Mysi model in vivo całkowitego znieczulenia dożylnego podczas operacji resekcji raka

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodę modelowania całkowitego znieczulenia dożylnego (TIVA) podczas operacji resekcji raka u myszy. Celem jest odtworzenie kluczowych cech podawania znieczulenia pacjentom z rakiem. Metoda pozwala na zbadanie, jak technika anestezjologiczna wpływa na nawrót nowotworu po operacji resekcji.

Streszczenie

Znieczulenie jest rutynowym elementem opieki onkologicznej, który jest używany do procedur diagnostycznych i terapeutycznych. Technika znieczulania została ostatnio zaangażowana w wpływ na długoterminowe wyniki raka, prawdopodobnie poprzez modulację reakcji adrenergiczno-zapalnych, które wpływają na zachowanie komórek rakowych i funkcję komórek odpornościowych. Pojawiające się dowody sugerują, że całkowite znieczulenie dożylne na bazie propofolu (TIVA) może być korzystne dla długoterminowych wyników leczenia raka w porównaniu z wziewnym znieczuleniem lotnym. Jednak dostępne wyniki kliniczne są niespójne. Badania przedkliniczne, które identyfikują mechanizmy leżące u podstaw tego procesu, są niezwykle potrzebne, aby pokierować projektowaniem badań klinicznych, które przyspieszą uzyskanie wglądu. Większość przedklinicznych modeli znieczulenia została ekstrapolowana na podstawie zastosowania znieczulenia w badaniach in vivo i nie jest optymalnie zaprojektowana do badania wpływu samego znieczulenia jako pierwszorzędowego punktu końcowego. W artykule opisano metodę dostarczania znieczulenia propofol-TIVA w mysim modelu resekcji raka piersi, który odtwarza kluczowe aspekty dostarczania klinicznego u pacjentek z rakiem. Model może być wykorzystany do badania mechanizmów działania znieczulenia na wyniki leczenia nowotworów w różnych typach nowotworów i może być ekstrapolowany na inne nienowotworowe obszary badań przedklinicznych nad anestezjologią.

Wprowadzenie

Ponad 60% pacjentów z rakiem otrzymuje znieczulenie do chirurgicznej resekcji¹. Obecnie nie ma konkretnych wytycznych klinicznych, które określałyby wybór znieczulenia stosowanego u pacjentów z nowotworami. Ankiety przeprowadzone wśród anestezjologów wskazują na preferowanie znieczulenia opartego na lotności, w tym podczas operacji nowotworowych^2,3. Istnieje jednak coraz więcej dowodów na to, że stosowanie całkowitego znieczulenia dożylnego na bazie propofolu (TIVA) podczas operacji raka może wiązać się z poprawą wyników pooperacyjnych (przeżycie wolne od progresji, przeżycie całkowite) w porównaniu ze znieczuleniem lotnym⁴. Kolejne badania kliniczne nadal podają sprzeczne wyniki^5,6,7,8. Odkrycia te potwierdzają potrzebę badań przedklinicznych w celu lepszego zrozumienia mechanistycznego wpływu różnych środków znieczulających na wyniki związane z rakiem.

Jednak w badaniach in vivo, które modelują chirurgię nowotworową, znieczulenie jest często przypadkową częścią procedury. Uzasadnienie wyboru znieczulenia często nie jest przedmiotem projektu eksperymentalnego, a jego wpływ na punkty końcowe związane z rakiem może nie być oceniany. Na przykład w badaniach in vivo, które wymagają podtrzymania znieczulenia do operacji nowotworowych, najczęściej stosuje się wziewne znieczulenie lotne⁹. W przypadku gdy propofol był stosowany w badaniach in vivo, był on podawany w pojedynczym bolusie z podaniem dootrzewnowym, co nie powiela klinicznych protokołów znieczulenia onkologicznego¹⁰. Takie podejście do podawania propofolu indukuje lekkie znieczulenie, które jest odpowiednie do szybkich zabiegów. Nie pozwala jednak na utrzymanie znieczulenia, które jest wymagane do operacji resekcji raka, która może być długotrwała. Ponadto kinetyka wchłaniania po podaniu dootrzewnowym różni się od klinicznych metod podawania.

Model TIVA na bazie propofolu do chirurgii resekcji raka został opracowany w celu zaspokojenia tej potrzeby. Opracowano protokół ciągłego utrzymywania znieczulenia z miareczkowaniem środka znieczulającego w celu umożliwienia odpowiedzi na bodziec chirurgiczny w celu odtworzenia kluczowych aspektów podawania środka znieczulającego pacjentom poddawanym operacji onkologicznej. Uzyskany protokół jest stosowany z mysim modelem raka w celu zapewnienia TIVA podczas operacji resekcji raka. Oceniany jest wpływ na krótko- i długoterminowe wyniki związane z rakiem.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Monash. W tym badaniu wykorzystano samice myszy Balb/c w wieku 6-8 tygodni.

1. Przygotuj komórki rakowe

1. Hodowla komórek nowotworowych w pożywce. Hodowla 66cl4 mysich komórek raka sutka w alfa-MEM zawierających 10% FBS i 200 mM glutaminy. Komórki powinny być ujemne dla mykoplazmy. OPCJONALNIE: Użyj komórek, które są stabilnie transdukowane w celu ekspresji lucyferazy świetlika do obrazowania bioluminescencyjnego, aby umożliwić monitorowanie nawrotu raka po operacji resekcji¹¹ (patrz krok 4).
   UWAGA: W tym badaniu wykorzystano linię komórkową i pożywkę wymienione powyżej.
2. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Komórki przechodzą aseptycznie w kapturze przy <80% zbiegu. Użyj komórek o niskim pasażu w logarytmicznej fazie wzrostu, aby uzyskać optymalne wyniki in vivo.
3. Podnieś przylegające komórki za pomocą 0,5 mg/ml trypsyny w PBS z 10 mM EDTA; 2 ml dla kolby T75. Po podniesieniu dodaj pożywkę, aby dezaktywować trypsynę i umyj komórki w PBS.
4. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć komórki w PBS do wstrzykiwań. W przypadku 66cl4 komórek raka sutka wstrzyknij 1 x 10⁵ komórek w 20 μl PBS na mysz.
5. Przed wstrzyknięciem umieścić komórki na lodzie.

2. Wygeneruj mysi model raka piersi

1. Użyj 4% izofluranu do znieczulenia myszy w komorze indukcyjnej. Następnie utrzymuj znieczulenie 2%-3% izofluranem za pomocą stożka nosowego. Potwierdź prawidłowe znieczulenie przez brak reakcji na uszczypnięcie palca.
2. Przygotować miejsce wstrzyknięcia, wycierając czwarty lewy obszar poduszeczki sutkowej za pomocą jednorazowego wacika nasączonego alkoholem.
3. Pobrać komórki nowotworowe (patrz krok 1.4) do strzykawki Hamiltona o pojemności 25 μl przymocowanej do sterylnej igły podskórnej o pojemności 27 G.
4. Wstrzyknij komórki do czwartej lewej poduszeczki sutkowej. Użyj kleszczy, aby zabezpieczyć i podnieść skórę. Wstrzyknąć około 1 mm od smoczka.
5. OPCJONALNIE: Jeśli komórki są znakowane lucyferazy, potwierdź udane wstrzyknięcie komórek nowotworowych za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Wstrzyknąć 100 μl 150 mg/kg D-lucyferyny do bocznej żyły ogonowej znieczulonych myszy za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml z igłą podskórną 30 G.
6. OPCJONALNIE: Umieść mysz w systemie obrazowania bioluminescencyjnego z podkładką sutkową skierowaną do góry. Odczekaj 2 minuty od wstrzyknięcia lucyferyny, aby uzyskać optymalny wychwyt lucyferyny w tkankach, a następnie obrazuj przez 10 sekund.
7. Umieść mysz w czystej klatce i pozwól jej dojść do siebie po znieczuleniu.
8. Dalsze monitorowanie dobrostanu zwierząt zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi dotyczącymi zwierząt.

3. Wywołanie stabilnego znieczulenia za pomocą dożylnego podania propofolu

1. Monitoruj wzrost guza pierwotnego za pomocą pomiaru suwmiarkowego i oblicz objętość guza za pomocą równania: Objętość (mm³) = (długość x (szerokość)² ÷ 2).
2. Wykonaj operację resekcji guza na myszach, gdy guz pierwotny osiągnie wymaganą objętość (tutaj 80-90 mm³).
3. Skonfiguruj automatyczną pompę strzykawkową ze strzykawką insulinową o pojemności 30 g i pojemności 1 ml zawierającą preparat propofolu (2% Lipuro propofolu) (Rysunek 1A).
4. Wywołać znieczulenie myszy w komorze indukcyjnej z 3% sewofluranem lub izofluranem.
   UWAGA: W tym przypadku zastosowano sewofluran, ponieważ jest to dominujący lotny składnik substancji czynnej stosowany klinicznie.
5. Przenieś mysz do poduszki grzewczej o temperaturze 37 °C na czas zabiegu. Krótko utrzymuj znieczulenie za pomocą 2%-3% sewofluranu za pomocą stożka nosowego.
6. Nałóż wodny lubrykant na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
7. Wstrzyknąć podskórnie 0,05 mg/kg buprenorfiny w celu znieczulenia.
8. Aby przygotować się do zabiegu, należy ogolić brzuch i przygotować skórę do zabiegu roztworem jodu i powidonu. Przetrzyj skórę chusteczką nasączoną alkoholem lub sterylną chusteczką.
9. Aby dostarczyć TIVA na bazie propofolu, należy kanniulować boczną żyłę ogonową za pomocą sterylnej igły podskórnej 30 G przymocowanej do sterylnego cewnika poliuretanowego. Potwierdź prawidłowe umieszczenie przez cofnięcie się krwi do cewnika (Rysunek 1B). Dostosuj podawanie sewofluranu zgodnie z wymaganiami podczas kaniulacji dożylnej, aby utrzymać stabilną głębokość znieczulenia, co objawia się utratą odruchu rogówki i pedałowania oraz częstością oddechów < 100 oddechów na minutę.
10. Podanie propofolu-TIVA należy rozpocząć od podania 2% propofolu w bolusie początkowym 27 mg/kg mc. przez ponad 1 minutę. Należy przerwać podawanie sewofluranu.
11. Kontynuuj infuzję propofolu z szybkością podtrzymującą 2,2-4,0 mg/kg/min, aby utrzymać stabilną głębokość znieczulenia przez cały czas trwania zabiegu (Rycina 1C).

4. Wyciąć guz pierwotny

1. Wykonaj proste 1 cm nacięcie poniżej guza w okolicy lewej czwartej poduszeczki sutkowej. Ostrożnie wyciąć guz i lewy pachwinowy węzeł chłonny, przeprowadzając sekcję kleszczami.
2. OPCJONALNIE: Jeśli używasz komórek nowotworowych znakowanych lucyferazy, użyj obrazowania bioluminescencyjnego, aby potwierdzić wyraźne marginesy chirurgiczne. Wstrzyknąć 150 mg/kg D-lucyferyny do bocznej żyły ogonowej, odczekać 2 minuty, a następnie obrazować przez 60 s za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego. Jeśli zostanie zidentyfikowany resztkowy guz, wyciąć dodatkową tkankę z poduszeczki tłuszczowej sutka i ponownie wykonać obraz, aby uzyskać wyraźne marginesy.
3. Zapewnij hemostazę w miejscu operacji i zamknij skórę za pomocą nylonowych szwów 5-0. Upewnij się, że futro nie dostanie się do miejsca operacji.
4. Po zakończeniu operacji resekcji należy przerwać znieczulenie. Umieść mysz w czystej klatce na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C i pozwól jej dojść do siebie po znieczuleniu.
5. Monitoruj co 15 minut po znieczuleniu, aż mysz powróci do normalnej czujności. Następnie monitoruj mysz co 12 godzin przez 48 godzin po zabiegu.
6. Podawać 0,05 mg/kg buprenorfiny podskórnie co 12 godzin przez 48 godzin po zabiegu.
7. Po 7-10 dniach zdejmij szwy za pomocą sterylnych zakrzywionych obcinaków do ściegów w krótkim znieczuleniu sewofluranem lub izofluranem.

5. Śledzenie nawrotów raka za pomocą obrazowania in vivo

1. Użyj obrazowania bioluminescencyjnego, aby nieinwazyjnie śledzić nawroty raka po operacji resekcji. Użyj systemu obrazowania bioluminescencyjnego, aby monitorować myszy raz w tygodniu pod kątem dowodów na nawroty guza pierwotnego lub nawrót odległy, począwszy od tygodnia po operacji.
2. Wywołać znieczulenie myszy w komorze indukcyjnej z 4% izofluranem. Następnie przenieś mysz do poduszki grzewczej o temperaturze 37 °C na czas znieczulenia i utrzymuj znieczulenie za pomocą 2%-4% izofluranu za pomocą stożka nosowego.
3. Nałóż wodny lubrykant na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
4. Wstrzyknąć D-lucyferynę w dawce 150 mg/kg do żyły ogonowej bocznej. Odczekaj 2 minuty, a następnie zmierz bioluminescencję w ciągu 60 sekund ekspozycji, aby wykryć nawrót guza pierwotnego lub przerzuty odległe.
5. Jeśli guz pierwotny nawróci i stanie się wyczuwalny, rozpocznij monitorowanie wzrostu guza za pomocą pomiarów suwmiarkowych.
6. Pod koniec eksperymentu humanitarnie zabij myszy zgodnie z zatwierdzonym protokołem. W tym przypadku zastosowano CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.

Wyniki

Niniejsza metoda opisuje model całkowitego znieczulenia dożylnego (TIVA) z użyciem propofolu podczas operacji resekcji nowotworu u myszy. Propofol jest podawany w tym modelu mysim poprzez cewnik dożylny przy użyciu pompy strzykawkowej (Rycina 1A,B), aby odtworzyć sposób podawania TIVA w warunkach klinicznych znieczulenia podczas operacji onkologicznych. Zastosowanie pompy strzykawkowej minimalizuje ekspozycję na anestetyki lotne, umożliwiając szybkie przejście z początkowej ...

Dyskusja

Badanie to przedstawia protokół podawania całkowitego znieczulenia dożylnego (TIVA) z propofolem w mysim modelu raka piersi, który powiela kluczowe aspekty praktyki klinicznej w przypadku TIVA u pacjentów wymagających operacji raka. Protokół umożliwia badanie zarówno krótkoterminowych, jak i długoterminowych klinicznie istotnych wyników po operacji raka w mysim modelu progresji raka, w tym pomiar poziomu cytokin i nawrotu raka (ryc. 2 i ryc. 3). Metodologia ta b...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,9% sól fizjologiczna	Fresnius Kabi	AUST R 197198
Kleszcze tętnicze	Proscitech	TS1322-140
Buprenorfina	Temgesic	TEMG I
Podgrzewana mata chirurgiczna	Niestandardowa
igła podskórna (strzykawka insulinowa 30 G, 1 ml)	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer
Luciferin	Promega	P1041/2/3
Cewnik poliuretanowy	Intramedic	427401
Powidon Jod	Betadine	AUST R 29562
Propofol Lipuro, 2%	Braun	3521490
Sevoflurane	Baxter	ANZ2L9117
Parownik Sevoflurane	Vetquip	VQ1334
Sterylna gaza	Multigate Medical Products	11-600A
Nożyczki chirurgiczne	Proscitech	TS1044
Szwy, 5-0 nylon	Dynek	V504
Pompa strzykawkowa	Aparat Harvard	70-4500
Strzykawki (1 mL)	Terumo	SS+01T

126274