Method Article

Mikroskopia fluorescencyjna w celu internalizacji ATP za pośrednictwem makropinocytozy w ludzkich komórkach nowotworowych i myszach z ksenoprzeszczepem guza

DOI:

10.3791/62768

⸱

June 30th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ohio University, 2Molecular and Cellular Biology Program, Ohio University, 3Neuroscience Program, Ohio University, 4Edison Biotechnology Institute, Ohio University, 5Translational Biomedical Sciences Program, Ohio University, 6Honors Tutorial College, Ohio University, 7Department of Biomedical Sciences, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy powtarzalną metodę wizualizacji internalizacji niehydrolizowalnego fluorescencyjnego trifosforanu adenozyny (ATP), substytutu ATP, o wysokiej rozdzielczości komórkowej. Zwalidowaliśmy naszą metodę przy użyciu niezależnych testów in vitro i in vivo - ludzkich linii komórek nowotworowych i myszy z niedoborem odporności ksenoprzeszczepowanych ludzką tkanką nowotworową.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano, że trifosforan adenozyny (ATP), w tym zewnątrzkomórkowe ATP (eATP), odgrywa znaczącą rolę w różnych aspektach nowotworzenia, takich jak oporność na leki, przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) i przerzuty. Stężenie eATP w obrębie guza jest 103 do 104 razy wyższe niż w normalnych tkankach. Podczas gdy eATP działa jako posłaniec aktywujący sygnalizację purynergiczną w celu indukcji EMT, jest również internalizowany przez komórki rakowe poprzez podwyższoną makropinocytozę, specyficzny rodzaj endocytozy, w celu wykonywania szerokiej gamy funkcji biologicznych. Funkcje te obejmują dostarczanie energii do reakcji biochemicznych wymagających ATP, oddawanie grup fosforanowych podczas transdukcji sygnału oraz ułatwianie lub przyspieszanie ekspresji genów jako kofaktora transkrypcyjnego. ATP jest łatwo dostępne, a jego badania nad rakiem i innymi dziedzinami niewątpliwie wzrosną. Jednak badania nad eATP pozostają na wczesnym etapie, a nierozwiązane pytania pozostają bez odpowiedzi, zanim ważne i wszechstronne działania odgrywane przez eATP i zinternalizowane wewnątrzkomórkowe ATP będą mogły zostać w pełni rozwikłane.

Wkład laboratoriów tych autorów w te wczesne badania eATP obejmuje obrazowanie mikroskopowe niehydrolizowalnego fluorescencyjnego ATP, w połączeniu z wysoko- i niskocząsteczkowymi fluorescencyjnymi dektransami, które służą jako znaczniki makropinocytozy i endocytozy, a także różne inhibitory endocytozy, do monitorowania i charakteryzowania procesu internalizacji eATP. Ta metoda obrazowania została zastosowana do linii komórek nowotworowych i myszy z niedoborem odporności, ksenoprzeszczepowanych z ludzkimi guzami nowotworowymi, w celu zbadania internalizacji eATP in vitro i in vivo. W niniejszym artykule opisano te protokoły in vitro i in vivo, z naciskiem na modyfikację i dostrojenie warunków testu, tak aby testy internalizacji eATP za pośrednictwem makropinocytozy/endocytozy mogły być z powodzeniem przeprowadzane w różnych systemach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oportunistyczne pobieranie wewnątrznowotworowych zewnątrzkomórkowych (tj.) składników odżywczych zostało ostatnio uznane za kluczową cechę metabolizmu raka1. Jednym z tych ważnych składników odżywczych jest ATP, ponieważ stężenie ieATP jest 103 i 104 razy wyższe niż w normalnych tkankach, w zakresie od kilkuset μM do niskiego mM2,3,4,5. Jako kluczowa cząsteczka energetyczna i sygnałowa, ATP odgrywa kluczową rolę w metabolizmie komórkowym w komórkach nowotworowych i zdrowych6,7,8. Zewnątrzkomórkowe ATP nie tylko bierze udział we wzroście komórek rakowych, ale także sprzyja oporności na leki9. Wcześniej nierozpoznane funkcje ATP, takie jak aktywność hydrotropowa, zostały niedawno zidentyfikowane, co sugeruje udział ATP w chorobach takich jak choroba Alzheimera10. Rzeczywiście, wydaje się, że nasze zrozumienie ATP i jego funkcji w komórkach rakowych, zdrowych komórkach i innych chorych komórkach jest dalekie od kompletności. Jednak ze względu na niestabilność ATP i wysokie tempo rotacji w komórkach, monitorowanie ruchu ATP przez błonę komórkową i do komórki jest technicznie trudne.

Aby rozwiązać ten problem i zaspokoić potrzeby tego obszaru badań, opracowano metodę, w której niehydrolizowalny fluorescencyjny ATP (NHF-ATP) (Rysunek 1) został użyty jako substytut do wizualizacji internalizacji ATP i obserwacji wewnątrzkomórkowej lokalizacji przestrzennej zinternalizowanego ATP, zarówno in vitro, jak i in vivo11,12. Wykazano, że NHF-ATP zastępuje endogenne ATP w celu zbadania ruchu ATP przez błony komórek zwierzęcych, zarówno w liniach komórek rakowych, jak i w ludzkiej tkance nowotworowej ksenoprzeszczepowanej na myszach z niedoborem odporności11,12. Co więcej, podawanie inhibitorów makropinocytozy komórkom blokowało internalizację eATP, co sugeruje, że wewnątrzkomórkowy wychwyt eATP obejmuje mechanizm makropinocytotozy9,11,12. Protokół ten umożliwia koznakowanie immunologiczne białek specyficznych dla komórki, a tym samym identyfikację, który typ komórki internalizuje NHF-ATP. Korzystając z ksenoprzeszczepów nowotworowych in vivo i mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, NHF-ATP można wizualizować przestrzennie w całej próbce tkanki, a nawet w obrębie pojedynczej komórki. Metody te umożliwiają również analizę ilościową, taką jak procent wychwytu komórkowego, liczba pęcherzyków makropinocytotycznych i kinetyka internalizacji. W tym artykule opisano szczegółowo, w jaki sposób NHF-ATP, działający samodzielnie lub razem z fluorescencyjnym znacznikiem endocytozy dextrans13,14,15,16, może być używany w różnych warunkach eksperymentalnych do badania internalizacji ATP i lokalizacji wewnątrzkomórkowej, po internalizacji w komórkach.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Struktury niehydrolizowalnego fluorescencyjnego ATP i tetrametylorodaminy znakowane destrem fluorescencyjnym o wysokiej masie cząsteczkowej. (A) Struktura NHF-ATP. (B) Schematyczne przedstawienie HMWFD. Skróty: ATP = adenozynotrifosforan; NHF-ATP = niehydrolizowalny fluorescencyjny ATP; TMR = tetrametylorodamina; HMWFD = dekstran fluorescencyjny o wysokiej masie cząsteczkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury opisane tutaj zostały wykonane zgodnie z IACUC Uniwersytetu Ohio oraz z NIH.

1. Wybór niehydrolizowalnych fluorescencyjnych ATP (NHF-ATP) i dektrans

  1. Wybierz sprzężony z fluoroforem NHF-ATP (Rysunek 1A) i znaczniki endocytozy, fluorescencyjny dektrans o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej (TMR-HMWFD i TMR-LMWFD) (Rysunek 1B), w oparciu o preferowane długości fal emisji (np. system obrazowania wyposażony w odpowiednie filtry) i specyficzny proces endocytozy, który ma być badany.

2. Badania lokalizacji ATP, in vitro (Rysunek 2)

figure-protocol-1
Rysunek 2: Procedura in vitro do zbadania internalizacji ATP. Schematyczne przedstawienie protokołu do wizualizacji internalizacji zewnątrzkomórkowego ATP w hodowanych komórkach nowotworowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Hodowla komórkowa i przygotowanie komórek
    UWAGA: Przeprowadzić hodowlę komórkową w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowej.
    1. Przygotować zmodyfikowaną pożywkę Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, zawierającą 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny (zwanej dalej DMEM/FBS), sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i 0,25% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Hodowla ludzkich komórek nowotworowych w DMEM/FBS w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm. Utrzymać komórki w inkubatorze ustawionym na 37 °C z 5% atmosferąCO2
      3. .
    3. Kiedy komórki osiągną zbieg, przejdź przez komórki, najpierw usuwając pożywkę hodowlaną. Następnie opłucz naczynie 5 ml sterylnego PBS, usuń PBS i dodaj 3 ml 0,25% trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 5 minut.
    4. Wyjmij naczynie, a następnie dodaj 6 ml DMEM/FBS, aby zatrzymać trypsynizację. Przenieść komórki w zawiesinie do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 800 × g przez 5 minut w celu osadzenia komórek.
    5. Po odwirowaniu odessać supernatant i użyć 10 ml DMEM/FBS do ponownego zawieszenia osadu komórkowego przez pipetowanie.
    6. Policz gęstość i żywotność komórek za pomocą hemocytometru. Użyj DMEM/FBS, aby rozcieńczyć zawiesinę komórkową do gęstości ~7,5 ×10 4 komórek/ml.
  2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych i komórek wysiewających
    1. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm umyj 70% etanolem i dokładnie przetrzyj je delikatnymi chusteczkami roboczymi. Wysterylizuj szkiełka nakrywkowe i jedną parę kleszczy za pomocą autoklawowania.
    2. W kapturze do hodowli tkankowej za pomocą kleszczy umieść jedno szkiełko nakrywkowe w każdym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
      UWAGA: Później szkiełko nakrywkowe z komórkami zostanie zamontowane bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym w celu obrazowania.
    3. Dozować 300 μl zawiesiny komórek (komórki w DMEM/FBS), o gęstości wysiewu ~2,5 × 104 komórek na studzienkę, do 24-dołkowej płytki zawierającej wysterylizowane szkiełka nakrywkowe. Inkubować w sterylnych warunkach w temperaturze 37 °C przy przepływie 5%CO2
      4. .
  3. Głód komórek
    1. Dwadzieścia cztery godziny po wysianiu usuń DMEM/FBS z każdej studzienki. Natychmiast dodaj 300 μl wstępnie podgrzanego DMEM bez surowicy do każdej studzienki, aby zagłodzić komórki w surowicy przez 15-18 godzin, aby wywołać wychwyt zewnątrzkomórkowych składników odżywczych.
      UWAGA: Krytycznym parametrem jest 15-18 godzinny okres głodu.
  4. Przygotowanie roztworów NHF-ATP i HMWFD/LMWFD
    1. Za pomocą wagi analitycznej zważ wysokocząsteczkowy (70 kDa) fluorescencyjny TMR-dekstran (TMR-HMWFD, 1 mg/mL), znacznik do wizualizacji makropinosomów, lub NHF-ATP (10 μmol/l) w DMEM bez surowicy w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Umieścić probówki, chronione przed światłem, w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut.
    2. Wirować przy 12 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie przenieść klarowny sklarowany sklaratant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, pozostawiając nienaruszone osady lub zanieczyszczenia w celu usunięcia nierozpuszczalnych kryształów.
    3. Dodać roztwory z kroku 2.4.1 do komórek w każdym studzience i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Jeśli roztwory HMWFD i NHF-ATP mają być zmieszane do jednoczesnej inkubacji z komórkami, należy przygotować oba roztwory w stężeniach 2x większych niż końcowe. Roztwory zostaną później zmieszane w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe dokładne stężenia robocze. Unikaj światła, ponieważ odczynniki są wrażliwe na światło.
  5. Leczenie komórek i stabilizacja
    1. Na świeżej 24-dołkowej płytce dozuj 500 μl podgrzanego PBS do każdego z pięciu dołków.
    2. Po inkubacji komórek ostrożnie podnieś każde szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy. Opłucz każde szkiełko nakrywkowe, zanurzając je w 500 μl podgrzanego PBS. Powtórz pięć razy, korzystając z pięciu studzienek wypełnionych PBS.
      UWAGA: Delikatne mycie komórek na szkiełkach nakrywkowych ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego eksperymentu.
    3. Po ostatnim praniu PBS postukaj w szkiełko nakrywkowe w delikatną chusteczkę zadaniową, aby wchłonąć nadmiar PBS i natychmiast przenieś szkiełko nakrywkowe do zimnego (4 °C) 3,7% formaldehydu, wstępnie załadowanego do 24-dołkowej płytki. Utrwal komórki na 15 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Podczas mocowania komórek należy wstępnie oczyścić szkiełka mikroskopowe 70% etanolem. Usunąć szkiełka nakrywkowe ze studzienek i zamontować je na szkiełkach, używając 5 μl wodnego podłoża montażowego zawierającego barwnik jądrowy 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) na szkiełko nakrywkowe. Delikatnie osusz nadmiar PBS ręcznikiem papierowym lub delikatną chusteczką do pracy.
  6. Mikroskopia fluorescencyjna i akwizycja obrazu
    1. Dwie do 24 godzin po wykonaniu powyższych kroków uchwyć obrazy komórek i zinternalizowanego HMWFD i/lub NHF-ATP za pomocą systemu obrazowania epifluorescencyjnego i oprogramowania do akwizycji danych.
      UWAGA: W tej podsekcji opisano czynności uzyskiwania obrazów za pomocą mikroskopu NiU firmy NiU firmy NiOn wyposażonego w funkcję obrazowania epifluorescencyjnego oraz oprogramowania Nikon NIS Elements. Można jednak stosować inne porównywalne systemy obrazowania i oprogramowanie do akwizycji. Postępuj zgodnie z instrukcją obsługi producenta.
      1. Umieść szkiełko na stoliku pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego w trybie lornetkowym. Uzyskaj dostęp do programu do obrazowania.
      2. Wybierz obiektyw 10x, dostosuj stolik, aby zdefiniować ostrość, i zeskanuj slajd od lewej do prawej w serpentynowy sposób, aby zidentyfikować obszary zainteresowania.
        UWAGA: Identyfikacja obszarów zainteresowania będzie się różnić w zależności od typu komórek, przy czym niektóre linie komórkowe/typy raka wykazują różne i odrębne stopnie wychwytu TMR-HMWFD i/lub NHF-ATP.
      3. Wybierz obiektyw 40x i przełącz się z trybu lornetki na tryb przechwytywania obrazu za pomocą przełącznika na mikroskopie.
      4. Kliknij ikonę Live Quality w programie do obrazowania, aby view i następnie uzyskaj obrazy.
      5. Korzystając z panelu OC na pasku narzędzi Adnotacje i pomiary, zdefiniuj parametry ekspozycji dla każdej kostki filtra lub kanału fluorescencyjnego.
        UWAGA: Wybierz odpowiedni czas ekspozycji dla każdego kanału, ponieważ intensywność sygnału jest różna. Na przykład wybierz czas ekspozycji 200 ms dla DAPI, 2 s dla HMWFD i 4 s dla NHF-ATP. Po określeniu czasu naświetlania dla każdego kanału należy użyć tego ustawienia dla wszystkich obrazów, dla każdego kanału, z różnymi zabiegami lub warunkami.
      6. Po ustawieniu ustawień ekspozycji dla każdego kanału, użyj paska narzędzi akwizycji wielokanałowej, aby uzyskać obraz 3-kanałowy ze zdefiniowanymi ustawieniami ekspozycji.
        UWAGA: Akwizycja obrazu w trybie wielokanałowej akwizycji ND umożliwia automatyczne przechwytywanie obrazu dla każdego kanału w tym samym polu widzenia. Migawka zamyka się automatycznie między zmianami głowicy rewolwerowej.
      7. Alternatywnie, można ręcznie uzyskać obrazy wielokanałowe, przełączając się między kostkami filtrów, ustawiając czas ekspozycji, zamykając/otwierając migawkę między akwizycją obrazu dla każdego kanału i nakładając na siebie każde zdjęcie zrobione dla poszczególnych kanałów.
        UWAGA: Tryb akwizycji ND automatyzuje ten proces i zapewnia scalone obrazy.
      8. Zapisz obraz jako plik .nd2 (format Nikon Elements zapisuje metadane). Zapisz pliki TIF, w tym scalony obraz kanału i obrazy poszczególnych kanałów.
        UWAGA: Pliki TIF mogą być używane z szerszym wyborem aplikacji.
      9. Użyj funkcji Liczba obiektów na pasku narzędzi Analiza, aby policzyć liczbę komórek NHF-ATP-, TMR-HMWFD-i/lub TMR-LMWFD-dodatnich w zapisanym pliku obrazu .nd2.
      10. Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego za pomocą programu do analizy.
  7. Kwantyfikacja i analiza danych
    1. Dla każdego badanego warunku zobrazuj od 50 do 100 komórek w celu określenia ilościowego. Korzystając z oprogramowania do analizy danych (oprogramowanie dołączone do systemu obrazowania epifluorescencji lub innego oprogramowania), policz i oblicz średnią liczbę pęcherzyków fluorescencyjnych na komórkę.
    2. Użyj odpowiednich metod statystycznych do analizy ilościowej wyników.

3. Internalizacja ATP w nowotworach, ex vivo (Rysunek 3)

figure-protocol-2
Rysunek 3: Procedura in vivo do badania internalizacji ATP. Schematyczne przedstawienie protokołu wizualizacji internalizacji zewnątrzkomórkowego ATP w ksenoprzeszczepach nowotworowych za pomocą kriosekcji i mikroskopii fluorescencyjnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przygotowanie kultur komórkowych do implantacji
    1. Hodować komórki rakowe do 80% konfluencji w temperaturze 37 °C w kolbie o długości 225cm2, używając DMEM uzupełnionego FBS, do końcowego stężenia 10% (v/v) i penicyliny/streptomycyny do 1% (v/v).
    2. Umyj komórki dwa razy 10 ml PBS. Podgrzej 0,25% trypsyny/EDTA do temperatury 37 °C. Dodać 8 ml trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.
    3. Gdy komórki zaczną odłączać się od dna kolby, użyj sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aby dodać 8 ml DMEM/FBS. Odessać dwa razy, aby usunąć wszelkie przylegające komórki. Za pomocą pipety przenieść oderwane komórki z kolby do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    4. Dodać 10 ml DMEM/FBS za pomocą pipety 10 ml i zebrać wszystkie pozostałe pływające komórki w tej samej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    5. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 600 × g, 4 °C przez 4 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego PBS.
    6. Policz gęstość komórek za pomocą hemocytometru. Podczas liczenia utrzymuj zawiesinę komórek na lodzie.
    7. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 600 × g, w temperaturze 4 °C przez 4 minuty. Usunąć supernatant i zawiesić komórki w lodowatym PBS tak, aby gęstość komórek wynosiła 5 × 106 komórek na 100 μl PBS. Przenieść zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Podskórne wstrzykiwanie komórek nowotworowych w celu rozwoju guza ksenoprzeszczepu
    1. Do wstrzykiwania komórek rakowych należy użyć strzykawki bez lateksu (1 ml) z precyzyjną igłą ślizgową (igła 27 G).
    2. Przenieść zawiesinę komórek (5 × 106 w 100 μl PBS) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Pobrać komórki do strzykawki.
    3. Wybierz miejsce wstrzyknięcia na boku myszy z niedoborem odporności (nago) i delikatnie oczyść skórę za pomocą 75% etanolu. Zetrzyj nadmiar etanolu delikatną chusteczką zadaniową.
    4. W przypadku wstrzyknięcia podskórnego należy trzymać igłę pod kątem około 10° do skóry. Wbić końcówkę igły skośnie do góry, tuż pod skórą, tak aby na zewnątrz skóry widoczne było tylko 1-2 mm igły. Dozować komórki ze strzykawki powoli przez około 10 sekund.
    5. Po wstrzyknięciu całej objętości należy kontynuować trzymanie igły w miejscu przez 3-5 sekund, a następnie wyjąć igłę i delikatnie ale mocno uciskać miejsce wstrzyknięcia palcem przez kolejne 3-5 sekund, aby zapobiec wyciekowi wstrzykniętej zawartości.
    6. Monitoruj i mierz wzrost guza za pomocą suwmiarki, aż guzy osiągną objętość 200-500 mm3.
  3. Przygotowanie roztworów HMWFD i NHF-ATP do stosowania po resekcji guza
    1. Rozpuścić 300 μl 16 mg/ml HMWFD w DMEM (pożywce hodowlanej) bez surowicy, inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut i odwirować przy 12 000 × g przez 5 minut, jak opisano powyżej. Przenieść roztwór do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać 40 μl analogowego produktu wyjściowego NHF-ATP (1 mM) do 160 μl DMEM bez surowicy, aby przygotować 0,2 mM roztwór NHF-ATP.
  4. Przygotowanie studni doświadczalnych
    UWAGA: Ten eksperymentalny projekt będzie oznaczał wewnątrzkomórkową internalizację HMWFD + NHF-ATP, wskazującą na wychwyt przez makropinosomy.
    1. Przygotuj studzienki w następujący sposób: Studzienka #1, Kontrola: 200 μL DMEM bez surowicy; Studnia # 2, kontrola: 100 μL 16 mg / ml LMWFD + 100 μL DMEM bez surowicy = 200 μL 8 mg / ml LMWFD; Studnia #3, kontrola: 100 μL 0,2 mM NHF-ATP + 100 μL DMEM bez surowicy = 200 μL 0,1 mM NHF-ATP; Cóż #4; Eksperymentalny: 100 μL 16 mg/ml HMWFD + 100 μL 0,2 mM NHF-ATP = 200 μL 0,1 mM NHF-ATP i 8 mg/ml HMWFD.
  5. Przygotowanie tkanek nowotworowych
    1. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy lub zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC.
    2. Użyj skalpela w rozmiarze 10, aby pokroić izolowane guzy o grubości ~500-1,000 μm.
    3. Inkubować plastry guza w DMEM bez surowicy uzupełnionym 100 μM NHF-ATP i/lub 8 mg/mL H/LMWFD w probówkach mikrowirówek przez 40 minut w temperaturze 37 °C przy przepływie 5% CO2
      UWAGA: Po inkubacji metabolizm tkanki nowotworowej powoduje zmianę koloru pożywki.
    4. Opłucz chusteczki w podgrzanym PBS o temperaturze 37 °C (2 ml na każde płukanie w 24-dołkowej płytce).
    5. Przenieś tkankę na nową 24-dołkową płytkę z podgrzanym świeżym PBS, spłucz i powtórz cztery razy, delikatnie wstrząsając.
  6. Kriozatapianie (przygotowanie zamrożonych bloków tkanek)
    1. Przygotuj etykiety identyfikacyjne dla każdego guza, który ma zostać pobrany. Wytnij 2 cm kawałek taśmy laboratoryjnej i złóż na pół, sklejając boki razem, wzdłuż. Użyj pisaka do znakowania, aby oznaczyć znacznik, np. numerem identyfikacyjnym myszy/guza
      2. .
    2. Przygotuj formy do zatapiania, umieszczając formy do bibułek ze stali nierdzewnej bezpośrednio na suchym lodzie.
      UWAGA: Suchy lód może spowodować odmrożenia, oparzenia i uduszenie. Podczas pracy z suchym lodem należy nosić ocieplane rękawice. Używaj suchego lodu w dobrze wentylowanym miejscu. Nie przechowuj suchego lodu w szczelnie zamkniętym pojemniku. Zamiast tego przechowuj w pojemniku (takim jak styropianowa chłodnica), który umożliwia ucieczkę gazu.
    3. Podczas gdy pleśń stygnie, umieść niewielką kałużę pożywki do zamrażania tkanek na 10-milimetrowej płytce do hodowli tkankowej. Upewnij się, że objętość jest wystarczająca do zanurzenia tkanki nowotworowej, która zostanie pobrana.
    4. Użyj perforowanej łyżki, aby zebrać wyciętą tkankę nowotworową i natychmiast umieść tkankę w pożywce zamrażającej, upewniając się, że tkanka jest zanurzona. Za pomocą perforowanej łyżki delikatnie zwiń chusteczkę w pożywce zamrażającej, upewniając się, że podłoże kąpie wszystkie powierzchnie tkanki.
    5. Ostrożnie przenieś tkankę do formy do zatapiania zawierającej medium zamrażające. Umieść odpowiednią etykietę pionowo w medium zamrażającym/formie, aby zamrozić na miejscu. Upewnij się, że pisemna etykieta jest widoczna poza nośnikiem.
    6. Po zakończeniu zamrażania (pożywka do zamrażania zmienia kolor na nieprzezroczysty biały), wyjmij blok tkanki z formy, umieść go na suchym lodzie i powtórz dla każdego guza. Bloki tkanek należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy przed zabiegiem kriosekcji.
  7. Przygotowanie preparatów z próbkami tkanek
    1. Aby zmaksymalizować szansę na znalezienie komórek z dodatnim wynikiem internalizacji i uzyskanie bardziej reprezentatywnych regionów tkanki, należy pobrać seryjne kriosekcje w temperaturze od -18 do -20 °C za pomocą kriostatu.
      1. Wstępnie schłodzić narzędzia do kriostatu (ostrze, żyletka, płytka zapobiegająca zwijaniu się, uchwyt na chusteczkę, pędzel) i zrównoważyć bloki tkanki nowotworowej, umieszczając je w komorze kriostatu w temperaturze od -18 do -20 °C. Ustaw kąt uchwytu ostrza na 5-10°. W razie potrzeby ostrożnie przytnij blok tkanki żyletką i zamontuj go na uchwycie uchwytu, używając pożywki do zamrażania tkanek jako "kleju".
      2. Zablokuj uchwyt uchwytu w pozycji pionowej na mikrotomie, który przesuwa się na ustawioną odległość (np. 10 μm) z każdym obrotem korby ręcznej. Ustaw płytkę stabilizującą przechylanie się tak, aby spoczywała tuż nad wysokością ostrza. Aby zapobiec zwijaniu się tkanki przed przesunięciem mikrotomu, ostrożnie przesuń kciuk po dolnej krawędzi bloku tkanki.
      3. W miarę postępu mikrotomu i opadania fragmentu tkanki na metalową płytkę, użyj pędzla, aby poprowadzić wycinek tkanki i rozwiń tkankę, jeśli to konieczne.
      4. Umieść szkiełko mikroskopu nad sekcją tkanki bez dotykania, tak aby sekcja została przyciągnięta do szkiełka.
        UWAGA: Ostrza kriostatu (wysokoprofilowe, jednorazowe) są bardzo ostre i mogą spowodować poważne obrażenia. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z ostrzami i obsługi kriostatu. Użyj osłony ostrza, jeśli jest dostępna. Wymagane jest odpowiednie szkolenie.
      5. Pokrój guz na sekcje o grubości 10 μm. Natychmiast przenieś pokrojone sekcje na dodatnio naładowane szklane szkiełko mikroskopowe.
        UWAGA: W przypadku sekcji szeregowych najpierw zbierz sekcję o grubości 10 μm w lewym górnym rogu każdego z ośmiu dodatnio naładowanych szkiełek. Przeprowadź kriostat przez kolejne 100-200 μm tkanki i wyrzuć tkankę. Natychmiast przenieś wszystkie pokrojone sekcje na szklane szkiełka mikroskopowe.
      6. Następnie zbierz kolejny wycinek o grubości 10 μm, obok wcześniej umieszczonego odcinka tkanki, dla każdego z ośmiu szkiełek. Powtarzaj ten proces pobierania seryjnego, aż każde z ośmiu szkiełek będzie zawierało osiem odcinków tkanki, każda oddalona od siebie o 100-200 μm. Skrawki tkanek należy przechowywać w ciemności, aby zachować fluorescencję.
        UWAGA: Wycinki tkanek na szkiełkach można przechowywać w pudełku na szkiełka w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.
  8. Mocowanie szkiełek tkankowych
    1. ETAP KRYTYCZNY: Utrwalić skrawki tkanki w 95% etanolu w temperaturze od -18 do -20 °C do 5 minut.
    2. Myć utrwalony fragment przez 5 minut PBS w temperaturze pokojowej, a następnie zamontować nieruchome skrawki guza pod szklanym szkiełkiem nakrywkowym za pomocą 10 μl wodnego podłoża montażowego z DAPI.
    3. Dwanaście do 24 godzin po zamontowaniu zbadaj utrwalone skrawki guza za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i uzyskaj obrazy, jak opisano dla hodowanych komórek powyżej.
  9. Mikroskopia fluorescencyjna i akwizycja obrazu
    1. Zidentyfikuj obszary zainteresowania i uzyskaj obrazy, zgodnie z opisem w sekcji 2.6.
  10. Kwantyfikacja i analiza danych
    1. Określić ilościowo komórki i zastosować odpowiednie analizy statystyczne, jak w sekcji 2.7.

4. Internalizacja ATP w nowotworach, in vivo

  1. Przygotować hodowle komórkowe do implantacji zgodnie z opisem w punkcie 3.1.
  2. Podskórne wstrzykiwanie komórek nowotworowych w celu rozwoju guza ksenoprzeszczepu
    1. Generuj ksenoprzeszczepowane guzy zgodnie z opisem w punkcie 3.2.
  3. Iniekcja ATP i/lub dekstranu do guzów ksenoprzeszczepu
    1. Przygotować roztwory do leczenia DMEM (nośnik) lub 8 mg/ml HMWFD lub LMWFD, z lub bez NHF-ATP (100 μM) w DMEM, jak opisano powyżej.
    2. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml zebrać 50 μl jednego roztworu leczniczego i wstrzyknąć roztwór bezpośrednio do każdego guza ksenoprzeszczepu. Powtórzyć procedurę dla czterech powtórzeń biologicznych każdego zabiegu.
  4. Pobieranie tkanek i kriozatapianie
    1. Przygotuj etykiety identyfikacyjne dla każdego guza, który ma zostać pobrany. Wytnij 2 cm kawałek taśmy laboratoryjnej i złóż na pół, sklejając boki razem, wzdłuż. Użyj pisaka do znakowania, aby oznaczyć znacznik, np. numerem identyfikacyjnym myszy/guza
      2. .
    2. Około 5 minut po wstrzyknięciu należy poddać mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy lub zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC.
    3. Za pomocą skalpela w rozmiarze 10 wykonaj nacięcie przylegające do guza i w przybliżeniu prostopadłe do kierunku wkłucia igły. Użyj kleszczy i nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć tkankę nowotworową z otaczającej tkanki.
    4. Podziel guz na dwie do czterech 1 cm2 części, w zależności od całkowitej wielkości guza.
    5. Przygotować formy do zatapiania i zatopić tkankę, jak opisano powyżej w sekcji 3.6. Upewnij się, że czas zbioru, od wstrzyknięcia dekstranu do kriozatapiania, nie przekracza 7-8 minut.
  5. Przygotowanie preparatów z próbkami tkanek
    1. Pobrać seryjne wycinki guza, jak opisano w punkcie 3.7.
  6. Mocowanie szkiełek tkankowych
    1. Utrwalić tkankę zgodnie z opisem w punkcie 3.8.
  7. Mikroskopia fluorescencyjna i akwizycja obrazu
    1. Zidentyfikuj obszary zainteresowania i uzyskaj obrazy, jak opisano w sekcji 2.6.
  8. Kwantyfikacja i analiza danych
    1. Określić ilościowo komórki i zastosować odpowiednie analizy statystyczne, jak opisano w sekcji 2.7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie in vitro
Wewnątrzkomórkową internalizację NHF-ATP wykazano przez kolokalizację NHF-ATP z HMWFD lub LMWFD (Figura 4). Powodzenie tej procedury zależy przede wszystkim od zastosowania odpowiednich stężeń NHF-ATP i dekstransu oraz od określenia odpowiedniego typu (rodzajów) dekstransu (polilizyna vs. neutralny). Na przykład, aby zbadać makropinocytozę, wybrano HMWFD, ponieważ jest on internalizowany tylko przez makropinosomy13...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano metodę przestrzennej, czasowej i ilościowej analizy internalizacji komórkowej niehydrolizowanego ATP. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w różnych systemach biologicznych, w tym w różnych modelach rakotwórczych, dla których zapewniamy instrukcje techniczne i reprezentatywne dane. Aby uzyskać możliwe do interpretacji dane podczas badań internalizacji ATP in vivo (sekcja 4 protokołu), kluczowe znaczenie ma ograniczenie eksperymentalnego czasu, jaki upłynął od wstrzyknięcia dekstranu do krioosadzania. Mo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriosekcja została przeprowadzona na miejscu w Centrum Histopatologii Uniwersytetu Ohio. Prace te były częściowo wspierane przez fundusze start-upowe (Ohio University College of Arts & Sciences) dla C Nielsena; Grant NIH R15 CA242177-01 i nagroda RSAC dla X Chen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Komórki A549, ludzki nabłonek płuc, rakNational Cancer Instituten/aTańsze źródło
AcetonFisher ScientificS25904
Folia aluminiowa, ReynoldsGrainger6CHG6
Wodne podłoże montażowe, ProLong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciuThermoFisherP36930
Analog ATPJena BiosciencesNK-101
Autoklaw, sterylizatorGrainger33ZZ40
Ostrza, kriostat, wysoki profilC. L. Sturkey, Inc.
Suwmiarki, noniuszGrainger4KU77
Pożywka komórkowa, mieszanka składników odżywczych szynki F12, bez surowicyMillipore Sigma51651C-1000ML
Wirówka, chłodzona z wahliwym wirnikiem kubełkowymEppendorf5810R
ChloroformAcros Organics423555000
Probówka stożkowa, 15 mlVWR21008-216
Rurka stożkowa, 50 mlVWR21008-242
Szkiełka nakrywkowe, szkło, 12 mmKriostat Corning2975-245
, Leica CM1950Leica BiosystemsCM1950
Delikatna chusteczka do zadań, Kim WipesKimberly-Clark34155
Dekstran, utrwalana lizyną, o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW)InvitrogenD1818MW = 70 000, dekstran tetrametylorodaminy
, neutralny, o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW)InvitrogenD1819
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM), bez surowicyFisher Scientific11885076
Suchy lódDostawa lokalnaZamówienie niestandardowe
System obrazowania epifluorescencyjnego, Nikon NiU i Nikon NIS Oprogramowanie do akwizycji elementówNikonNa zamówienie
EtanolFisher ScientificBP2818-4
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Kleszcze16000044
, Dumont #7, zakrzywioneKleszcze Fine Science Tools11274-20
, Dumont #5, prosteRękawice Fine Science Tools11254-20
(małe, średnie, duże)MicroflexN191, N192, Rękawice N193
, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (do pracy z suchym lodem)Fisher Scientific19-046-563
HemocytometrDaiggerEF16034F EA
Inkubator, hodowla komórkowaEppendorfGalaxy 170 S
Taśma opisowaFisher Scientific159015R
Pisak do znakowania, Sharpie (ultra-drobny)Zszywki
Myszy, z niedoborem odporności (Nu/J)Laboratorium Jacksona2019
Mikrowirówka, accuSpin Micro17Fisher Scientific13-100-675
Probówki do mikrowirówek, probówki Eppendorfa (1,5 ml)AxygenMCT-150-C
Pudełko na szkiełka mikroskopoweFisher Scientific50-751-4983
Igła, rozmiar27Becton-Dickinson752 0071
PędzelGrainger39AL12
Ręczniki papieroweZszywki33550
ParaformaldehydAcros Organics416785000
Penicylina/StreptomycynaGibco15140122
Łyżka perforowana, średnica 15 mm, długość 135 mmRoboz Surgical Instrument Co.RS-6162
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Fisher ScientificBP3991
Końcówki do pipet (10 μ L)Fisher Scientific02-707-438
Końcówki do pipet (200 μ L)Fisher Scientific02-707-411
Końcówki do pipet (1000 μ L)Fisher Scientific02-707-403
Pipety, serologiczne (10 ml)VWR89130-910
Pippetor, Gilson P2DaiggerEF9930A
Zestaw startowy pipetora, Gilson (2-10 μ L, 20-200 μ L, 200-1000 μ L)DaiggerEF9931A
Wytrząsarka platformowa - orbitalna, stołowaCole-ParmerEW-51710-23
Dodatnio naładowane szkiełka mikroskopowe, skalpel SuperfrostFisher Scientific12-550-15
, rozmiar 10, Surgical Design, Inc.Fisher Scientific22-079-707
Nożyczki chirurgiczne - ostre, zakrzywioneFine Science Tools14005-12
Oprogramowanie do analizy obrazu, Nikon ElementsNikon Nazamówienie
Oprogramowanie do analizy obrazu, ImageJ (FIJI)National Institutes of Healthn/aPobierz online (bezpłatnie)
Tarcza do próbek 30 mm (uchwyt uchwytu), akcesorium do kriostatuLeica Biosystems14047740044
Taca do barwienia, 245 mm Naczynie do testów biologicznych
, 1 ccBecton-Dickinson309623
, laboratoryjna, szerokość 19 mmFisher Scientific15-901-5R
Timer Fisher Scientific14-649-17
Naczynie do hodowli tkankowych, średnica100 x 15 mmFisher Scientific08-757-100D
Kolba do hodowli tkankowych, 225 cm2ThermoFisher159933
Płytka do hodowli tkankowych, 24-dołkowaBecton-Dickinson353226
Forma do zatapiania tkanek, stal nierdzewnaTissue Tek4161
Podłoże do zamrażania tkanek, optymalna temperatura cięcia (OCT)Fisher Scientific4585
Trypsyna-EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), 0,25%Gibco25200072
Łaźnia wodna, Precision GP 2SThermoFisherTSGP2S
DT554550ThermoFisher642736 Strzykawka Corning 431111 Taśma

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
  2. Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 3, 25992008(2008).
  3. Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space. Interface Focus. 3 (3), 20120101(2013).
  4. Michaud, M., et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science. 334, 1573-1577 (2011).
  5. Wilhelm, K., et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).
  6. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  7. Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 85-95 (2011).
  8. Chen, X., Qian, Y., Wu, S. The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept. Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).
  9. Wang, X., et al. Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase. Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).
  10. Patel, A., et al. ATP as a biological hydrotrope. Science. 356, 753-756 (2017).
  11. Qian, Y., et al. Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells. Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).
  12. Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms. Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).
  13. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
  14. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
  15. Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline. Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).
  16. Hoppe, H. C., et al. Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).
  17. Chaudry, I. H. Does ATP cross the cell plasma membrane. Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).
  18. Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).
  19. Chaudry, I. H., Baue, A. E. Further evidence for ATP uptake by rat tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).
  20. Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).
  21. Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes & Development. 26, 877-890 (2012).
  22. Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. ATP consumption promotes cancer metabolism. Cell. 143, 669-671 (2010).
  23. Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection. Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).
  24. Szendroedi, J., et al. Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes. PLoS Medicine. 4, 154(2007).
  25. Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyATP InternalizationMacropinocytosisHuman Tumor CellsTumor Xenograft MiceExtracellular ATPEndocytosis TracersFluorescent DextranEpifluorescence ImagingCryosectioning Procedure

Related Articles