Badania interakcji chaperon-cochaperone przy użyciu jednorodnego testu na bazie kulek

Summary

Ten protokół przedstawia technikę badania interakcji białko-białko za pomocą koralików donorowych połączonych z glutationem z ko-chaperonami z motywem TPR i koralikami akceptorowymi sprzężonymi z peptydem pochodzącym z Hsp90. Wykorzystaliśmy tę technikę do badań przesiewowych małych cząsteczek w celu zakłócenia interakcji Hsp90-FKBP51 lub Hsp90-FKBP52 i zidentyfikowaliśmy silne i selektywne inhibitory interakcji Hsp90-FKBP51.

Abstract

Ukierunkowanie na interakcje białko szoku cieplnego 90 (Hsp90)-cochaperon daje możliwość specyficznego regulowania procesów wewnątrzkomórkowych zależnych od Hsp90. Konserwatywny pentapeptyd MEEVD na C-końcu Hsp90 jest odpowiedzialny za interakcję z motywem powtórzeń tetratrikopeptydu (TPR) ko-chaperonów. Białko wiążące FK506 (FKBP) 51 i FKBP52 to dwa podobne ko-białka opiekuńcze z motywem TPR, zaangażowane w choroby hormonozależne steroidowe o różnych funkcjach. W związku z tym identyfikacja cząsteczek specyficznie blokujących interakcje między Hsp90 a FKBP51 lub FKBP52 zapewnia obiecujący potencjał terapeutyczny w przypadku kilku chorób u ludzi. W tym miejscu opisujemy protokół amplifikowanego luminescencyjnego testu jednorodnego zbliżeniowego w celu zbadania interakcji między Hsp90 a jego partnerskimi współopiekunami FKBP51 i FKBP52. Po pierwsze, oczyściliśmy białka zawierające motyw TPR FKBP51 i FKBP52 w postaci znakowanej S-transferazą glutationową (GST). Używając kulek donorowych połączonych glutationem z białkami motywu TPR połączonymi z GST oraz kulek akceptorowych sprzężonych z 10-merowym peptydem C-końcowym Hsp90, zbadaliśmy interakcje białko-białko w jednorodnym środowisku. Wykorzystaliśmy ten test do badań przesiewowych małych cząsteczek w celu zakłócenia interakcji Hsp90-FKBP51 lub Hsp90-FKBP52 i zidentyfikowaliśmy silne i selektywne inhibitory interakcji Hsp90-FKBP51.

Introduction

Molekularne białka opiekuńcze przyczyniają się do homeostazy białek, w tym do ich zwijania, transportu i degradacji. Regulują one kilka procesów komórkowych i są powiązane z licznymi chorobami, takimi jak rak i choroby neurodegeneracyjne¹. Białko szoku cieplnego 90 (Hsp90) jest jednym z najważniejszych białek opiekuńczych, którego funkcja zależy od zmian konformacyjnych napędzanych hydrolizą ATP i wiązania się z białkami klienta, w których pośredniczą jego ko-chaperony². Pomimo oczywistego potencjału Hsp90 jako celu terapeutycznego, dopracowanie jego funkcji stanowi duże wyzwanie. Istnieje kilka inhibitorów Hsp90 ukierunkowanych na N-końcowy region wiązania ATP, które zostały ocenione w badaniach klinicznych, ale żaden z nich nie został zatwierdzony do obrotu³. Ze względu na brak dobrze zdefiniowanej kieszeni wiążącej ligand⁴, celowanie w region C-końcowy Hsp90 odniosło ograniczony sukces⁴. Ostatnio badano zakłócenie oddziaływań Hsp90-kochaperon przez małe cząsteczki jako alternatywną strategię⁵. Ukierunkowanie na interakcje Hsp90-kochaperon nie wywołałoby ogólnej reakcji komórki na stres i daje możliwość specyficznej regulacji różnych procesów wewnątrzkomórkowych. Konserwatywny pentapeptyd MEEVD na C-końcu Hsp90 jest odpowiedzialny za interakcję z motywem powtórzeń tetratrikopeptydu (TPR) co-chaperones⁶. Spośród 736 białek zawierających motyw TPR opisanych w bazie danych białek ludzkich, ~20 różnych białek oddziałuje z Hsp90 za pośrednictwem tego peptydu⁷. Cząsteczki konkurujące o wiązanie peptydów MEEVD zakłócałyby interakcje między Hsp90 a ko-chaperonami zawierającymi domenę TPR. Miejsce wiązania peptydów ma podobną strukturę trzeciorzędową, ale ogólna homologia między różnymi domenami motywu TPR jest stosunkowo niska⁷, co daje możliwość identyfikacji cząsteczek specyficznie zdolnych do blokowania interakcji między Hsp90 a poszczególnymi ko-opiekunami motywu TPR. Wśród tych współopiekuńczych z motywem TPR, białko wiążące FK506 (FKBP) 51 i FKBP52 są regulatorami sygnalizacji receptora hormonu steroidowego (SHR) i biorą udział w kilku chorobach zależnych od hormonów steroidowych, w tym raku, chorobach związanych ze stresem, chorobach metabolicznych i chorobie Alzheimera⁸. Chociaż FKBP51 i FKBP52 mają wspólne podobieństwo sekwencji > 80%, ich funkcje różnią się: FKBP52 jest dodatnim regulatorem aktywności SHR, podczas gdy FKBP51 jest negatywnym regulatorem w większości przypadków⁸. W związku z tym identyfikacja cząsteczek, w szczególności blokujących interakcje między Hsp90 a FKBP51 lub FKBP52, zapewnia obiecujący potencjał terapeutyczny w przypadku chorób pokrewnych.

Auproszczony Luminescencyjny test Proximity Homogenny A(AlphaScreen) został po raz pierwszy opracowany w 1994 roku przez Ullman EF et al.⁹. Obecnie jest szeroko stosowany do wykrywania różnych typów interakcji biologicznych, takich jak peptide¹⁰, protein¹¹, DNA¹², RNA¹³ i sugar¹⁴. W tej technice istnieją dwa rodzaje koralików (średnica 200 nm), jeden to koralik donorowy, a drugi to koralik akceptorowy. Biomolekuły są unieruchomione na tych kulkach; Ich interakcje biologiczne zbliżają do siebie koraliki dawcy i akceptora. Przy długości fali 680 nm fotouczulacz w kulce donorowej oświetla i przekształca tlen w tlen singletowy. Ponieważ tlen singletowy ma krótką żywotność, może dyfundować tylko do 200 nm. Jeśli koralik akceptorowy znajduje się w pobliżu, jego pochodna tioksenu reaguje z tlenem singletowym, tworząc chemiluminescencję przy 370 nm. Energia ta dodatkowo aktywuje fluorofory w tym samym koraliku akceptorowym, aby emitować światło o długości fali 520-620 nm¹⁵. Jeśli interakcje biologiczne zostaną zakłócone, koralik akceptorowy i koralik donorowy nie mogą osiągnąć zbliżenia, co powoduje rozpad tlenu singletowego i niski poziom wytwarzania sygnału.

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący tę technikę do badania małych cząsteczek hamujących interakcje między Hsp90 i TPR co-chaperonami, zwłaszcza FKBP51 i FKBP52. 10 peptydów o długości 1 aminokwasów odpowiadających ekstremalnemu C-końcowi Hsp90 jest przyłączonych do kulek akceptorowych. Oczyszczone kochaperony TPR oznaczone GST oddziałują z koralikami dawcy połączonymi z glutationem. Kiedy interakcja między peptydami pochodzącymi z Hsp90 a ko-opiekunami z motywem TPR zbliża kulki do siebie, wytwarzany jest wzmocniony sygnał (Rysunek 1A). Jeśli przesiane małe cząsteczki mogą hamować interakcje między Hsp90 a ko-białkami opiekuńczymi z motywem TPR, ten wzmocniony sygnał zostanie zmniejszony (Rysunek 1B). Ich IC₅₀ można obliczyć za pomocą pomiaru ilościowego. Protokół ten może być rozszerzony na dowolne interakcje opiekuńczo-opiekuńcze z motywem TPR, które są przedmiotem zainteresowania i ma ogromne znaczenie w rozwoju nowych cząsteczek, w szczególności blokując interakcję między Hsp90 a FKBP51 lub FKBP52.

Rysunek 1: Podstawowa zasada tego testu. (A) Oczyszczony GST-FKBP51 oddziałuje z kulkami donorowymi połączonymi z glutationem. 10 długich peptydów aminokwasowych odpowiadających skrajnemu C-końcowi Hsp90 jest przyłączonych do koralików akceptorowych. Interakcja między peptydami pochodzącymi z Hsp90 a domeną TPR FKBP51 zbliża do siebie kulki dawcy i akceptora. Przy długości fali 680 nm fotouczulacz w kulce donorowej oświetla i przekształca tlen w tlen singletowy. Pochodna tioksenu na koraliku akceptorowym reaguje z tlenem singletowym i generuje chemiluminescencję przy 370 nm. Energia ta dodatkowo aktywuje fluorofory w tym samym koraliku akceptorowym, aby emitować światło o długości fali 520-620 nm. (B) Gdy małe cząsteczki hamują interakcje między Hsp90 i FKBP51, kulki donorowe i akceptorowe nie mogą osiągnąć zbliżenia. Następnie tlen singletowy o krótkim czasie życia rozpada się i nie jest wytwarzany żaden wykrywalny sygnał. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

UWAGA: Przegląd tego protokołu jest pokazany w Rysunek 2.

1. Ekspresja i oczyszczanie GST-FKBP51 i GST-FKBP52 (Rysunek 2A)

1. Plazmidy
   UWAGA: Uzyskaj klony cDNA dla ludzkiego FKBP51 (identyfikator klonu: 5723416) i dla ludzkiego FKBP52 (identyfikator klonu: 7474554) z konsorcjum IMAGE.
   1. Amplifikować ludzkie DNA FKBP51 metodą PCR za pomocą starterów (do przodu; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', do tyłu; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCTCCAC-3') zawierających zwisy BamHI i XhoI i sklonować do wektora pGEX6-1 w miejscach restrykcji BamHI / XhoI.
   2. Amplifikować ludzkie DNA FKBP52 metodą PCR za pomocą starterów (do przodu; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', do tyłu; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCTCCAC-3') zawierających zwisy EcoRI i XhoI i sklonować do wektora pGEX6-2 w miejscach ograniczeń EcoRI / XhoI.
      UWAGA: Układ i warunki reakcji PCR przedstawiono w Tabeli 1 i Tabeli 2.
   3. Sprawdź wstawioną sekwencję i przekształć plazmidy w chemicznie kompetentną E. coli zgodnie z protokołem wytwarzania.
2. Ekspresja i oczyszczanie białek
   1. Dodaj 25 g bazy bulionowej Luria (LB) do 1 l wody destylowanej, aby uzyskać roztwór LB. Autoklawować w temperaturze 121 °C przez 15 min. Po schłodzeniu dodać 50 μg/ml ampicyliny.
   2. Weź kolonię bakterii wykazujących ekspresję GST-FKBP51 lub GST-FKBP52 i wymieszaj z 500 μl roztworu LB w probówce o pojemności 1,5 ml. Wir.
   3. Dodać mieszaninę "1.2.2" do 1 l roztworu LB w kolbie Erlenmeyera pokrytej folią aluminiową. Inkubować kolbę Erlenmeyera w wytrząsarce przez noc w temperaturze 37 °C.
   4. Indukować ekspresję białka przez dodanie 1 mM izopropylo-β-D-tiogalaktozydu (IPTG) do kolby Erlenmeyera i kontynuować inkubację przez kolejne 2 godziny.
   5. Aby uzyskać granulki komórek, odwirować przy 5 000 x g przez 15 minut. Usunąć supernatant.
      UWAGA: Granulki komórkowe można przechowywać w temperaturze -20 °C.
   6. Zawiesić granulki komórkowe w 40 ml PBS i poddać sonifikacji 3 x 20 s na lodzie. Dodaj 1 mM PMSF, 1 mM EDTA i koktajl inhibitorów proteazy (1 tabletka), aby zapobiec proteolizie.
   7. Odwirować zawiesinę przez 30 minut 50 000 x g w celu usunięcia resztek komórek i nanieść supernatant na kolumnę pułapki GST o pojemności 5 ml.
   8. Po przemyciu kolumny 30 ml PBS, wymyj GST-FKBP51 i GST-FKBP52 5 ml 10 mM glutationu w PBS.
   9. Skoncentruj białka na 15 ml 10 000 MWCO jednostce wirówkowej. Aby usunąć wolny glutation, przepuść koncentraty przez kolumnę PD-10 zrównoważoną 0,5x PBS i ponownie skoncentruj się na urządzeniu wirówkowym z filtrem.
   10. Zbierz frakcje zawierające białko. Sprawdź białka w SDS-PAGE i dostosuj stężenie białka do 1 mg/mL.
       UWAGA: Typowa wydajność białka to 2-5 mg/L hodowli. Białko może być przechowywane w temperaturze -20 °C.

2. Sprzężenie peptydu C-końcowego Hsp90 z koralikami akceptorowymi (Rysunek 2B)

1. Preparat peptydowy Hsp90
   1. Zsyntetyzuj dziesięć peptydów aminokwasowych NH 2-EDASRMEEVD-COOH odpowiadających aminokwasom 714-724 ludzkiej izoformy beta Hsp90 (UniProt ID: P08238) za pomocą usługi syntezy peptydów.
   2. Rozcieńczyć peptyd Hsp90 w PBS do stężenia 1 mg/ml.
2. Przygotowanie koralików akceptorowych
   1. Rozcieńczyć niesprzężone kulki akceptorowe w PBS do stężenia 1 mg/ml i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
   2. Przemywać przez odwirowanie przy 16 000 x g przez 15 minut. Ostrożnie usunąć sklarowany osad.
3. koniugacja
   1. Ustaw stosunek między kulkami a peptydem na 10:1. Do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 mg granulki perełki akceptorowej (przygotowanej w sposób opisany powyżej) dodać 1 ml PBS (pH 7,4), 0,1 mg rozcieńczonego peptydu, 1,25 μl Tween-20, 10 μL 400 mM roztworu cyjanoborowodorku sodu (NaBH₃CN) w wodzie.
      UWAGA: NaBH3CN jest toksyczny; Używaj dygestorium i rękawic. Roztwór NaBH₃CN powinien być świeżo przygotowany
   .
   2. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z mieszaniem od końca do końca (10-20 obr./min) na wytrząsarce obrotowej.
4. Hartowanie reakcyjne i mycie kulek
   1. Dodać 20 μl 1 M roztworu Tris-HCl (pH 8,0) do reakcji, aby zablokować miejsca, w których nie podano reakcji. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   2. Wirować przy 16 000 x g (lub maksymalnej prędkości) przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulkę w 1 ml roztworu Tris-HCl (100 mM, pH 8,0).
   3. Powtórz krok prania trzy razy.
   4. Po ostatnim odwirowaniu ponownie zawiesić kulki w stężeniu 1 mg/ml w buforze do przechowywania (1 ml 0,5 × PBS z 0,01% azydkiem sodu jako środkiem konserwującym). Przechowywać sprzężony roztwór kulki akceptorowej w temperaturze 4 °C light protected.
      UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny; Używaj dygestorium i rękawic.

3. Test badający interakcję między GST-FKBP51 lub GST-FKBP52 a peptydem C-końcowym Hsp90 oraz inhibicję związkami o małej masie cząsteczkowej (Rysunek 2C)

1. Białka znakowane GST oddziałujące z kulkami donorowymi glutationu
   1. Ustaw reakcje w płytkach 384-dołkowych.
   2. Przygotować roztwór zawierający 10 μg/ml kulek donorowych glutationu w 0,5x PBS, pH 7,4,
      UWAGA: Po dłuższym przechowywaniu koraliki osiadają i należy je wirować.
   3. Dodaj GST-FKBP51 lub GST-FKBP52 do końcowego stężenia 10 μg/ml.
   4. Inkubować w ciemności w temperaturze 25 °C przez 10 min.
      UWAGA: Na tym etapie białka oznaczone GST będą wchodzić w interakcje z glutationem przyczepionym do kulek. Na każdą studzienkę zostanie użyte 22,5 μl tej mieszaniny. Stężenie związków wiążących musi być określone empirycznie. Miareczkować GST-FKBP51 i GST-FKBP52 i wybrać stężenie, które daje najlepszy sygnał.
2. Dodawanie związków
   1. Wykonać seryjne rozcieńczenia badanych związków w DMSO.
      UWAGA: Stosowane stężenia to zazwyczaj 10, 30, 100, 300, 1,000 i 3,000 μM.
   2. Dodaj 0,25 μl DMSO (kontrola ujemna) lub peptydu C-końcowego Hsp90 (kontrola pozytywna, 30 μM) lub związków w DMSO do rogu każdej studzienki płytki. Stosować trzykrotnie dla każdego stężenia związku.
   3. Do każdej studzienki dodać 22,5 μl roztworu zawierającego kulki donorowe glutationu z białkami oznaczonymi GST.
   4. Delikatnie potrząśnij talerzem ręką, ale dokładnie. Inkubować w ciemności w temperaturze 25 °C przez 15 min.
      UWAGA: W tym czasie związki będą oddziaływać z domeną TPR w miejscu wiązania peptydu C-końcowego Hsp90.
3. Dodawanie koralików akceptorowych
   1. Rozcieńczyć kulki akceptora z dołączonym peptydem C-końcowym Hsp90 do 100 μg/ml w 0,5x PBS.
   2. Dodać 2,25 μl rozcieńczonych kulek akceptorowych do każdej studzienki.
   3. Wymieszaj delikatnie, ale dokładnie. Inkubować w ciemności w temperaturze 25 °C przez 15 min.
      UWAGA: Na tym etapie kulki dawcy i akceptora zbliżają się do siebie przez interakcje białko-peptyd. Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 25 μl. W związku z tym końcowe stężenia związków wahają się od 0,1 do 30 μM.
4. Odczyt tabliczki
   UWAGA: Odczytać tabliczkę za pomocą czytnika tabliczek ustawionego w odpowiednim trybie.
   1. Włącz instrument i otwórz oprogramowanie
   2. Wybierz odpowiedni protokół.
   3. Kliknij opcję Edytuj mapę płyty i wybierz studnię używaną w płycie do pomiaru.
   4. Kliknij przycisk Dalej, aby kontynuować i uruchomić wybrany protokół.
   5. Po pomiarze kliknij Pokaż wyniki, aby wyświetlić wyniki.
   6. Eksportuj dane.

4. Analiza danych

1. Współczynnik Z' i stosunek sygnału do tła (S/B)
   1. Obliczyć współczynnik Z' i stosunek S/B dla testu, korzystając z następującego równania:
      Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μ neg│¹⁶
      S/B=μneg/μpos
      gdzie, σ i μ reprezentują odchylenia standardowe i średnie odpowiednio dodatnich (peptyd C-końcowy Hsp90, 30 μM) i ujemnych (DMSO). Współczynnik Z' > 0,5 zapewni, że test jest wystarczająco solidny do badań przesiewowych. W celu monitorowania czułości testu obliczono również stosunek S/B.
2. Krzywa dawka-odpowiedź i IC ₅₀
   UWAGA: Użyj analizy regresji nieliniowej, aby dopasować dane inhibitorów IPP Hsp90-cochaperonów za pomocą oprogramowania.
   1. Utwórz tabelę danych XY w oknie dialogowym Witamy i wybierz X liczb, a następnie Y Wprowadź 3 (jeśli są potrójne) replikuj wartości w kolumnach obok siebie.
   2. Znormalizuj dane sygnałowe próbek do ujemnej grupy kontrolnej. Zaimportuj wartości stężeń do kolumny X, a wartości sygnału do kolumny Y.
   3. Kliknij przycisk Analizuj i wybierz pozycję Przekształć stężenie (X) w obszarze Przekształć | Normalizować. Wybierz opcję Przekształć w logarytmy.
      UWAGA: Spowoduje to przekształcenie stężenia w skalę logarytmiczną. Jeśli stężenie początkowe wynosi zero, ustaw je na bardzo małą liczbę, która jest faktycznie zerowa (np. 0,1 nM), aby nie stracić tych wartości, ponieważ logarytm zera nie jest zdefiniowany.
   4. Kliknij przycisk Analizuj i wybierz opcję Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej) w obszarze Analizy XY, otwórz okno Dose-Response-Inhibition i wybierz opcję Log(inhibitor) vs. response -- Variable slope.
   5. Kliknij przycisk OK, aby wyświetlić wyniki (zawierające wartość IC₅₀) i wykresy.

Rysunek 2: Schemat tego protokołu. (A) Ekspresja i oczyszczanie GST-FKBP51 i GST-FKBP52. (B) Sprzężenie peptydu C-końcowego Hsp90 z koralikami akceptorowymi. (C) Test badający interakcję między GST-FKBP51 lub GST-FKBP52 a C-końcowym peptydem Hsp90. Hamowanie związkami o małej masie cząsteczkowej. Utworzono za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

W naszym teście współczynnik Z' i stosunek S/B wynoszą odpowiednio 0,82 i 13,35 (Rysunek 3A), co pokazuje, że nasz test jest solidny i niezawodny dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Następnie wykorzystaliśmy go do badań przesiewowych związków o małej masie cząsteczkowej. Rysunek 3B przedstawia zależne od dawki hamowanie interakcji chaperon-cochaperon z wybraną małą cząsteczką (D10). Krzywe dawka-odpowiedź dla D10 są generowane przez analizę regresji nieliniowej, na podstaw...

Discussion

W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący test do badań przesiewowych małych cząsteczek hamujących interakcje między Hsp90 a ko-opiekunami z motywem TPR, zwłaszcza FKBP51 i FKBP52. Wysoki wynik Z' (>0,8) świadczy o solidności i niezawodności formatu o wysokiej przepustowości. Wyniki można uzyskać w ciągu jednej godziny i wymagane są niewielkie ilości kulek, białka i związków. Co więcej, protokół ten można łatwo rozszerzyć na dowolne interakcje Hsp90/Hsp70 - TPR-motif co-chaperone, które są przedmiotem zainteresowan...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Płytki 384-dołkowe	Perkin Elmer	6008350	Objętość testu 25 ml
Jednostka wirująca Amicon 10.000 MWCO	Koncentrat białka Millipore	UFC901008
Ampicillin	Sigma	A0166	Antybiotyki
Wytrząsarka bakteryjna Unimax 1010	Heidolph		Culture
bakterie klony cDNA dla człowieka FKBP51	Źródło: BioScience	identyfikator klonu: 5723416	wektor pCMV-SPORT6
klony cDNA dla człowieka FKBP52	Źródło BioScience	identyfikator klonu: 7474554	wektor pCMV-SPORT6
Chemicznie kompetentny E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Oprogramowanie do analizy danych	GraphPad Prism	9.0.0	Analiza danych i tworzenie liczb
	Excel		Dane analityczne
DMSO	Supelco	1.02952.1000	Rozcieńczone związki
DPBS	Gibco	14190-144	Przygotuj roztwór
EDTA	Calbiochem	344504	Zapobiegaj proteolizie podczas sonikacji
Glutation	Sigma	G-4251	Elute Białka znakowane GST
Koraliki donorowe glutationu	Perkin Elmer	6765300	Koralik dawcy
Kolumna pułapki GST	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Oczyszczanie białek oznaczonych GST
Izopropylo-β-D-tiogalaktozyd	Thermo Fisher Scientific	R0392	Indukuj ekspresję białka
LB Broth (Miller)	Sigma	L3522	Pożywka do wzrostu drobnoustrojów
Instrument do PCR	BIO-RAD	S1000 Kolumna Thermal Cycler	Amplifikacja/PCR
PD-10	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Wektor wymiany roztworów
pGEX-6P-1	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Wektor plazmidowy
pGEX-6P-2	Cytiva (GE Healthcare)	28954650
Plazmid Czytnik płytek	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Odczyt	tabliczki alfa
Oprogramowanie do odczytu płytek	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Oprogramowanie do odczytu płytek
Protokół oprogramowania czytnika płytek	Perkin Elmer	Alpha 384-well Niska głośność	Użyj tego protokołu, aby odczytać płytę
PMSF	Sigma	P7626	Zapobiegaj proteolizie podczas sonikacji
koktajl inhibitorów proteazy	Sigma	S8830	Zapobiegaj proteolizie podczas sonikacji
Azydek sodu	Sigma	S2002	Jako środek konserwujący
Sicyjanoborowodorek sodu (NaBH3CN)	Sigma	156159	Aktywuje matrycę do sprzężenia
Dziesięć peptydów aminokwasowych NH2-EDASRMEEVD-COOH odpowiadających aminokwasom 714-724 ludzkiej izoformy beta Hsp90	peptyd 2.0 inc		Syntetyzuj peptyd C-końcowy Hsp90
Rotator probówki	LABINCO		Wykonaj mieszanie end-over-end
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Zablokuj nieprzereagowane miejsca koralików akceptorowych
Tween-20	Sigma	P1379	Zapobiegaj agregacji koralików
Ultra wirówka Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Wirówka do uzyskiwania granulek komórek bakteryjnych
Ultradźwiękowy zaburzacz komórek	Microson		Sonicate komórki w celu uwolnienia białka
Niesprzężone koraliki akceptorowe	Perkin Elmer	6762003	Akceptor koraliki
XCell SureLock Mini-Cell i moduł XCell II Blot	Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE