Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie roztworu naringeniny do stosowania in vivo

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62736

⸱

10 sierpnia 2021

 ,  , 
1Spine Research Institute, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Integrative Medicine, Huashan Hospital, Fudan University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj protokół przedstawia przygotowanie roztworu naringeniny do podania dootrzewnowego in vivo. Naringenina jest całkowicie rozpuszczona w mieszaninie dimetylosulfotlenku, Tween 80 i soli fizjologicznej. Przeciwcukrzycowe działanie osteoporotyczne naringeniny oceniano za pomocą badania stężenia glukozy we krwi, barwienia kwasową fosfatazą oporną na winian i testu immunoenzymatycznego

.

Streszczenie

Przygotowanie złożonego (fitochemicznego) roztworu jest pomijanym, ale krytycznym krokiem przed jego zastosowaniem w badaniach, takich jak badania przesiewowe leków. Całkowite rozpuszczenie związku jest niezbędne do jego bezpiecznego stosowania i stosunkowo stabilnych wyników. Jako przykład przedstawiono protokół przygotowania roztworu naringeniny i jej dootrzewnowego podawania w diecie wysokotłuszczowej i modelu cukrzycowego indukowanego streptozotocyną (STZ). Niewielką ilość naringeniny (3,52-6,69 mg) użyto do zbadania jej rozpuszczalności w rozpuszczalnikach, w tym odpowiednio etanolu, dimetylosulfotlenku (DMSO) i DMSO plus Tween 80 rozpuszczonego w soli fizjologicznej (PS). Całkowite rozpuszczenie związku określa się poprzez obserwację koloru roztworu, obecności osadów po odwirowaniu (2000 x g przez 30 s) lub pozostawienie roztworu na 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Po uzyskaniu stabilnego związku/roztworu fitochemicznego, końcowe stężenie/ilość związku wymagane do badań in vivo można przygotować w roztworze podstawowym zawierającym tylko rozpuszczalnik (bez PS), a następnie rozcieńczyć/zmieszać z PS zgodnie z życzeniem. Przeciwcukrzycowe działanie osteoporotyczne naringeniny u myszy (podawanie dootrzewnowe w dawce 20 mg/kg m.c., 2 mg/ml) oceniano, mierząc stężenie glukozy we krwi, masę kostną (mikro-CT) i szybkość resorpcji kości (barwienie TRAP i ELISA). Naukowcy poszukujący szczegółowych preparatów roztworów organicznych/fitochemicznych skorzystają z tej techniki.

Wprowadzenie

Wraz z rosnącą liczbą badań dotyczących wykorzystania związków fitochemicznych do badań przesiewowych leków, warto zwrócić uwagę na podejścia do przygotowywania roztworów fitochemicznych w celu oceny ich optymalnych efektów. Wiele aspektów, takich jak metodologia rozpuszczania, dawkowanie i stężenie, należy wziąć pod uwagę podczas przygotowywania compound1.

Rozpuszczanie na bazie rozpuszczalnika jest powszechnie stosowane do przygotowywania związków organicznych1. Powszechnie stosowane rozpuszczalniki to woda, olej, dimetylosulfotlenek (DMSO), metanol, etanol, kwas mrówkowy, Tween, gliceryna itp2. Chociaż zawiesina z nierozpuszczonymi substancjami jest dopuszczalna, gdy związek jest podawany przez zgłębnik żołądkowy, całkowicie rozpuszczona substancja rozpuszczona ma kluczowe znaczenie dla podawania dożylnego. Ponieważ roztwór oleju, zawiesina i emulsja mogą powodować zatorowość kapilarną, sugeruje się roztwór wodny do przygotowania związku, szczególnie podczas podawania zastrzyków dożylnych, domięśniowych i dootrzewnowych3.

Efektywny zakres dawek różni się między związkami, a nawet między chorobami leczonymi tym samym związkiem. Ustalenia skutecznej i bezpiecznej dawki oraz stężenia zależą od literatury i wstępnych eksperymentów4. Tutaj jako przykład pokazano przygotowanie związku naringeniny.

Naringenina (4,5,7-trihydroksy-flawanon), związek polifenolowy, był badany w leczeniu chorób pod kątem hepatoprotekcji5, przeciwcukrzycowy6, przeciwzapalny7, oraz przeciwutleniający8. W przypadku zastosowań in vivo powszechnie stosuje się doustne podawanie naringeniny. Wcześniejsze badania donosiły o przygotowaniu roztworu naringeniny w dawce 0,5%-1% karboksymetylocelulozy, 0,5% metylocelulozy, 0,01% DMSO i soli fizjologicznej (PS) w dawce 50-100 mg/kg, podawanej doustnie przez zgłębnik9,10,11,12. Poza tym inne badania wykazały suplementację naringeniny z chow w stężeniu 3% (wag./wag.) do przyjmowania doustnego w dawce 3,6 g/kg/d13,14. Badania wykazały również stosowanie etanolu (0,5% v/v), PS i DMSO do rozpuszczania naringeniny do wstrzykiwań dootrzewnowych w dawkach 10-50 mg/kg15,16,17,18. W badaniu padaczki skroniowej myszy otrzymały zastrzyk naringeniny zawieszonej w 0,25% karboksymetylocelulozie rozpuszczonej w PS19. Chociaż badania te donoszą o użyciu różnych rozpuszczalników do przygotowania roztworów naringeniny, dalsze szczegóły, takie jak stan rozpuszczania i reakcja zwierząt, nie zostały zgłoszone.

Ten protokół wprowadza procedurę przygotowania roztworu naringeniny do stosowania in vivo w osteoporozie indukowanej cukrzycą. Przygotowanie roztworu do wstrzykiwań obejmuje przygotowanie rozpuszczalników i związków, oszacowanie dawkowania, proces rozpuszczania i filtrację. Dawkę ustalono na podstawie badań literaturowych i wstępnych eksperymentów, monitorując myszy po podawaniu zastrzyków codziennie przez 3 dni i modyfikowaniu dawki zgodnie z zachowaniami myszy. Ostatecznie wybrane stężenie (20 mg/kg m.c.) podawano dootrzewnowo 5 dni w tygodniu przez 8 tygodni w diecie wysokotłuszczowej i myszy z cukrzycą wywołaną streptozotocyną (STZ)20,21. Wpływ naringeniny na osteoporozę cukrzycową oceniano za pomocą badania stężenia glukozy we krwi, mikrotomografii komputerowej, barwienia kwaśną fosfatazą oporną na winian (TRAP) i testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Ogólnie zaobserwowano, że naringenina w zakresie stężeń 40-400 mg/ml nie rozpuszcza się całkowicie ani w etanolu, ani w DMSO, ani w 5% (etanolu lub DMSO) plus 95% PS (v/v). Jednak naringenina całkowicie rozpuściła się w mieszaninie 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 i 92,96% PS. Szczegółowa procedura pomoże naukowcom przygotować związek jako roztwór do wstrzykiwań do stosowania in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisane badania były zgodne z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych Narodowej Rady ds. Badań i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Szanghaju. Podczas wykonywania eksperymentów ze względów bezpieczeństwa wymagane są fartuchy laboratoryjne, jednorazowe rękawiczki nitrylowe i okulary.

1. Przygotowanie rozpuszczalników i oszacowanie naringeniny wymaganej do aplikacji in vivo

  1. Przygotuj następujące rozpuszczalniki: Tween-80 (końcowy zakres stężenia: 0,5%-1%), DMSO, gliceryna (końcowy zakres stężeń: 15%-20%), etanol (końcowy zakres stężeń: 12% do wstrzykiwań domięśniowych)22 i 0,9% PS.
  2. Oszacuj wymaganą ilość naringeniny na podstawie dawki, liczby myszy i częstotliwości wstrzyknięć.
    1. Zamów 10 myszy (C57BL/6, samiec, 5 tygodni, SPF) do podawania naringeniny 5 dni w tygodniu przez 8 tygodni. Trzymaj myszy w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF).
      UWAGA: Dawka wymagana do wstrzyknięcia dootrzewnowego wynosi 20 mg/kg m.c.23.
    2. Zważyć 160 mg naringeniny na podstawie następującego obliczenia: 20 mg/kg x 0,02 kg/mysz x 10 myszy x 5 dni/tydzień x 8 tygodni = 160 mg.
  3. Obliczyć stężenie naringeniny do wstrzyknięcia in vivo.
    1. Przygotuj zalecaną objętość na podstawie masy ciała myszy. Zalecana objętość naringeniny podawana każdej myszy wynosi 1% masy ciała (0,3 ml). W tym eksperymencie użyto 0,2 ml na mysz.
    2. Oblicz całkowitą objętość: 0,2 ml na mysz x 10 myszy x 5 dni / tydzień x 8 tygodni = 80 ml.
    3. Obliczyć stężenie naringeniny w magazynie: 160 mg/80 ml rozpuszczalników = 2 mg/ml.
    4. Oblicz objętość na każdy dzień: 0,2 ml na mysz x 10 myszy = 2 ml.

2. Rozwiązanie

  1. Roztwór etanolu
    1. Aby przygotować roztwór naringeniny w stężeniu 2 mg/ml, odważyć 3,52 mg naringeniny i dodać ją do probówki o pojemności 2,0 ml.
      UWAGA: Aby osiągnąć stężenie 2 mg/ml, całkowita wymagana objętość wyniesie 1760 μl (obliczenie: 3,52 mg/1760 μL = 2 mg/ml).
    2. Szybko odwiruj w dół (2000 x g przez 30 s), aby proszek naringeniny osiadł na dnie probówki (Rysunek 1A).
    3. Dodaj 8,8 μl 100% etanolu do probówki, aby przygotować 0,5% (v/v) roztwór w stosunku do całkowitej wymaganej objętości2. Naringenina nie rozpuszcza się całkowicie (Rysunek 1B).
    4. Kontynuuj dodawanie 79,2 μl 100% etanolu do probówki, aby przygotować 5% (v/v) roztwór w stosunku do całkowitej wymaganej objętości (obliczenie: (79,2 μL + 8,8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%). Naringenina nie rozpuszcza się całkowicie (Rysunek 1B).
    5. Dodać 1672 μl 0,9% PS do probówki zawierającej 5% etanolu, jak opisano w kroku 2.1.4. W ten sposób powstanie emulsja (Rysunek 1D). Odwirować (2000 x g przez 30 s) roztwór, aby sprawdzić, czy naringenina jest całkowicie rozpuszczona w roztworze. W roztworze pojawiają się białe osady nierozpuszczonej naringeniny (Rysunek 1E).
  2. Rozwiązanie DMSO
    1. Aby przygotować roztwór naringeniny w stężeniu 2 mg/ml, odważyć 3,95 mg naringeniny i dodać do probówki o pojemności 2,0 ml.
      UWAGA: Aby osiągnąć stężenie 2 mg/ml, całkowita wymagana objętość wyniesie 1975 μl (obliczenie: 3,95 mg/1975 μL = 2 mg/ml).
    2. Szybko odwiruj (2000 x g przez 30 s), aby naringenina w proszku osiadła na dnie tubki.
    3. Dodać 9,8 μl DMSO do probówki, aby przygotować 0,5% (v/v) roztwór (obliczenie: 9,8 μL/1975 μL x 100% = 5%). Naringenina rozpuszcza się całkowicie (Rysunek 2A).
    4. Dodać 88,2 μl DMSO do probówki, aby przygotować 5% (v/v) roztwór w stosunku do całkowitej wymaganej objętości (obliczenie: (88,2 μL + 9,8 μL) / 1975 μL x 100% = 5%). Naringenina rozpuszcza się całkowicie (Rysunek 2B).
    5. Dodać 1877 μl 0,9% PS (v/v procent 95%) do roztworu przygotowanego w kroku 2.2.4. Wytwarzana jest emulsja (Rysunek 1C). Odwirować (2000 x g przez 30 s) roztwór, aby sprawdzić, czy naringenina jest całkowicie rozpuszczona w roztworze. W roztworze pojawiają się białe osady nierozpuszczonej naringeniny (Rysunek 1D).
  3. Rozwiązanie Tween-80 i DMSO
    1. Aby przygotować roztwór naringeniny w stężeniu 2 mg/ml, odważyć 6,69 mg naringeniny i dodać do probówki o pojemności 5,0 ml.
      UWAGA: Aby osiągnąć końcowe stężenie 2 mg/ml, całkowita wymagana objętość roztworu wyniesie 3345 μl (obliczenie: 6,69 mg/3345 μL = 2 mg/mL).
    2. Szybko odwiruj (2000 x g przez 30 s), aby naringenina w proszku osiadła na dnie tubki.
    3. Dodać 117,7 μl DMSO, aby przygotować 3,5% (v/v) roztwór w stosunku do całkowitej wymaganej objętości (obliczenie: 117,7 μL /3345 μL x 100% = 3,5%). Naringenina rozpuszcza się całkowicie (Rysunek 3A)
    4. Dodać 117,7 μl Tween 80 do roztworu przygotowanego w kroku 2.3.3, aby uzyskać 3,5% (v/v) Tween 80 i 3,5% (v/v) DMSO. Obserwuj całkowite rozpuszczenie naringeniny (Rysunek 3B)
    5. Powoli dodawać roztwór przygotowany w kroku 2.3.4 do probówki o pojemności 5,0 ml zawierającej 3109,6 μl 0,9% PS (v/v procent 93%) i dobrze wstrząsnąć, aby uzyskać pozorny roztwór naringeniny (Rysunek 3C).
    6. Pozostawić roztwór przygotowany w kroku 2.3.5 w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 godziny. Roztwór jest nadal widoczny bez żadnych widocznych osadów (Rysunek 3D).
  4. Przygotowanie roztworu naringeniny do podawania in vivo
    1. Zgodnie z krokiem 1.2.2 zważyć 160 mg naringeniny (160 mg / 2 mg/ml = 80 ml).
    2. Dodaj 2,8 ml DMSO, aby uzyskać 3,5% (v/v) roztwór (obliczenie: 2,8 ml / 80 ml x 100% = 3,5%)
    3. Następnie dodaj 2,8 ml Tween 80 do roztworu przygotowanego w kroku 2.4.2, aby uzyskać 3,5% (v/v) Tween 80 i 3,5% (v/v) DMSO.
    4. Podwielokrotność roztworu przygotowanego w kroku 2.4.3 rozdzielić na cztery probówki, po 1,4 ml na probówkę [(2,8 ml + 2,8 ml) / 4 = 1,4 ml].
    5. Podajcie 18,6 ml 0,9% PS do pięciu probówek o pojemności 15 ml.
    6. Przechowywać roztwór przygotowany w kroku 2.4.3 (roztwór podstawowy) i 2.4.5 w temperaturze 4 °C (2,8 ml + 2,8 ml + 18,6 ml x 4 = 80 ml).
    7. Pobrać 140 μl roztworu podstawowego (krok 2.4.3) i wymieszać go z 1860 μl 0,9% PS, aby przygotować 2 ml roztworu naringeniny na 1 dzień podania.
    8. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 μm.

3. Podawanie roztworu naringeniny

  1. Obchodzenie się z nim i krępowanie
    1. Spryskaj klatkę i ręce 70-75% alkoholem przed otwarciem pokrywy. Podnieś mysz za podstawę ogona i umieść ją na twardej powierzchni, aby delikatnie ustawić ogon do tyłu.
    2. Chwyć kark za uszy lewym kciukiem i palcem wskazującym, a następnie umieść ogon między małym a serdecznym palcem. Trzymaj mysz w pozycji leżącej z jej tylnym końcem lekko uniesionym.
  2. zastrzyk
    1. Chwyć tylną skórę myszy tak, aby skóra brzucha była napięta.
    2. Wbić igłę (strzykawkę insulinową) pod kątem 10° między igłą a powierzchnią brzucha, w dolną prawą lub lewą ćwiartkę brzucha, aby uniknąć uderzenia w pęcherz, wątrobę lub inne narządy wewnętrzne.
    3. Wprowadzić igłę podskórnie w kierunku czaszkowym przez 3-5 mm, a następnie wprowadzić ją pod kątem 45° do jamy brzusznej.
    4. Gdy igła przejdzie przez ścianę jamy brzusznej i opór zniknie, wykonaj aspirację, aby upewnić się, że nie został pobrany materiał refluksowy. Następnie powoli popchnij roztwór.
    5. Po wstrzyknięciu należy powoli wyciągnąć igłę i lekko ją obrócić, aby zapobiec przeciekaniu. Zalecana objętość to 50-100 μL/10 g.
    6. Wyrzuć resztki naringeniny do pojemnika na zagrożenie biologiczne.

4. Badanie stężenia glukozy we krwi

UWAGA: Zbadaj poziom glukozy we krwi 1 dzień przed wstrzyknięciem oraz 1 i 2 miesiące po wstrzyknięciu.

  1. Pościć myszy przez 15 godzin przed badaniem stężenia glukozy we krwi. Woda może być nadal dostarczana.
  2. Otwórz paski testowe i zaznacz datę. Po otwarciu zużyj paski testowe w ciągu 3 miesięcy. Przechowuj paski testowe w temperaturze 2-30 °C. Po zdjęciu paska szczelnie zamknij pokrywę, aby zapobiec tworzeniu się wilgoci.
  3. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej. Włącz parownik na poziomie indukcji 4% dla izofluranu i 4 l/min dla tlenu. Po całkowitym znieczuleniu zwierzęcia należy utrzymać znieczulenie za pomocą stożka nosowego i podawanie środka znieczulającego na poziomie 1,5% dla izofluranu i 0,4 l/min dla tlenu.
  4. Przetrzyj ogon wacikami/wacikami nasączonymi alkoholem 70%-75%.
  5. Zaczynając od najniższego punktu ogona, wykonaj małe nakłucie bocznej żyły ogonowej za pomocą nakłucia igłą 25G i wyciśnij kroplę krwi.
  6. Wytrzyj kroplę krwi bibułą.
  7. Wyciśnij kolejną kroplę krwi i zbierz ją na brzegu paska testowego.
  8. Odczytaj i zapisz wynik wyświetlany na glukometrze.
  9. Aby zatamować krwawienie, uszczypnij ogon myszy sterylną gazą i przetrzyj obszar 75% alkoholem.
  10. Dodatkowe próbki można uzyskać za pomocą podobnej techniki, przesuwając się w górę ogona czaszkowego.

5. Barwienie PUŁAPKI

  1. Przygotowanie preparatów
    1. Wykonuj testy stężenia glukozy we krwi na czczo na myszach raz w tygodniu. Gdy poziom glukozy we krwi wynosi ≥ 11,1 mmol/L (wskazujący na udany model myszy z cukrzycą typu II24), poddaj myszy eutanazji za pomocą CO2, a następnie dyslokacji szyjki macicy i zbierz odcinek lędźwiowy 4-6(L4-L6) (podczas badania stężenia glukozy we krwi na czczo nie przeprowadza się eutanazji).
    2. Utrwal próbki L4-L6 4% paraformaldehydem przez 24 godziny (upewnij się, że objętość paraformaldehydu jest >20x objętość tkanki), a następnie myj przez 2 godziny w ciągłym przepływie wody z kranu.
    3. Aby odwapnić próbki, zanurz je w 10% roztworze kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) na 2 tygodnie w temperaturze pokojowej w stanie statycznym, aż próbki zmiękną. Upewnij się, że objętość roztworu odwapniającego jest 20-30 razy większa niż objętość tkanki/próbki. Zmieniaj roztwór EDTA co drugi dzień.
    4. Odwodnić próbkę za pomocą odwadniacza.
      1. Umieść próbki w kasetach do przetwarzania tkanek i zatapiania. Ponumeruj kasetę za pomocą ołówka.
      2. Ustaw program odwadniacza w następujący sposób: 75% alkoholu przez 2 h, 85% alkoholu przez 1 h, 95% alkoholu przez 1 h, 95% alkoholu przez 2 h, etanol bezwodny (I) przez 2 h, etanol bezwodny (II) przez 2 h, etanol bezwodny (III) przez 2 h, ksylen (I) przez 1 h, ksylen (II) przez 1 h, ksylen (III) przez 1 h, wosk parafinowy (I) przez 2 godziny i wosk parafinowy (II) przez 2 godziny, w temperaturze pokojowej.
    5. Zanurzyć próbki w wosku parafinowym.
      1. Dodać wosk parafinowy do tacki kasetowej stacji zatapiania parafiny i podgrzać do temperatury 60 °C. Zanurzyć odwodnione próbki na co najmniej 2 godziny.
      2. Umieść kasetę na chusteczki higieniczne w tacce na chusteczki i podgrzej.
      3. Dodać parafinę do zbiornika parafiny i podgrzać do 60 °C.
      4. Po 2 godzinach zabierz zarówno kasetę na tkanki, jak i próbki do miejsca pracy. Wlej podgrzany wosk parafinowy ze zbiornika parafiny do kasety na bibułki. Umieść próbkę w wosku parafinowym, upewnij się, że wosk parafinowy całkowicie pokrywa tkankę, a następnie natychmiast przenieś kasetę na stację oblodzenia.
      5. Za pomocą mikrotomu pociąć próbki zatopione w parafinie na odcinki o wielkości 5-6 μm. Rozłóż sekcje w ciepłej wodzie o temperaturze 40 °C przez mniej niż 10 sekund. Zbierz skrawki na szkiełkach pokrytych APS (aminosilanem). Szkiełka suszyć w temperaturze nasłonecznika przez 1 godzinę, a następnie wkładać je na noc do piekarnika nastawionego na 60 °C.
  2. Przygotowanie odczynnika TRAP
    1. Przygotować podstawowy roztwór do inkubacji: Rozpuścić 9,2 g bezwodnego octanu sodu, 11,4 g kwasu L-(+) winowego i 2,8 ml kwasu lodowatego w 1000 ml wody destylowanej. Dostosuj pH do 4,7-5,0 i przechowuj w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.
    2. Przygotować roztwór eteru naftolowego: Rozpuścić 0,1 g fosforanu AS-BI naftolu w 5 ml eteru monoetylowego glikolu etylenowego. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 5 tygodni.
    3. Przygotować roztwór azotynu sodu: Rozpuścić 1 g azotynu sodu w 25 ml wody destylowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotuj barwnik pararozanilinowy: Dodaj 1 g zasady pararozaniliny do 20 ml 2N HCl (83 ml HCl w 417 ml wody). Użyj płytki mieszającej, aby rozpuścić bazę i przefiltrować ją przed użyciem.
  3. Barwienie TRAP
    1. Napełnij dwa słoiki Coplin 50 ml podstawowego roztworu do inkubacji i umieść w piekarniku o temperaturze 37 °C na 2 godziny.
    2. Weź jeden słoik Coplin i dodaj 0,5 ml roztworu eteru naptolu.
    3. Umieścić szkiełka w słoiku Coplin i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h.
      UWAGA: Przygotuj co najmniej trzy preparaty dla każdej grupy.
    4. Na kilka minut przed zakończeniem inkubacji dodać 1 ml roztworu azotynu sodu i 1 ml barwnika pararozanilinowego. Mieszaj delikatnie przez 30 s i pozostaw na 2 min.
    5. Dodać roztwór przygotowany w kroku 5.2.2 do drugiego podgrzanego słoika Coplin zawierającego podstawowy roztwór podstawowy. Dobrze wymieszaj roztwór i włóż szkiełka ze słoika Coplin w kroku 5.3.3.
    6. Inkubować przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Opłucz plastry w innym słoiku Coplin z 200 ml PBS przez 5 minut.
    8. Przeciwbarwić plastry 100% hematoksyliną przez 30 s w słoiku Coplin.
    9. Odwodnić plastry alkoholem 85%, 95% i 100% (200 ml) przez 2 minuty każdy i traktować ksylenem (200 ml) przez 2 minuty przez 3x. Użyj słoików Coplin do wykonania każdego kroku.
    10. Zabezpiecz część na szkle nakrywkowym szkiełkiem nakrywkowym za pomocą żywicy. Upewnij się, że nie ma miejsca na uwięzienie pęcherzyków powietrza.

6. TEST ELISA

  1. Przygotowanie próbki
    1. Usuń tkanki miękkie z kości udowej i piszczelowej myszy. Oczyść kości gazą.
    2. Umieścić próbki kości w probówce do mikrowirówek o pojemności 1 ml i przechowywać probówki w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Próbki można również przechowywać w zbiorniku z ciekłym azotem nie dłużej niż 6 miesięcy.
    3. Zważyć próbkę kości. Rozcieńczyć 0,9% PS w stosunku 1:10. Na przykład rozcieńczyć 0,1 g kości z 1 ml PS.
    4. Dodać 3 mm kulki cyrkonu do probówki i zmielić próbki 3x przy 70 Hz przez 30 s z 20-sekundową przerwą pomiędzy nimi.
    5. Odwirować próbki w temperaturze 4 °C i 12 000 x g przez 5 minut. Zebrać sklarowany sklarowany osad.
  2. Zestaw testowy ELISA
    UWAGA: Test ELISA należy wykonać zgodnie z protokołem testu określonym przez producenta.
    1. Dodać 100 μl każdego rozcieńczenia wzorca, próby ślepej i próbki do odpowiednich studzienek. Inkubować przez 90 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Zdekantować płyn z każdej studzienki i dodać 100 μl biotynylowanego roztworu roboczego przeciwciała wykrywającego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    3. Zdekantować roztwór, dodać 350 μl buforu do przemywania do każdej studzienki. Moczyć przez 1 min, powtórzyć 3x.
    4. Do każdego dołka dodać 100 μl sprzężonego roztworu roboczego HRP. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Zdekantować roztwór. Powtórz proces prania 5 razy, jak opisano w kroku 6.2.3.
    6. Dodać 90 μl odczynnika do substratu. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem.
    7. Dodać 50 μl roztworu zatrzymującego.
  3. Za pomocą czytnika płytek zapisywać absorbancję każdej studzienki przy długości fali 450 nm.
  4. Generowanie krzywej standardowej
    1. Wykreślić odpowiednie średnie wartości absorbancji w stosunku do stężeń białka rozcieńczanego seryjnie.
    2. Połącz punkty, aby utworzyć krzywą najlepszego dopasowania. Użyj dowolnej odpowiedniej aplikacji komputerowej (arkusza kalkulacyjnego), aby wygenerować równanie krzywej standardowej.
  5. Zastąp wartość absorbancji każdej próbki w równaniu krzywej wzorcowej, aby uzyskać stężenie odpowiedniej próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stwierdzono, że masa ciała myszy z cukrzycą indukowaną STZ i karmionych dietą wysokotłuszczową spadła w porównaniu z grupami kontrolnymi w okresie od 0 do 8 tygodni po leczeniu STZ. Utrata masy ciała u myszy traktowanych naringeniną była istotna w porównaniu z myszami nietraktowanymi (grupa STZ) w 4. tygodniu. Grupy kontrolna i STZ otrzymały taką samą objętość PS (Tabela 1). Poziom glukozy we krwi u myszy z cukrzycą gwałtownie wzrósł w ciągu miesiąca po indukcji STZ. Następnie automatycznie obniżył się d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przygotowanie roztworu fitochemicznego jest podstawą jego stosowania in vivo. W tym protokole wykazano przygotowanie roztworu naringeniny przy użyciu różnych rozpuszczalników, takich jak etanol, DMSO, Tween 80 i 0,9% PS. Roztwór w stanie całkowicie rozpuszczonym musi być dalej monitorowany, pozwalając mu pozostać w temperaturze pokojowej przez kilka dłuższych godzin, a następnie przefiltrowany przed użyciem in vivo.

Oznaczanie rozpuszczalnika jest kluczowym krokiem w tym prot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81973607 i 81573992).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 mL  mikroprobówkiCorning Science (Wujiang) Co.23218392Ciecz do przechowywania
Automatyczna suszarkaLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA ASP 300SOdwadnianie próbki
Paski testowe do pomiaru stężenia glukozy we krwiJohnson & Johnson (Chiny) Sprzęt medyczny Co.
WirówkaMIULABMinutówkaOdwadniacz roztworu odśrodkowego
Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA  ASP300SOdwodnienie
DMSOSangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.E918BA0041Zestaw
testowy ELISA współrozpuszczalnikaElabscience Biotechnology Co., LtdMysz COL1 (kolagen typu I) Zestaw ELISA: E-EL-M0325c
Mysz  Zestaw CTX I ELISA: E-EL-M0366c
Zestaw PICP ELISA myszy: E-EL-M0231c
Mysz PINP Zestaw ELISA: E-EL-M0233c
Absolutny etanolSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218Współrozpuszczalnik
Eter monoetylowy glikolu etylenowegoSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501118-0500PUŁAPKA barwienie
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009617odwapniający
Merck Millpore LTD.Millex-GP, 0,22 i mikro; mroztwór filtracyjny
Kwas lodowcowySinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10000218Barwienie TRAP
GlukometrJohnson & Johnson (Chiny) Sprzęt medyczny Co.One Touch Ultra VueNumer seryjny: COJJG8GW
MłynekShanghaijingxin Eksperymentalna technologiaTissuelyser-24
HematoxylinNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteD005Barwienie TRAP
Strzykawka insulinowaShanghai Kantaray Medical Devices Co.0,33 mm x 13 mm, RW LBIniekcja dootrzewnowa
Kwas L-(+) winowySinopharm Chemical ReagentCo., Ltd100220008Mikroskop do barwienia TRAP
Mikrotom obserwacyjny OLYMPUSsz61Leica
Microsystems (Shanghai) Trading Co.Sekcja LEICA RM 2135
Mini wirówkaHangzzhou Miu Instruments Co., Ltd.  Wirówka Mini-6KC
Naftol AS-BI FosforanSIGMA-ALDRICHBCBS3419TRAP barwienie
NaringeninaJiangsu Yongjian Pharmaceutical Co., Ltd102764parafiny rozpuszczonej
Leica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA  EG 1150 H, LEICA  EG 1150 CEmbed  próbki
Baza pararozanilinyBBI Nauki biologiczneE112BA0045barwienie TRAP
Pipetyeppendorf2– 20 &mikro; L, 100– 1000 &mikro; L, 20– 200 i mikro; L  transferre Płynny
czytnik płytekBioTek Instruments USA, Inc.Czytnik obrazowania BioTek CYTATION 3Żywica ELISA
ShanghaiYyang Instrument Co., Ltd.Neutralny balsamTRAP barwiący
sól fizjologiczna (0,9 PS)Baxter Healthcare (Shanghai) Co., LtdA6E1323Rozpuszczalnik
Octan sodu bezwodnySinopharm Chemical ReagentCo., LtdMerck-1.06268.0250 | 250gBarwienie TRAP
Azotyn soduSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10020018Barwienie TRAP
Tween-80Sangon Biotech (Shanghai ) Co., Ltd.E819BA0006Emulgator
Koraliki cyrkonoweShanghaijingxin Eksperymentalna technologia11079125z 454gSzlifowanie
4130392 Filtr Stacja zatapiania

Bibliografia

  1. Stoye, D. Solvents. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley Online Library. (2000).
  2. Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
  5. Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
  6. Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
  7. Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
  8. Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
  9. Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
  10. Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
  11. Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28(2019).
  12. Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat's brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
  13. Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
  14. Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
  15. Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
  16. Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
  17. Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224(2019).
  18. Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
  19. Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
  20. Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
  21. Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
  22. Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. , Pharmaceutical Press. London, Chicago. (2003).
  23. Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
  24. Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
  25. Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
  26. Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393(2015).
  27. Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), Basel, Switzerland. (2019).
  28. van Thriel, C. Toxicology of solvents (including alcohol). Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
  29. Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
  30. Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
  31. Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single--and repeated--dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
  32. Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
  33. Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przygotowanie fitochemicznewstrzyknięcie doszpikowedieta wysokotłuszczowamodel streptozotocynypomiar glikemiianaliza masy kostnejbarwienie TRAPresorpcja kości
Przygotowanie roztworu naringeniny do stosowania in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.