Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja lizatu bezkomórkowego

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62753

⸱

29 października 2021

 ,  ,  , 
1Biocircuits Institute, University of California, San Diego, 2Present address, Kyoto Institute of Technology, 3Present address, Vertex Pharmaceuticals, 4Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 5Molecular Biology Section, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje szybką i prostą metodę produkcji lizatu bakteryjnego do ekspresji genów bez komórek, przy użyciu zmodyfikowanego szczepu Escherichia coli i wymagającego jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Streszczenie

Ekspresja genów bez komórek oferuje moc biologii bez komplikacji żywego organizmu. Chociaż istnieje wiele takich systemów ekspresji genów, większość z nich jest dość droga w zakupie i/lub wymaga specjalnego sprzętu i precyzyjnie dopracowanej wiedzy, aby skutecznie produkować. Protokół ten opisuje metodę wytwarzania lizatu bezkomórkowego bakterii, który obsługuje wysoki poziom ekspresji genów, przy użyciu wyłącznie standardowego sprzętu laboratoryjnego i wymaga minimalnego przetwarzania. W metodzie wykorzystuje się szczep Escherichia coli wytwarzający endolizynę, która nie wpływa na wzrost, ale która skutecznie lizuje zebrane osady komórkowe po prostym cyklu zamrażania i rozmrażania. Jedynym wymaganym dalszym przetwarzaniem jest krótka inkubacja, po której następuje wirowanie w celu oczyszczenia autolizatu z resztek komórkowych. Dynamiczne obwody genowe można osiągnąć poprzez heterologiczną ekspresję proteazy ClpX w komórkach przed pobraniem. Szczep E. coli pozbawiony genu lacZ może być wykorzystany do zastosowań biosensorycznych o wysokiej czułości, bez komórek przy użyciu odczytu kolorymetrycznego lub fluorescencyjnego. Cały protokół wymaga zaledwie 8-9 godzin, przy zaledwie 1-2 godzinach pracy praktycznej od zaszczepienia do zakończenia. Zmniejszając koszty i czas uzyskiwania lizatu bezkomórkowego, metoda ta powinna zwiększyć przystępność cenową bezkomórkowej ekspresji genów do różnych zastosowań.

Wprowadzenie

Ekspresja genów w lizatach bezkomórkowych ma kilka zalet w porównaniu z używaniem żywych komórek1,2,3,4. Lizaty mogą być łatwo modyfikowane biochemicznie i stosowane w warunkach, które mogą być szkodliwe lub niemożliwe do osiągnięcia w żywych komórkach. Obwody ekspresji genów nie muszą zmagać się ani konkurować z procesami biologicznymi gospodarza, a testowanie nowych obwodów genetycznych jest tak proste, jak dodanie DNA. Z tych powodów ekspresja genów bez komórek znalazła różne zastosowania, od biosensors5,6 do szybkiego prototypowania obwodów syntetycznych genów7,8 do tworzenia sztucznych komórek9. Większość ekspresji genów bezkomórkowych wykorzystuje lizaty komórkowe, które zostały wysoko przetworzone, zazwyczaj wymagając długich i złożonych protokołów, specjalistycznego sprzętu i/lub wrażliwych kroków, które mogą prowadzić do znacznych różnic między użytkownikami i partiami10,11.

Ten artykuł opisuje prostą, efektywną metodę produkcji lizatu bez komórek, która wymaga minimalnego przetwarzania i specjalistycznej wiedzy (Rysunek 1A)12. Metoda opiera się na komórkach E. coli, które są zaprojektowane do lizy po prostym cyklu zamrażania i rozmrażania. Komórki wyrażają endolizynę z faga lambda, która degraduje ścianę komórkową. W miarę wzrostu komórek ta endolizyna pozostaje w cytoplazmie, oddzielona od ściany komórkowej. Jednak prosty cykl zamrażania i rozmrażania przerywa błonę cytoplazmatyczną, uwalniając endolizynę do peryplazmy, gdzie degraduje ścianę komórkową, powodując szybką lizę komórek. Protokół można wykonać po zaledwie kilku godzinach praktycznej pracy i wymaga jedynie zamrażarki, wirówki o pojemności 30 000 × g (dla optymalnych wyników; można używać niższych prędkości z większą ostrożnością, aby nie naruszyć peletu), mieszalnika wirowego i prostego roztworu buforowego. Funkcjonalny lizat może być nawet wytwarzany przez liofilizację komórek i ich ponowne nawodnienie in situ. Jednak ta metoda wytwarza lizaty o niższej aktywności, prawdopodobnie ze względu na pozostałe resztki komórek.

Lizaty są bardzo aktywne w ekspresji genów bez komórek i mogą być wzmacniane na różne sposoby, w zależności od końcowego zastosowania. Szybkość syntezy białek można dodatkowo zwiększyć poprzez zagęszczenie lizatu za pomocą standardowych koncentratorów spinowych. Liniowe DNA można chronić przed degradacją poprzez dodanie oczyszczonego białka GamS. Degradacja białka, niezbędna dla bardziej złożonej dynamiki obwodów, takich jak oscylacja, może być osiągnięta przez koekspresję heksameru ClpX w szczepionce wytwarzającej autolizat class13. Wreszcie, odczyty wizualne oparte na LacZ są możliwe dzięki użyciu szczepu autolizatu pozbawionego lacZ. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta wytwarza wysoce aktywny lizat bezkomórkowy, który nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotuj nośniki i.

  1. Przygotuj pożywkę 2xYTPG.
    1. Wymieszaj 62 g proszku 2xYT, 5,99 g fosforanu potasu jednozasadowego, 13,93 g dwuzasadowego fosforanu potasu i wody dejonizowanej do 2 l.
    2. Autoklaw w cyklu ciekłym z czasem naświetlania 30 min14.
    3. Do 400 ml pożywki 2xYTP z 1.1.2 dodać 7,2 g D-glukozy (dekstrozy) i mieszać aż do rozpuszczenia.
    4. Sterylizacja filtracyjna przez filtr 0,2 μm.
  2. Przygotuj bufor S30A.
    1. Wymieszaj Tris-HCl (pH 7,7, stężenie końcowe 50 mM), glutaminian potasu (60 mM końcowy) i glutaminian magnezu (14 mM końcowy).
    2. Dostosuj pH do 7,7 za pomocą 10 M KOH.
  3. Przygotować roztwór 1 (patrz Tabela 1).
    1. Zawiesić kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) w 2 ml wody.
    2. Dostosuj pH do 8,0 za pomocą KOH.
    3. Dodać wszystkie pozostałe składniki z tabeli 1.
    4. Doprowadzić pH do 7,6 za pomocą 10 M KOH. Filtruj - sterylizuj.
  4. Przygotować 2,5 x roztwór premiksu (patrz Tabela 2).
    1. Wymieszać wszystkie składniki z tabeli 2.
    2. Dostosuj pH do 7,5 za pomocą KOH.
    3. Podwielokrotność porcji i zamrażać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W reakcji 20 μl zużywa się 8,9 μl premiksu.

2. Przygotuj komórki.

  1. Umieścić komórki autolizatu na płytkach agarowych LB zawierających 50 μg/ml ampicyliny za pomocą pętli zaszczepiającej i rosnąć w temperaturze 37 °C (patrz uwaga 1).
  2. Za pomocą końcówki pipety wybrać pojedynczą kolonię do kultury starterowej z LB/ampicyliną i hodować w temperaturze 37 °C przez noc.
  3. Zaszczepić 400 ml pożywki 2xYTPG zawierającej 50 μg/ml ampicyliny 400 μl kultury starterowej i rosnąć w temperaturze 37 °C w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 l, wstrząsając z prędkością 300 obr./min.
  4. Okresowo mierzyć gęstość optyczną kultury przy długości fali 600 nm (OD600) za pomocą spektrofotometru w celu odczytu kuwety optycznej o długości ścieżki 1 cm. Gdy OD600 przekroczy 1, rozpocznij rozcieńczanie kultury 5-krotnie przed pomiarami, aby upewnić się, że pomiary pozostają w zakresie liniowym typowego spektrofotometru laboratoryjnego. Kontynuuj hodowlę komórek, aż 5-krotnie rozcieńczona kultura osiągnie OD600 0,3 (co odpowiada ODkultury 600 1,5).

3. Przygotuj lizat.

  1. Przygotować bufor S30A uzupełniony 2 mM ditiotreitolem (DTT). Zmieszać 3 ml buforu S30A z 6 μl roztworu podstawowego DTT w ciągu 1 M. Umieścić na lodzie do użycia w kroku 3.7.
  2. Zebrać komórki, odwirowując w temperaturze 1800 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Odlać supernatant przez wylanie go i użycie pipety do usunięcia pozostałego płynu.
  4. Zawiesić osad w 45 ml zimnego (4-10 °C) bufora S30A za pomocą mieszalnika wirowego.
  5. Zważyć pustą probówkę wirówkową o pojemności 50 ml, przenieść do niej komórki i powtórzyć kroki 3.2-3.3, aby umyć komórki.
  6. Zważyć granulkę, odejmując wagę pustej probówki o pojemności 50 ml. Upewnij się, że ostrożnie zasysasz pozostały supernatant, aby zapewnić dokładny pomiar masy osadu.
    UWAGA: Typowy plon to ~1,3 g osadu komórkowego z 400 ml kultury produkcyjnej.
  7. Dodać 2 objętości zimnego buforu S30A uzupełnionego 2 mM ditiotreitolem, tj. 2 ml buforu na każdy 1 g osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki przez energiczne mieszanie wirowe.
  8. Zamroź komórki. Umieść probówkę o pojemności 50 ml zawierającą komórki w zamrażarce o temperaturze -20 °C lub -80 °C, aż granulki zostaną dokładnie zamrożone.
    UWAGA: Krok zamrażania jest dobrym punktem zatrzymania na cały dzień.
  9. Rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej.
  10. Wirować energicznie przez 2-3 min.
  11. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut z wytrząsaniem przy 300 obr./min.
  12. Oczyścić próbkę z ciężkich resztek komórkowych przez odwirowanie w przezroczystych probówkach wirówkowych o stężeniu 30 000 × g przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Jeśli wirówka o wydajności 30 000 x g nie jest dostępna, wiruj przez 45 minut przy 21 000 × g i zachowaj dodatkową ostrożność w kroku 3.13, ponieważ osad będzie mniej zwarty.
  13. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki za pomocą pipety, unikając w jak największym stopniu naruszenia osadu. Jeżeli przenoszony supernatant jest zanieczyszczony materiałem z osadu, należy powtórzyć poprzedni krok.
  14. Przenieść supernatant do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i ponownie odwirować przy 21 000 × g (lub maksymalnej prędkości wirówki stołowej) przez 5 minut.
  15. Oczyszczony autolizat podzielić na żądane objętości, ostrożnie unikając resztek osadu, i zamrozić w temperaturze -80 °C lub natychmiast zużyć.
    UWAGA: Pojedyncza reakcja o pojemności 20 μl wykorzystuje 8 μl autolizatu.

4. Ekspresja genów bezkomórkowa

UWAGA: Autolizat jest teraz gotowy do dowolnego pożądanego końcowego użycia. Poniżej znajduje się przykładowy standardowy protokół ekspresji genów bez komórek.

  1. Aby uzyskać reakcję o objętości 20 μl, wymieszaj z lodem 8 μl autolizatu i 8,9 μl premiksu. Patrz UWAGA na końcu sekcji protokołu dotyczącej optymalizacji stężeń glutaminianu magnezu i PEG 8000.
  2. Dodać DNA (np. pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 do końcowego stężenia 8 nM), wszelkie inne odczynniki i wodę do 20 μl.
  3. Umieścić reakcję w 384-dołkowej mikropłytce i zmierzyć przebieg czasu fluorescencji i/lub punkty końcowe za pomocą czytnika płytek. W przypadku białka zielonej fluorescencji (GFP) należy użyć długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 520 nm.

5. Modyfikacje protokołu

UWAGA: Następujące modyfikacje protokołu umożliwiają mu obsługę innych aplikacji.

  1. Bezkomórkowa ekspresja genów przy użyciu liniowych matryc DNA
    1. Wykonaj kroki opisane w sekcji 4, uzupełniając reakcję oczyszczonym białkiem GamS o wielkości 2,2 μM (wyrażonym i oczyszczonym zgodnie z opisem12) przed dodaniem liniowego DNA.
  2. Bezkomórkowa ekspresja genów z udziałem degradacji białek
    1. W kroku 2.1 użyj komórek autolizatu zawierających plazmid pACYC-FLAG-dN6-His (patrz tabela materiałów). We wszystkich podłożach wzrostowych należy dodatkowo dodać 34 μg/ml chloramfenikolu.
    2. W kroku 2.3 włącz 40 μM izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do pożywki wzrostowej w celu wywołania ekspresji plazmidu.
    3. Powtórzyć kroki 3.2-3.4 (mycie) jeszcze dwa razy (w sumie trzy płukania), aby zapewnić całkowite usunięcie chloramfenikolu, który jest inhibitorem translacji. W przypadku pierwszych dwóch płukań (etap 3.4) należy zastąpić bufor S30A solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (pH 7.4).
    4. W kroku 4.2 uzupełnij dodatkowym 3 mM ATP (dodanym z roztworu podstawowego 100 mM ATP w wodzie, pH 7,2) i 4,5 mM glutaminianu magnezu (używając 1 M roztworu podstawowego w wodzie) (stężenia końcowe) w celu skompensowania wysokiego zużycia ATP przez ClpXP, a także chelatacji magnezu przez dodatkowe ATP.
  3. Bezkomórkowa ekspresja genów przy użyciu odczytów opartych na LacZ (w tym kolorymetrycznych)
    1. W kroku 2.1 użyj komórek autolizaty, które nie wykazują natywnej ekspresji LacZ (patrz Tabela materiałów).
  4. Alternatywnie przygotuj lizat bezpośrednio z liofilizowanych komórek.
    1. Wykonaj wszystkie kroki od 1.1 do 3.7.
    2. Zmieszać 8 μl zawiesiny komórek z 8,9 μl premiksu.
    3. Dodaj plazmidowe DNA (w razie potrzeby), inne niestandardowe odczynniki i wodę, aby osiągnąć końcową objętość 20 μl.
    4. Przenieść reakcję na 384-dołkową mikropłytkę i wysuszyć ją.
      UWAGA: Próbki liofilizowane mogą być przechowywane do tygodnia, a nawet dłużej.
    5. Aby rozpocząć reakcję, należy ją ponownie nawodnić 18 μl wody dejonizowanej uzupełnionej dowolnym pożądanym DNA lub innymi odczynnikami.
    6. Śledź dynamikę fluorescencji w czytniku płytek.

UWAGA 1: Komórki autolizatu są zaprojektowane do lizy w cyklu zamrażania i rozmrażania, dlatego szczególnie ważne jest stosowanie krioprotektantu podczas wytwarzania zamrożonych zapasów. Zamroziliśmy zapasy w glicerolu 24% wt/vol i przechowywaliśmy je w temperaturze -80 °C.

UWAGA 2: Jony magnezu i PEG 8000 mają kluczowe znaczenie dla wydajności lizatu. Bazowy premiks 2,5x, na podstawie wcześniej opublikowanych danych, zawiera 6 mM glutaminianu magnezu i 4,8% wag./obj. PEG 8000, które w końcowej reakcji osiągają odpowiednio 2,4 mM i 1,9%. Autolizat przygotowany zgodnie z tym protokołem zazwyczaj działa najlepiej z dodatkowymi 5 mM Mg-glutaminianu i 1,5% PEG 8000 w końcowej reakcji. Można to jednak zoptymalizować w zakresie dodatkowych 0-10 mM Mg glutaminianu i dodatkowych 0-3% PEG 8000 (w porównaniu z premiksem bazowym). Aby przygotować premiks z zalecanymi dodatkowymi 5 mM Mg-glutaminianu i 1,5% PEG 8000 (stężenia końcowe), należy wymieszać 380 μL premiksu z 4,75 μl glutaminianu magnezu w 1 M i 36,1 μL PEG 8000 przy 40% masy/objętości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki można zaobserwować, wykorzystując autolizat do ekspresji GFP z plazmidu o konstytutywnej ekspresji, w tym przypadku pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, oraz rejestrując przebieg czasowy fluorescencji GFP w czytniku płytek (Rysunek 1B). Seria rozcieńczeń DNA plazmidowego wykazała silną ekspresję nawet przy stężeniu DNA 1 nM. W porównaniu z komercyjnie dostępnym lizatem, autolizat może zapewnić większą całkowitą wydajność i osiągnąć wyższą maksymalną szybkość produkcji, ob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół daje wysoce aktywny lizat bakteryjny do ekspresji genów bez komórek. Kluczem jest wykorzystanie komórek przenoszących plazmid pAD-LyseR, który wyraża endolizynę faga lambda cytozolowo. Komórki te są wzmacniane do lizy po przepuszczalności błony wewnętrznej, umożliwiając endolizynie dostęp do ściany komórkowej, co metoda osiąga poprzez prosty cykl zamrażania i rozmrażania. Ponieważ komórki skutecznie się poddają, produkt ten określa się mianem autolizatu. Po lizie komórek jedynymi pozostałymi etapam...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

J.H. jest współzałożycielem firmy GenCirq Inc, która koncentruje się na terapiach przeciwnowotworowych. Zasiada w Radzie Dyrektorów i posiada udziały w GenCirq.

Podziękowania

Autorzy dziękują Zachary'emu Sunowi i Richardowi Murrayowi (California Institute of Technology) za uprzejme dostarczenie plazmidu P_araBAD-gamS, oraz Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) za uprzejme dostarczenie wirówki chłodzącej o dużej prędkości. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health oraz z programu ARO MURI i były częściowo wspierane przez Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japonia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2xYT mediaEMD Millipore4.85008lub odpowiednik
3-PGASigma AldrichP8877lub równoważny
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15, 3 kDa odcięcieMillipore SigmaUFC900308opcjonalnie, może być używany do zagęszczania lizatu, należy dobrać pojemność koncentratora odpowiednią do objętości, która ma być zagęszczona
ampicylinaSigma AldrichA0166-5Glub karbenicylina, bardziej stabilny wariant
ATPSigma AldrichA8937lub równoważny
cAMPSigma AldrichA9501lub równoważny
CoASigma AldrichC4282lub równoważny
CTPUnited States Biosciences14121lub równoważny
D-glukoza (dekstroza)Fisher ScientificAAA1749603lub równoważny
ditiotreitol (DTT)Sigma AldrichD0632-1Glub równoważny
E. coli BL21-Gold (DE3) przenoszący pAD-LyseRAddgene99244
E. coli BL21-Gold (DE3) i Delta; lacZ zawierające pAD-LyseRAddgene99245
Kwas folinowySigma AldrichF7878lub równoważny
GTPUnited States Biosciences16800lub równoważny
HEPESSigma AldrichH3375-25Glub równoważny
LB mediaFisher ScientificDF0446075lub równoważny
glutaminianmagnezuSigma Aldrich49605-250Glub równoważny
NADSigma AldrichN6522lub równoważny
glutaminian potasuSigma AldrichG1501-100Glub równoważny
wodorotlenek potasu (KOH)Sigma Aldrich221473-25Gdo regulacji pH
dwuzasadowego fosforanu potasuFisher ScientificBP363-500lub równoważny
fosforan potasu jednozasadowyFisher ScientificBP362-500lub równoważny
SpermidineSigma Aldrich85558lub równoważny
Tris-HClFisher Scientific9310500GMlub równoważna
mieszanina tRNARoche10109541001lub równoważna
UTPUnited States Biosciences23160lub równoważna

Bibliografia

  1. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  2. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  3. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  4. He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
  5. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  6. Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  7. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  8. Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
  9. Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027(2018).
  10. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762(2013).
  11. Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
  14. Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
  15. Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  16. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614(2016).
  17. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bezkom rkowa ekspresja gen wlizat kom rek bakteryjnychlizat Escherichia coliliza przez zamra anie i odmra anieprotok autolizyekspresja obwod w genowychbezkom rkowe biosensorowanieekspresja proteazy ClpXodczyt kolorymetrycznyodczyt fluorescencyjny
Szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja lizatu bezkomórkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.