Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Definiowanie funkcji genów w nowotworzeniu poprzez ablację ex vivo floksowanych alleli w złośliwych komórkach nowotworowych osłonki nerwów obwodowych

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62740

⸱

25 sierpnia 2021

 ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Pediatrics and Neurology, Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania, 3Division of Child Neurology, Children's Hospital of Philadelphia

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania nokautów genów, które są embrionalne śmiertelne in vivo w genetycznie modyfikowanych mysich modelach nowotworów, a następnie oceniamy wpływ nokautu na wzrost, proliferację, przeżycie, migrację, inwazję i transkryptom in vitro i in vivo.

Streszczenie

Rozwój nowych leków, które precyzyjnie celują w kluczowe białka w ludzkich nowotworach, fundamentalnie zmienia terapie przeciwnowotworowe. Zanim jednak leki te będą mogły być stosowane, ich docelowe białka muszą zostać zatwierdzone jako cele terapeutyczne w określonych typach raka. Walidacja ta jest często przeprowadzana poprzez wyeliminowanie genu kodującego potencjalny cel terapeutyczny w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu raka (GEM) i określenie, jaki wpływ ma to na wzrost guza. Niestety, kwestie techniczne, takie jak śmiertelność zarodka w przypadku konwencjonalnych nokautów i mozaikowatość w przypadku nokautów warunkowych, często ograniczają to podejście. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano metodę ablacji zarodkowego genu letalnego, który jest przedmiotem zainteresowania w krótkoterminowych hodowlach złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych (MPNST) wygenerowanych w modelu GEM.

Ten artykuł opisuje, jak stworzyć model myszy z odpowiednim genotypem, uzyskać krótkoterminowe hodowle nowotworów od tych zwierząt, a następnie dokonać ablacji zarodkowego genu letalnego za pomocą wektora adenowirusowego, który wyraża rekombinazę Cre i wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP). Następnie szczegółowo opisano oczyszczanie komórek transdukowanych adenowirusem za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) oraz ilościowe określenie wpływu ablacji genów na proliferację komórek, żywotność, transkryptom i ortotopowy wzrost alloprzeszczepu. Metodologie te zapewniają skuteczne i uogólnione podejście do identyfikacji i walidacji celów terapeutycznych in vitro i in vivo. Podejścia te zapewniają również odnawialne źródło komórek pochodzących z guza o niskim pasażu ze zredukowanymi artefaktami wzrostu in vitro. Pozwala to na badanie biologicznej roli docelowego genu w różnych procesach biologicznych, takich jak migracja, inwazja, przerzuty i komunikacja międzykomórkowa, w której pośredniczy sekretom.

Wprowadzenie

Przed ostatnimi dwoma dekadami, leczenie ludzkich nowotworów opierało się głównie na radioterapii i chemioterapeutykach, które były szeroko ukierunkowane na szybko rozprzestrzeniające się populacje komórkowe poprzez uszkadzanie DNA lub hamowanie syntezy DNA. Chociaż metody te hamowały wzrost komórek rakowych, miały również szkodliwe skutki uboczne dla normalnych, szybko proliferujących typów komórek, takich jak komórki nabłonka jelitowego i komórki mieszków włosowych. Niedawno terapia nowotworów zaczęła wykorzystywać chemioterapeutyki, które precyzyjnie celują w białka w szlakach sygnałowych, które są krytycznie ważne dla wzrostu nowotworu u danego pacjenta. Podejście to, powszechnie określane jako "medycyna precyzyjna", doprowadziło do opracowania stale poszerzającego się repertuaru przeciwciał monoklonalnych i inhibitorów małocząsteczkowych. Środki te skutecznie hamują proliferację i przeżycie komórek nowotworowych, unikając jednocześnie szkodliwych skutków ubocznych dla normalnych typów komórek, obserwowanych w przypadku konwencjonalnych chemioterapeutyków i radioterapii. Przeciwciała monoklonalne stosowane w leczeniu nowotworów u ludzi najczęściej celują w cząsteczki powierzchniowe komórek, takie jak receptory czynnika wzrostu1 (np. duża rodzina receptorowych kinaz tyrozynowych obejmujących błonę) i modulatory odpowiedzi immunologicznej2 (np. białko programowanej śmierci komórki 1, ligand programowanej śmierci 1). Małe inhibitory molekularne mogą hamować zarówno białka powierzchniowe komórki, jak i białka sygnałowe, które znajdują się wewnątrzkomórkowo3. Jednak, aby skutecznie zastosować te nowe środki terapeutyczne, należy ustalić, że dany nowotwór jest zależny od cząsteczki, która jest celem potencjalnego środka terapeutycznego.

Chociaż te nowe środki terapeutyczne mają bardziej skoncentrowane działanie, wiele z nich nadal hamuje działanie więcej niż jednego białka. Ponadto często dostępnych jest wiele środków o różnej skuteczności i swoistości, które są ukierunkowane na określone białko. W związku z tym podczas badań przedklinicznych rozsądne jest stosowanie dodatkowych podejść, takich jak ablacja genetyczna, w celu walidacji białka kandydującego jako celu terapeutycznego. Jednym ze szczególnie użytecznych podejść do walidacji białka jako celu terapeutycznego jest ablacja genu kodującego białko kandydujące w genetycznie zmodyfikowanym modelu zwierzęcym, który rozwija określony typ nowotworu będący przedmiotem zainteresowania. Podejście to może być stosunkowo proste, jeśli dostępne są myszy z mutacją zerową (albo mutacją naturalną, genetycznie modyfikowaną mutacją zerową ("nokaut"], lub mutacją zerową wprowadzoną przez pułapkę genową), a myszy są zdolne do dorosłości. Niestety, myszy z mutacją zerową, które spełniają te kryteria, często nie są dostępne, zazwyczaj dlatego, że mutacja zerowa powoduje śmierć zarodkową lub w pierwszych dniach życia pourodzeniowego. W tej sytuacji myszy podatne na rozwój nowotworu mogą zamiast tego zostać skrzyżowane z myszami, u których kluczowe segmenty genu będącego przedmiotem zainteresowania są otoczone miejscami loxP ("floxed"), co pozwala na ablację genu poprzez wprowadzenie transgenu wyrażającego rekombinazę Cre do komórek nowotworowych (warunkowy nokaut). Takie podejście ma kilka zalet. Po pierwsze, jeśli dostępny jest sterownik Cre, który ulega ekspresji w guzie, ale nie w typie komórki, który doprowadził do śmierci w konwencjonalnych nokautach, takie podejście może potencjalnie zweryfikować kandydata na cel terapeutyczny. Po drugie, ablacja genu kodującego białko kandydujące w komórkach nowotworowych, ale nie w innych elementach wewnątrznowotworowych, takich jak fibroblasty związane z nowotworem lub komórki odpornościowe, pozwala badaczowi na rozróżnienie między autonomicznymi i nieautonomicznymi komórkami efektami celu terapeutycznego. Wreszcie, indukowany tamoksyfenem sterownik Cre (CreERT2) pozwala badaczowi usunąć gen będący przedmiotem zainteresowania na różnych etapach rozwoju guza i określić okno, w którym kandydat na środek terapeutyczny z największym prawdopodobieństwem będzie skuteczny.

Niestety, istnieją również problemy techniczne, które mogą ograniczać stosowanie warunkowych nokautów w nowotworach powstających w modelach GEM. Na przykład czynnik Cre, który ulega ekspresji w komórkach nowotworowych i pozwala uniknąć delecji genu w normalnych komórkach niezbędnych do życia, może nie być dostępny. Inną kwestią, która może być niedoceniana, jest to, że czynniki napędzające Cre i CreERT2 często zmiennie ablują floksowane allele u myszy, co skutkuje mozaicyzmem mutacji zerowej w raku GEM. Kiedy tak się stanie, komórki nowotworowe, w których docelowy gen nie został poddany ablacji, będą nadal szybko się namnażać, przerastając komórki nowotworowe allelami, którym uległa ablacja. Mozaicyzm w liniach napędowych Cre może wystąpić z powodu niewszechobecnej ekspresji Cre w docelowej linii oraz przez nieudaną rekombinację w poszczególnych komórkach niezależnie od wyrażenia Cre4. Jest to znane zjawisko czynników napędzających Cre, które jest zależne od typu komórki i powinno być brane pod uwagę podczas projektowania eksperymentalnego i interpretacji danych. Mozaicyzm może maskować efekt nokautu i prowadzić badacza do błędnego wniosku, że gen będący przedmiotem zainteresowania nie jest niezbędny do proliferacji komórek nowotworowych i/lub przeżycia, a zatem nie jest ważnym celem terapeutycznym.

Kilka z tych problemów napotkano w poprzednim badaniu, które próbowało ustalić, czy receptorowa kinaza tyrozynowa erbB4 jest potencjalnym celem terapeutycznym w komórkach MPNST5. W tych badaniach wykorzystano myszy, które wyrażają transgen kodujący izoform glejowego czynnika wzrostu neureguliny-1 (NRG1) β3 (GGFβ3) pod kontrolą promotora zerowego białka mieliny specyficznego dla komórek Schwanna (myszy P 0-GGFβ3). Myszy P 0-GGFβ3 rozwijają mnogie nerwiakowłókniaki splotowate, które postępują, aby przekształcić się w MPNST w procesie, który podsumowuje procesy patogenezy nerwiakowłókniaka i progresję nerwiakowłókniaka splotowatego-MPNST obserwowaną u pacjentów z autosomalnym dominującym zespołem podatności na nowotwór nerwiakowłókniakowatość typu 1 (NF1)6. Po skrzyżowaniu z myszami z mutacją zerową Trp53, powstały P 0-GGFβ3; Myszy Trp53 +/- rozwijają MPNST de novo, jak widać w cis-Nf1 +/-; Trp53 +/- myszy.

Te MPNST podsumowują postęp od II stopnia Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) do IV stopnia zmian obserwowanych u ludzi7. U myszy P 0-GGFβ3 MPNST powstają w istniejących wcześniej nerwiakowłókniakach splotowatych w nerwie trójdzielnym (58%) i rdzeniowych korzeniach nerwów grzbietowych (68%)7; MPNST powstające w P 0-GGFβ3; Myszy Trp53 +/- mają bardzo podobny rozkład. U ludzi MPNST najczęściej powstają w nerwie kulszowym, a następnie w splocie ramiennym, korzeniach nerwów rdzeniowych, błędnym, udowym, środkowym, splocie krzyżowym, zasłonie podkolanowej oraz tylnym nerwie piszczelowym i łokciowym8. Ten rozkład guza w tych modelach GEM różni się nieco od tego, co obserwuje się u ludzi. Jednak MPNST, które powstają w P 0-GGFβ3 i P0-GGFβ3; Myszy Trp53 +/- są histologicznie identyczne z ludzkimi MPNST, przenoszą wiele tych samych mutacji, które obserwuje się w ludzkich MPNST i podsumowują proces progresji nerwiakowłókniaka-MPNST obserwowany u pacjentów z NF1. Generowanie P 0-GGFβ3 lub P0-GGFβ3; Myszy Trp53 +/- z Erbb4-/- nie były wykonalne, ponieważ myszy z dwoma allelami zerowymi Erbb4 umierają w macicy w 10,5 dniu embrionalnym, wtórnym do wad serca9. Ponieważ uratowanie ekspresji Erbb4 w sercu poprzez wprowadzenie specyficznego dla serca transgenu Erbb4 (łańcuch ciężki α-miozyny (MHC)-Erbb4) skutkuje żywotnymi Erbb4-/- myszy10, generacja myszy ze skomplikowanym P 0-GGFβ3; Trp53+/-; α-MHC-ERBB4; Podjęto próbę zbadania genotypu Erbb4-/-.

Jednak kojarzenia nie dały myszy w oczekiwanych proporcjach mendlowskich, co wskazuje, że pożądany genotyp był szkodliwy. W związku z tym generowanie P 0-GGFβ3; Myszy Trp53 +/- z floksowanymi allelami Erbb4 < klasa sup = "xref">11 i sterownik CreERT2 zostały podjęte w celu umożliwienia usunięcia Erbb4 w MPNST powstających u tych myszy. U tych zwierząt nadal obecne były liczne komórki nowotworowe z nienaruszonymi allelami Erbb4 (mozaikowość). Zaobserwowana mozaicyzm może wynikać z nieefektywnego dostarczania tamoksyfenu, co skutkowało różnicami w skuteczności rekombinacji w tkance. Możliwość spontanicznych mechanizmów kompensacyjnych może dodatkowo przyczynić się do mozaicyzmu w rekombinacji za pośrednictwem tamoksyfenu, omijając wymóg ekspresji Erbb4. Możliwe jest, że utrata Trp53 sprawia, że komórki nowotworowe są podatne na dodatkowe spontaniczne "permisywne" mutacje, które mogą zmylić interpretację danych. Ponieważ wydawało się prawdopodobne, że nienaruszone komórki MPNST Erbb4 zamaskują konsekwencje ablacji Erbb4 w innych komórkach nowotworowych, podejście to zostało porzucone.

Te przeszkody doprowadziły do opracowania metodologii ablacji Erbb4 w bardzo wczesnych komórkach MPNST za pomocą adenowirusa eksprymującego rekombinazę Cre i eGFP. Komórki te można oddzielić od komórek niezakażonych za pomocą FACS, co znacznie zmniejsza mozaicyzm dla ablowanego genu Erbb4. Poniżej opisano metody stosowane w tym celu, wraz z metodami stosowanymi do oceny skutków ablacji genów in vitro i in vivo. Poniższy protokół jest przykładem produkcji myszy z nowotworem, które dają guzy zawierające floksowane allele embrionalnych genów letalnych będących przedmiotem zainteresowania do wycięcia ex vivo przed oceną wzrostu guza przeszczepu allogenicznego in vivo. Obejmuje to opis podejść zastosowanych do analizy wpływu, jaki ablacja Erbb4 wywiera na proliferację komórek nowotworowych, przeżycie i ekspresję genów in vitro oraz proliferację, przeżycie i angiogenezę w ortotopowych alloprzeszczepach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przed wykonaniem jakichkolwiek procedur na myszach, wszystkie procedury muszą zostać sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt. Protokół opisany w tym manuskrypcie został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego Południowej Karoliny. Protokół ten został wykonany przez odpowiednio przeszkolony personel zgodnie z wytycznymi MUSC dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Pokolenie myszy, które rozwijają MPNST homozygotyczne pod względem alleli flox Erbb4

  1. Wyprodukuj generację F1 P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ zwierzęta przez krycie P 0-GGFβ3; Trp53+/- mice7 z Erbb4fl/fl mice11. Użyj kwadratu Punneta (Rysunek 1), aby poprowadzić schemat hodowlany, aby upewnić się, że wygenerowano wystarczającą liczbę młodych samców i samic F1 z pożądanym P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Genotyp Erbb4fl/+.
  2. Genotyp F1 potomstwo poprzez wyizolowanie genomowego DNA z wycinka ogonowego pobranego zgodnie z wytycznymi IACUC, a następnie przeprowadzenie PCR przy użyciu wcześniej opisanych starterów w celu wykrycia transgenu P 0-GGFβ3 12, Trp53 typu dzikiego (+) i null (-) alleli class<="xref">7 oraz Erbb4flox i Erbb4 allele typu dzikiego13.
    1. Wyizoluj DNA ogona za pomocą metod opisanych na jacks-lab.mit.edu/protocols.
    2. Przygotuj reakcję PCR z 25 ng DNA, 0,25 nM dNTP, 0,02 U / μL Taq, 0,5 μM każdego startera i 1x buforem PCR. Przeprowadzić reakcję PCR z pojedynczą inkubacją w temperaturze 95 °C (w celu stopienia genomowego DNA i aktywacji Taq) przez 1 minutę, a następnie 35 cykli PCR w temperaturze 94 °C, 10 s (topnienie); 55 °C, 30 s (wyżarzanie); 72 °C, 40 s (przedłużenie), a następnie pojedyncze 72 °C (przedłużenie) przez 5 min. Przechowywać reakcje w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą gotowe do użycia na 1,2-1,5% żelu agarozowym.
      UWAGA: Temperatura wyżarzania zależy od zastosowanego systemu buforowego PCR; Zaleca się wykonanie gradientu temperatury wyżarzania w celu określenia właściwej temperatury wyżarzania.
  3. Wyprodukuj generację F2 P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl zwierząt poprzez krzyżowanie odpowiedniego potomstwa F1 (P 0-GGFβ3;Trp53-/+; Erbb4fl/+) ze sobą.
    UWAGA: Rysunek 1 ilustruje przewidywania kwadratu Punneta używane do obliczenia oczekiwanej liczby potomstwa F2 o pożądanym genotypie.
  4. Zidentyfikuj zwierzęta z pożądanym P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Genotyp Erbb4fl/fl zgodnie z opisem w kroku 1.2.
  5. Kojarzyć potomstwo F2 ze sobą, aby utrzymać P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl / fl kolonia i genotyp wszystkich młodych. Upewnij się, że nowo wprowadzony allel floksowany nie zagraża przeżyciu ani latencji guza. Osiągnij to, ustanawiając kohorty (20 myszy / kohortę) P 0-GGFβ3; Trp53+/- oraz P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl myszy i śledzić ich przeżycie i częstotliwość występowania nowotworu.
  6. Monitorować zwierzęta kilka razy w tygodniu, aż do osiągnięcia doświadczalnego punktu końcowego (maksymalny dopuszczalny rozmiar guza/humanitarny punkt końcowy zatwierdzony przez IACUC).
    1. Podczas cotygodniowego monitorowania oceń masę ciała, normalne zachowania społeczne i pielęgnacyjne oraz pomiary wielkości guza. Umów się na ocenę weterynaryjną w przypadku utraty masy ciała o >10% masy ciała, odosobnienia społecznego i garbienia się.
    2. Kiedy mysz z nowotworem zostanie zidentyfikowana i osiągnie humanitarny punkt końcowy, humanitarnie poddaj zwierzę eutanazji za pomocą wdychania dwutlenku węgla, a następnie zwichnięcia szyjki macicy i sterylnie usuń guz za pomocą noża skalpela. Wykonaj pomiary guza, mierząc długość, szerokość i głębokość za pomocą suwmiarki i wagi guza (masa i objętość). Pracuj szybko, aby uniknąć autolizy.
  7. Pokrój guz na trzy sekcje za pomocą cięć w stylu bochenka chleba za pomocą noża skalpela w sterylnych warunkach, aby wygenerować segmenty tkanki do utrwalania formaliny / zatapiania parafiny (FFPE), wczesnego generowania kultur pasażowych i materiału zamrożonego błyskawicznie (Figura 2A).
    1. Upewnij się, że sekcja 1 (dla wczesnego generowania hodowli pasażowej, krok 1.7.2) wynosi około 10% całkowitej objętości guza, sekcja 2 (dla fiksacji i IHC, krok 1.7.3) wynosi 70% całkowitej objętości guza, a sekcja 3 (dla błyskawicznego zamrażania, krok 1.7.4) wynosi 20% całkowitej objętości guza.
    2. Weź sekcję 1 guza w celu przygotowania kultur wczesnego pasażu (patrz poniżej).
    3. Utrwalić sekcję 2 guza w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie zanurzyć w parafinie (zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE) w celu przeprowadzenia diagnostyki.
    4. Sekcja 3 dotycząca błyskawicznego zamrażania w celu analiz analitycznych (np. immunobloty w celu sprawdzenia, czy białko kodowane przez docelowy gen floksowany ulega odpowiedniej ekspresji).
  8. Wybarwić skrawki tkanki FFPE o grubości 5 μm hematoksyliną i eozyną (H&E), aby potwierdzić diagnozę guza przez wykwalifikowanego patologa. W razie potrzeby wykonaj barwienie immunohistochemiczne (IHC), aby potwierdzić diagnozę guza.
    1. Immunostainowe MPNST dla białka wiążącego wapń B (S100β) S100, nestyny i regionu determinującego płeć Y (SRY)-Box czynnika transkrypcyjnego 10 (Sox10)-trzy markery, które ulegają ekspresji zarówno w MPNST, jak i komórkach Schwanna (pochodzenie komórek nowotworowych)5,6,14,15. Wybarwić guzy przeciwciałami rozpoznającymi erbB4, białko kodowane przez gen przeznaczony do ablacji w dalszych etapach.
    2. Aby potwierdzić diagnozę, poproś wykwalifikowanego lekarza weterynarii lub patologa o ocenę wszystkich barwionych szkiełek nowotworowych zgodnie z kryteriami diagnostycznymi i klasyfikacyjnymi WHO5,6,7,16.

2. Ablacja ex vivo floksowanych alleli Erbb4 w komórkach MPNST

  1. Utwórz kultury wczesnego pasażu ze świeżo pobranej tkanki MPNST, umieszczając tkankę z sekcji 1 (krok 1.7.3) w 10 ml lodowato zimnej sterylnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na lodzie, a następnie przenosząc ją do sterylnego obszaru roboczego (Rysunek 2B)16.
    UWAGA: Wszystkie kolejne zabiegi należy wykonywać w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych.
  2. Zmiel tkankę nowotworową na kawałki o średnicy 2-4 mm i rozcieraj 8-10 razy w naczyniu do hodowli tkankowej o długości 10cm2 z 10 ml pożywki wzrostowej. Hoduj te preparaty w pożywce wzrostowej DMEM-10 o wysokiej zawartości glukozy (zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierająca 10% płodowej surowicy cielęcej, 1% glutaminy, 10 μg/ml streptomycyny i 10 j.m./ml penicyliny) uzupełnioną 10 nM neureguliną-1β (NRG1β) i 2 μM forskoliny. Dodaj forskolinę na tym etapie, aby zahamować wzrost powszechnych typów komórek zanieczyszczających, takich jak fibroblasty.
  3. Mechanicznie zdysocjowaną tkankę i komórki należy utrzymywać przez okres do 3 dni w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 w celu uzyskania kultury wczesnego pasażu. W tym miejscu nie należy oddzielać rozproszonych komórek i pozostałych fragmentów tkanki.
  4. Odświeżaj kultury nową pożywką co 3-4 dni. Pozwól komórkom nowotworowym namnażać się, aż się zlewają.
  5. Rozszerz kultury wczesnego przejścia, dzieląc zlewające się kultury na kilka potraw. Usuń pożywkę wzrostową i umyj komórki 1x dPBS. Następnie dodaj 1 ml 0,25% trypsyny przez 2-5 minut w temperaturze pokojowej na 10 cm2 potraktowane naczynie do hodowli komórkowych. Delikatnie rozetrzeć kulturę, aby ułatwić oderwanie i wytworzyć zawiesinę jednokomórkową.
    1. Zakończ trypsynizację, dodając 2 ml pożywki wzrostowej DMEM-10. Zebrać mieszaninę trypsynizowanych komórek i przenieść ją do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 5 ml. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut w temperaturze 500 × g w temperaturze pokojowej.
    2. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml DMEM-10. Podziel komórki na dwie do czterech 10-centymetrowych szalek do hodowli komórkowych, z których każda zawiera 10 ml pożywki wzrostowej (około 1 × 106 komórek na szalkę).
  6. Po 5 pasażach (powtarzając kroki w 2,5), użyj pożywki wzrostowej bez NRG1β i forskoliny. Wybarwić immunologicznie próbkę kultury przeciwciałem anty-S100β w celu sprawdzenia, czy hodowla składa się wyłącznie z komórek nowotworowych. Utrzymuj komórki w pożywce wzrostowej DMEM-10 we wszystkich kolejnych pasażach.
  7. W następnym przejściu policz komórki i zamroź część P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl / fl Komórki MPNST pobrane z konfluentnych kultur (3 × 106 komórek / fiolkę).
  8. Płyta P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/fl wczesne pasażowanie komórek MPNST o gęstości 1,5 × 106 komórek na 10 cm traktowane naczynie do hodowli komórkowej w pożywce wzrostowej DMEM-10.
  9. Dzień 0: (około 12-16 godzin po posiewie) przemyć przylegające kultury 2-4 ml dPBS i zainfekować Ad5CMV-Cre/eGFP lub Ad5CMV-eGFP w ilości około 400 jednostek tworzących płytkę (pfu)/komórkę w 10 ml DMEM bez surowicy (tj. 30 μl 2 ×10 10 pfu wirusa na 10 cm szalkę). Ableksować floksowane allele Erbb4 za pomocą adenowirusa przy maksymalnym tolerowanym stężeniu wirusa (mnogość infekcji, MOI), jak określono empirycznie. Zapoznaj się z Rysunek 2C, aby zapoznać się ze schematem przepływu pracy dla tej ablacji.
  10. Dzień 1: Około 16 godzin później uratuj kultury, dodając 10 ml DMEM-10 do koktajlu infekcyjnego.
  11. Dzień 2 - 3: FACS sortuje zakażone komórki zgodnie z zalecanym protokołem z głównej placówki w celu sortowania komórek eGFP-dodatnich około 48 godzin po zakażeniu. Przed sortowaniem FACS należy krótko sprawdzić komórki pod kątem sygnału eGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby upewnić się, że kultury zostały skutecznie zainfekowane (~50-100% komórek dodatnich). Wróć komórki odzyskane po FACS do 10 cm szalek do hodowli tkankowej; Zarezerwuj jedno naczynie do izolacji genomowego DNA.
  12. Dzień 4 - 5: Po sortowaniu metodą FACS pozwól komórkom zregenerować się w inkubatorze do hodowli tkankowych przez co najmniej 24-48 godzin, a następnie przygotuj komórki do analiz komórkowych in vitro lub przeszczepów in vivo. Potwierdź delecję Erbb4 za pomocą PCR przy użyciu genomowego DNA wyizolowanego z części posortowanych komórek eGFP-dodatnich. Sprawdzić, czy komórki eGFP-dodatnie są ErbB4-ujemne za pomocą PCR lub immunobarwienia próbki kultury przeciwciałem anty-erbB4.
    1. Wyizoluj genomowe DNA z komórek za pomocą standardowej metody izolacji DNA na bazie kwasu, guanidyny, fenolu i chloroformu17.
    2. Wykonaj standardowy PCR, aby odróżnić floksowane allele Erbb4 i ablowane allele Erbb4. Wykonaj 40 cykli z 2 ng DNA, 20 μM starterami 1 + 2, aby uzyskać produkt Erbb4-zerowy 250 pz i iloczyn floksowany 350 pz13. Wykonuj zarówno metody PCR, jak i oparte na przeciwciałach, aby potwierdzić nokaut, gdy nie są dostępne żadne wiarygodne przeciwciała.
      UWAGA: Komórki są gotowe do testów komórkowych in vitro, jak opisano poniżej. Z tak przygotowanymi komórkami można przeprowadzić wiele rodzajów dalszych analiz. Celem przedstawionych poniżej protokołów jest przedstawienie kilku przykładów zastosowań in vitro i in vivo tych komórek nowotworowych po ablacji genu Erbb4.

3. Testy proliferacji i żywotności w komórkach MPNST z ablowanymi allelami Erbb4

  1. Wykonaj testy proliferacji w ciągu następnych siedmiu dni na posortowanych komórkach MPNST posianych na płytce wielodołkowej za pomocą automatycznego cytometru opartego na obrazie.
    1. Dzień 6: Umieść 2,000 komórek na dołku w końcowej objętości 150 μL (~13,300 komórek/ml) pożywki wzrostowej na 96-dołkowej płytce. Wykonaj pomiary w trzech egzemplarzach dla każdej kohorty eksperymentalnej i 4 dzienne odczyty punktów końcowych (3 powtórzenia x 2 warunki x 4 dni).
    2. Dzień 7, 9, 11, 13: Zabarwić komórki barwnikami Hoechst i jodkiem propidyny (PI) i zobrazować je na automatycznym czytniku płytek, aby policzyć liczbę żywych i martwych komórek w każdym dołku. Aby to osiągnąć, należy jednocześnie wybarwić komórki barwnikiem Hoechst, aby zabarwić jądra zarówno żywych, jak i martwych komórek, oraz jodkiem propidyny (PI), aby oznaczyć martwe komórki. Wykonuj wszystkie odczyty o tej samej porze każdego dnia lub co drugi dzień.
      1. Dodać 50 μl 4 x roztworu barwiącego PI/Hoechst (po 4 μg/ml każdy) do każdego dobrze oznaczonego ilościowo tego dnia (np. tylko dnia 7) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych. Przechowywać płytkę przed światłem.
        UWAGA: Stężenie barwienia Hoechst musi być określone empirycznie i może wynosić od 1 do 10 μg/ml w zależności od typu komórki.
      2. Odczytaj wybarwione studzienki po inkubacji za pomocą odpowiedniego kanału fluorescencyjnego w automatycznym obrazie komórek. Po odczytaniu należy odłożyć płytkę do inkubatora w celu przyszłych odczytów w kolejnych dniach (tj. dniach 9, 11, 13).
      3. Określ ilościowo intensywność barwienia na podstawie zastosowanego systemu obrazowania i oblicz liczbę martwych komórek, żywych komórek i wszystkich komórek, korzystając z następujących ustawień: kanał niebieski (377/50 nm, Hoechst): całkowita liczba komórek (żywych i martwych); kanał czerwony (531/40 nm, PI): tylko martwe komórki; niebieski - czerwony (całkowita - martwe) = żywe komórki.
  2. W razie potrzeby przeprowadzić test żywotności komórek przez trzy dni, postępując zgodnie z protokołem producenta testu.
    UWAGA: Testy żywotności można łączyć z testami proliferacji, wykonując potrójne barwienie, w tym kalceinę AM (488/32 nm; zielony kanał, specjalnie oznacza żywe komórki), PI i Hoechst. Test apoptozy można również przeprowadzić przy użyciu kultur skonfigurowanych w sposób opisany powyżej; Konkretny protokół będzie zależał od systemu obrazowania.
    1. Dzień 6: Płytka 4,000 komórek na basenik w końcowej objętości 150 μl na 96-dołkowej płytce w trzech egzemplarzach.
    2. Dni 7 - 9: Dodaj 2,000 odczynników do oznaczania żywotności komórek bioluminescencyjnych (tabela materiałów), włóż płytkę z powrotem do inkubatora i odczytaj płytkę 1 godzinę później. Wykonuj kolejne odczyty o tej samej porze każdego dnia. W przypadku testów bioluminescencyjnych (MTT) test należy wykonywać dokładnie tak, jak opisano w instrukcjach producenta co 24 godziny przez 72 godziny za pomocą czytnika płytek luminometru.

4. Analizy RNA-Seq i identyfikacja genów, których ekspresja jest zmieniona przez utratę Erbb4

  1. Dzień 6: Wyizoluj całkowite RNA z posortowanych komórek MPNST przy użyciu standardowych metod opartych na kwasie, guanidynie-fenolu i chloroformie. W przypadku eksperymentów mających na celu wykrycie zmian w poziomach mRNA między dwiema kohortami należy przygotować całkowite RNA z co najmniej trzech powtórzeń biologicznych w każdej kohorcie.
    1. Aby wyeliminować zdarzenia spowodowane przez wektor adenowirusowy lub ekspresję eGFP, a nie utratę Erbb4, wyizoluj RNA z trzech biologicznych powtórzeń P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Komórki Erbb4fl / fl MPNST transdukowane za pomocą Ad5CMV-Cre / eGFP i trzy kontrpróby biologiczne transdukowane za pomocą Ad5CMV-eGFP.
      UWAGA: Wyizolowany RNA musi mieć wynik liczby integralności RNA (RIN) ≥ 8 dla analizy RNA-Seq. Upewnij się, że rdzeń sekwencjonowania określa RIN wszystkich próbek przed utworzeniem bibliotek.
  2. Użyj 100-200 ng wysokiej jakości całkowitego RNA z każdej próbki, aby przygotować biblioteki RNA-Seq (na tym etapie należy skontaktować się z podstawową funkcją sekwencjonowania). Wykonuj sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości przy użyciu sekwenatora DNA nowej generacji. W celu kwantyfikacji mRNA wykonaj sekwencjonowanie jednostronne, aby wygenerować pliki Fastq. Upewnij się, że każda próbka ma co najmniej 50 milionów odczytów.
    UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 3, aby zapoznać się ze schematem ilustrującym przepływ pracy używany do przetwarzania danych RNA-Seq i ilościowego określania ekspresji transkryptów o zróżnicowanej ekspresji. Dane sekwencyjne, w postaci plików Fastq, poddawane są procedurom kontroli jakości; >80% odczytów powinno dać wynik Phred równy 30, aby można go było uznać za odpowiedni do późniejszej analizy. Sekwencje są również wstępnie przetwarzane (przycinane) za pomocą Trimmomatic18 w celu usunięcia sekwencji adapterów i odfiltrowania odczytów o niskiej jakości.
  3. Wykonaj wyrównanie i analizę RNA-Seq na plikach wygenerowanych przez fastq za pomocą dowolnego odpowiedniego oprogramowania (np. DNAStar19,20 lub Partek21). Postępuj zgodnie z instrukcjami specyficznymi dla programu, korzystając z ustawień domyślnych, aby wyrównać pliki fastq do genomu referencyjnego myszy (GRCm38/mm10).
    UWAGA: Na przykładzie DNAStar opisano ogólny przepływ pracy (Rysunek uzupełniający 1).
    1. Wybierz metodę analizy, RNA-Seq.
    2. Wybierz genom referencyjny, Mysz.
    3. Prześlij plik BED, jeśli został dostarczony przez rdzeń sekwencjonowania.
    4. Prześlij pliki sekwencjonowania fastq, przypisując im unikalne nazwy replikacji.
    5. Grupuj pliki fastq i przypisuj je do zestawu replikacji (np. GFP, CRE)
      UWAGA: Każdy program wyrównywania ma swoje określone kroki, a użytkownik musi zapoznać się z podręcznikiem użytkownika programu, aby uzyskać informacje na temat protokołu specyficznego dla programu. Następnie program wygeneruje specyficzne dla genu surowe dane zliczania z tych plików Fastq.
  4. Przeprowadzić analizę statystyczną i normalizacyjną (DESeq2, EdgeR) na surowych danych zliczania przy użyciu dowolnego odpowiedniego oprogramowania, jak opisano w 4.3, z zestawem próbek Ad5CMV-eGFP jako zestawem danych kontrolnych i zestawem Ad5CMV-Cre jako zestawem danych testowych w celu identyfikacji różnicowych sygnałów ekspresji genów o solidnej mocy statystycznej22,23.
    1. Wybierz pliki GFP fastq jako zestaw danych kontrolnych.
    2. Wybierz DESeq2 jako metodę statystyczną i normalizacyjną .
    3. Rozpocznij montaż i analizę.
      UWAGA: Każdy program wyrównywania ma swoje określone kroki, a użytkownik musi zapoznać się z podręcznikiem użytkownika programu, aby uzyskać informacje na temat protokołu specyficznego dla programu. Następnie program wygeneruje specyficzne dla genu surowe dane zliczania z tych plików Fastq. Analiza statystyczna i normalizacyjna jest wbudowanym krokiem w wielu programach, jak pokazano w poniższym przykładzie, w ramach protokołu wyrównania sekwencji. Jeśli używany jest alternatywny program do wyrównywania sekwencji, który nie oferuje tego kolejnego wbudowanego kroku, należy przeprowadzić analizę statystyczną i normalizacyjną na surowych danych zliczania na poziomie końcowym przy użyciu pakietów kodowania DESeq2 lub EdgeR napisanych w R, dostępnych bezpłatnie do pobrania na Bioconductor.org.
  5. Użyj tych podejść, aby zidentyfikować zmiany reprezentujące co najmniej 1,5-krotny wzrost lub spadek w stosunku do kontroli (w tym przypadku komórek transdukowanych wirusem Ad5CMV-eGFP). Do późniejszej analizy wzbogacenia funkcjonalnego należy używać tylko tych genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG), które zostały uznane za statystycznie istotne, które wykazują ≥1,5-krotne zmiany i wartość p 0,05 lub padj 0,1.
    UWAGA: Spowoduje to wygenerowanie listy genów DEG i ich mocy statystycznej do analizy wzbogacenia funkcjonalnego.
  6. Przeprowadzić analizę wzbogacenia funkcjonalnego na statystycznie istotnym DEG za pośrednictwem Erbb4 zidentyfikowanym w 4.4 za pomocą uszeregowanego pliku z listą genów przy użyciu dowolnego z bezpłatnych narzędzi internetowych. Określ biologiczne i szlakowe znaczenie utraty genu Erbb4 za pomocą zestawów danych ontologii genów zintegrowanych z tymi ogólnodostępnymi narzędziami do analizy wzbogacania funkcjonalnego24,25,26,27 (przykłady można znaleźć w Tabeli materiałów, a Rysunek 3 przedstawia przykładowy przepływ pracy z wykorzystaniem Panther).
    1. Wyeksportuj dane uzyskane w kroku 4.4 jako arkusz kalkulacyjny.
    2. Uszereguj dane według zmiany krotności log2, wartości p/padj lub obu.
    3. Pamiętaj, aby usunąć wszystkie dane, które nie są istotne statystycznie.
    4. Wyeksportuj listę genów rangi z identyfikatorem genu tylko jako plik .txt i prześlij ją na stronę internetową.
      UWAGA: Używaj tylko statystycznie istotnych DEG (wartości p/padj odpowiednio <0,05 lub 0,1), aby wygenerować uszeregowaną listę genów wejściowych przy użyciu zmian log2 krotności (od najwyższej do najniższej), wartości p/padj (od najniższej do najwyższej) lub obu [(-log10(pval)*sign(log2FC)]. Istnieje kilka podejść do generowania listy genów rangi i jest ona empirycznie określana dla zestawu danych i zadawanego pytania. Specyficzny rodzaj narzędzia do analizy wzbogacenia funkcjonalnego, które jest używane, może również pomóc w określeniu odpowiedniego typu listy genów rangi. Aby uzyskać dodatkowe zasoby na temat sekwencji RNA, zobacz następujące artykuły28,29,30.

5. Ortotopowe przeszczepy allograficzne komórek MPNST z ablowanymi allelami Erbb4 i analiza efektów ablacji Erbb4

  1. Przed wykonaniem ortotopowego przeszczepu allotopowego posortowanych komórek MPNST należy upewnić się, że wszystkie procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt oraz że wszystkie procedury są wykonywane przez odpowiednio przeszkolony personel.
  2. W dniu wstrzyknięcia należy usunąć komórki o niskim pasażu (około 85% zbiegu) z płytek lub kolb do hodowli komórkowych za pomocą nieenzymatycznego roztworu dysocjacji komórek (np. mieszaniny chelatorów; patrz Tabela Materiałów) i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. W przypadku wstrzyknięć ortotopowych do nerwu kulszowego, należy rozpuścić komórki w 16 667 komórkach/ml (50 000 komórek na 3 μl dla każdego zwierzęcia) w DMEM-1031. Utrzymuj komórki na lodzie.
    UWAGA: Niektóre kultury nie ustanowią przeszczepów, chyba że komórki zostaną wstrzyknięte do macierzy błony podstawnej o niskim współczynniku wzrostu. Wymóg matrycy membrany podstawnej (10-50%) musi zostać określony empirycznie.
  3. Oceń potencjał wzrostu przeszczepu allogenicznego in vivo w komórkach po zakażeniu, wstrzykując komórki MPNST do nerwu kulszowego 8-10 znieczulonych Hsd: Athymic Nude-Foxn1nu myszy na kohortę (w wieku 4-8 tygodni). Do ortotopowej iniekcji komórek nowotworowych, patrz Turk et al31. Tutaj pokazano wstrzyknięcie podskórne.
    UWAGA: Aby określić liczbę zwierząt doświadczalnych potrzebnych do uzyskania istotności statystycznej, skonsultuj się z biostatystykiem lub zaleca się użycie G*Power3, bezpłatnego oprogramowania32.
  4. Należy ściśle obserwować zwierzęta dwa razy na dobę przez pierwszy tydzień po wstrzyknięciu w celu wykrycia jakichkolwiek objawów bólu. Następnie monitoruj szczepione myszy trzy razy w tygodniu pod kątem pomiarów suwmiarki i oceniaj wyniki kondycji ciała (BCS) zgodnie z wcześniejszym opisem5,31. Jak określono w wytycznych IACUC, należy poddawać eutanazji zwierzęta z BCS 2 lub mniejszym.
  5. Ponieważ przeszczepione komórki rosną w różnym tempie, przed wykonaniem eksperymentów opisanych w tej sekcji należy empirycznie określić czas przeszczepu przy użyciu komórek kontrolnych (niezmodyfikowanych). Aby pobrać przeszczepy w eksperymentalnym punkcie końcowym, należy humanitarnie poddać myszy eutanazji przy użyciu wdychania dwutlenku węgla, a następnie zwichnięcia szyjki macicy jako środka wtórnego. Zapisz końcowe pomiary objętości i masy każdego przeszczepu.
    UWAGA: Jako niezmodyfikowany P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Komórki Erbb4fl / fl MPNST zwykle osiągają maksymalny rozmiar dozwolony przez IACUC w ciągu 30-45 dni, typowy czas to około 30-45 dni po wstrzyknięciu.
  6. Wyizolować i wyciąć tkankę zgodnie z opisem w krokach 1.6-1.8. Umocuj część przeszczepionej tkanki na noc w 4% paraformaldehydzie (Rysunek 2), a następnie zanurz ją w parafinie. Przygotuj skrawki o grubości 5 μm z tkanki FFPE i zamontuj je na szkiełkach. Wykonać barwienie H&E i inne niezbędne barwienie immunologiczne, aby potwierdzić, że przeszczepiona tkanka składa się z komórek nowotworowych, jak opisano w 1.8.1. Błyskawiczne zamrożenie reszty tkanki nowotworowej w celu dalszych analiz, takich jak walidacja utraty ekspresji Erbb4 i ocena wpływu utraty Erbb4 na ekspresję innych członków rodziny Erbb.
    UWAGA: Potwierdzenie komórek nowotworowych w tkance przeszczepu musi być wykonane, ponieważ myszy z niedoborem odporności są podatne na rozwój nowotworów. W przypadku małych przeszczepów ważne jest, aby upewnić się, że tkanka bliznowata lub stan zapalny nie są mylone z nowotworem.
    1. Wykonaj standardowe barwienie IHC na tkance FFPE, aby porównać ekspresję interesujących białek w przeszczepach allogenicznych wyhodowanych z komórek poddanych działaniu Ad5CMV-eGFP i Ad5CMV-Cre/eGFP. Wytnij wyciętą tkankę przeszczepu za pomocą przeciwciał specyficznych dla erbB4, aby potwierdzić różnice w ekspresji erbB4 in vivo między dwoma warunkami eksperymentalnymi. Określ indeks proliferacyjny za pomocą barwienia Ki67 i poziom apoptozy za pomocą końcowego barwienia za pośrednictwem deoksynukleotydylotransferazy dUTP (TUNEL).
      UWAGA: Każdy docelowy białko może być również oceniany za pomocą IHC. Na przykład ocena gęstości naczyń krwionośnych poprzez immunobarwienie alloprzeszczepów przeciwciałem anty-CD31 (rozcieńczenie 1:50) w celu określenia in vivo różnic w mikrośrodowisku naczyń krwionośnych, w których pośredniczy ablacja genów. Liczba profili naczyniowych na pole 40x może być policzona w celu określenia ilościowego. W przypadku tych testów opartych na IHC należy postępować zgodnie ze standardowymi protokołami IHC dotyczącymi procedur barwienia oraz protokołem producenta dotyczącym barwienia TUNEL. Do kwantyfikacji obrazów należy użyć wtyczki ImageJ "automatyczne zliczanie obrazu jednokolorowego".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 4 przedstawia typowy wynik uzyskany podczas transdukcji komórek MPNST P0-GGFβ3;Trp53-/+;Erbb4fl/fl za pomocą adenowirusa Ad5CMV-eGFP lub adenowirusa Ad5CMV-Cre/eGFP (Rysunek 4A). Hodowle analizuje się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu zidentyfikowania komórek wykazujących ekspresję eGFP oraz za pomocą mikroskopii fazokontrastowej w celu określenia całkowitej liczby komórek obecnych w tym samy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawione tu szczegółowe metody zostały opracowane z wykorzystaniem modelu GEM MPNST. Jeśli jednak interesująca nas tkanka nowotworowa może zostać rozproszona na pojedyncze komórki, metodologie te można łatwo dostosować do różnych typów nowotworów powstających w GEM. Ważne jest, aby upewnić się, że floksowany allel nie powoduje i) zmniejszonego przeżycia, co może utrudnić uzyskanie wystarczającej liczby myszy do badań przesiewowych w kierunku nowotworów, lub ii) zwiększonej latencji guza, która może utrudnić uzyskani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353, R01 NS109655), National Cancer Institute (R01 CA122804), Departamentu Obrony (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073 i W81XWH-15-1-0193) oraz The Children's Tumor Foundation (2014-04-001 i 2015-05-007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ad5CMV-eGFPRdzeń wektora transferu genów, Univ of IowaVVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFPGene Transfer Vector Core, Univ of IowaVVC-U of Iowa-1174
Alexa 568 Przeciwciało wtórneThermo/FisherGaR A11036
Bioconductor Open Source Software dla Bioconductor Bioninformaticshttp://www.bioconductor.orgalternatywne narzędzie do analizy statystycznej używane w kroku 4.4
CD31Abcamab28364
Celigo Image CytometerNexcelom BioscienceN/A
Cell StripperCorning25-056-Clmieszanina chelatorów
Zestaw do barwienia DABVector LabsMP-7800
DAVID (baza danych do adnotacji, wizualizacji i zintegrowanego odkrywania)Oprogramowanie DAVIDhttps://david.ncifcrf.govanalizy wzbogacenia funkcjonalnego używane w kroku 4.5
DMEMCorning15-013-Cl
DreamTaq i bufor (genotypowanie PCR)Przeciwciała Thermo/FisherEP0701 i K1072
erbB4Cruzsc-284
erbB4Abcamab35374
erbB4 przeciwciałaMilliporeHFR1: 05-1133
FACS SorterBD BiosciencesAria II
ForskolinSigmaF6886
GenomeSpace Narzędzia i źródła danychGenomeSpacehttps://genomespace.org/support/tools/ogólne źródło dla kilku rodzajów narzędzi bioinformatycznych typu open source dla kroku 4.5
GlutaminaCorning25-005-
analizy i wizualizacji genów Cl Gorilla Gene OntologyGorillaN/A,oprogramowanie do analizy wzbogacenia funkcjonalnego http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il używane w kroku 4.5
GSEA Gene Set Enrichment AnalysisBroad InstituteN/A,oprogramowanie do analizy wzbogacenia funkcjonalnego https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp używane w kroku 4.5
HSD: myszy Athymic Nude-FOxn1nuEnvigo (wcześniej Harlan Labs)69
Illumina HiSeq2500 (sekwencer DNA nowej generacji)Sekwencer DNA IlluminaHi Seq 2500używany w kroku 4.2
Lasergene: ArrayStar Analiza ekspresji i wariantów genówDNAStar LaserGene OprogramowanieN/AAnaliza statystyczna i normalizacyjna używana w kroku 4.4
Lasergene: Montażwyrównania sekwencji SeqMan NGenwyrównanie oprogramowania używane w kroku 4.3Nie dotyczy Wyrównanieprogramowe używane w kroku 4.3
Matrigel, matryca błony podstawnej o niskim współczynniku wzrostuCorning354230
NRG1-betaWe własnym zakresieGenerowane przez SLC, dostępne również na rynku przez R & Systemy D (396-HB-050 / CF).
Plama jądrowa Hoeschst 33342Thermo62249
System klasyfikacji ontologii genów PantherOprogramowanieanalizy wzbogacenia funkcjonalnego http://pantherdb.org używane w kroku 4.5
Partek (nakładki i analizatory BWA)Partek, Ver 7Wyrównanie oprogramowania N/Ai statystyczna/normalizacja używane w kroku 4.3
Pen/StrepCorning30-002-Cl
Podkład 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTCTGTTCTTTGT
GTCTG- 3′		Eurofins GenomicsPrimer 1 + 2: 250  bp ErbB4 produkt zerowy i 350  bp Floxowany produkt ErbB4;
Podstawa 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC
AGAAGC-3′		Eurofins GenomicsPrimer 1 + 2: 250  bp ErbB4 produkt zerowy i 350  bp Floxowany produkt ErbB4;

Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA
ACCCAG-3′

Eurofins GenomicsPrimer 1 + 3: 350  bp Produkt ErbB4 typu dzikiego.
Propidium JodineFisher51-351-0
Proteom Profiler Matryce FosfokinazyR& D SystemsARY003B
Test żywotności komórek bioluminescencyjnychPromegaG9712czasie rzeczywistym
Pakiet ToppGene Oprogramowanieanalizy wzbogacenia funkcjonalnego ToppGene https://toppgene.cchmc.org używane w kroku 4.5
Trizol (odczynnik na bazie kwasu-kwas i fenolu i choloroformu)Invitrogen
Perkin ElmerNEL721001EA
do Santa Narzędzie do do glo w do Zestaw do wzmacniania sygnału tyramidowego 15596026

Bibliografia

  1. Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
  2. Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347(2019).
  3. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
  4. Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218(2012).
  5. Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74(2019).
  6. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  7. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
  8. Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
  9. Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
  10. Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
  11. Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
  12. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  13. Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
  14. Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
  15. Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
  16. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690(2021).
  17. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  18. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  19. Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
  20. Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577(2018).
  21. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891(2020).
  22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  23. Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28(2016).
  24. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48(2009).
  25. Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183(2007).
  26. Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
  27. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  28. Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984(2010).
  29. Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919(2016).
  30. Koch, C. M., et al. A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
  31. Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558(2011).
  32. Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175(2007).
  33. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  34. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807(2021).
  35. Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
  36. Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
  37. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ablacja genugenetycznie zmodyfikowana myszadenowirusowa rekombinaza Cresortowanie komórek aktywowane fluorescencjąhodowla komórek nowotworowychallograft ortotopowyróżnicowa ekspresja genówanaliza wzbogacenia funkcjonalnego
Definiowanie funkcji genów w nowotworzeniu poprzez ablację ex vivo floksowanych alleli w złośliwych komórkach nowotworowych osłonki nerwów obwodowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.