Artykuł metodologiczny

Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62741

⸱

13 sierpnia 2021

 ,  ,  , 
1Morgridge Institute for Research, Madison, WI

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy zoptymalizowane narzędzia do badania serca danio pręgowanego in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego. W szczególności sugerujemy jasne transgeniczne linie serca i prezentujemy nowe techniki delikatnego osadzania i unieruchamiania, które pozwalają uniknąć wad rozwojowych i wad serca. Przewidziano również możliwy potok pozyskiwania i analizy danych dostosowany do obrazowania serca.

Streszczenie

Badania nad embrionalnym sercem znacznie skorzystały z postępów w szybkiej mikroskopii fluorescencyjnej in vivo (LSFM). W połączeniu z szybkim rozwojem zewnętrznym, łatwą do opanowania genetyką i przezroczystością danio pręgowanego, Danio rerio, LSFM dostarczyło informacji na temat formy i funkcji serca w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej bez znaczącej fototoksyczności lub fotowybielania. Obrazowanie bijącego serca stanowi wyzwanie dla istniejących technik przygotowywania próbek i mikroskopii. Konieczne jest utrzymanie zdrowej próbki w ograniczonym polu widzenia i uzyskanie ultraszybkich obrazów, aby rozwiązać problem bicia serca. Tutaj opisujemy zoptymalizowane narzędzia i rozwiązania do badania serca danio pręgowanego in vivo. Demonstrujemy zastosowania jasnych linii transgenicznych do znakowania składników serca i prezentujemy nowatorskie techniki delikatnego osadzania i unieruchamiania, które pozwalają uniknąć wad rozwojowych i zmian częstości akcji serca. Proponujemy również proces pozyskiwania i analizy danych dostosowany do obrazowania serca. Cały przedstawiony tutaj przepływ pracy koncentruje się na obrazowaniu embrionalnym serca danio pręgowanego, ale można go również zastosować do różnych innych próbek i eksperymentów.

Wprowadzenie

Aby odkryć złożone zdarzenia i interakcje we wczesnym bijącym sercu, wymagane jest obrazowanie in vivo całego narządu. Dzięki minimalnej fototoksyczności1,2,3, low photobleaching4, i wysokiej prędkości, mikroskopia arkuszowa światła ewoluowała jako podstawowe narzędzie obrazowania dla rozwoju embrionalnego i sercowego5,6. Dostarczył on wglądu w formę i funkcję serca w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej7,8,9 i pozwolił naukowcom obrazować i śledzić znakowane fluorescencyjnie części serca z dużą prędkością, badać siły hemodynamiczne i śledzić rozwój serca bezpośrednio w ciele rozwijających się zarodków6,10,11,12.

Aby precyzyjnie i powtarzalnie ograniczyć rybę danio pręgowaną w polu widzenia, istnieje wiele protokołów osadzania dla arkuszy świetlnych, na krótką i długą metę, a także dla pojedynczej lub wielu próbek13,14,15,16,17,18,19. Najczęstszy protokół polega na unieruchomieniu trikainy i zamontowaniu agarozy w szklanej lub plastikowej rurce. Ponieważ jednak tętno może się zmieniać ze względu na temperaturę, środki znieczulające i użyty materiał do wbudowania20,21,22, obrazowanie serca danio pręgowanego wymaga określonych, delikatnych protokołów, aby zapewnić zdrowie próbki6,8,11,12,20, 21,22,23. W przypadku obrazowania krótkotrwałego (do godziny) można znieczulić rybę w trikainie 130 mg/L i osadzić ją w probówkach z fluorowanym etylenem propylenem (FEP) z 0,1% roztworem agarozy i zatyczką, jak opisano w Weber i in. 201416. Ponieważ jednak trikaina może prowadzić do wad rozwojowych20,22, do długotrwałego obrazowania należy stosować różne protokoły.

Tutaj opisujemy nową strategię długoterminowego obrazowania serca. Chociaż istnieje wiele implementacji arkuszy świetlnych24, zalecamy użycie wiszącej próbki w mikroskopie T-SPIM (jedna soczewka detekcyjna i dwie soczewki oświetleniowe w płaszczyźnie poziomej, przy czym próbka wisi pionowo we wspólnym ognisku). Zapewnia to niezbędną swobodę ruchu i obrotu do precyzyjnego pozycjonowania próbki. Ryby są unieruchamiane przez wstrzyknięcie 30 pg mRNA α-bungarotoksyny w stadium jedno- lub dwukomórkowym. α-bungarotoksyna to jad węża, który paraliżuje mięśnie, nie wpływając na rozwój układu krążenia ani fizjologię22. W celu uzyskania precyzyjnego obrazowania bez zniekształceń zalecamy montaż ryb w rurkach wykonanych z FEP, polimeru o współczynniku załamania światła prawie identycznym jak woda. Omawiamy, jak najlepiej przygotować rurki FEP, prostując je i czyszcząc przed obrazowaniem. Ryby są następnie umieszczane w tych rurkach, głową w dół, w pożywce, a dno rurki jest uszczelnione 2% zatyczką agarozową, na której spoczywają głowy ryb. Wycinanie otworów w rurze FEP ułatwia wymianę gazową i zapewnia wzrost ryb. Osadzone ryby mogą być przechowywane w pożywce do momentu zamontowania na uchwycie na próbkę tuż przed obrazowaniem. Sugerujemy również potok pozyskiwania i analizy danych w celu powtarzalnego obrazowania z dużą prędkością. Ponadto omawiamy zastosowanie linii transgenicznych cytoplazmatycznych i markerów błonowych do solidnego znakowania komórek serca, a także różnych opcji zatrzymania pracy serca. Te techniki mocowania zapewniają zdrowie próbki, a jednocześnie pozwalają na precyzyjne i powtarzalne ograniczenie pracy serca w polu widzenia.

Protokół

Wszystkie dorosłe osobniki i embriony danio pręgowanego (Danio rerio) były traktowane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Madison (UW-Madison).

1. Przygotowanie rybek zebrafish

  1. Postępuj z danio pręgowanym zgodnie z ustalonymi protokołami25,26 oraz wytycznymi instytucjonalnymi. Hoduj dorosłe ryby pożądanej linii transgenicznej (patrz sekcja Dyskusja). Zbierz zarodki i przechowuj je w 28 °C w szalce Petriego wypełnionej pożywką dla ryb, np. E327.
  2. Wybierz metodę unieruchomienia (patrz sekcja Dyskusja).
    1. W przypadku stosowania α-bungarotoksyny mRNA w celu unieruchomienia ryby, wstrzyknąć 30 pg mRNA22 do żółtka embrionów w stadium jednego lub dwóch komórek, przy użyciu igły szklanej wyciąganej, zamontowanej na mikromanipulatorze i podłączonej do piko-wtryskiwacza28.
    2. W przypadku użycia trikainy należy przygotować 0,4% roztwór zapasowy, którego pH doprowadzono do wartości 7,0–7,4 za pomocą 1 M Tris(hydroksymetylaminometanu), a następnie przechowywać go w temperaturze -20 °C do momentu obrazowania.
  3. Przechowywać jaja w szalce Petriego wypełnionej medium E3 w temperaturze 28 °C i przenosić jaja co 24 h do nowej szalki ze świeżym medium E3 aż do momentu obrazowania.
  4. Aby zapobiec tworzeniu się pigmentu, jeśli tło danego szczepu zebrafish nie jest albinotyczne, należy przenieść ryby w 24. godzinie po zapłodnieniu (hpf) do nowej szalki z medium E3 zawierającym 0,2 mM inhibitor tyrozynazy 1-fenylo-2-tiomocznik (patrz sekcja Dyskusja).

2. Przygotowanie probówek z FEP

Proces laboratoryjny przedstawiający przygotowanie włókien fotonicznych i narzędzia do ich obsługi. Kroki montażu i zastosowania.
Rysunek 1: Czyszczenie i prostowanie rurek FEP. (a) Rurki FEP na bębnie kablowym. (b) Rurki FEP przed prostowaniem. (c) Rurki FEP w szklanych i stalowych rurkach odpornych na autoklawowanie. (d) Płukanie rurek FEP po prostowaniu i schłodzeniu. (e) Rurka FEP docięta do rozmiaru probówki do wirowania w celu sonikacji. (f) Płukanie rurek FEP po sonikacji. (g) Przechowywanie oczyszczonych i wyprostowanych rurek FEP w probówce do wirowania. (h) Cięcie rurki FEP przed obrazowaniem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Wyprostuj rurki FEP (Rycina 1a,b), umieszczając je w szklanej lub stalowej rurce odpornej na autoklawowanie (Rycina 1c) o odpowiedniej średnicy wewnętrznej dopasowanej do rurek FEP, zazwyczaj 1,6 lub 2,4 mm, a następnie autoklawuj w temperaturze 180 °C przez 2 h. Pozostaw rurki do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 h. Następnie wyjmij je z rurek prostujących.
    UWAGA: Podczas manipulowania rurkami należy używać rękawiczek i pracować z odcinkami o długości 50 cm na raz.
  2. Oczyść rurki FEP.
    UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa zaleca się stosowanie strzykawek z tępą końcówką igły o rozmiarze odpowiadającym wewnętrznej średnicy rurki FEP, jednakly regularna igła również się sprawdzi.
    1. Przepłucz rurki 1 M NaOH dwukrotnie, używając strzykawki 50 mL (Rycina 1d).
    2. Dotnij rurki FEP do rozmiaru probówki wirówkowej 50 mL za pomocą żyletki (Rycina 1e), umieść przycięte rurki w probówkach wirówkowych wypełnionych 0,5 M NaOH i poddaj je ultradźwiękom przez 10 min.
    3. Przepłucz rurki FEP podwójnie destylowaną H2O, a następnie powtórz płukanie 70% etanolem (Rycina 1f).
    4. Przenieś rurki do 70% etanolu i poddaj je ultradźwiękom przez 10 min.
    5. Przepłucz rurki podwójnie destylowaną H2O i przechowuj je w probówkach wirówkowych w podwójnie destylowanej H2O (Rycina 1g).

3. Przygotowanie 2% agarozy w szalce

  1. W szklanej kolbie rozpuścić agarozę o niskiej temperaturze topnienia w medium E3. Podgrzewać roztwór w mikrofalówce, mieszając co 20 s, aż cały proszek zostanie rozpuszczony.
  2. Wlać agarozę do szklanej lub plastikowej płytki Petriego, tworząc warstwę o grubości 1-2 mm. Odczekać do całkowitego zestalenia się agarozy.
  3. W celu przechowywania delikatnie wlać medium E3 na powierzchnię agaru, aby zapobiec jego wysychaniu. Owinąć folią parafinową i przechowywać w temperaturze 4 °C.

4. Przygotowanie podłoży do zatapiania

  1. Przygotować wystarczającą ilość medium E3, aby wypełnić komorę z próbką.
    UWAGA: Należy unikać stosowania błękitu metylowego, jeśli medium ma kontakt z obiektywami.
  2. W przypadku stosowania trikainy, rozmrozić roztwór zapasowy i dodać 0,02% trikainy do medium E3.

5. Montowanie próbek

Schemat układu eksperymentalnego i sprzęt do enkapsulacji krążka agarowego w rurce FEP do analizy.
Rysunek 2: Montaż embrionów w rurce FEP. (a) Zznieczona ryba pozbawiona pigmentu w medium montażowym. (b) Strzykawka z tępą igłą i przymocowaną rurką FEP. (c) Po zassaniu medium i ryby do rurki FEP, należy odciąć rurkę na krawędzi igły. (d) Zanurzanie odciętej rurki w naczyniu pokrytym 2% agarozą w celu zapieczenia jej końca. (e) Danio pręgowany w zapieczonej rurce FEP. (f) Delikatne nacięcie rurki FEP pod kątem 30°, aby utworzyć otwory do wymiany gazowej. (g) Rurka FEP z czterema otworami nad osadzonym danio pręgowanym. (h) Schemat danio pręgowanego osadzonego w rurce FEP. Oznaczono otwory i krążek agarowy. (i) Kilka osadzonych osobników danio pręgowanego gotowych do obrazowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Za pomocą jednorazowej pipety szklanej przenieść ryby do medium do zatapiania (Rysunek 2a). W przypadku użycia trikainy, przenieść ryby do szalki Petriego wypełnionej medium E3 z dodatkiem trikainy na 10 min przed obrazowaniem. W obu przypadkach sprawdzić pod stereomikroskopem, czy ryby przestały się poruszać i czy serce bije z prędkością zbliżoną do grupy kontrolnej.
  2. Odciąć rurkę FEP do odpowiedniej długości za pomocą żyletki (Rysunek 1h).
    UWAGA: Długość należy dostosować do uchwytu próbek w mikroskopie; typowa długość wynosi około 3 cm.
  3. Przygotować strzykawkę z tępą kaniulą. Napełnić strzykawkę powietrzem, następnie zamocować rurkę FEP na igle i delikatnie wypłukać pozostałą wodę, opróżniając strzykawkę (Rysunek 2b).
    UWAGA: Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, należy powoli wypłukiwać powietrze.
  4. Za pomocą zamocowanej do strzykawki rurki FEP najpierw pobrać medium, aby wypełnić rurkę, a następnie pobrać embrion głową w dół. Głowę ryby należy trzymać jak najbliżej końca rurki. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza; w przypadku wystąpienia pęcherzyka należy odrzucić próbkę.
  5. Za pomocą żyletki ostrożnie odciąć rurkę FEP na krawędzi tępej kaniuli lub igły (Rysunek 2c).
  6. Usunąć wszelki płyn z powierzchni szalki pokrytej agarem. Wbić rurkę FEP prosto w agar (Rysunek 2d). Obrócić rurkę i wyjąć ją, aby odseparować czop z agarozy od podłoża.
  7. Pod stereoskopem sprawdzić obecność czopa agarowego na końcu rurki (Rysunek 2e).
  8. W przypadku obrazowania długoterminowego wykonać 3-5 otworów w rurce FEP w każdym kierunku kardynalnym, co najmniej 5 mm powyżej końca ciała ryby.
    1. Pod stereoskopem, używając żyletki prostopadle do osi rurki, wykonać nacięcie pod kątem 30° w rurce FEP, aż do osiągnięcia medium montażowego (Rysunek 2f).
    2. Wykonać drugie nacięcie pod kątem 180°, aby utworzyć otwór (Rysunek 2g,h).
  9. Przenieść zamontowany embrion głową w dół do probówki do mikrowirówki o pojemności 1.5 mL z medium do zatapiania do czasu rozpoczęcia obrazowania (Rysunek 2i).

6. Pozycjonowanie próbki

Schemat układu spektroskopowego z komorą próbki, obiektywami i stolikami do badań ekscytacji optycznej.
Rysunek 3: Komora próbki. (a) Probówka FEP zamocowana na uchwycie do próbek. (b) Komora próbki ze stolikami i obiektywami. (c) Widok z góry komory próbki wypełnionej medium, z obiektywem oświetlającym i detekcyjnym w konfiguracji T-SPIM. (d) Uchwyt do próbek zamocowany w mikroskopie, z próbką w komorze. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Ustawienie oczu rybek danio na etapie 24 hpf i 48 hpf, zaznaczono stopnie rotacji; badanie z zakresu biologii rozwoju.
Rysunek 4Pozycjonowanie zarodka do obrazowania serca. (a) 24 hpf zarodki danio prążkowanego Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry) z nieprawidłowym ustawieniem oczu. (a') Ta sama ryba z wyrównanymi oczami. (b) Te same ryby po obróceniu -100 ° oraz (Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.) -50 ° dla optymalnego obrazowania serca. (Wprowadzenie do technik obrazowania komórkowego: fluorescencyjna mikroskopia konfokalna (CLSM) oraz mikroskopia fluorescencyjna z szeroką wiązką (WB) W tej publikacji przedstawiamy podstawowe zasady i praktyczne zastosowania mikroskopii fluorescencyjnej z szeroką wiązką (WB) oraz fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej (CLSM) w obrazowaniu próbek biologicznych. Obie techniki wykorzystują fluorescencyjne znaczniki do wizualizacji specyficznych struktur komórkowych, jednak różnią się one znacząco pod względem rozdzielczości osiowej i zdolności do obrazowania w trzech wymiarach (3D). Mikroskopia z szeroką wiązką jest metodą szybką i czułą, idealną do obserwacji dynamicznych procesów w żywych komórkach, jednak cierpi z powodu rozmycia pozaogniskowego, co ogranicza jej zastosowanie w grubych próbkach. W przeciwieństwie do niej, mikroskopia konfokalna wykorzystuje tzw. otwór stenowy (pinhole), który eliminuje światło pochodzące spoza płaszczyzny ogniskowania, umożliwiając uzyskanie ostrych obrazów tzw. przekrojów optycznych. Dzięki temu CLSM pozwala na precyzyjną rekonstrukcję 3D struktur komórkowych. W materiale wideo zaprezentowano proces przygotowania preparatów, dobór odpowiednich fluoroforów oraz konfigurację parametrów akwizycji obrazu dla obu systemów. Omówiono również kluczowe różnice w kontraście i jakości obrazu, pomagając badaczowi wybrać najbardziej odpowiednią technikę w zależności od celu eksperymentu. Słowa kluczowe: mikroskopia konfokalna, szeroka wiązka, fluorescencja, obrazowanie komórkowe, przekrój optyczny, rozdzielczość osiowa, rekonstrukcja 3D) 48 hpf zarodki ryb zebrafish z nieprawidłowym ustawieniem oczu. (c') Ta sama ryba z wyrównanymi oczami. (d) Te same ryby obrócone o 30° dla optymalnego obrazowania serca. Czarne strzałki wskazują serce. Pasek skali 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przy mikroskopie zamocuj probówkę FEP w uchwycie na próbki (Rysunek 3a) i napełnij komorę obrazowania medium do zatapiania (Rysunek 3b,c). Następnie umieść uchwyt na próbki na stole mikroskopu tak, aby próbka była zanurzona w komorze (Rysunek 3d).
  2. Sprawdź stan zdrowia próbki. Wizualnie oceń częstość akcji serca w celu oceny ogólnej kondycji ryby, porównując ją z niezamocowaną rybą kontrolną, ponieważ specyficzna częstość akcji serca zależy od stadium rozwoju i temperatury. Jeśli tętno jest zbyt niskie, odrzuć rybę.
    UWAGA: Należy zapewnić delikatne obchodzenie się z embrionami, ostrożny transfer do medium do zatapiania, obrazowanie bezpośrednio po zatopieniu, unikanie gwałtownych zmian temperatury, unikanie tricainy oraz skrócenie czasu ekspozycji na tricainę.
  3. W celu zapewnienia powtarzalności obrazowania zawsze stosuj tę samą pozycję próbki. Zaleca się wyrównanie oczu i obrazowanie pod kątem.
  4. Obróć rybę tak, aby oba oczy (Rysunek 4a,c) znajdowały się w płaszczyźnie ogniskowej (Rysunek 4a',c').
  5. Z tej pozycji obróć rybę dodatkowo o około 50 °-100 ° zgodnie z ruchem wskazówek zegara dla obrazowania w 24 hpf (Rysunek 4b, b') oraz o około 20°-30° przeciwnie do ruchu wskazówek zegara dla obrazowania w 48 hpf (Rysunek 4d).
    ​UWAGA: Wczesne serce, przed 30 hpf, może być trudne do obrazowania ze względu na jego ukryte położenie (Rysunek 4b).

7. Akwizycja obrazów

  1. Wybierz stronę oświetlenia, która zapewnia najlepszą jakość obrazu, i dostosuj moc lasera do każdej ryby.
    UWAGA: Zapisz wartość mocy lasera do późniejszej analizy obrazu.
  2. W każdej płaszczyźnie z zarejestruj 4–5 uderzeń serca przy częstotliwości 300 klatek na sekundę (fps) lub więcej.
    ​UWAGA: Pole widzenia można przyciąć w celu zwiększenia szybkości akwizycji. Na przykład w 48 hpf serce danio prążkowanego bije od dwóch do trzech razy na sekundę, zatem przy 300 fps wymagane jest zarejestrowanie od 300 do 600 klatek, aby uchwycić od czterech do sześciu uderzeń serca.
  3. Aby zarejestrować bijące serce, przesuwaj próbkę stopniowo przez płaszczyznę światła. Stosuj odstęp z rzędu 1-2 µm, obejmując całą głębokość serca.

8. Przetwarzanie obrazów

  1. Zsynchronizuj nagrany film, aby zrekonstruować 4D (x,y,z, czas) serca, korzystając z wtyczki Fiji (Image J229,30) zgodnie z wcześniejszym opisem6.
  2. Aby przeanalizować dane i wygenerować filmy z wyrenderowanego serca danio-pręgowanego, załaduj plik 4D (x,y,z, czas) do oprogramowania do renderowania 3D.

Wyniki

Schemat anatomiczny serca; oznakowane mięsień sercowy/wsierdzie; obrazowanie 2D/3D i zmiany czasowe.
Rysunek 5: Serce zebrafish w 48 hpf. (a) Pojedyncza klatka z płaszczyzny z, widok przednio-brzuszny zebrafish Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) w 48 hpf, obrazowanie za pomocą LSFM, (b) rekonstrukcja 3D stosów filmowych, widok przekroju przez przedsionek. (c) Montaż czterech klatek obejmujących pełny cykl pracy serca na jednej płaszczyźnie z. Wykresy kołowe wskazują czas trwania cyklu pracy serca. Pasek skali 50 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Nagraliśmy bijące serce 48-godzinnych zarodków danio prążkowanego Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) zgodnie z protokołem opisanym powyżej (Rysunek 5). Próbkę oświetlono jednocześnie wiązkami laserowymi o długości fali 488 nm i 561 nm. Emitowaną fluorescencję detektowano prostopadle, wykorzystując obiektyw 16x/0,8 W oraz naukową kamerę metal-oxide semiconductor (sCMOS).

W 48. godzinie po zapłodnieniu (hpf) serce przeszło właśnie proces zapętlania i posiada dwie komory – komorę i przedsionek – ale nie wykształciło jeszcze zastawek. Na naszych nagraniach poszczególne struktury serca, takie jak trakt dopływowy, komora, kanał przedsionkowo-komorowy (AVC), przedsionek oraz trakt odpływowy, są łatwo rozróżnialne (Rysunek 5a,b). Dane te ukazują precyzyjne tętno i ujawniają złożone oddziaływania między dwiema warstwami komórkowymi serca: mięśniem sercowym, jednowarstwową warstwą mięśniową kurczącą się i generującą siłę (Rysunek 5c, kolor czerwony) oraz endokardium, jednowarstwową warstwą komórek łączącą serce z układem naczyniowym (Rysunek 5c, kolor cyjan).

Rekonstrukcja cyklu pracy serca w osiach x,y,z (3D) + czas (4D) + kolor (5D) została wykonana zgodnie z metodą Mickoleit i wsp.6. Rekonstrukcja opiera się na dwóch hipotezach: ruch serca jest powtarzalny, a dane powinny być pozyskiwane z niewielkim krokiem w osi z. Wynikiem jest zrekonstruowany pojedynczy cykl pracy serca w 5D, o rozmiarze od 30 GB do 80 GB na jeden cykl. Do wizualizacji danych wykorzystano darmowe narzędzie open-source FluoRender do renderowania pogłębionego (in depth rendering)31, ponieważ zostało ono zaprojektowane do obsługi wielowymiarowych zbiorów danych i umożliwia łatwe renderowanie filmów 5D zarówno dla całych warstw komórkowych, jak i poszczególnych warstw (Rycina 5b).

Dyskusja

Linie transgeniczne do obrazowania serca

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, naczynia zebrafish, analiza rozwoju naczyniowego, GFP, dsRed.
Rysunek 6: Porównanie transgenicznych linii zebrafish z markerem cytoplazmatycznym i błonowym. Widok przednio-brzuszny serc zebrafish po 48 hpf obrazowany za pomocą LSFM. Białe strzałki wskazują struktury widoczne tylko w transgenicznej linii z markerem błonowym. (a) Sygnał Tg(kdrl:EGFP)32 w kolorze cyjan w sercu oraz (a') w komorze. (b) Sygnał Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed)33 w kolorze czerwonym w sercu oraz (b') w komorze. (c,c') Nałożenie sygnałów Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) oraz Tg(kdrl:EGFP). Pasek skali 50 µm. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Obrazowanie serca danio pręgowanego wymaga precyzyjnego znakowania komórek serca. Podczas gdy grubość mięśnia sercowego jest stosunkowo stała we wszystkich komórkach, komórki śródbłonka serca są grube wokół jądra, ale posiadają cienkie wypustki błonowe, które w niektórych obszarach mają grubość mniejszą niż 2 µm. Cytoplazmatyczne linie transgeniczne, takie jak Tg(kdrl:EGFP)32, skutecznie znakują obszary wokół jąder komórek śródbłonka, jednak w miejscach oddalonych cienka cytoplazma może nie emitować wystarczającej liczby fotonów, aby zostać wykrytą przy tak krótkich czasach ekspozycji, co prowadzi do powstawania sztucznych przerw w danych (Rysunek 6a). W przeciwieństwie do nich, linie transgeniczne z markerem błonowym, takie jak Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33, mogą skutecznie znakować śródbłonek serca i ujawniać więcej szczegółów (Rysunek 6b,c). Dla każdego eksperymentu należy starannie dobrać najbardziej odpowiednią linię transgeniczną.

Immobilizacja danio pręgowanego
Wybór techniki immobilizacji zależy od czasu trwania eksperymentu oraz wieku ryb poddawanych obrazowaniu. Do immobilizacji danio pręgowanego powszechnie stosowano trikainę, głównie ze względu na łatwość jej użycia. W rzeczywistości proste dodanie 130 mg/L trikainy do medium hodowlanego prowadzi do znieczulenia ryb w ciągu 10 min. Ponieważ może to prowadzić do wad rozwojowych i wpływać na fizjologię serca20,22, zalecamy stosowanie trikainy wyłącznie w krótkich eksperymentach (trwających mniej niż 30 min). W przypadku dłuższego obrazowania, iniekcje mRNA α-bungarotoksyny w stadium jednej lub dwóch komórek paraliżują ryby do 3 dni po zapłodnieniu (dpf), nie wpływając na rozwój ani fizjologię układu sercowo-naczyniowego22.

Wybór odpowiednich rurek FEP
Rurki FEP są dostępne w różnych średnicach i grubościach. Do obrazowania ryb w wieku 0-5 dpf odpowiednia średnica wewnętrzna to 0,8 mm; należy wybrać rurki o grubych ściankach 0,8 x 1,6 mm lub rurki o cienkich ściankach 0,8 x 1,2 mm. Zalecamy stosowanie rurek cienkościennych, jednak grubsze ścianki zapewniają większą stabilność i sztywność, co może być istotne, jeśli w komorze z próbką znajduje się przepływające medium, które mogłoby zaburzyć pozycję lub przemieścić cienką rurkę. W przypadku większych próbek można zastosować rurki o wymiarach 1,6 x 2,4 mm oraz 2 x 3 mm.

Temperatura i wymiana gazowa
Kluczowym aspektem dobrostanu zarodka danio pręgowanego jest temperatura. Podczas obrazowania należy idealnie utrzymywać temperaturę 28,5 °C, ponieważ temperatura otoczenia wpływa na rozwój i częstość akcji serca34.

Z naszego doświadczenia wynika, że wymiana tlenu poprzez 2% zagłuskę agarową zapewnia stabilną częstotliwośćy bicia serca jedynie do 3–4 dpf. Dlatego wykonanie otworów w rurce zapewnia dyfuzję tlenu. Może to być również konieczne w przypadku chęci podania leku do próbki.

Zatrzymanie akcji serca.
Szybkie prędkości akwizycji odpowiednio wyposażonych mikroskopów arkusza światła umożliwiają rejestrację bijącego serca in vivo. Aby jednak uzyskać niezakłócony stos obrazów z-stack, można spowolnić lub zatrzymać pracę serca. Należy jednak pamiętać, że zatrzymanie akcji serca prowadzi do rozluźnienia mięśnia sercowego i może spowodować zapadnięcie się serca6. Zatrzymanie akcji serca można przeprowadzić z wykorzystaniem morfolino, niskich temperatur, inhibitora skurczu mięśni lub optogenetyki. Każda z tych metod ma swoje wady i musi zostać starannie oceniona pod kątem każdego eksperymentu.

Wstrzyknięcie 4 ng morfolino silent heart (sih) w stadium jednego komórki może zatrzymać bicie serca poprzez celowanie w gen tnnt2a , który jest kluczowy dla tworzenia sarkomerów35. Rybki zebrafish sih nie mają bicia serca i przeżywają jedynie do 7 dpf, kiedy embriony zaczynają polegać na krążącej krwi w celu natlenienia. Ponieważ morfogeneza serca jest napędzana zarówno przez siły genetyczne, jak i biomechaniczne36, ryby te wykazują malformacje serca około 3 dpf.

Ponieważ przepływ Ca2+ jest wrażliwy na temperaturę, temperatura wpływa na częstość akcji serca u embrionalnych danio pręgowanych21. W konsekwencji obniżenie temperatury w komorze obrazującej spowalnia bicie serca. Zatrzymanie akcji serca wymaga temperatury poniżej 15 °C. Ponieważ danio pręgowane są zazwyczaj utrzymywane w temperaturze 28,5 °C, tak niskie temperatury mogą być utrzymywane jedynie przez krótkie okresy (mniej niż 10 min).

Leki takie jak chemiczne inhibitory skurczów mięśni, np. 2,3-butanodion-2-monoksym (BDM), mogą być dodawane do pożywki dla rybek zebrafish (50 nM37,38) w celu tymczasowego zatrzymania akcji serca. BDM jest wygodny w użyciu, ponieważ zatrzymuje skurcze serca w czasie krótszym niż 15 minut i może zostać wypłukany w celu przywrócenia funkcji serca. Należy jednak zachować ostrożność przy stosowaniu BDM, ponieważ modyfikuje on potencjał czynnościowy serca37.

Wreszcie, serce transgenicznych rybek danio wykazujących ekspresję światłoczułych kanałów jonowych lub pomp, takich jak channelrhodopsin lub halorhodopsin, w mięśniu sercowym może być manipulowane i zatrzymywane poprzez naświetlanie rozrusznika w obrębie drogi dopływowej39,7,40,41,9.

Perspektywy
Przedstawione zoptymalizowane narzędzia i rozwiązania do badania serca danio przebrzuchłego in vivo umożliwiają długoterminowe, delikatne obrazowanie ultraszybkiej dynamiki kardiologicznej. Metoda zatapiania próbek może zostać dostosowana do różnych modalności obrazowania, takich jak mikroskopia konfokalna, mikroskopia dwufotonowa czy optyczna tomografia projekcyjna (OPT). Mikroskopia arkuszem światła jest jednak prawdopodobnie preferowaną techniką, która oferuje sekcjonowanie optyczne z prędkością wystarczającą do uchwycenia dynamiki serca. Chociaż niniejszy protokół koncentruje się na obrazowaniu embrionalnego serca danio przebrzuchłego, uważamy, że można go zastosować również do różnych innych próbek i eksperymentów. Interesujące będzie sprawdzenie w przyszłości, czy podobne techniki zatapiania i obrazowania mogą być stosowane również na późniejszych etapach rozwoju, gdy serce jest bardziej ukryte, a larva mniej przezroczysta.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Madelyn Neufeld za ilustrację na rysunku 2h. Prace te były wspierane przez Towarzystwo Maxa Plancka, Morgridge Institute for Research, Inicjatywę Chana Zuckerberga oraz Human Frontier Science Program (HFSP).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 mlEppendorf Eppendorf22364111Do przenoszenia osadzonych próbek
15 ml probówki FalconFalcon352095Do przenoszenia osadzonych próbek
50 ml probówki wirówkoweFalcon35207050 ml do etapu sonikacji i przechowywania oczyszczonych, wyprostowanych probówek FEP
Strzykawka 50 mlBD309654Strzykawka 50 ml do czyszczenia
FEP Agaroza, niska temperatura żelowaniaSigma Aldrich39346-81-1Do wykonania
igieł z końcówką, rozmiar 21VWR89500-304Igła z końcem do rurki FEP o średnicy wewnętrznej 0,8 średnicy wewnętrznej rurki FEP
McMaster-Carr8729K33Rurka do prostowania rur FEP Średnica zewnętrzna 9,5 mm, średnica wewnętrzna 5,6, długość 30 cm, dostępne inne rozmiary
rurka ze szkła borokrzemianowegoMcMaster-Carr8729K31Rurka do prostowania rur FEP Średnica zewnętrzna 6,35 mm, średnica wewnętrzna 4 mm, długość 30 cm, inne rozmiary dostępne
Igły konwencjonalne, 21 GaugeBD 305165Igła konwencjonalna do rurki FEP o średnicy wewnętrznej 0,8
Jednorazowa szklana pipetaGrainger52NK56Do przenoszenia ryb należy używać z pompką do pipet
E3 podłoże do zarodków danio pręgowanego
EtanolSigma Aldrich64-17-5Etanol do czyszczenia FEP
Rurka FEP, 0,8 / 1,2 mmRurka ProLiquid2001048FEP z cienką ścianką, dostępne inne rozmiary
Rurka FEP, 0,8 / 1,6 mmBolaS1815-04Rurka FEP o grubych ściankach, dostępne inne rozmiary
Rurka FEP, 2/3mmBGB211581Duża rura FEP o grubych ściankach, dostępne inne rozmiary
Guma do gorącej ręki RękawicaCole-Parmer691000Do przenoszenia gorącego sprzętu po autoklawowaniu
Strzykawki Omnifix 1mLB Strzykawka Braun9161406V1ml do zatapiania
szalki Petriego, małaDot ScientificPD-94050Do produkcji korka agarozowego
Pompy do pipetArgos Technologies04395-05Do przenoszenia ryb należy używać jednorazowej szklanej pipety
PTUSigma Aldrich103-85-5Znany również jako:
N-fenylotiomocznik, 1-fenylo-2-tiomocznik, Żyletki fenylotiokarbamidowe
Azpack11904325Do cięcia rur FEP
Wodorotlenek soduDot ScientificDSS24000NaOH do czyszczenia FEP
TricaineSigma AldrichE10521Znany również jako: MS-222,
3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian etylu, Trikaine

Bibliografia

  1. Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nature Biotechnology. 25 (2), 249-253 (2007).
  2. Jenielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  3. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003(2017).
  4. Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage. Human Frontier Science Program Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
  5. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 566-572 (2011).
  6. Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
  7. Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
  8. Trivedi, V., et al. Dynamic structure and protein expression of the live embryonic heart captured by 2-photon light sheet microscopy and retrospective registration. Biomed Optics Express. 6 (6), 2056-2066 (2015).
  9. Weber, M., et al. Cell-accurate optical mapping across the entire developing heart. eLife. Yelon, D. 6, 28307(2017).
  10. Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Medical Weekly. 145, 14227(2015).
  11. Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Science Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
  12. Felker, A., et al. Continuous addition of progenitors forms the cardiac ventricle in zebrafish. Nature Communication. 9 (1), 1-14 (2018).
  13. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), New York, NY. 1007-1009 (2004).
  14. Keller, P. J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Life sciences require the third dimension. Current Opinion in Cell Biology. 18 (1), 117-124 (2006).
  15. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  16. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (84), e51119(2014).
  17. Berndt, F., Shah, G., Power, R. M., Brugués, J., Huisken, J. Dynamic and non-contact 3D sample rotation for microscopy. Nature Communications. 9 (1), 1-7 (2018).
  18. Daetwyler, S., Günther, U., Modes, C. D., Harrington, K., Huisken, J. Multi-sample SPIM image acquisition, processing. and analysis of vascular growth in zebrafish. Development. , 173757(2019).
  19. Keomanee-Dizon, K., Fraser, S. E., Truong, T. V. A versatile, multi-laser twin-microscope system for light-sheet imaging. Review of Scientific Instruments. 91 (5), 053703(2020).
  20. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
  21. Gierten, J., et al. Automated high-throughput heartbeat quantification in medaka and zebrafish embryos under physiological conditions. Science Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
  22. Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved long-term imaging of embryos with genetically encoded α-bungarotoxin. PLOS ONE. 10 (8), 0134005-0134015 (2015).
  23. Taylor, J. M., et al. Adaptive prospective optical gating enables day-long 3D time-lapse imaging of the beating embryonic zebrafish heart. Nature Communication. 10 (1), 1-15 (2019).
  24. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  25. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  26. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).
  27. Cold Spring Harbor. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 66449(2011).
  28. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113(2009).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  31. FluoRender. , Available from: www.fluorender.com (2020).
  32. Jin, S. -W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
  33. Chi, N. C., et al. Foxn4 directly regulates tbx2b expression and atrioventricular canal formation. Genes and Development. 22 (6), 734-739 (2008).
  34. Scott, G. R., Johnston, I. A. Temperature during embryonic development has persistent effects on thermal acclimation capacity in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 14247-14252 (2012).
  35. Sehnert, A. J., et al. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nature Genetics. 31 (1), 106-110 (2002).
  36. Sidhwani, P., Yelon, D. Fluid forces shape the embryonic heart: Insights from zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. Wellik, D. M. 132, Academic Press. Chapter 11 395-416 (2019).
  37. Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
  38. Chow, R. W. -Y., Lamperti, P., Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. following endocardial tissue movements via cell photoconversion in the zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments. (132), e57290(2018).
  39. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proccedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  40. Knollmann, B. C. Pacing lightly: optogenetics gets to the heart. Nature Methods. 7 (11), 889-891 (2010).
  41. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie sercaobrazowanie in vivodynamika sercatechniki zatapianiatransgeniczne danio pr gowaneobrazowanie wysokiej szybko cirozw j sercarendering 3D
Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.