Stosowanie tlenu hiperbarycznego w celu poprawy wrażliwości na promieniowanie ludzkich komórek glejaka U251

Podsumowanie

Ten protokół pokazuje, że tlen hiperbaryczny może zwiększyć hamowanie proliferacji i apoptozę komórek glejaka U251 poddanych promieniowaniu rentgenowskiemu poprzez blokowanie komórek w fazie G2/M. Poprawia to radiowrażliwość ludzkich linii komórkowych glejaka.

Streszczenie

Celem tego badania było zbadanie możliwości wykorzystania tlenu hiperbarycznego do zwiększenia wrażliwości na promieniowanie komórek ludzkiego glejaka. Hodowane w subkulturze ludzkie komórki glejaka U251 zostały losowo podzielone na cztery grupy: nieleczoną grupę kontrolną, komórki traktowane tylko tlenem hiperbarycznym (HBO), komórki traktowane tylko promieniowaniem rentgenowskim (promieniowanie rentgenowskie) oraz komórki traktowane zarówno HBO, jak i promieniowaniem rentgenowskim. W tych grupach obserwowano morfologię komórek, aktywność proliferacji komórek, dystrybucję cyklu komórkowego i apoptozę, aby ocenić rolę HBO w poprawie wrażliwości komórek glejaka na promieniowanie . Wraz ze wzrostem dawek promieniowania rentgenowskiego (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy) frakcja przeżycia (SF) komórek glejaka stopniowo się zmniejszała.

Znacznie niższe SF zaobserwowano dla komórek leczonych HBO i promieniowaniem rentgenowskim razem niż w grupie rentgenowskiej dla każdej dawki (wszystkie P < 0,05). Zahamowanie proliferacji było istotnie wyższe w grupie HBO w połączeniu z promieniowaniem rentgenowskim niż w grupie rentgenowskiej dla każdej dawki (wszystkie P < 0,05) dla linii komórkowej U251. Odsetek komórek fazowych G2/M był istotnie wyższy w grupie HBO w połączeniu z promieniowaniem rentgenowskim (2 Gy) (26,70% ± 2,46%) i HBO (22,36% ± 0,91%) niż w grupie kontrolnej (11,56% ± 2,01%) i rentgenowskiej (2 Gy) (10,35% ± 2,69%) (wszystkie P < 0,05). Apoptoza komórek U251 była znacznie wyższa w grupie HBO w połączeniu z promieniowaniem rentgenowskim (2 Gy) niż w grupie HBO, grupie rentgenowskiej (2 Gy) i grupie kontrolnej (wszystkie P < 0,05). Wnioskujemy, że HBO może zwiększyć hamowanie proliferacji, inhibicję i apoptozę komórek glejaka U251 poprzez blokowanie komórek glejaka w fazie G2 / M i poprawę wrażliwości na promieniowanie komórek glejaka U251.

Wprowadzenie

Glejak to pierwotny nowotwór wewnątrzczaszkowy, który wywodzi się z komórek glejowych ośrodkowego układu nerwowego¹. Obecną strategią leczenia glejaka jest operacja połączona z radioterapią i chemioterapią. Pooperacyjna radioterapia glejaka może zapewnić korzyści w zakresie przeżycia (dowody I stopnia), a wczesna radioterapia pooperacyjna może skutecznie przedłużyć przeżycie pacjenta (dowody II stopnia)². W przypadku glejaków wyższego stopnia (stopień III lub IV), zwłaszcza glejaka wysoce złośliwego i inwazyjnego (dowody III stopnia)³, radioterapię pooperacyjną należy przeprowadzić jak najwcześniej (<6 tygodni). Jednak pomimo wczesnej interwencji, glejak nadal ma wysoki wskaźnik nawrotów i złe rokowanie po kompleksowym leczeniu. Wyniki te są głównie związane z niską wrażliwością glejaka na radio. Czynniki związane z wrażliwością guza na promieniowanie obejmują wrodzoną wrażliwość na promieniowanie komórek nowotworowych, niedotlenionych lub nieniedotlenionych komórek nowotworowych, proporcję niedotlenionych komórek nowotworowych oraz zdolność tkanki okołonowotworowej do naprawy uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem⁴.

Wśród tych czynników, niedotlenione lub nieniedotlenione komórki nowotworowe oraz proporcja niedotlenionych komórek nowotworowych mają istotny wpływ na radiowrażliwość guza. Tlen hiperbaryczny (HBO) może poprawić magazynowanie tlenu w tkankach poprzez zwiększenie napięcia tlenu w tkankach i dyfuzji tlenu we krwi. HBO może również wytwarzać szereg korzystnych efektów biochemicznych, cytologicznych i fizjologicznych⁵. Na przykład HBO ma wyraźny efekt naprawczy w przypadku uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem wywołanym radioterapią. Chociaż doniesiono, że HBO w połączeniu z radioterapią lub chemioterapią poprawia skuteczność kliniczną radioterapii lub chemioterapii w przypadku glejaka⁶, toczy się poważna debata na temat tego, jak samo HBO wpływa na wzrost glejaka złośliwego. Ding i wsp.⁷ oraz Wang et al.⁸ wykazali, że HBO promuje wzrost glejaka in situ u myszy poprzez mechanizmy, które obejmują hamowanie apoptozy i promowanie angiogenezy guza. W warunkach fizjologicznych HBO promuje angiogenezę guza poprzez indukowanie stresu oksydacyjnego⁹.

Jednak jedno z badań wykazało, że krótkotrwała ekspozycja na HBO sprzyja proliferacji komórek nowotworowych, podczas gdy długotrwała ekspozycja na HBO sprzyja apoptozie i hamuje proliferację¹⁰. Dlatego potrzebne są dalsze badania, aby zbadać, czy HBO promuje, czy hamuje wzrost glejaka i w jaki sposób HBO w połączeniu z radioterapią lub chemioterapią może wywołać uczulenie terapeutyczne. W szczególności potrzebne są mechaniczne szczegóły dotyczące tego, w jaki sposób HBO poprawia wrażliwość glejaka na promieniowanie promieniotwórcze. Aby zbadać, w jaki sposób HBO poprawia wrażliwość na promieniowanie ludzkich komórek glejaka U251 w tym badaniu, zastosowaliśmy HBO w połączeniu z promieniowaniem rentgenowskim na proliferację komórek glejaka i zaobserwowaliśmy wpływ na dystrybucję cyklu komórkowego i apoptozę.

Protokół

Wszystkie metody badania zostały zatwierdzone przez Radę Przeglądu Instytucjonalnego oraz Komitet Etyki Drugiego Szpitala Powiązanego z Uniwersytetem w Lanzhou i zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.

1. Traktowanie komórek glejaka

UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystano linię komórkową glejaka U251.

1. Hodowla komórek U251
   1. Wysiać komórki U251 do wielu naczyń z DMEM zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i hodować je w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂.
   2. Po osiągnięciu 50%-60% konfluencji zdissocjować komórki za pomocą roztworu trypsyny-EDTA (0,25%, bez czerwieni fenolowej), a następnie pozwolić im urosnąć do 80% konfluencji.
2. Naświetlanie promieniami rentgenowskimi
   1. Przykryć płytki lub kolby hodowlane ekwiwalentnym kompensatorem tkankowym o grubości do 1 cm. Następnie poddać komórki naświetlaniu promieniami rentgenowskimi z liniowego akceleratora 6 MV z odległości źródła od komórek wynoszącą 100 cm, regulowaną poprzez naciśnięcie przycisku rotate na zdalnym panelu sterowania.
   2. Zlecić fizykowi pomiar dawki promieniowania i korektę tłumienia. W ramach kontroli umieścić w detektorze kolby zawierające pożywkę przed naświetlaniem rentgenowskim.
3. Tlen hiperbaryczny (HBO)
   1. Zdezynfekować komorę HBO, włączając światło ultrafioletowe na 15 min, a następnie wypełnić ją czystym tlenem pod ciśnieniem 0,02 MPa przez 5 min.
   2. Po umieszczeniu komórek w płytkach lub kolbach hodowlanych w komorze, nacisnąć przycisk pressure regulator na panelu sterowania na zewnątrz komory, aby zwiększyć ciśnienie HBO w komorze do 0,2 MPa (2,0 ATA) w ciągu 30 min naświetlania.
   3. Trzydzieści minut później nacisnąć przycisk pressure regulator, aby obniżyć ciśnienie HBO do poprzedniego poziomu (0,1 MPpa). Następnie poddawać butelki lub płytki hodowlane działaniu HBO 1x dziennie przez 3 kolejne dni.

2. Komórki glejaka U251 w różnych grupach

1. Wyznacz grupę kontrolną, grupę poddaną działaniu promieniowania rentgenowskiego (2 Gy) oraz grupę poddaną łączonemu działaniu HBO i promieniowania rentgenowskiego (2 Gy) w celu wykreślenia krzywych wzrostu komórek.
2. Przygotuj zawiesiny pojedynczych komórek z linii komórek glejaka U251 wykazujących maksymalne tempo wzrostu (patrz krok 1.1.2). Dostosuj gęstość komórek do poziomu 1 × 10⁶/mL, licząc komórki za pomocą komory licznikowej. Następnie dodaj 1 mL zawiesiny komórkowej do butelki hodowlanej (gęstość komórek: 1 × 10⁶/butelkę), stosując trzy oddzielne butelki dla każdej grupy.
3. Oceń morfologię komórek przy powiększeniu 100x za pomocą mikroskopu w polu jasnym, aby zliczyć komórki adherentne po 24 h, 48 h i 72 h hodowli.

3. Radiowrażliwość komórek glejaka U251 (test tworzenia kolonii) w ciągu 30 min po HBO

1. Wysiać zawiesinę pojedynczych komórek U251 do studzienek płytek 6-dołkowych w zagęszczeniu 5 × 10² cells/mL, a następnie poddać je działaniu wskazanego poziomu dawki promieniowania rentgenowskiego (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy i 8 Gy), badając trzy próbki równoległe dla każdej dawki promieniowania.
2. W przypadku grupy HBO w połączeniu z promieniowaniem rentgenowskim (2 Gy), poddać komórki naświetlaniu w ciągu 30 min od zabiegu HBO. Po zabiegu inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ przez 14 dni.
3. Po pojawieniu się widocznych kolonii usunąć medium i przemyć kolonie 2x PBS.
4. Utrwalić komórki w 1 mL 10% metanolu przez 15 min, a następnie zabarwić 1 mL 0,1% fioletu krystalicznego przez 20 min.
5. Po barwieniu przemyć komórki 6 mL wody destylowanej za pomocą pipety, a następnie odessać roztwór fioletu krystalicznego. Pozostawić komórki do wyschnięcia na powietrzu.
6. Policzyć pod mikroskopem kolonie o średnicy od 0,3 mm do 1,0 mm, aby upewnić się, że każda kolonia składa się z >50 komórek.
7. Obliczyć frakcję przeżycia (SF) korzystając z równania (1):
   SF = × 100%    (1)
8. Za pomocą oprogramowania statystycznego wygenerować krzywą przeżywalności w zależności od dawki promieniowania w oparciu o model pojedynczego trafienia w wiele celów (SHMT), korzystając z równania (2):
   S = 1 - (1 - )^N    (2)
   Gdzie S = prawdopodobieństwo przeżycia; k = średnia dawka letalna (dawka powodująca średnio jedno trafienie na komórkę); x = liczba trafień na komórkę; N = liczba celów (liczba trafień niezbędnych do śmierci komórki).
9. Obliczyć parametry radiobiologiczne, w tym średnią dawkę letalną (D₀), dawkę quasi-progową (Dq), liczbę ekstrapolacji (N), frakcję przeżycia przy dawce naświetlania 2 Gy (SF₂), współczynnik wzmocnienia uwrażliwienia (D₀) (SER = D₀ w grupie kontrolnej/D₀ w grupie eksperymentalnej) oraz SER (Dq) (SER = Dq w grupie kontrolnej/Dq w grupie eksperymentalnej), aby ocenić wpływ HBO na radiowrażliwość komórek glejaka U251.
   Gdzie D₀ = wartość odwrotna do nachylenia liniowej części krzywej przeżywalności (dawka redukująca przeżywalność o 63%)
   N = wartość punktu przecięcia powstałego przez ekstrapolację części liniowej do osi rzędnych (odzwierciedla zdolność komórek do naprawy uszkodzeń wywołanych promieniowaniem)
   Dq = wartość punktu projekcji przecięcia na osi odciętych oraz przecięcia utworzonego przez poprowadzenie linii przez wartość 1,0 na osi rzędnych, równolegle do osi odciętych, do linii ekstrapolacji.

4. Test zliczania komórek w celu oceny proliferacji komórek glejaka U251

1. Wyznacz grupę kontrolną, grupę HBO oraz grupy poddane działaniu samego promieniowania rentgenowskiego (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy) lub w połączeniu z HBO.
2. Dostosuj gęstość komórek do poziomu 1 × 10⁴ komórek/mL, wykorzystując zawiesiny pojedynczych komórek linii U251.
3. Wysiej zawiesiny komórek (100 µL, gęstość: 1 × 10³/dołek) na płytkach 96-dołkowych (pięć dołków na grupę). Przeprowadź test zliczania komórek (patrz Tabela materiałów), a następnie po 48 h hodowli z odczynnikiem zmierz gęstość optyczną (OD) przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
4. Oblicz wskaźnik hamowania proliferacji komórek (IR) zgodnie z równaniem (3):
   IR = × 100%    (3)

5. Wykrywanie apoptozy komórek glejaka U251

1. Wyznaczyć grupę kontrolną oraz grupy: HBO, promieniowanie rentgenowskie (2 Gy) i HBO w połączeniu z promieniowaniem rentgenowskim (2 Gy).
2. Usunąć medium po hodowli i przemyć komórki 1x PBS.
3. Odczepić komórki za pomocą trypsyny, a następnie zneutralizować działanie trypsyny poprzez dodanie DMEM po zaobserwowaniu pod mikroskopem zaokrąglenia morfologii komórek.
4. Przenieść komórki do probówki do wirowania i wirować przez 5 min przy 200 × g.
5. Odlać nadsącz, dodać 3 mL 1x PBS do osadu i delikatnie pipetować w celu resuspensji komórek.
6. Ponownie wirować komórki przy 200 × g przez 5 min. Następnie odessać nadsącz PBS i przemyć komórki 2x przed ich resuspensją poprzez delikatne pipetowanie w 50 µL Binding Buffer.
7. Dodać 5 µL annexin V-FITC do komórek w temperaturze 4 °C i inkubować komórki w ciemności w temperaturze 4 °C przez 15 min przed dodaniem 400 µL Binding Buffer. Przenieść mieszaninę do probówki do cytometrii przepływowej zawierającej 5 µL roztworu barwiącego jodkiem propidyny (PI) (10 mg/mL). Wykryć komórki apoptotyczne 5 min później za pomocą cytometrii przepływowej¹¹.
8. Zarejestrować fluorescencję czerwoną przy fali wzbudzenia 488 nm, wprowadzić dane do komputera w celu analizy odsetka każdej fazy cyklu komórkowego dla 5 000 komórek, a następnie wydrukować piki komórek apoptotycznych.
9. Zebrać fluorescencję czerwoną i zieloną przy podwójnym znakowaniu annexin V i PI, wprowadzić dane do komputera w celu analizy, a następnie wydrukować wykres kropkowy (dot plot).

6. Wykrywanie rozkładu cyklu komórkowego komórek glejaka U251

1. Wymyj wspomniane wyżej komórki 2x w 1 mL PBS przed potraktowaniem ich trypsyną.
2. Gdy pod mikroskopem świetlnym zostanie zaobserwowana zaokrąglona morfologia komórek, dodaj DMEM zawierający 10% FBS.
3. Wirowarkuj komórki przez 5 min przy 200 × g w temperaturze pokojowej.
4. Usuń supernatant i resuspenduj komórki w 1 mL PBS przed dodaniem schłodzonego 75% roztworu etanolu.
5. Inkubuj mieszaninę przez co najmniej 4 h lub przez noc w temperaturze −20 °C.
6. Wymyj komórki 2x lodowatym PBS oraz 180 µL EDTA (0,1 mM, 3,7 mg EDTA + 100 mL PBS), 20 µL RNazy A (10 mg/mL), 35 µL Triton X-100 (2%, 2 mL Triton + 98 mL FBS) i 96,5 µL PBS. Następnie dodaj 17,5 µL roztworu PI (1 mg/mL).
7. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 4 °C w ciemności przez 10 min.
8. Wymyj komórki w 200 µL PBS, a następnie umieść je w cytometrze przepływowym w celu oceny rozkładu cyklu komórkowego, zgodnie z wcześniejszym opisem¹².
9. Uruchom cytometr przepływowy w trybie wzbudzania dwulaserowym w przestrzeni trójwymiarowej, z rozmiarem plamki 22 µm x 66 µm i 13 µm x 66 µm. Użyj komory przepływowej o wymiarach 430 µm x 180 µm, widma 300-1100 nm, wykrywalności ≤100 MESF i rozdzielczości CV <2%. Następnie poddaj komórki działaniu światła wzbudzającego o długości fali 488 nm, a sygnały fluorescencyjne wykryj i zmierz za pomocą oprogramowania urządzenia, aby określić rozkład cyklu komórkowego¹³.
10. Wyznacz zawartość DNA, a następnie na podstawie zawartości DNA przeanalizuj cykl komórkowy.

7. Analiza statystyczna

1. Przeprowadź analizy statystyczne.
2. Dane należy przedstawić jako średnia ± odchylenie standardowe.
3. Użyj studenta/studentki t-test w celu porównania grup, przy przyjętej istotności statystycznej wynoszącej P < 0.05.

Wyniki

Hodowla komórek glejaka U251
Komórki glejaka U251 miały kształt wrzecionowaty od 24 h do 48 h po hodowli w DMEM i były adherentne. Komórki te wykorzystano do dalszych badań (Rysunek 1).

Morfologia i liczba komórek glejaka
Liczba komórek glejaka U251 w grupie HBO w połączeniu z promieniami RTG (2 Gy) była znacząco niższa niż w grupie promieni RTG (2 Gy) po 24 h, 48 h i 72 h hodowli komórkowej (wszystkie P < 0,05...

Dyskusja

Linia komórkowa glejaka U251 jest jedną z najbardziej klasycznych linii komórkowych glejaka ludzkiego i jest szeroko stosowana jako model glejaka w wielu badaniach.

Wpływ HBO na proliferację komórek glejaka U251
HBO zazwyczaj odnosi się do oddychania czystym tlenem (100% stężenie tlenu) w szczelnej komorze pod ciśnieniem 1,5-3 razy wyższym niż normalne ciśnienie atmosferyczne, co może zwiększyć zawartość tlenu w osoczu mikronaczyniowym¹⁴. U pacjent...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor wiązania	Dickinson and Company	RH10 9RR
CCK-8	DOJINDO	zliczania komórek	NJ
CELL FIT			analiza cyklu komórkowego (zawartość DNA)
Analiza komórek apoptotycznych	CELLQUEST
DMEM i aneksyna V-FITC	Gibco BRL
	Dickinson
Glioma U251 i U87	Instytut Biologii
Hiperbaryczna komora tlenowa	Instytut		Hongyuan
medyczny akcelerator liniowy	Elekta Limited Company
czytnik
MOD FITLT formac v1.01			analiza komórkowa - trypsyna w fazie cyklu komórkowego
	Laboratoria Hyclone  Inc

Zestaw testowy Test Cytometr przepływowy Linia komórkowa Komórki w Szanghajumikropłytek