Method Article

Wysokoprzepustowy test na mikropłytkach do ilościowego oznaczania spożycia u Drosophila

DOI:

10.3791/62771

⸱

June 14th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Biochemistry and Center for Human Genetics, Clemson University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test podawania mikropłytek oferuje ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania spożycia płynów u Drosophila. Urządzenie wydrukowane w 3D łączy 96-dołkową mikropłytkę, w której trzymane są muchy, z 1536-dołkową mikropłytką, z której muchy spożywają roztwór pokarmowy z barwnikiem znacznikowym. Spadek objętości roztworu jest mierzony spektrofotometrycznie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantyfikacja spożycia pokarmu u Drosophila służy do badania genetycznych i fizjologicznych podstaw cech związanych z konsumpcją, ich czynników środowiskowych oraz toksykologicznych i farmakologicznych efektów wielu substancji. Niewiele obecnie stosowanych metod nadaje się do pomiaru wysokiej przepustowości. Test podawania mikropłytek (MFA) został opracowany do ilościowego określania spożycia płynnego pokarmu dla poszczególnych much za pomocą absorbancji. W tym teście muchy spożywają płynną pożywkę pokarmową z wybranych studzienek mikropłytki z 1536 dołkami. Poprzez wprowadzenie rozcieńczonego barwnika znacznikowego do płynnej pożywki spożywczej i załadowanie znanej objętości do każdej studzienki, pomiary absorbancji studzienki uzyskane przed i po spożyciu odzwierciedlają wynikającą z tego zmianę objętości (tj. objętości zużytej). Aby umożliwić wysokoprzepustową analizę za pomocą tej metody, zaprojektowano wydrukowany w 3D łącznik, który umożliwia indywidualne sortowanie much na 96-dołkowe mikropłytki. Urządzenie to precyzyjnie orientuje mikropłytki z 96 i 1536 dołkami, aby zapewnić każdej muchy dostęp do maksymalnie 4 dołków do spożycia, umożliwiając w ten sposób kwantyfikację preferencji żywieniowych oprócz regularnego spożycia. Ponadto urządzenie posiada paski barierowe, które przełączają się między pozycją otwartą i zamkniętą, aby umożliwić kontrolowane przechowywanie i uwalnianie kolumny próbek na raz. Metoda ta umożliwia wysokoprzepustowe pomiary zużycia roztworów wodnych przez wiele much jednocześnie. Ma również potencjał, aby przystosować się do innych owadów i kontrolować spożycie składników odżywczych, toksyn lub farmaceutyków.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster jest szeroko stosowana jako genetyczny organizm modelowy do badania biologicznych podstaw przyjmowania pokarmu i cech związanych z konsumpcją1. Szacuje się, że 65% genów powodujących choroby u ludzi ma funkcjonalne homologi u much, przy czym znaczna część z nich ulega ekspresji w funkcjonalnie równoważnych tkankach między muchami a ludźmi2. Co więcej, wielkość D. melanogaster, krótki czas międzypokoleniowy, prosta pielęgnacja i podatność genetyczna sprawiają, że D. melanogaster jest atrakcyjnym modelem do badań nad spożyciem składników odżywczych3,4 oraz toksykologicznym i farmakologicznym sile różnych substancji, w tym insektycydów5, zanieczyszczeń6, pharmaceuticals7 oraz narkotyków8,9,10.

W wielu przypadkach badanie takich cech wymaga precyzyjnego określenia ilościowego konsumpcji. Metody ilościowego określania zużycia są zróżnicowane i obejmują test CApillary FEeder (CAFE) 11, test MAnual FEeding (MAFE), 12, test Proboscis Extension Response (PER)13, ekstrakcja barwnika znacznikowego14,15, ekstrakcja znacznika oligonukleotydowego16 i ekstrakcja radioizotopów5,17. Ostatnie wysiłki koncentrowały się na zwiększeniu przepustowości tych testów, takich jak w przypadku testu Expresso18 lub opartego na płytkach systemu Whole Animal Feeding FLat (WAFFL) class<="xref">19. Pomimo swojej użyteczności, testy te mogą być skomplikowane, kosztowne lub pracochłonne, co utrudnia ich zastosowanie w badaniach o wysokiej przepustowości.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Elementy testu do podawania mikropłytek. (A) Renderowanie 3D testu z podajnikiem mikropłytek. Mikropłytka 1536-dołkowa jest zorientowana przez łącznik wydrukowany w 3D w taki sposób, że każda studzienka dolnej 96-dołkowej mikropłytki ma dostęp do czterech dołków górnej mikropłytki 1536-dołkowej. Dostęp do studni można kontrolować, regulując położenie pasów barierowych przepuszczonych przez mufę. (B) Graficzne przedstawienie każdego dołka w teście podawania mikropłytek. Roztwory konsumpcyjne są zatrzymywane w każdej studzience za pomocą folii uszczelniającej, która została perforowana, aby umożliwić dostęp muchy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Przegląd procedur w teście z podawaniem mikropłytek. Rysunek przedstawia diagram bloku, który odpowiada krokom 4.1–5.8 protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby pokonać te przeszkody, test podajnika mikropłytek (MFA; Rysunek 1) został opracowany. W tym teście muchy są umieszczane pojedynczo w 96-dołkowych mikropłytkach. Każda mikropłytka jest sprzężona z mikropłytką zawierającą 1536 dołków za pomocą niestandardowego urządzenia wydrukowanego w 3D. Urządzenie precyzyjnie ustawia dwie płytki w taki sposób, że każda mucha w odpowiednim dołku 96-dołkowej płytki ma dostęp do 4 dołków 1536-dołkowej mikropłytki. Dzięki zastosowaniu bezdennej płytki 1536-dołkowej i folii uszczelniających, roztwory są dozowane do wybranych studzienek i perforowane za pomocą precyzyjnych igieł o średnicy 0,25 mm, aby zapewnić dostęp do much. Co najważniejsze, zezwolenie na konsumpcję bezpośrednio z mikropłytki pozwala na natychmiastowe pomiary oparte na absorbancji za pomocą czytnika mikropłytek. Rozcieńczony barwnik znacznikowy jest wprowadzany do pożywki konsumpcyjnej, a zmiana absorbancji po ekspozycji jest wykorzystywana do określenia zużytej objętości ( Rysunek 2 i Rysunek 3). Ponieważ ciecz w każdej studzience jest zbliżona do kolumny płynu, różnice objętościowe objawią się jako różnice w wysokości kolumny. (Rysunek 3A) Zgodnie z prawem Beera-Lamberta20:

figure-introduction-3

gdzie A to absorbancja, ε to molowy współczynnik absorpcji analitu tłumiącego, l to długość ścieżki optycznej, a c to stężenie analitu tłumiącego. Tak więc, przy stałym molowym współczynniku absorpcji i stężeniu, zmiany absorbancji są spowodowane wyłącznie zmianami ścieżki światła optycznego, tj. poziomu płynu w danej studni. Mierząc absorbancję przed i po ekspozycji, proporcjonalna zmiana absorbancji odzwierciedla proporcjonalną zmianę objętości (Rysunek 3B).

figure-introduction-4
Rysunek 3: Kwantyfikacja objętości studni na podstawie absorbancji. (A) Światło padające o znanym natężeniu wejściowym (I0) przechodzi przez każdy dołek. Tłumienie światła przy różnych objętościach wypełnienia daje różne intensywności wyjściowe (I), wykazując liniową zależność między objętością a absorbancją. (B) Empiryczny pomiar absorbancji w funkcji objętości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Na podstawie zmiany objętości, ilość jakiegokolwiek spożytego związku może być obliczona na podstawie jego znanego stężenia w roztworze do karmienia. Części potrzebne do testu są tanie i mają wysoki stopień ponownego użycia, co znacznie zmniejsza powtarzające się koszty testu. W związku z tym procedura ta oferuje przystępną cenowo, wysokowydajną metodę precyzyjnego ilościowego określania zużycia.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie płytki głodowej

  1. Odważyć 1,5 g agarozy do szklanej zlewki o pojemności 250 ml.
  2. Dodać 100 ml destylowanegoH2Odo zlewki.
  3. Kuchenkę mikrofalową z przerwami, aż agaroza zostanie całkowicie stopiona.
    UWAGA: Obserwuj zlewkę, ponieważ agaroza jest podatna na wykipienie.
  4. Wlej stopioną agarozę do koryta odczynnika i dozuj 80 μl stopionej agarozy do każdej studzienki 96-dołkowej mikropłytki za pomocą pipety wielokanałowej. Pozwól płytkom utwardzić się, gdy są przykryte w temperaturze pokojowej. Przechowuj resztki agarozy w lodówce do tygodnia w szczelnie zamkniętej torbie i ponownie rozpuść w celu zrobienia dodatkowych talerzy.

2. Sortowanie na muchy i głód

  1. Przygotuj łączniki, wkładając paski odgradzające do kanałów taśm odgradzających. Jeśli paski barierowe są zbyt luźne, owiń je wokół palca, aby nadać im krzywiznę i utrzymać je w kanałach.
  2. Przymocuj łącznik do płytki głodowej. Nie używaj łącznika do manipulowania płytą, ponieważ łącznik może się ześlizgnąć. Upewnij się, że łączniki są prawidłowo zorientowane (tj. upewnij się, że kątowy róg łącznika pasuje do kątowego rogu mikropłytki).
  3. W znieczuleniu CO2 (tabela materiałów) sortuj 3-5-dniowe muchy. Załaduj pojedyncze muchy kolumnowo do płyty głodowej.
    UWAGA: Chociaż muchy są ładowane według kolumny, zaleca się rozprowadzanie grup próbek wzdłuż rzędów płyty, a nie wzdłuż kolumn (patrz Rysunek 4 dla przykładu układu płyty).
  4. Zamknij każdą kolumnę podczas jej wypełniania, ustawiając jej pasek bariery w pozycji zamkniętej.

figure-protocol-1
Rysunek 4: Reprezentatywny układ płyt głodowych. Diagram przedstawia organizację kontroli parowania oraz samców i samic much w 96-dołkowej płytce użytej w tym badaniu. Można również stosować alternatywne konfiguracje, w tym naprzemienne rzędy samców i samic z kontrolą parowania w rzędach A i H. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Ostrożnie zapisz układ próbki na mikropłytce. Po napełnieniu płytki głodowej pozwól muszkom spontanicznie zregenerować się po usunięciu CO2 i głodz je przez 6 godzin, zaczynając od początkowego czasu znieczulenia.

3. Przygotowywanie płynnych potraw

UWAGA: Codziennie świeżość płynnych potraw.

  1. Przygotować 10 mg/ml roztworu podstawowego barwnika FD&C Blue #1 w destylowanym H2O.
    UWAGA: Może być przechowywany w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.
  2. Przygotuj 10 ml płynnego pokarmu (4% sacharozy, 1% ekstraktu drożdżowego, 40 μg/ml FD&C Blue #1) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, rozpuszczając 0,4 g sacharozy i 0,1 g ekstraktu drożdżowego w 10 ml destylowanego H2O. Wirować probówkę, aż ciała stałe całkowicie się rozpuszczą. Dodać 40 μl roztworu podstawowego barwnika i kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu homogenizacji roztworu.
  3. Przenieś płynny pokarm do strzykawki o pojemności 10 ml zakończonej filtrem 0,45 μm. Przefiltruj ~1,5 ml roztworu na raz do 1,7 ml probówki mikrowirówkowej. Odłożyć na bok strzykawkę zawierającą roztwór i w razie potrzeby przefiltrować dodatkowy roztwór podczas przygotowywania płytki podającej.

4. Przygotowanie płyty podającej

UWAGA: Po napełnieniu należy delikatnie obchodzić się z płytami podajnika, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków lub kropelek w studzience, które mogłyby wpłynąć na odczyty absorbancji.

  1. Przygotuj płytkę podającą, uszczelniając dno mikropłytki z 1536 dołkami folią uszczelniającą. Użyj łopatki uszczelniającej, aby dokładnie przykleić się do folii. Odetnij nadmiar folii z lewej i prawej krawędzi żyletką.
  2. Dozuj 10 μl przefiltrowanej płynnej żywności kolumnowo (patrz Rysunek 5 dla ilustracji) do odpowiednich dołków mikropłytki 1536-dołkowej. Dozuj do lewego górnego dołka dla każdej grupy czterech studzienek (patrz Rysunek 5 dla ilustracji).

figure-protocol-2
Rysunek 5: Kolejność napełniania i lokalizacja studni dla płyty zasilającej 1536-dołkową. Na diagramie przedstawiono krok 4.2 protokołu. Strzałki pokazują kolejność, w jakiej roztwór zasilający jest wprowadzany do płyty podającej, po jednej kolumnie na raz od kolumny 1 do 12. Próbka B1 jest powiększona w celu pokazania przykładowej lokalizacji roztworów żywieniowych dla testów 1-choice i 2-choice. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Po napełnieniu wszystkich studzienek nałóż folię uszczelniającą na górną część płytki. Użyj łopatki uszczelniającej, aby dokładnie przykleić się do folii. Odetnij nadmiar folii z lewej i prawej krawędzi żyletką. Powtórz dla żądanej liczby płytek.
  2. Odwirować płytki o masie 200 x g przez 10 sekund, aby osadzić płyn. Nie dopuścić do schłodzenia płytki, ponieważ może to spowodować kondensację pary wodnej w studzienkach, zasłaniając odczyty absorbancji.

5. Ekspozycja

  1. Gdy muchy będą gotowe do testu spożycia, przedziurawić dołki na górnej powierzchni płytki za pomocą sondy igłowej wyposażonej w igłę o średnicy 0,25 mm. Do perforacji należy użyć tej samej kolejności, w jakiej użyto jej podczas dozowania roztworów. Odwróć płytkę i przebij dołki na dnie. Wytrzeć igłę między roztworami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Uważaj, aby nie dotknąć perforacji, ponieważ powoduje to odprowadzanie roztworu ze studzienek.
  2. Odczytać absorbancję płytki przy 630 nm bez pokrywki.
  3. Umieść wewnętrzną pokrywę na górnej folii uszczelniającej, aby upewnić się, że pierścienie kondensacyjne otaczają perforowane studzienki. Umieść zewnętrzną pokrywkę na talerzu.
  4. Umieść płytę podającą zadrukowaną do góry na złączu tak, aby prowadnice wyrównały odpowiednie otwory płyty podajnika i płyty głodowej. Upewnij się, że łącznik i płytki są prawidłowo zorientowane (tj. upewnij się, że kątowy róg łącznika i płytki pasują do siebie). Owiń elastyczne opaski wokół górnej i dolnej płyty, aby utrzymać łącznik razem. Sprawdź wyrównanie i szczeliny między płytą podającą a złączem.
  5. Gdy wszystkie płyty podające zostaną załadowane na łączniki, otwórz dołki na płyty, regulując paski barierowe na łączniku. Umieść zespoły łącznika/płyty w pojemniku wtórnym. Każdy kontener pomocniczy może pomieścić do sześciu zestawów.
  6. Umieść dolną połowę pudełka na pipety zawierającego nasączone ręczniki papierowe w każdym dodatkowym pojemniku, aby zapewnić wilgotność. Zamknij pokrywę pojemników wtórnych i przenieś je do kontrolowanego środowiska (25 °C, kontrolowana wilgotność, 12 godzin cykli światło: ciemność). Pozwól muchom jeść przez 22 godziny.
  7. Po 22-godzinnej ekspozycji sprawdź każdą płytkę pod kątem martwych much i odpowiednio zaktualizuj układ płytki. Po sprawdzeniu wszystkich płytek należy masowo znieczulić muchy, pompując CO2 do pojemnika wtórnego. Po ~60 s upewnij się, że wszystkie muchy są unieruchomione. Delikatnie wbij muchy w płytkę głodową i wymień plastikowe paski odgradzające. Zdejmij płyty podajnika do odczytu.
  8. Ponownie odczytać absorbancję płytki przy 630 nm. Powtarzaj, aż wszystkie tabliczki zostaną odczytane.

6. Analiza danych

UWAGA: Analiza może być przeprowadzona za pomocą preferowanego przez badacza pakietu oprogramowania.

  1. Pomiń wszelkie muchy, które zdechły podczas 22-godzinnej ekspozycji.
  2. Dla każdej studzienki oblicz zużytą objętość jako:
    figure-protocol-3
    C - Zużyta objętość (μL)
    V - Początkowa objętość studzienki (tj. 10 μl)
    ABS0 - Absorbancja przedekspozycyjna
    ABS1 - Absorbancja poekspozycyjna
    UWAGA: W obliczeniach zużycie jest oznaczane jako objętość dodatnia.
  3. Aby uwzględnić parowanie, odejmij średnią objętość parowania od wartości zużycia much na odpowiednich płytkach. W przypadku testów 2-wyboru/preferencji, dostosuj każdą studzienkę według odpowiedniego roztworu, np. dostosuj studzienki "wyboru 1" według "wyboru 1" w kontrolach parowania.
  4. Po dostosowaniu do parowania należy upuścić wszystkie próbki o wartości zużycia mniejszej od zera.
  5. W przypadku testów 2-krotnego wyboru oblicz preferencję dla każdej studzienki jako:
    figure-protocol-4
    P - Indeks preferencji (kierunek dodatni oznacza preferencję)
    fa - objętość spożytego płynnego środka spożywczego zawierającego dodatek (wybór 2)
    fn - objętość normalnie spożytego płynnego pokarmu (wybór 1)

7. Protokół mycia mikropłytek i łączników.

UWAGA: Uważaj, aby zapobiec uszkodzeniu spodów mikropłytek, ponieważ uszkodzenia mogą wpłynąć na uszczelnienie.

  1. Usuń folie i etykiety z mikropłytek z 1536 dołkami. Oddziel łączniki i listwy odgradzające. Umieść paski barierowe w zamykanym pojemniku, takim jak butelka. Umyj paski barierowe, energicznie potrząsając serią ciepłej wody z kranu, łagodnego roztworu detergentu, ciepłej wody z kranu, a następnie destylowanejH2O.
  2. Opłucz 1536-dołkowe mikropłytki i łączniki pod ciepłą wodą z kranu. W przypadku mikropłytek przepuść wodę z kranu przez studzienki każdej mikropłytki, aby usunąć jak najwięcej roztworu i zanieczyszczeń. W razie potrzeby użyj końcówki pipety, aby usunąć zanieczyszczenia; Nie używaj metalowych ani szklanych przyborów do układania na talerzach.
  3. Pokryj każdą płytkę i łącznik łagodnym roztworem detergentu (np. 1% v/v Aquet). W przypadku talerzy wyszoruj powierzchnie ręką w rękawiczce. Do łączników użyj szczotki.
  4. Dokładnie wypłucz każdą płytkę wodą z kranu, a następnie destylowanąH2O. Upewnij się, że studzienki są specjalnie wypłukane pod strumieniem wody.
  5. Pozostaw płyty i łączniki do wyschnięcia na powietrzu przykryte w temperaturze pokojowej. Przechowywać w czystym pojemniku do czasu użycia.
    UWAGA: Nigdy nie należy obchodzić się z mikropłytkami 1536-dołkowymi bez rękawiczek. Resztki olejów ze skóry mogą utrudniać uszczelnianie, prowadząc do wycieku z odwiertu i parowania.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ustalić, czy istnieją jakiekolwiek korelacje między studniami na poszczególnych płytkach, parowanie zostało określone ilościowo dla każdej studni (n = 96 dołków/płytkę dla trzech płytek). Stwierdzono, że parowanie wynosi -0,036 μL ± 0,003 μL (średnia ± SEM w całym tekście). (Rysunek 6A) Korelacje Pearsona obliczono w celu oceny trendów między parowaniem a lokalizacją odwiertów. Współczynnik korelacji (Rysunek 6B,C) dla parowania w stosunku do rzędów wynosił -0,04 (p = 0,4949), a dla parowania w stosunku do kolumn wynosił -0,23 (p = 0,0001). Grupy zostały następnie rozmieszczone między kolumnami, aby złagodzić łagodne, ale statystycznie istotne korelacje między kolumnami.

figure-results-1
Rysunek 6: Parowanie w MFA. (A) Rozkład gęstości parowania zmienia się ze średnią ± SD oznaczoną linią przerywaną. Korelacje między parowaniem a wierszami (B) lub kolumnami (C) ze współczynnikiem korelacji Pearsona i wartością p, jak wskazano. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby ustalić ważność protokołu, spożycie zostało określone ilościowo dla 3-5-dniowych muszek Canton-S B (n = 36/płeć/płytka i n = 24 kontrole parowania/płytka dla trzech płytek) (Rysunek 7). Parowanie między studzienkami kontrolnymi różniło się istotnie od zera (-0,030 μL ± 0,006 μL, p = 4,81 x 10-6; test t jednej próbki vs zero). Dwie próbki (obie męskie) zostały pominięte w zbiorze danych, jedna z powodu śmierci podczas nocnego narażenia, a druga z powodu ujemnej wartości spożycia po korekcie o parowanie. Pozwoliło to uzyskać > 99% wskaźnik retencji próbek.

figure-results-2
Rysunek 7: Kwantyfikacja zużycia za pomocą MFA. (A) Zużycie zostało zobrazowane za pomocą specjalnie wyprodukowanej szklanej komory. Zaobserwowano, że muchy piją z perforowanych studzienek i wykazywały niebieskie zabarwienie brzucha po spożyciu barwionego roztworu. Patrz również Film uzupełniający S.1. (B) Wartości zużycia (średnia ± SEM) wśród kontroli parowania, muchówek płci męskiej i żeńskiej. Dla porównań statystycznych przeprowadzono parami test t post hoc o nierównej wariancji, z istotnością wskazywaną przez słupki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Następnie, model analizy wariancji (ANOVA) został skonstruowany zgodnie z opisem Y = μ + S + P + SxP + e, gdzie Y jest średnią grupy, μ jako średnia ogólna, S jako stały efekt płci, P jako stały efekt płytki, SxP jako interakcja między płcią a płytą, a e jako zmienność resztowa. ANOVA nie wykazała istotnej zmienności między płytkami (p = 0,671) ani specyficznych dla płci interakcji z płytkami (p = 0,104) do spożycia, podczas gdy sam seks istotnie przyczynił się do obserwowanej zmienności konsumpcji (p = 4,17 x 10-18). Test t post hoc wykazał, że mężczyźni spożywali znacznie mniej niż kobiety (0,500 μL ± 0,017 μL vs 0,811 μL ± 0,028 μL, p = 1,13 x 10-17, test t dla dwóch próbek o nierównej wariancji).

Aby pokazać, że test może być używany do kwantyfikacji preferencji dwuwyboru, muchy miały wybór między 4% roztworem sacharozy z 1% ekstraktem drożdżowym a 4% roztworem sacharozy uzupełnionym 15% etanolem i 1% ekstraktem drożdżowym. Zarówno mężczyźni, jak i samice wykazywali zdecydowaną preferencję dla roztworu z etanolem i ekstraktem drożdżowym ze wskaźnikami preferencji 0,974 ± 0,026 dla mężczyzn i 0,876 ± 0,06 dla kobiet (średnia ± SEM) (Ryc. 8).

figure-results-3
Rysunek 8: Kwantyfikacja preferencji za pomocą MFA. Spożycie 4% sacharozy w porównaniu z 4% sacharozą uzupełnioną 15% etanolem i ekstraktem drożdżowym dla samców i samic much (n = 33 dla każdej płci). Samce much spożywały więcej roztworu etanolu niż kontrolnego roztworu sacharozy (0,511 μl ± 0,029 μl w porównaniu z 0,00 μl ± 0,017 μl; p = 4,06e-10; test t dla dwóch próbek). Samice much spożywały również więcej roztworu etanolu niż kontrolnego roztworu sacharozy (0,939 μl ± 0,044 μl w porównaniu z 0,132 μl ± 0,044 μl; p = 7,38e-17; test t dla dwóch prób). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo S.1: Wideo pokazuje muchę żerującą z perforowanej studni i gromadzącą niebieskie zabarwienie brzucha podczas spożywania barwionego roztworu. Nieruchomy obraz jest pokazany w Rysunek 7A. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Plik uzupełniający S.2: Łącznik do testów podajników mikropłytek. Jest to drukowana w 3D konstrukcja łącznika używanego w MFA. Materiał do druku: Nylon PA12 został wykorzystany do MFA. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający S.3: Taśma barierowa do testów z mikropłytkami. Zawiera to konstrukcję plastikowych pasków barierowych używanych do przełączania ekspozycji much na płytę podajnika. Pojedynczy łącznik może wykorzystywać do dwunastu pasków barierowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający S.4: Instrukcje rozpakowywania i wytwarzania dla testu podawania mikropłytek. W zestawie znajduje się instrukcja rozpakowywania łącznika i listew odgradzających. Do wieczka wewnętrznego, pokrywy zewnętrznej i pojemnika wtórnego dołączone są instrukcje produkcyjne, które służą do ograniczania parowania podczas ekspozycji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający S.5:Porównanie kosztów testu mikropłytki (MFA) i testu kapilarnego FEeder (CAFE) z pojedynczym wyborem muchy. Przetestowanie 72 much/płeć dla jednej linii wymagałoby dwóch zestawów sprzętu MFA (łączniki + płytki + paski barierowe), podczas gdy CAFE potrzebowałoby tylko 1 kapilary na każdą fiolkę hodowlaną. Pomimo dużej różnicy w początkowej inwestycji w MFA, duża różnica w kosztach cyklicznych (odpowiednio 14,80 USD vs 46,08 USD) pozwoliłaby na odzyskanie kosztów początkowych po przetestowaniu tylko 4 linii (próg rentowności). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W badaniu opisano nowatorski protokół ilościowego określania spożycia u Drosophila: test podawania mikropłytek (MFA). W tym teście muchy spożywają z zamkniętych studzienek mikropłytki z 1536 dołkami przez perforacje o kontrolowanej wielkości (ryc. 1, ryc. 2; Film uzupełniający S.1). Ponieważ płynna żywność jest barwiona i podawana za pomocą mikropłytki, pomiary absorbancji optycznej żywności można uzyskać za pomocą spektrofotometru do mikropłytek (rysunek 3). W ten sposób konsumpcja jest określana poprzez porównanie absorbancji przed i po spożyciu, a następnie zastosowanie tej proporcji do znanej objętości dozowanej przed spożyciem. Zostało to zweryfikowane empirycznie, mierząc absorbancję różnych objętości barwionego podłoża (ryc. 3B).

Aby opracować ten test, potrzebne było urządzenie, które mogłoby wykorzystać kwantyfikację zużycia na podstawie absorbancji. Testowanie much w formacie mikropłytki jest atrakcyjne, ponieważ uzupełnia mikropłytkę używaną do dozowania żywności i pozwala na elastyczność w wyborze spośród wielu formatów płytek (np. formatów 6-, 12-, 48- lub 96-dołkowych) poprzez dostosowanie geometrii łącznika. Wybrano 96-dołkowy format mikropłytki, aby umożliwić indywidualną hodowlę much.

Urządzenie wydrukowane w 3D (rysunek 1) precyzyjnie orientuje 1536-dołkową płytkę podającą z 96-dołkową płytką hodowlaną, dając każdej muchy dostęp do maksymalnie 4 dołków płytki podajnika w celu spożycia. Ponadto, aby zapewnić odpowiedni czas na rozmieszczenie much w płytce oprawy i kontrolę rozpoczęcia testu, urządzenie zawiera przełączające paski barierowe zawierające muchy w odpowiednich dołkach i zapobiegające naruszeniom. Dostarczane są pliki potrzebne do pozyskania lub modyfikacji tych części (Pliki uzupełniające S.2-S.3), a także niezbędne instrukcje produkcji odpowiednich części (Plik uzupełniający S.4).

MFA zapewnia prostą metodę o wysokiej przepustowości, która uzupełnia bardziej wyszukane metody monitorowania zachowań żywieniowych Drosophila 18,21,22. Pomoc makrofinansowa ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami stosowanymi do ilościowego określania spożycia żywności. Przepustowość jest zwiększana poprzez ilościowe określanie zużycia za pomocą czytnika płytek. Eliminuje to ręczne pomiary i ręczne wprowadzanie danych. Dane można również programowo wyodrębniać i przetwarzać. Ponadto wyższa przepustowość zwiększa możliwą liczbę powtórzeń biologicznych, szczególnie w porównaniu z projektami wspólnych zasilaczy, co znacznie zwiększa moc wykrywania niewielkich różnic w zużyciu. Korzystając z MFA, pojedynczy eksperymentator może określić ilościowo zużycie lub preferencje ponad 500 much na nocny przebieg testu. Dzięki nakładaniu się na siebie przebiegów testu, w ciągu 5 dni można przebadać ponad 2000 much. Wreszcie, istnieją długoterminowe oszczędności kosztów dzięki możliwości ponownego użycia mikropłytek i łączników (plik uzupełniający S.5). Korzystając z MFA, szacowany koszt testu może wynosić zaledwie 14,80 USD, z początkowym kosztem sprzętu w wysokości 127,60 USD. Przy użyciu klasycznego testu CApillary FEeder (CAFE), który wymaga kosztownych precyzyjnych mikrokapilarek, szacowany koszt testu dla porównywalnej liczby powtórzeń wynosi 46,08 USD. W związku z tym, mimo że z góry inwestuje się w zakup niezbędnego sprzętu, zmniejszenie kosztów stałych może prowadzić do znacznych oszczędności, szczególnie w przypadkach, gdy przeprowadzane są wielokrotne testy.

Podobnie jak w przypadku wszystkich testów, MFA ma pewne ograniczenia. Przede wszystkim wymaga dostępu do spektrofotometru mikropłytkowego zdolnego do odczytu mikropłytek 1536-dołkowych. Ponadto poleganie na pomiarach absorbancji w celu określenia ilościowego sprawia, że metoda jest podatna na zakłócenia optyczne. Objawia się to ujemnymi wartościami zużycia dla niewielkiej podgrupy badanych próbek. Składniki odżywcze, leki, farmaceutyki lub toksyny będące przedmiotem zainteresowania muszą być również rozpuszczalne w wodzie, aby były zgodne z testem.

Pomimo swoich ograniczeń, metoda ta oferuje wysokoprzepustową metodę ilościowego określania zachowań konsumpcyjnych u Drosophila. Co więcej, urządzenie sprzęgające można łatwo zmodyfikować, aby przyjmowało wiele formatów płyt, co pozwala na dostosowanie się do różnych gatunków owadów.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem z National Institute on Drug Abuse (U01 DA041613) dla TFCM i RRHA.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Igły o średnicy 0,25 mmRave ScientificRS-MN-52-001012
0,45 i mikro; m Filtry strzykawkoweOlympus Plastics25-245
10 ml Jednorazowa strzykawkaEXELINT26200
AgaroseFisher ScientificBP1600
Paski barierowe (wycinane laserowo)Ponoko-Materiał: przezroczysty PETG, grubość 0,5 mm; Plik uzupełniający:
Wirówka 5810 REppendorf22625501
Wirnik wirówki A-4-62 z wiadrami z płytką mikromiareczkowąEppendorf22638041
FD& C Blue #1Spectrum Chemical Mfg CorpFD110
Wiosło uszczelniające do foliiFisher Scientific50-563-280
FlystuffFlypad Genesee Scientific#59-114 i #59-119CO2 Znieczulenie: Flypads  są dostępne w dwóch rozmiarach, z których każdy jest odpowiedni
Łącznik mikropłytek (drukowany w 3D)Shapeways-Materiał: nylon Multi Jet Fusion (MJF PA12); Plik uzupełniający:
Pokrywki do mikropłytekGreiner Bio-One656170
Urządzenia molekularne SpectraMax iD5Urządzenia molekularne-Każdyczytnik mikropłytek o rozdzielczości 1536 dołków wystarczy.
Uchwyt sondy igłowejRave ScientificRS-MN-52-001000
Poliestrowa folia uszczelniającaExcel Scientific, Inc.100-SEAL-PLT
Polistyren 96-dołkowe mikropłytkiGreiner Bio-One655101
Polistyren, bez dna, 1536-dołkowe mikropłytkiGreiner Bio-One783000Wykonane na zamówienie; Uwzględnij odpowiedni czas realizacji przy zakupie.
Gumki Sacharoza
SigmaS7903
Izolacja1/2 "x 1/8" Samoprzylepny ekstrakt drożdżowy z kauczuku neoprenowego o wysokiej gęstości
Fisher ScientificBP1422
pogodowa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong, R., Piper, M. D. W., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS ONE. 4 (6), (2009).
  2. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  3. Spitaler, U., et al. Yeast species affects feeding and fitness of Drosophila suzukii adults. Journal of Pest Science. 93 (4), 1295-1309 (2020).
  4. Wang, Q. P., et al. PGC1α controls sucrose taste sensitization in Drosophila. Cell Reports. 31 (1), 107480(2020).
  5. Valtierra-de-Luis, D., et al. Quantification of dose-mortality responses in adult Diptera: Validation using Ceratitis capitata and Drosophila suzukii responses to spinosad. PLoS ONE. 14 (2), 1-11 (2019).
  6. Williams, M. J., et al. Exposure to bisphenol A affects lipid metabolism in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 114 (5), 414-420 (2014).
  7. Jajoo, A., Donlon, C., Shnayder, S., Levin, M., McVey, M. Sertraline induces DNA damage and cellular toxicity in Drosophila that can be ameliorated by antioxidants. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
  8. Fochler, S., et al. Genetics of alcohol consumption in Drosophila melanogaster. Genes, Brain and Behavior. 16 (7), 675-685 (2017).
  9. Highfill, C. A., Baker, B. M., Stevens, S. D., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Genetics of cocaine and methamphetamine consumption and preference in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 15 (5), 1007834(2019).
  10. Keebaugh, E. S., Park, J. H., Su, C., Yamada, R., Ja, W. W. Nutrition Influences caffeine-mediated sleep loss in Drosophila. Sleep. 40 (11), (2017).
  11. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (20), 8253-8256 (2007).
  12. Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8 (1), 87(2015).
  13. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193(2007).
  14. Shell, B. C., et al. Measurement of solid food intake in Drosophila via consumption-excretion of a dye tracer. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  15. Wu, Q., et al. Excreta quantification (EX-Q) for longitudinal measurements of food intake in Drosophila. iScience. 23 (1), 100776(2020).
  16. Park, A., Tran, T., Atkinson, N. S. Monitoring food preference in Drosophila by oligonucleotide tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9020-9025 (2018).
  17. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: Comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  18. Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A Taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
  19. Jaime, M. D. L. A., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
  20. IUPAC. Compendium of Chemical Terminology (The "Gold Book"). , Blackwell Scientific Publications. Research Triangle Park, NC. (1997).
  21. Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560(2014).
  22. Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microplate Feeder AssayDrosophila FeedingHigh Throughput AssayFood Intake QuantificationAbsorbance MeasurementLiquid Food Consumption96 Well Microplate1536 Well MicroplateFeeding BehaviorFood Preference Assay

Related Articles