Artykuł metodologiczny

Skuteczny mysi model jednostronnego uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego nerek

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62749

⸱

15 lipca 2021

 ,  ,  , 
1Department of Veterinary Biomedical Sciences, Long Island University College of Veterinary Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne nerek wiąże się z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością u hospitalizowanych pacjentów. W tym miejscu przedstawiamy prosty i skuteczny mysi model jednostronnego uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego nerek i zapewniamy sekwencyjny przegląd reprezentatywnych zmian patologicznych obserwowanych w nerkach.

Streszczenie

Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI) jest główną przyczyną ostrej niewydolności nerek i znacząco przyczynia się do opóźnionej funkcji przeszczepu. Modele zwierzęce są jedynymi dostępnymi zasobami, które naśladują złożoność uszkodzeń związanych z IRI napotkanych in vivo. W artykule opisano skuteczny mysi model jednostronnego IRI nerki, który dostarcza wysoce powtarzalnych danych. Niedokrwienie jest wywoływane przez zamknięcie prawej szypułki nerki na 30 minut, a następnie reperfuzję. Oprócz zabiegu chirurgicznego, sekwencyjny przegląd oczekiwanych zmian fizjologicznych i histopatologicznych po IRI nerki zostanie dostarczony poprzez porównanie danych z siedmiu różnych czasów reperfuzji (4 godziny, 8 godzin, 16 godzin, 1 dzień, 2 dni, 4 dni i 7 dni). Udostępnione zostaną dane o krytycznym znaczeniu dla planowania eksperymentów z wyprzedzeniem, takie jak średni czas operacji, średnie zużycie środka znieczulającego i zmiany masy ciała w czasie. Prace te pomogą naukowcom wdrożyć wiarygodny model IRI nerki i wybrać odpowiedni czas reperfuzji, który będzie zgodny z zamierzonymi celami badawczymi.

Wprowadzenie

Nerki należą do najwyższych perfuzji organów w ciele i są niezwykle podatne na zmiany w perfuzji krwi1. Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne nerek (IRI) pozostaje główną przyczyną ostrej niewydolności nerek2,3 i wiąże się z wysoką zachorowalnością i wysoką śmiertelnością u hospitalizowanych pacjentów4. Przy ograniczonych dostępnych opcjach terapeutycznych,4,5 IRI nerek jest obecnie przedmiotem kilku wysiłków badawczych w biomedycynie6,7 mających na celu opracowanie nowych celów terapeutycznych oraz scharakteryzowanie wczesnych i czułych markerów uszkodzenia nerek8,9,10. Uważa się, że znalezienie wiarygodnego, efektywnego czasowo i kosztowo modelu zwierzęcego jest niezbędne do zaspokojenia tych potrzeb. W pracy przedstawiono prosty i skuteczny mysi model jednostronnego nerkowego IRI. Niedokrwienie jest wywoływane przez zaciśnięcie prawej szypułki nerki przez 30 min11,12. Kluczową częścią tego modelu jest wybór najbardziej odpowiedniego czasu reperfuzji, który odtworzy interesujące nas zdarzenia patologiczne, takie jak martwica kanalików, wielojądrzaste nacieki komórek zapalnych lub zwłóknienie. W związku z tym badacze mają do dyspozycji sekwencyjny przegląd reprezentatywnych zmian patologicznych oczekiwanych w nerce IRI.

Protokół

Następujący protokół opisuje operację przetrwania. W związku z tym stosowana jest najwyższa praktyka aseptyczna i chirurgiczna. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania. Aby wyeliminować różnice w efektach IRI związane z płcią i szczepem, w badaniu wykorzystano tylko samce myszy C57BL6. Wszystkie zwierzęta zostały dopasowane pod względem wieku i wagi, aby uzyskać porównywalne wyniki.

1. Przygotowanie

UWAGA: Oś czasu różnych faz eksperymentalnych i interwencji jest pokazana w Rysunek 1A.

  1. Wyczyść i zdezynfekuj stół operacyjny przed każdym zabiegiem. Przygotuj i umieść wszystkie wymagane materiały (wysterylizowane narzędzia i waciki, sterylną gazę i serwety, wstępnie rozcieńczone środki znieczulające, poduszkę grzewczą, wysterylizowany zacisk naczyniowy, sterylny roztwór soli fizjologicznej oraz środki antyseptyczne i szwy do skóry) na stole operacyjnym (patrz Tabela materiałów).
  2. Znieczulić samce myszy C57BL6 (przedział wiekowy 11-13 tygodni) przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (odpowiednio 100 mg/kg i 20 mg/kg masy ciała, uprzednio rozcieńczonych w sterylnym roztworze soli fizjologicznej).
    UWAGA: Umiejętne obchodzenie się ze zwierzętami jest niezbędne, aby zminimalizować stres dla zwierzęcia, ponieważ reakcje na stres mogą negatywnie wpływać na działanie środków znieczulających.
  3. Po podaniu ketaminy/ksylazyny należy ogolić obszar chirurgiczny na prawym boku za pomocą żyletki i mydła.
    UWAGA: Golenie skóry poprawia gojenie się ran, a także ogólne wyniki operacji przetrwania.
  4. Zdezynfekuj skórę w obszarze operacyjnym najpierw 70% alkoholem, a następnie roztworem jodu powidonu za pomocą bawełnianego wacika.
  5. Po przygotowaniu skóry umieść mysz na stole grzewczym w brzusznej pozycji odleżynowej i ustabilizuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C (monitorowaną za pomocą sond czujnikowych doodbytniczych i elektrodowych).
    UWAGA: Nerki są łatwiej dostępne i chirurgicznie odsłonięte, gdy są umieszczone w brzusznym odleżynie, a nie bocznym.
  6. Gdy temperatura ciała się ustabilizuje, nałóż maść na oczy myszy.
    UWAGA: Dysocjacyjne środki znieczulające, takie jak ketamina, powodują, że oczy zwierzęcia pozostają otwarte podczas znieczulenia.

2. Chirurgia

  1. Gdy odruchy bólowe znikną (szczypanie palca u nogi pęsetą) należy wykonać około 1 cm grzbietowo-boczne nacięcie chirurgiczne na prawym boku za pomocą ostrza skalpela. Rozpocznij nacięcie za ostatnim żebrem i kontynuuj doogonowo około 1 cm równolegle do linii środkowej odcinka lędźwiowego.
  2. Przeciąć mięśnie brzucha za pomocą nożyczek, aby uwidocznić przestrzeń zaotrzewnową. Usuń niewielkie ilości krwi wytworzonej podczas cięcia mięśni za pomocą sterylnych wacików.
    UWAGA: Ponieważ stosuje się dostęp grzbietowo-boczny, ta procedura uzyskuje dostęp do przestrzeni zaotrzewnowej, a nie do jamy otrzewnej.
  3. Wypchnij prawą nerkę z jamy brzusznej. Użyj kleszczyków Graefe, aby ostrożnie odsłonić nerkę.
    UWAGA: Zawsze trzymaj kleszcze zamknięte, aby uniknąć urazowego uszkodzenia nerki po umieszczeniu na brzuchu i używaj ich tylko do ostrożnego pchania i prowadzenia nerki w kierunku nacięcia chirurgicznego i na zewnątrz.
  4. Powoli odsłaniaj prawą nerkę i zidentyfikuj szypułkę nerkową. Ostrożnie usuń tkankę tłuszczową wokół szypułki.
  5. Aby wywołać niedokrwienie, umieść zacisk naczyniowy na tętnicy nerkowej i żyle znajdującej się w szypułce nerki, unikając zaciskania sąsiedniego moczowodu. Użyj hemostatu Halsteda-Mosquito do manipulowania zaciskiem naczyniowym.
    UWAGA: Niedokrwienie potwierdza wizualizacja zmiany koloru nerki z czerwono-różowego na ciemnofioletowy (Ryc. 1B).
  6. Przykryj zaciśniętą nerkę sterylną gazą nasączoną solą fizjologiczną, aby uniknąć wysuszenia i pozostaw na 30 minut.
  7. W tym czasie należy okresowo monitorować głębokość znieczulenia i wilgotność gazy.
    UWAGA: Indukcyjna dawka znieczulenia jest wystarczająca do zapewnienia znieczulenia do końca incydentu niedokrwiennego; W związku z tym nie są wymagane żadne dodatkowe zastrzyki znieczulające.
  8. Na krótko przed końcem okresu niedokrwienia usuń gazę i odsłoń nerkę. Trzymaj hemostat Halsted-Mosquito, gotowy do usunięcia zacisku.
  9. W 30 minucie otwórz zacisk naczyniowy z hemostatem i wyjmij go z szypułki nerki, aby umożliwić reperfuzję nerki.
    UWAGA: Reperfuzję potwierdza wizualizacja zmiany koloru nerki z ciemnofioletowego na czerwono-różowy (Ryc. 1C).
  10. Wykonaj te same procedury, które opisano powyżej dla zwierząt pozorowanych bez zaciskania szypułki nerki.
  11. Po zweryfikowaniu zmiany koloru nerki należy przywrócić nerkę do jamy brzusznej. Zamknij mięśnie brzucha za pomocą wchłanialnego szwu 5-0 za pomocą wzoru krzyżowego.
    UWAGA: Może być konieczne drugie wstrzyknięcie środków znieczulających w celu utrzymania analgezji podczas szycia mięśni i skóry. Połowa dawki początkowej okazała się skuteczna w działaniu przeciwbólowym aż do zakończenia operacji.
  12. Zamknij skórę wchłanialnym szwem 5-0 za pomocą poziomego wzoru materaca. Oczyść ranę roztworem jodu powidonu za pomocą bawełnianego wacika.

3. Rekonwalescencja i po operacji

UWAGA: Ponieważ czas po operacji jest rzeczywistym czasem reperfuzji, właściwa opieka pooperacyjna jest etycznie obowiązkowa i naukowo istotna. Czasy reperfuzji można wybrać zgodnie z wymaganiami badacza. Czasy reperfuzji wynoszące 4 godziny, 8 godzin, 16 godzin, 1 dzień, 2 dni, 4 dni i 7 dni są porównywane w celu uzyskania sekwencyjnego przeglądu zmian patologicznych wywołanych przez IRI nerek.

  1. Trzymaj mysz na poduszce grzewczej, aż zacznie wracać do zdrowia po znieczuleniu.
    UWAGA: Zaleca się poczekać, aż mysz zacznie poruszać nogami i spróbuje się poruszać. W przypadkach, gdy podczas operacji wymagane są dodatkowe zastrzyki znieczulające, czas rekonwalescencji jest dłuższy. Atipamezol, antagonista receptora alfa-2, może być podawany dootrzewnowo w dawce 0,5 mg/kg masy ciała w celu odwrócenia działania ksylazyny i skrócenia fazy rekonwalescencji. W celu leczenia bólu buprenorfina (0,1 mg/kg masy ciała, dootrzewnowa) jest podawana przed operacją i co 6 godzin w fazie rekonwalescencji i po operacji. Odradza się stosowanie niesteroidowych leków przeciwzapalnych, ponieważ kilka leków z tej rodziny wywołuje nefrotoksyczność i dlatego może zmieniać wyniki.
  2. Po wyzdrowieniu ze znieczulenia umieść mysz z powrotem w klatce ze swobodnym dostępem do wody i jedzenia.
    UWAGA: Puree z żywności może być dostarczone na szalkę Petriego, a także materiał do ukrywania i zabawy (np. arkusze papieru, rurki po ręcznikach papierowych).
  3. Monitoruj mysz codziennie, aby ocenić gojenie się ran, spożycie pokarmu i wody, masę ciała i zachowanie.
    UWAGA: Stan gojenia się ran oceniano za pomocą następującej skali: 1, sucha; 2, mokry; 3, częściowo otwarte; 4, otwarty. W tym badaniu udokumentowano szybkie gojenie się ran, z ponad 90% suchych ran po 2 dniu.

4. Eutanazja i pobieranie próbek

  1. Poddaj myszy eutanazji pentobarbitalem sodu podawanemu dootrzewnowo w dawce dwukrotnie większej niż dawka znieczulająca dla myszy (100 mg / kg).
  2. W razie potrzeby pobrać próbki płynów i tkanek.
    UWAGA: Pobrano obie nerki, krew pełną (do morfologii krwi), surowicę (do biochemii krwi), mocz, serce i płuca. Do analizy biochemicznej krwi potrzeba kilku mikrolitrów surowicy (azot mocznikowy (BUN) we krwi, kreatynina, elektrolity). W razie potrzeby, 24 godziny przed eutanazją, myszy można umieścić w klatkach metabolicznych w celu zebrania większej objętości moczu, co pozwala na określenie parametrów funkcji nerek.

Wyniki

Parametry fizjologiczne
Myszy po operacji jednostronnego niedokrwienno-reperfuzyjnego uszkodzenia nerek (IRI) wracały do zdrowia bez powikłań; były aktywne i czujne oraz wykazywały prawidłowy apetyt, pragnienie i zachowanie następnego dnia. U niektórych myszy może wystąpić utrata masy ciała po IRI, choć zazwyczaj wynosi ona mniej niż 10% początkowej masy ciała (Rysunek 2). Większa utrata masy ciała (˃10%) może być szkodliwa, a takie zwierzęta należy wykluczyć z badania. Myszy poddane operacji pozorowanej (sham) nie wykazały zmian masy ciała po zabiegu (pomiar wykonano 24 h po operacji). Większość myszy odzyskała początkową masę ciała między 4. a 7. dniem po operacji (patrz grupa IRI 7-dniowa, Rysunek 2). Funkcję nerek można ocenić za pomocą tradycyjnych markerów, takich jak poziom azotą mocznika we krwi (BUN) i kreatynina. Dodatkowo w analizie uwzględniono poziomy elektrolitów w surowicy (sód, potas i chlorki) oraz automatyczne różnicowanie morfologii krwi.

Zmiany histopatologiczne
Ocenę zmian histopatologicznych przeprowadzono na pełnych przekrojach pośrodkowych nerek utrwalonych w 4% paraformaldehydzie i zatopionych w parafinie, barwionych hematoksyliną i eozyną (HE), kwasem okresowym i reagentem Schiffa (PAS) oraz metodą trichrome Massona. Najbardziej wyraźne zmiany wywołane przez ten jednostronny model niedokrwienno-reperfuzyjnego uszkodzenia (IRI) nerek widoczne są w obrębie przejścia korowo-rdzeniowego, w szczególności w kanalikach proksymalnych, grubych odcinkach wstępujących pętli Henlego i kanalikach krętych dystalnych, a także w śródmiąższu kanalikowym (patrz legenda do Rysunku 3). Obrazy mikroskopowe przedstawiające najbardziej charakterystyczne zmiany po IRI nerek znajdują się na Rysunku 3. Lista następujących po sobie zmian histopatologicznych została przedstawiona w Tabeli 1.

Opracowano system oceny uszkodzeń cewkowych w celu skategoryzowania zmian w czasie (Rycina 4). W systemie tym trzech różnych oceniających analizowało pięć zdefiniowanych zmian: 1) zanik nabłonka cewkowego; 2) utrata rąbka szczoteczkowego; 3) martwica cewkowa; 4) niedrożność światła; oraz 5) obecność złogów białkowych. Przypisanie wartości „1” oznacza obecność zmiany, natomiast „0” oznacza jej brak.

Oś czasu niedokrwienia i reperfuzji u myszy; operacja, regeneracja, pobieranie próbek, wyniki wizualne.
Rycina 1: Eksperymentalny model IRI nerek u myszy. (A) Przedstawiono fazy eksperymentów i interwencji (indukcja znieczulenia, niedokrwienie i reperfuzja). Należy zwrócić uwagę na zmianę koloru prawej nerki na ciemnoczerwoną podczas niedokrwienia (B) oraz na różową podczas reperfuzji (C). (D) Makroskopowy wygląd prawej nerki po IRI (czerwona strzałka) w porównaniu z przeciwległą nerką bez IRI tego samego zwierzęcia 24 h po operacji. Czerwona strzałka w (B) wskazuje miejsce założenia zacisku hemostatycznego. Skrót: IRI = urazy po niedokrwieniu i reperfuzji. Aby wyświetlić tę figurę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.

Wykres zmiany masy ciała po niedokrwieniu, wpływ czasu reperfuzji, wizualizacja danych, analiza badawcza.
Rysunek 2: Masa ciała myszy przed i po renalnym IRI. Przedstawiono dane indywidualne. Skróty: IRI = Ischemia-reperfusion injury; h = godziny; d = dni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Histologia uszkodzenia nerek, przebieg czasowy IRI, obrazy mikroskopowe przedstawiające zmiany w PCT, DCT i kłębuszkach.
Rysunek 3: Typowe zmiany mikroskopowe zaobserwowane w korze i w obszarze połączenia korowo-rdzeniowego u myszy poddanych zabiegowi IR. Przedstawiono grupę sham oraz różne czasy reperfuzji (wskazane nad każdym zdjęciem). (A) Przedstawiono nienaruszone struktury w grupie sham (powiększenie 40x; pasek skali = 20 µm). Strzałki w IRI 4 h wskazują obecność białkowych złogów w świetle kanalików (powiększenie 40x; pasek skali = 20 µm). Strzałki w IRI 8 h pokazują rozszerzenie kanalików (powiększenie 40x; pasek skali = 50 µm). Czarna strzałka w IRI 16 h pokazuje złogi kanalikowe w segmentach rdzeniowych; białe strzałki wskazują obszary nekrozy komórkowej (powiększenie 40x; pasek skali = 50 µm). Czarne strzałki w IRI 1 d wskazują rozszerzenie kanalików (powiększenie 10x; pasek skali = 100 µm). Czarna strzałka w IRI 2 d pokazuje powiększone jądra komórkowe; białe groty strzałek wskazują obszary infiltracji limfocytów i makrofagów (powiększenie 40x; pasek skali = 50 µm). Białe groty strzałek w IRI 4 d wskazują komórki kanalikowe w fazie mitozy (powiększenie 40x; pasek skali = 50 µm). Czarna strzałka w IRI 7 d pokazuje obszar włóknienia ogniskowego; biały grot strzałki wskazuje obszar regeneracji (powiększenie 20x; pasek skali = 100 µm). (B) Barwienie PAS przedstawiające korę nerek myszy podczas wczesnej reperfuzji (4 h, 8 h i 16 h). Zwróć uwagę na postępujące zanikanie rąbka szczoteczkowego (strzałki). Powiększenia 40x; paski skali = 50 µm (C) Barwienie trichromem Massona u myszy sham oraz IRI 7 d, pokazujące obszary włóknienia śródmiąższowego (białe strzałki). Powiększenie 40x; paski skali = 50 µm. Skróty: IRI = uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne; Glo = kłębuszek; PCT = proksymalna kręta kanalikowa; DCT = dystalna kręta kanalikowa; CD = kanalik zbiorczy; PAS = kwas okresowy i Schiff; d = dzień. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres czasu reperfuzji w stosunku do wyniku uszkodzenia kanalikowego; analiza uszkodzenia nerek w czasie po reperfuzji.
Rysunek 4: Wynik uszkodzenia kanalikowego u myszy poddanych operacji pozornej oraz IRI. Skala systemu punktacji od 1 do 5 dla: spłaszczenia nabłonka kanalikowego; utraty rąbka szczoteczkowego; martwicy kanalikowej; niedrożności światła; oraz obecności złogów białkowych. Przypisanie wartości „1” oznacza obecność zmiany, a „0” jej brak. Przedstawiono wartości indywidualne. Słupki reprezentują średnią ± SD (n = 4). Skrót: IRI = ischemia-reperfusion injury (uraz niedokrwienno-reperfuzyjny). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Czas po IRINajistotniejsze zmiany patologiczne
4 hZator kanalików
Walce białkowe w świetle kanalika
8 hRozszerzenie kanalików
Wczesna nekroza
Wstępne spłaszczenie nabłonka
16 hNekroza komórkowa
Walce kanalikowe
Infiltracja neutrofilna
1 dzieńNekroza
Rozszerzenie kanalików
Infiltracja neutrofilna
2 dniRozszerzenie kanalików
Infiltracja limfocytarna i makrofagarna
Powiększone jądra komórkowe
4 dniWyraźna aktywność mitotyczna komórek kanalików
7 dniWłołowate włóknienie
Obszary regeneracji

Tabela 1: Najistotniejsze zmiany patologiczne w czasie. Rozpoznane na podstawie badania mikroskopowego 4–6 zwierząt w grupie.

Dyskusja

Mysie modele IRI nerek są popularne w badaniach biomedycznych ze względu na stosunkowo niskie koszty operacyjne i dostępność różnorodnych modeli transgenicznych12. Przedstawiony tutaj jednostronny model IRI nerki naśladuje charakterystyczne zmiany patologiczne obserwowane w IRI nerek człowieka, takie jak poszerzenie kanalików nerkowych, martwica i zwłóknienie13. Wyniki te opierają się na różnych czasach reperfuzji.

Kluczowe etapy tego protokołu obejmują utrzymanie stałej temperatury ciała i prawidłowe umieszczenie klamry naczyniowej w szypułce nerki. Temperatura ciała wpływa na metabolizm zwierzęcia14, zmieniając wyniki eksperymentalne zarówno na poziomie fizjologicznym, jak i komórkowym15. W tym modelu temperatura ciała była stabilizowana przed operacją za pomocą sond sensorowych doodbytniczych i elektrodowych. Ponadto zaleca się ciągłe monitorowanie temperatury ciała podczas całego zabiegu chirurgicznego, zwłaszcza przed założeniem klamry naczyniowej w celu wywołania niedokrwienia.

Odsłonięcie nerki i prawidłowe umieszczenie zacisku naczyniowego mają również kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Uszkodzenie torebki nerkowej przez niewłaściwe obchodzenie się z kleszczami podczas ekspozycji nerki przez nacięcie chirurgiczne spowoduje krwotok okołonerkowy i stan zapalny. Zacisk naczyniowy należy umieścić na szypułce nerki zamykającej tętnicę nerkową i żyłę nerkową bez wpływu na moczowód i tętnice nadnerczowe. Kluczowe znaczenie dla tego etapu ma staranne wypreparowanie tkanki tłuszczowej otaczającej wnękę nerkową14,16.

Ten model jest ekonomiczny i czasochłonny. Zużycie środka znieczulającego na mysz wynosiło 156,47 ± 37,88 μl (średnia ± SD, n = 17) wstępnie rozcieńczonego koktajlu ketamina/ksylazyna (1:10 ketamina, 1:50 ksylazyna, w soli fizjologicznej; stężenie roztworu podstawowego, 100 mg/ml oba). Zabieg chirurgiczny można wykonać w stosunkowo krótkim czasie. Całkowity czas operacji na mysz wynosił 53 ± 5,23 min (średnia ± SD, n = 17). Dzięki przeszkolonemu personelowi można wykonać kilka operacji w tym samym czasie. W naszej grupie jeden doświadczony badacz wykonywał operację do momentu uwolnienia klamry z szypułki nerki, podczas gdy drugi przejął kontrolę nad zamknięciem rany do momentu wyzdrowienia myszy. Dzięki takiemu podejściu byliśmy w stanie wykonać dużą liczbę operacji w ciągu jednego dnia. W tym modelu zastosowaliśmy dostęp grzbietowo-boczny, który skutkuje mniejszym urazem oraz zmniejszoną utratą płynów i ciepła z jamy brzusznej w porównaniu z podejściem w linii środkowej16.

Wcześniej opublikowane protokoły opisywały technikę zaciskania szypułki nerek w celu wywołania ostrego uszkodzenia nerek u myszy 17,18,19. Jednak w tych badaniach oprócz jednostronnego IRI wykonano nefrektomię przeciwstronną z czasem niedokrwienia od 15 do 26 minut. W tym protokole wywołaliśmy jednostronne niedokrwienie przez 30 minut, zachowując przeciwległą nerkę. Spowodowało to przeżycie na poziomie 100%. Jednak model ten nie nadaje się do indukowania azotemicznego uszkodzenia nerek, częściowo ze względu na efekt kompensacyjny wywierany przez nieinterwencję chirurgiczną przeciwległą nerkę. Jednak utrzymanie jednej nerki w stanie nieuszkodzonym u tego samego zwierzęcia ma tę zaletę, że wydłuża się czas niedokrwienia i zapewnia wyższy wskaźnik przeżycia. Oprócz tego nerka przeciwległa może być wykorzystana do oceny możliwych skutków ubocznych badanych leków lub terapii stosowanych podczas procedury eksperymentalnej oraz do badania efektów przesłuchów nerkowo-nerkowych 20,21. Na przykład, model ten okazał się przydatny w wykazaniu zmian wywołanych przez reaktywne formy tlenu na poziomie komórkowym zarówno w IRI, jak i w przeciwległej, niechirurgicznie interwencyjnej nerce11.

Model ten ma potencjalne zastosowanie w badaniach mających na celu identyfikację i scharakteryzowanie markerów jednostronnego uszkodzenia nerek, efektów przesłuchów nerkowych, zmian hemodynamicznych wywołanych IRI po nerkach oraz potencjalnych nefrotoksycznych skutków kandydatów na leki, które mają być stosowane w IRI nerek. Ten szczegółowy opis głównych zmian patologicznych służy jako cenne narzędzie do wyboru najbardziej odpowiedniego czasu na badanie określonych procesów komórkowych, od zapalenia i martwicy (4 godziny do 2 dni) po regenerację (4 dni) i zwłóknienie (7 dni i później).

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że w związku z tym artykułem nie występują konflikty interesów.

Podziękowania

Część pracy pokazanej w tym artykule została założona przez Centrum Integracyjnych Badań nad Ssakami Ross University School of Veterinary Medicine (RUSVM), Saint Kitts i Nevis. Bardzo doceniamy pomoc finansową udzieloną przez Wydział Weterynaryjnych Nauk Biomedycznych Long Island University College of Veterinary Medicine.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorowodorek atipamezoluPenn Veterinary Supply, Inc., PA, USAPVS87005 mg/ml
BuprenorfinaPenn Veterinary Supply, Inc., PA, USAPRMBURPEN220,3 mg/ml
Komercyjne rozwiązanie do eutanazjiróżni dostawcynp. Euthasol Virbac (pentobarbital sodu 390 mg / ml + fenytoina sodu 50 mg / ml)
Maść do oczu PuralubeDechra Produkty weterynaryjne, KS, USAna3.5 g (1/8 uncji)
Poduszka grzewcza RightTempJrKent Scientific, CT, USA  RT-JR-20Rozważ ten z dwiema sondami temperatury
Chlorowodorek ketaminyPenn Veterinary Supply, Inc., PA, USAVED1220100 mg / ml
S& T Zacisk naczyniowyFine Science Tools, Inc., Niemcy00398-02Wymiary szczęk: 5,5 x 1,5 mm; długość: 11 mm
Sterylne jednorazowe serwety na ręczniki Kent Scientific, CT, USA SURGI-5023-3 Jednorazowe, pakowane pojedynczo
Narzędzia chirurgiczne (kleszcze Graefe, hemostat Halsted-Mosquito, nożyczki itp.)Fine Science Tools, Inc., NiemcyRóżneWeź pod uwagę bardzo cienkie proste nożyczki i kątowe kleszcze Graefe
Szew Vicryl EthiconUS, LLCJ493GRozmiar 5-0
Chlorowodorek ksylazynyPenn Veterinary Supply, Inc., PA, USAVAM4821100 mg / ml

Bibliografia

  1. Ray, S. C., Mason, J., O'Connor, P. M. Ischemic renal injury: can renal anatomy and associated vascular congestion explain why the medulla and not the cortex is where the trouble starts. Seminars in Nephrology. 39 (6), 520-529 (2019).
  2. Weight, S. C., Bell, P. R., Nicholson, M. L. Renal ischaemia--reperfusion injury. The British Journal of Surgery. 83 (2), 162-170 (1996).
  3. Ratliff, B. B., Abdulmahdi, W., Pawar, R., Wolin, M. S. Oxidant mechanisms in renal injury and disease. Antioxidants & Redox Signaling. 25 (3), 119-146 (2016).
  4. Schrier, R. W., Wang, W., Poole, B., Mitra, A. Acute renal failure: definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy. The Journal of Clinical Investigation. 114 (1), 5-14 (2004).
  5. Fernández, A. R., Sánchez-Tarjuelo, R., Cravedi, P., Ochando, J., López-Hoyos, M. Review: Ischemia reperfusion injury-a translational perspective in organ transplantation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8549(2020).
  6. Wu, C. -L., et al. Tubular peroxiredoxin 3 as a predictor of renal recovery from acute tubular necrosis in patients with chronic kidney disease. Scientific Reports. 7 (1), 43589(2017).
  7. Nishida, K., et al. Systemic and sustained thioredoxin analogue prevents acute kidney injury and its-associated distant organ damage in renal ischemia reperfusion injury mice. Scientific Reports. 10 (1), 20635(2020).
  8. Mishra, J., et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a biomarker for acute renal injury after cardiac surgery. Lancet. 365 (9466), 1231-1238 (2005).
  9. Han, W. K., Bailly, V., Abichandani, R., Thadhani, R., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 (KIM-1): A novel biomarker for human renal proximal tubule injury. Kidney International. 62 (1), 237-244 (2002).
  10. Coca, S. G. Kidney injury biomarkers with clinical utility: has Godot finally arrived. American Journal of Nephrology. 50 (5), 357-360 (2019).
  11. Godoy, J. R., et al. Segment-specific overexpression of redoxins after renal ischemia and reperfusion: protective roles of glutaredoxin 2, peroxiredoxin 3, and peroxiredoxin 6. Free Radical Biology & Medicine. 51 (2), 552-561 (2011).
  12. Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (11), 1487-1494 (2012).
  13. Gaut, J. P., Liapis, H. Acute kidney injury pathology and pathophysiology: a retrospective review. Clinical Kidney Journal. 14 (2), 526-536 (2021).
  14. Le Clef, N., Verhulst, A., D'Haese, P. C., Vervaet, B. A. Unilateral renal ischemia-reperfusion as a robust model for acute to chronic kidney injury in mice. PLoS One. 11 (3), 0152153(2016).
  15. Pelkey, T. J., et al. Minimal physiologic temperature variations during renal ischemia alter functional and morphologic outcome. Journal of Vascular Surgery. 15 (4), 619-625 (1992).
  16. Kennedy, S. E., Erlich, J. H. Murine renal ischaemia-reperfusion injury. Nephrology. 13 (5), 390-396 (2008).
  17. Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (78), e50495(2013).
  18. Hesketh, E. E., et al. Renal ischaemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51816(2014).
  19. Wei, J., et al. New mouse model of chronic kidney disease transitioned from ischemic acute kidney injury. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 286-295 (2019).
  20. Basile, D. P., Leonard, E. C., Tonade, D., Friedrich, J. L., Goenka, S. Distinct effects on long-term function of injured and contralateral kidneys following unilateral renal ischemia-reperfusion. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 302 (5), 625-635 (2012).
  21. Polichnowski, A. J., et al. Pathophysiology of unilateral ischemia-reperfusion injury: importance of renal counterbalance and implications for the AKI-CKD transition. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (5), 1086-1099 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ostra niewydolno nerekniedro no pie ka nerkowegojednostronne niedokrwienie i reperfuzja nerekuszkodzenie kanalikowezmiany histopatologicznezacisk naczyniowyw knienie nerek

Powiązane artykuły