogólnie rzecz biorąc, metabolomika dostarczyła dogłębnego wglądu w architekturę genetyczną wielu metabolitów i dywersyfikację metaboliczną, która miała miejsce podczas udomowienia roślin w ciągu ostatnich dziesięcioleci, co wskazuje na ogromny potencjał hodowli związanej z metabolomiką⁵³. Podejścia biologii molekularnej do dalszej walidacji QTL obejmują generowanie zmutowanych linii CRISPR/Cas9⁵⁴, linii insercyjnych T-DNA⁵⁵, stabilnych i/lub przejściowych linii nadekspresji⁵⁶, VIGS, podejścia metabolomiczne ex vivo ⁵⁷ obok konwencjonalnego podejścia w generowaniu populacji krzyżowych F2, a także walidacji krzyżowej w różnych populacjach.

Dokonując niezbędnej korekty dla zmian analitycznych, jak opisano powyżej, oprócz GWAS można wykonać kilka zintegrowanych podejść, takich jak analiza korelacji metabolit-metabolit, analiza korelacji metabolit-lipid, analiza korelacji z danymi fenomicznymi w celu rzucenia światła na bardziej złożone cechy i/lub analiza koekspresji w celu dalszego rozwikłania podstaw systemów biologicznych⁵⁸.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki i wzorce
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-fosfocholina (17:0 PC)	Avanti Polar Lipids	850360P	Wzorzec wewnętrzny lipidów
Chloroform	Supleco	67-66-3	Rozpuszczalnik FAME
Isovitexin	Sigma Aldrich	38953-85-4	Wzorzec wewnętrzny dla metabolitów
Kwas lignocerynowy Metylester	Sigma Aldrich	2442-49-1	FAME
Metanol (MeOH)	Biosolve Chemikalia	13684102	klasy ULC-MS
Metoksyamina-chlorowodorek	Sigma Aldrich	593-56-6	Derywiatyzacja metabolitów
Laurynian metylu	Sigma Aldrich	111-82-0	FAME
Mirystynian metylu	Sigma Aldrich	124-10-7	sława
Palmitynian metylu	Sigma Aldrich	112-39-0	FAME
Stearynian metylu	Sigma Aldrich	112-61-8	FAME
Eter metylowo-tert-butylowy (MTBE)	Biosolve Chemicals	13890602	klasy HPLC
Metylo-kapat	Sigma Aldrich	110-42-9	FAME
Metylokaprylat	Sigma Aldrich	111-11-5	FAME
Methyldocosanoat	Sigma Aldrich	929-77-1	FAME
Metylo-pelargonian	Sigma Aldrich	1120-28-1	FAME
Metyloheksakozanonian	Sigma Aldrich	5802-82-4	FAME
Metylo-oktakozanian	Sigma Aldrich	55682-92-3	FAME
Pelarnian metylu	Sigma Aldrich	1731-84-6	FAME
N-metylo-N-( trimetylosililo)trifluoracetamid (MSTFA)	Macherey-Nagel	24589-78-4	Derywiatyzacja metabolitów
Pirydyna	Supleco	110-86-1	Derywiatyzacja metabolitów
Ribitol	Supleco	22566-17-2	Wzorzec wewnętrzny dla metabolitów derywatyzowanych
Ester metylowy kwasu triakontanowego	TCI Chemicals	629-83-4	Woda
	FAMEBiosolve Chemicals	23214102	Klasa ULC-MS
Sprzęt
1,5 mL Probówki do mikrowirówek	Eppendorf	3120086
2 mL Probówki do mikrowirówek	Eppendorf	3120094
Balance	Sartorius Corporation	14 557 572
DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &mikro;	m Aglient	123-3832	Analiza derywatyzowanych metabolitów
System GC-MS	Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)		Analiza derywatyzowanych metabolitów
Kule szlifierskie, stal nierdzewna	OPS DIAGNOSTICS	GBSS 196-2500-10
MS system	Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)		Analiza lipidów
MS system	Q Intensywne skupienie (Q Eksaktywne&handel; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&handel; Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)		Analiza metabolitów
Mikrowirówka z chłodzeniem	Eppendorf, model 5427R	22620701
Kolumna C8 z hybrydą etylową z odwróconą fazą (RP) z mostkiem (BEH) (100 mm & razy 2,1 mm zawierające 1,7 μ m średnica cząstek)	Wody	186002878	Analiza lipidów
RP Krzemionka o wysokiej wytrzymałości (HSS) Kolumna T3 (100 mm i razy 2,1 mm zawierające 1,8 μ m średnica cząstki)	Wody	186003539	Analiza metabolitów
Shaker	Eppendorf Thermomixer 5436	2050-100-05
Sonicator	USC 300 TH	142-0084
Młyn mieszający do mielenia tkanek	Retsch, Młyn miksujący MM 300	20.746.0001
System UPLC	Wody System Acquity UPLC (Wody)
Próżnia koncentrator	Prędkość skanowania Maxi Vac Alpha Parowniki	7.008.500.002
Mieszalnik wirowy	Vortex-Genie 2, model G560	SI-0236
Oprogramowanie
MetAlign			Przetwarzanie chromatogramów
MzMine			Przetwarzanie chromatogramów
Pakiet R "data.table"
Pakiet R "fujiplot"			mapa plejotropiczna
Pakiet R "genetyka"
Pakiet R "Ime4"			Obliczenia BLUPs
pakiet R "LDmapa ciepła"			LD wykresy
R pakiet "MASA"			transformacja
Pakiet R "rMVP"GWAS
R wersja 4.0.4
RefinerMS			Przetwarzanie chromatogramów
RefinerMS Genedata	Expressionist		Przetwarzanie chromatogramów
Tassel 5			Filtrowanie genotypów
Xcalibur	Thermo Fisher Scientific	OPTON-30965	Przetwarzanie chromatogramów