Test podawania mikropłytek oferuje ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania spożycia płynów u Drosophila. Urządzenie wydrukowane w 3D łączy 96-dołkową mikropłytkę, w której trzymane są muchy, z 1536-dołkową mikropłytką, z której muchy spożywają roztwór pokarmowy z barwnikiem znacznikowym. Spadek objętości roztworu jest mierzony spektrofotometrycznie.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowy test na mikropłytkach do ilościowego oznaczania spożycia u Drosophila
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kwantyfikacja spożycia pokarmu u Drosophila służy do badania genetycznych i fizjologicznych podstaw cech związanych z konsumpcją, ich czynników środowiskowych oraz toksykologicznych i farmakologicznych efektów wielu substancji. Niewiele obecnie stosowanych metod nadaje się do pomiaru wysokiej przepustowości. Test podawania mikropłytek (MFA) został opracowany do ilościowego określania spożycia płynnego pokarmu dla poszczególnych much za pomocą absorbancji. W tym teście muchy spożywają płynną pożywkę pokarmową z wybranych studzienek mikropłytki z 1536 dołkami. Poprzez wprowadzenie rozcieńczonego barwnika znacznikowego do płynnej pożywki spożywczej i załadowanie znanej objętości do każdej studzienki, pomiary absorbancji studzienki uzyskane przed i po spożyciu odzwierciedlają wynikającą z tego zmianę objętości (tj. objętości zużytej). Aby umożliwić wysokoprzepustową analizę za pomocą tej metody, zaprojektowano wydrukowany w 3D łącznik, który umożliwia indywidualne sortowanie much na 96-dołkowe mikropłytki. Urządzenie to precyzyjnie orientuje mikropłytki z 96 i 1536 dołkami, aby zapewnić każdej muchy dostęp do maksymalnie 4 dołków do spożycia, umożliwiając w ten sposób kwantyfikację preferencji żywieniowych oprócz regularnego spożycia. Ponadto urządzenie posiada paski barierowe, które przełączają się między pozycją otwartą i zamkniętą, aby umożliwić kontrolowane przechowywanie i uwalnianie kolumny próbek na raz. Metoda ta umożliwia wysokoprzepustowe pomiary zużycia roztworów wodnych przez wiele much jednocześnie. Ma również potencjał, aby przystosować się do innych owadów i kontrolować spożycie składników odżywczych, toksyn lub farmaceutyków.
Wprowadzenie
Drosophila melanogaster jest szeroko wykorzystywana jako genetyczny organizm modelowy do badania biologicznych podstaw przyjmowania pokarmu oraz cech związanych z konsumpcją1. Szacuje się, że 65% genów wywołujących choroby u ludzi posiada funkcjonalne homologi u muszek, a znaczna ich część jest ekspresowana w funkcjonalnie równoważnych tkankach u muszek i ludzi2. Co więcej, niewielki rozmiar D. melanogaster, krótki czas między pokoleniami, łatwość utrzymania oraz podatność na manipulacje genetyczne sprawiają, że jest to atrakcyjny model do badań nad konsumpcją składników odżywczych3,4 oraz efektami toksykologicznymi i farmakologicznymi wielu substancji, w tym insektycydów5, zanieczyszczeń6, produktów farmaceutycznych7 oraz substancji psychoaktywnych8,9,10.
W wielu przypadkach badanie takich cech wymaga precyzyjnego ilościowego określenia spożycia. Metody ilościowego oznaczania spożycia są różnorodne i obejmują test CApillary FEeder (CAFE)11, test MAnual FEeding (MAFE)12, test odruchu wyciągania trąbki (PER)13, ekstrakcję barwników śledzących14,15, ekstrakcję oligonukleotydowych znaczników16 oraz ekstrakcję radioizotopów5,17. Niedawne wysiłki skoncentrowano na zwiększeniu przepustowości tych testów, czego przykładem jest test Expresso18 lub płytkowy system Whole Animal Feeding FLat (WAFFL)19. Pomimo ich użyteczności, testy te mogą być skomplikowane, kosztowne lub pracochłonne, co utrudnia ich zastosowanie w badaniach wysokoprzepustowych.
Rysunek 1: Komponenty testu z podajnikiem na mikropłytce. (A) Rendering 3D zmontowanego testu z podajnikiem na mikropłytce. Mikropłytka 1536-dołkowa jest ustawiona za pomocą łącznika wydrukowanego w technologii 3D w taki sposób, aby każdy dołek dolnej mikropłytki 96-dołkowej miał dostęp do czterech dołków górnej mikropłytki 1536-dołkowej. Dostęp do dołków można kontrolować poprzez regulację pozycji pasków barierowych wsuniętych w łącznik. (B) Graficzna reprezentacja każdego dołka testu z podajnikiem na mikropłytce. Roztwory do spożycia są zatrzymywane w każdym dołku za pomocą folii uszczelniającej, która została perforowana, aby umożliwić dostęp muszce. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Przegląd procedur w teście z wykorzystaniem mikropłytki z komórkami dokarmiającymi. Na rysunku przedstawiono schemat blokowy odpowiadający krokom 4.1-5.8 protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Aby pokonać te przeszkody, opracowano test z podawaniem pokarmu na mikropłytce (MFA; Rysunek 1). W tym teście muchy są przetrzymywane indywidualnie w mikropłytkach 96-dołkowych. Każda mikropłytka jest łączona z mikropłytką 1536-dołkową za pomocą specjalnie zaprojektowanego urządzenia wydrukowanego w technologii 3D. Urządzenie to precyzyjnie orientuje obie płytki w taki sposób, aby każda mucha w odpowiednim dołku płytki 96-dołkowej miała dostęp do 4 dołków mikropłytki 1536-dołkowej. Dzięki zastosowaniu bezdennej płytki 1536-dołkowej oraz folii uszczelniających, roztwory są dozowane do wybranych dołków, a następnie perforowane precyzyjnymi igłami o średnicy 0,25 mm, aby zapewnić dostęp muchom. Co istotne, umożliwienie spożycia bezpośrednio z mikropłytki pozwala na natychmiastowe pomiary oparte na absorbancji przy użyciu czytnika mikropłytek. Do medium spożywczego dodaje się rozcieńczony barwnik śledzący, a zmiana absorbancji po ekspozycji służy do określenia spożytej objętości (Rysunek 2 i Rysunek 3). Ponieważ ciecz w każdym dołku przypomina kolumnę płynu, różnice objętościowe będą objawiać się jako różnice w wysokości kolumny (Rysunek 3A). Zgodnie z prawem Beer-Lamberta20:
gdzie A to absorbancja, ε to molowy współczynnik absorpcji analizowanego związku, l to długość drogi optycznej, a c to stężenie analizowanego związku. Zatem przy stałym molowym współczynniku absorpcji i stężeniu, zmiany absorbancji wynikają wyłącznie ze zmian w optycznej drodze światła, tzn. poziomu cieczy w danej studzience. Poprzez pomiar absorbancji przed i po ekspozycji, proporcjonalna zmiana absorbancji odzwierciedla proporcjonalną zmianę objętości (Rycina 3B).
Rysunek 3: Ilościowe określanie objętości studnika na podstawie absorbancji. (A) Światło padające o znanej intensywności wejściowej (I0) przechodzi przez każdy studniek. Osłabienie światła przy różnych objętościach wypełnienia daje różne intensywności wyjściowe (I), wykazując liniową zależność między objętością a absorbancją. (B) Empiryczny pomiar absorbancji w funkcji objętości. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Na podstawie zmiany objętości można obliczyć ilość każdego spożytego związku, znając jego stężenie w roztworze pokarmowym. Elementy niezbędne do przeprowadzenia analizy są tanie i w dużym stopniu nadają się do ponownego wykorzystania, co znacząco obniża powtarzalne koszty badania. Tym samym procedura ta oferuje przystępną cenowo, wysokoprzepustową metodę precyzyjnego ilościowania spożycia.
Protokół
1. Przygotowanie płytek do głodzenia
- Odważ 1,5 g agarozy do szklanego zlewki o pojemności 250 ml.
- Dodać 100 ml destylowanej H2O2do zlewki.
- Podgrzewać w mikrofalówce z przerwami, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
UWAGA: Należy obserwować zlewkę, ponieważ agaroza ma tendencję do wykipienia. - Wlej roztopioną agarozę do korytka na odczynniki i dozuj. 80 µL stopioną agarozę do każdej studzienki mikropłytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej. Pozostawić płytki do zastygnięcia pod przykryciem w temperaturze pokojowej. Pozostałą agarozę przechowywać w lodówce przez maksymalnie tydzień w szczelnym worku i ponownie roztopić w celu przygotowania kolejnych płytek.
2. Sortowanie i głodzenie much
- Przygotuj łączniki, wkładając paski barierowe do kanałów na paski barierowe. Jeśli paski barierowe są zbyt luźne, owiń je wokół palca, aby nadać im krzywiznę ułatwiającą utrzymanie w kanałach.
- Przymocuj łącznik do płytki głodzeniowej. Nie używaj łącznika do manipulowania płytką, ponieważ może on się ześlizgnąć. Upewnij się, że łączniki są prawidłowo zorientowane (tzn. upewnij się, że ścięty róg łącznika odpowiada ściętemu rogowi mikropłytki).
- Pod CO2 znieczulenie (Tabela materiałów), posegreguj muchy w wieku 3-5 dni. Umieść poszczególne muchy kolumnowo na płytce do głodzenia.
UWAGA: Mimo że muchy są nakładane kolumnami, zaleca się rozdzielanie grup próbek w rzędach płytki, a nie w kolumnach (patrz Rysunek 4 (np. w celu przedstawienia układu płytek). - Zamykaj każdą kolumnę w miarę wypełniania, przesuwając pasek przegrody do pozycji zamkniętej.
Rycina 4: Reprezentatywny układ płytki do głodzenia. Na schemacie przedstawiono rozmieszczenie kontroli odparowania oraz muchsamiców i samic w płytce 96-dołkowej użytej w tej badaniu. Można również stosować inne konfiguracje, w tym naprzemienne rzędy samców i samic z kontrolami odparowania w rzędach A i H. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Dokładnie zapisz układ próbek w mikropłytce. Po wypełnieniu płytki głodówkowej pozwól muchom na spontaniczną rekonwalescencję po usunięciu CO2 i poddaj je głodzeniu przez 6 h, licząc od momentu ich początkowego znieczulenia.
3. Przygotowanie pokarmu w formie płynnej
UWAGA: Pożywkę w formie płynnej należy przygotowywać codziennie.
- Przygotować roztwór zapasu barwnika FD&C Blue #1 o stężeniu 10 mg/mL w destylowanej H2O.
UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy. - Przygotować 10 mL pożywki płynnej (4% sacharozy, 1% ekstraktu drożdżowego, 40 µg/mL FD&C Blue #1) w 15 mL probówce stożkowej, rozpuszczając 0,4 g sacharozy i 0,1 g ekstraktu drożdżowego w 10 mL destylowanej H2O. Mieszać próbkę na wortexie do całkowitego rozpuszczenia ciał stałych. Dodać 40 µL roztworu zapasu barwnika i kilkakrotnie odwrócić probówkę, aby uhomogenizować roztwór.
- Przenieść pożywkę płynną do strzykawki 10 mL wyposażonej w filtr 0,45 µm. Filtrować po ok. 1,5 mL roztworu jednocześnie do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL. Odstawić strzykawkę z roztworem i filtrować dodatkowe porcje w miarę potrzeb podczas przygotowywania płytki do karmienia.
4. Przygotowanie płyt z komórkami karmionkami
UWAGA: Po napełnieniu należy obchodzić się z płytkami z komórkami dokarmiającymi ostrożnie, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza lub kropel w dołkach, co mogłoby wpłynąć na pomiary absorbancji.
- Przygotuj płytkę z pożywką, uszczelniając dno mikropłytki 1536-dołkowej folią uszczelniającą. Użyj łopatki do uszczelniania, aby dokładnie przylepić folię. Odetnij nadmiar folii z lewej i prawej krawędzi za pomocą żyletki.
- Napełnij odpowiednie dołki mikropłytki 1536-dołkowej, dozując 10 µL przefiltrowanego pokarmu w kolumnach (patrz Rysunek 5). Dozuj pożywkę do górnego lewego dołka w każdym klastrze czterech dołków (patrz Rysunek 5).
Rysunek 5: Kolejność napełniania i lokalizacja dołków dla płytki zasilającej 1536-dołkowej. Schemat przedstawia krok 4.2 protokołu. Strzałki wskazują kolejność wprowadzania roztworu zasilającego do płytki zasilającej, kolumna po kolumnie, od kolumny 1 do 12. Próbka B1 została powiększona, aby pokazać przykład lokalizacji roztworów zasilających dla testów 1-wyborowych i 2-wyborowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Po wypełnieniu wszystkich dołków nałóż folię uszczelniającą na górną część płytki. Użyj łopatki do uszczelniania, aby dokładnie przydzielić folię. Nadmiar folii z lewej i prawej krawędzi odetnij żyletką. Powtórz czynność dla wymaganej liczby płytek.
- Wirowkuj płytki przy 200 x g przez 10 s, aby osadzić ciecz. Nie dopuszczaj do schłodzenia płytki, ponieważ może to spowodować powstanie kondensacji w dołkach, co utrudni odczyt absorbancji.
5. Ekspozycja
- Gdy muchy będą gotowe do testu spożycia, należy przebić otwory na górnej powierzchni płytki za pomocą narzędzia z igłą o średnicy 0,25 mm. Perforację należy przeprowadzać w tej samej kolejności, w jakiej dozowano roztwory. Obróć płytkę i przebij otwory na spodzie. Przecieraj igłę pomiędzy roztworami, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej. Należy uważać, aby nie dotykać perforacji, ponieważ może to spowodować odsysanie roztworu z otworów.
- Zmierz absorbancję płytki przy 630 nm bez przykrycia.
- Umieść wewnętrzną pokrywkę na górnej folii uszczelniającej, aby upewnić się, że pierścienie kondensacyjne otaczają perforowane otwory. Nałóż zewnętrzną pokrywkę na płytkę.
- Umieść płytkę z pożywką stroną górną do góry na sprzęgaczu w taki sposób, aby prowadnice wyrównały odpowiednie otwory płytki z pożywką i płytki do głodzenia. Upewnij się, że sprzęgacz i płytki są prawidłowo zorientowane (np. upewnij się, że skośny róg sprzęgacza i płytek pokrywa się). Owiń gumki recepturki wokół górnej i dolnej płytki, aby utrzymać sprzęgacz razem. Sprawdź wyrównanie oraz ewentualne szczeliny między płytką z pożywką a sprzęgaczem.
- Po załadowaniu wszystkich płytek z pożywką na sprzęgacze, otwórz otwory dla płytek, regulując paski barierowe na sprzęgaczu. Umieść zestawy sprzęgacz/płytka w pojemniku wtórnym. Każdy pojemnik wtórny może pomieścić do sześciu zestawów.
- Aby zapewnić odpowiednią wilgotność, do każdego pojemnika wtórnego włóż dolną połowę pudełka na pipety z namoczonymi ręcznikami papierowymi. Zamknij pokrywę pojemników wtórnych i przenieś je do kontrolowanego środowiska (25 °C, kontrolowana wilgotność, 12-godzinne cykle światło:ciemność). Pozostaw muchy do spożycia na 22 h.
- Po 22 h ekspozycji sprawdź każdą płytkę pod kątem martwych much i odpowiednio zaktualizuj układ płytki. Po sprawdzeniu wszystkich płytek znieczul muchy en masse, wpompowując CO2 do wnętrza pojemnika wtórnego. Po około 60 s upewnij się, że wszystkie muchy są unieruchomione. Delikatnie dociśnij muchy do płytki do głodzenia i ponownie załóż plastikowe paski barierowe. Usuń płytki z pożywką w celu odczytu.
- Ponownie zmierz absorbancję płytki przy 630 nm. Powtarzaj czynność, aż wszystkie płytki zostaną odczytane.
6. Analiza danych
UWAGA: Analizę można przeprowadzić przy użyciu preferowanego przez badacza pakietu oprogramowania.
- Należy odrzucić wszystkie muchy, które padły podczas 22-godzinnej ekspozycji.
- Dla każdej studni obliczyć objętość zużycia według wzoru:
C - Zużyta objętość (µL)
V - Początkowa objętość studzienki (t.j. 10 µL)
ABS0 - Absorbancja przed naświetleniem
ABS1 - Absorbancja po ekspozycji
UWAGA: W obliczeniach zużycie jest oznaczone jako objętość dodatnia. - Aby uwzględnić parowanie, należy odjąć średnią objętość odparowania od wartości zużycia przez muchy w obrębie poszczególnych płytek. W przypadku testów preferencji/wyboru z dwóch opcji, należy skorygować każdą studzienkę o odpowiedni roztwór, np..skoryguj studzienki „wybór 1” o wartość „wybór 1” w kontrolach odparowania.
- Po skorygowaniu o parowanie, należy odrzucić wszystkie próbki, w których wartość zużycia jest mniejsza od zera.
- W przypadku testu dwuwybiorczego należy obliczyć preferencję dla każdej studni według następującego wzoru:
P - Indeks preferencji (kierunek dodatni wskazuje na preferencję)
FA - Objętość spożytej płynnej pożywki zawierającej dodatek (Wariant 2)
FN - Objętość spożytego normalnego pokarmu w formie płynnej (Wybór 1)
7. Protokół mycia mikropłytek i łącznika.
UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić dna mikropłytek, ponieważ uszkodzenia mogą wpłynąć na szczelność zamknięcia.
- Zdejmij folie i etykiety z mikro płytek 1536-dołkowych. Oddziel łączniki i listwy barierowe. Umieść listwy barierowe w szczelnym pojemniku, np. w butelce. Umyj listwy barierowe, energicznie wstrząsając nimi w serii roztworów: ciepłej wody z kranu, łagodnego detergentu, ciepłej wody z kranu, a następnie destylowanej H2O.
- Opłucz mikro płytki 1536-dołkowe oraz łączniki pod ciepłą bieżącą wodą. W przypadku mikro płytek przepuść wodę przez każde dołeczki, aby usunąć jak największą ilość roztworu i zanieczyszczeń. W razie potrzeby użyj końcówki do pipety, aby usunąć osady; nie używaj na płytkach narzędzi metalowych ani szklanych.
- Przykryj każdą płytkę i łącznik roztworem łagodnego detergentu (np. 1% v/v Aquet). W przypadku płytek wyszoruj powierzchnie dłonią w rękawiczce. W przypadku łączników użyj szczotki.
- Dokładnie opłucz każdą płytkę wodą z kranu, a następnie destylowaną H2O. Upewnij się, że dołeczki zostały dokładnie wypłukane pod strumieniem wody.
- Pozostaw płytki i łączniki do wyschnięcia na powietrzu pod przykryciem w temperaturze pokojowej. Przechowuj w czystym pojemniku do czasu użycia.
UWAGA: Nigdy nie dotykaj mikro płytek 1536-dołkowych bez rękawiczek. Pozostałości tłuszczu ze skóry mogą utrudniać uszczelnienie, co prowadzi do wycieków z dołeczków i odparowania.
Wyniki
Aby ustalić, czy istnieją korelacje pomiędzy poszczególnymi studzienkami na płytkach, ilościowo określono parowanie dla każdej studzienki (n = 96 studni/płytka dla trzech płytek). Stwierdzono, że parowanie wynosiło -0,036 µL ± 0,003 µL (średnia ± SEM dla wszystkich pomiarów). (Rysunek 6A) Obliczono korelacje Pearsona w celu oceny trendów między parowaniem a położeniem studzienek. Współczynnik korelacji (Rysunek 6B,C) dla parowania w stosunku do rzędów wyniósł -0,04 (p = 0,4949), a dla parowania w stosunku do kolumn -0,23 (p = 0,0001). Następnie grupy rozdzielono pomiędzy kolumny, aby zminimalizować niewielkie, lecz istotne statystycznie korelacje występujące w obrębie kolumn.
Rysunek 6: Odparowanie w MFA. (A) Rozkład gęstości zmian odparowania ze średnią ± SD wskazaną linią przerywaną. Korelacje między odparowaniem a rzędami (B) lub kolumnami (C) wraz z zaznaczonym współczynnikiem korelacji Pearsona i wartością p. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Aby potwierdzić poprawność protokołu, określono ilość spożycia dla 3-5 dniowych much Canton-S B (n = 36/płeć/płytka oraz n = 24 kontroli odparowania/płytka dla trzech płytek) (Rysunek 7). Odparowanie w dołkach kontrolnych różniło się istotnie od zera (-0,030 µL ± 0,006 µL, p = 4,81 x 10-6; jednopróbkowy test t względem zera). Z zestawu danych pominięto dwie próbki (obie samce) – jedną z powodu śmierci podczas nocnej ekspozycji, a drugą z powodu ujemnej wartości spożycia po skorygowaniu o odparowanie. Przełożyło się to na współczynnik utrzymania próbek > 99%.
Rysunek 7: Ilościowe określanie spożycia przy użyciu MFA. (A) Spożycie wizualizowano przy użyciu specjalnie wykonanej szklanej komory. Obserwowano muchy pijące z perforowanych studni; po spożyciu barwionego roztworu zaobserwowano niebieskie zabarwienie odwłoka. Patrz również Wideo uzupełniające S.1. (B) Wartości spożycia (średnia ± SEM) w grupach kontrolnych odparowania, samców oraz samic. Do porównań statystycznych przeprowadzono parowe testy post hoc t dla nierównych wariancji, a istotność zaznaczono słupkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Następnie skonstruowano model analizy wariancji (ANOVA) opisany wzorem Y = µ + S + P + SxP + e, gdzie Y oznacza średnią grupową, µ – średnią ogólną, S – stały efekt płci, P – stały efekt płytki, SxP – interakcję między płcią a płytką, a e – zmienność rezydualną. Analiza ANOVA nie wykazała istotnej zmienności między płytkami (p = 0,671) ani specyficznych dla płci interakcji z płytkami (p = 0,104) w odniesieniu do spożycia, podczas gdy sama płeć znacząco wpływała na obserwowaną zmienność spożycia (p = 4,17 x 10-18). Test post hoc t wykazał, że samce spożywały znacznie mniej niż samice (0,500 µL ± 0,017 µL vs 0,811 µL ± 0,028 µL, p = 1,13 x 10-17, dwupróbkowy test t dla nierównych wariancji).
Aby wykazać, że test ten może być wykorzystany do ilościowego określenia preferencji w wyborze dwukrotnym, muchom zaoferowano wybór pomiędzy 4% roztworem sacharozy z 1% ekstraktem drożdżowym a 4% roztworem sacharozy uzupełnionym o 15% etanol i 1% ekstrakt drożdżowy. Zarówno samce, jak i samice wykazały zdecydowaną preferencję dla roztworu z etanolem i ekstraktem drożdżowym, przy indeksach preferencji wynoszących 0,974 ± 0,026 dla samców oraz 0,876 ± 0,06 dla samic (średnia ± SEM) (Rysunek 8).
Rycina 8: Ilościowe określenie preferencji z wykorzystaniem MFA. Spożycie 4% sacharozy w porównaniu z 4% sacharozą uzupełnioną o 15% etanol i ekstrakt drożdżowy u samców i samic muszek (n = 33 dla każdej płci). Samce spożyły więcej roztworu etanolu niż kontrolnego roztworu sacharozy (0,511 µL ± 0,029 µL w porównaniu z 0,00 µL ± 0,017 µL; p = 4,06e-10; test t dla dwóch prób). Samice również spożyły więcej roztworu etanolu niż kontrolnego roztworu sacharozy (0,939 µL ± 0,044 µL w porównaniu z 0,132 µL ± 0,044 µL; p = 7,38e-17; test t dla dwóch prób). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Wideo uzupełniające S.1: Wideo przedstawia muchę żerującą z perforowanej studzienki i akumulującą niebieskie zabarwienie odwłoka podczas spożywania barwionego roztworu. Klatka z filmu została przedstawiona na Rysunku 7A. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.
Plik uzupełniający S.2: Łącznik do testu MFA na mikropłytkach. Jest to wydruk 3D łącznika wykorzystywanego w MFA. Do wykonania MFA użyto nylonu PA12. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający S.3: Pasek barierowy do testu z podajnikiem na płytce mikrotitracyjnej. Zawiera on projekt plastikowych pasków barierowych używanych do przełączania ekspozycji much na płytkę z podajnikiem. Pojedynczy łącznik może pomieścić do dwunastu pasków barierowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający S.4: Instrukcje rozpakowywania i wykonania dla testu Microplate Feeder Assay. Dołączone zostały instrukcje rozpakowywania sprzęgacza i listew barierowych. Zawarto instrukcje wykonania wewnętrznej pokrywy, zewnętrznej pokrywy oraz pojemnika wtórnego używanego do ograniczenia parowania podczas ekspozycji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający S.5:Porównanie kosztów analizy z wykorzystaniem mikroplatek do karmienia (Microplate Feeder Assay, MFA) oraz analizy z wykorzystaniem jednowybierowej kapilarnej karmidła (CApillary FEeder, CAFE) dla pojedynczej muchy. Przebadanie 72 much na płeć dla jednej linii wymagałoby dwóch zestawów sprzętu MFA (łączniki + płytki + paski barierowe), podczas gdy w przypadku CAFE potrzebna byłaby tylko jedna kapilara dla każdej fiolki hodowlanej. Mimo znacznej różnicy w początkowej inwestycji w MFA, duża różnica w kosztach bieżących (odpowiednio 14,80 USD i 46,08 USD) pozwoliłaby na odzyskanie kosztów początkowych po przebadaniu zaledwie 4 linii (punkt rentowności). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
W badaniu opisano nowatorski protokół ilościowego określania spożycia u Drosophila: test podawania mikropłytek (MFA). W tym teście muchy spożywają z zamkniętych studzienek mikropłytki z 1536 dołkami przez perforacje o kontrolowanej wielkości (ryc. 1, ryc. 2; Film uzupełniający S.1). Ponieważ płynna żywność jest barwiona i podawana za pomocą mikropłytki, pomiary absorbancji optycznej żywności można uzyskać za pomocą spektrofotometru do mikropłytek (rysunek 3). W ten sposób konsumpcja jest określana poprzez porównanie absorbancji przed i po spożyciu, a następnie zastosowanie tej proporcji do znanej objętości dozowanej przed spożyciem. Zostało to zweryfikowane empirycznie, mierząc absorbancję różnych objętości barwionego podłoża (ryc. 3B).
Aby opracować ten test, potrzebne było urządzenie, które mogłoby wykorzystać kwantyfikację zużycia na podstawie absorbancji. Testowanie much w formacie mikropłytki jest atrakcyjne, ponieważ uzupełnia mikropłytkę używaną do dozowania żywności i pozwala na elastyczność w wyborze spośród wielu formatów płytek (np. formatów 6-, 12-, 48- lub 96-dołkowych) poprzez dostosowanie geometrii łącznika. Wybrano 96-dołkowy format mikropłytki, aby umożliwić indywidualną hodowlę much.
Urządzenie wydrukowane w 3D (rysunek 1) precyzyjnie orientuje 1536-dołkową płytkę podającą z 96-dołkową płytką hodowlaną, dając każdej muchy dostęp do maksymalnie 4 dołków płytki podajnika w celu spożycia. Ponadto, aby zapewnić odpowiedni czas na rozmieszczenie much w płytce oprawy i kontrolę rozpoczęcia testu, urządzenie zawiera przełączające paski barierowe zawierające muchy w odpowiednich dołkach i zapobiegające naruszeniom. Dostarczane są pliki potrzebne do pozyskania lub modyfikacji tych części (Pliki uzupełniające S.2-S.3), a także niezbędne instrukcje produkcji odpowiednich części (Plik uzupełniający S.4).
MFA zapewnia prostą metodę o wysokiej przepustowości, która uzupełnia bardziej wyszukane metody monitorowania zachowań żywieniowych Drosophila 18,21,22. Pomoc makrofinansowa ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami stosowanymi do ilościowego określania spożycia żywności. Przepustowość jest zwiększana poprzez ilościowe określanie zużycia za pomocą czytnika płytek. Eliminuje to ręczne pomiary i ręczne wprowadzanie danych. Dane można również programowo wyodrębniać i przetwarzać. Ponadto wyższa przepustowość zwiększa możliwą liczbę powtórzeń biologicznych, szczególnie w porównaniu z projektami wspólnych zasilaczy, co znacznie zwiększa moc wykrywania niewielkich różnic w zużyciu. Korzystając z MFA, pojedynczy eksperymentator może określić ilościowo zużycie lub preferencje ponad 500 much na nocny przebieg testu. Dzięki nakładaniu się na siebie przebiegów testu, w ciągu 5 dni można przebadać ponad 2000 much. Wreszcie, istnieją długoterminowe oszczędności kosztów dzięki możliwości ponownego użycia mikropłytek i łączników (plik uzupełniający S.5). Korzystając z MFA, szacowany koszt testu może wynosić zaledwie 14,80 USD, z początkowym kosztem sprzętu w wysokości 127,60 USD. Przy użyciu klasycznego testu CApillary FEeder (CAFE), który wymaga kosztownych precyzyjnych mikrokapilarek, szacowany koszt testu dla porównywalnej liczby powtórzeń wynosi 46,08 USD. W związku z tym, mimo że z góry inwestuje się w zakup niezbędnego sprzętu, zmniejszenie kosztów stałych może prowadzić do znacznych oszczędności, szczególnie w przypadkach, gdy przeprowadzane są wielokrotne testy.
Podobnie jak w przypadku wszystkich testów, MFA ma pewne ograniczenia. Przede wszystkim wymaga dostępu do spektrofotometru mikropłytkowego zdolnego do odczytu mikropłytek 1536-dołkowych. Ponadto poleganie na pomiarach absorbancji w celu określenia ilościowego sprawia, że metoda jest podatna na zakłócenia optyczne. Objawia się to ujemnymi wartościami zużycia dla niewielkiej podgrupy badanych próbek. Składniki odżywcze, leki, farmaceutyki lub toksyny będące przedmiotem zainteresowania muszą być również rozpuszczalne w wodzie, aby były zgodne z testem.
Pomimo swoich ograniczeń, metoda ta oferuje wysokoprzepustową metodę ilościowego określania zachowań konsumpcyjnych u Drosophila. Co więcej, urządzenie sprzęgające można łatwo zmodyfikować, aby przyjmowało wiele formatów płyt, co pozwala na dostosowanie się do różnych gatunków owadów.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca została wsparta grantem z National Institute on Drug Abuse (U01 DA041613) dla TFCM i RRHA.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Igły o średnicy 0,25 mm | Rave Scientific | RS-MN-52-001012 | |
| 0,45 i mikro; m Filtry strzykawkowe | Olympus Plastics | 25-245 | |
| 10 ml Jednorazowa strzykawka | EXELINT | 26200 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Paski barierowe (wycinane laserowo) | Ponoko-Materiał: przezroczysty PETG, grubość 0,5 mm; Plik uzupełniający: | ||
| Wirówka 5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Wirnik wirówki A-4-62 z wiadrami z płytką mikromiareczkową | Eppendorf | 22638041 | |
| FD& C Blue #1 | Spectrum Chemical Mfg Corp | FD110 | |
| Wiosło uszczelniające do folii | Fisher Scientific | 50-563-280 | |
| Flystuff | Flypad Genesee Scientific | #59-114 i #59-119 | CO2 Znieczulenie: Flypads są dostępne w dwóch rozmiarach, z których każdy jest odpowiedni |
| Łącznik mikropłytek (drukowany w 3D) | Shapeways | - | Materiał: nylon Multi Jet Fusion (MJF PA12); Plik uzupełniający: |
| Pokrywki do mikropłytek | Greiner Bio-One | 656170 | |
| Urządzenia molekularne SpectraMax iD5 | Urządzenia molekularne-Każdy | czytnik mikropłytek o rozdzielczości 1536 dołków wystarczy. | |
| Uchwyt sondy igłowej | Rave Scientific | RS-MN-52-001000 | |
| Poliestrowa folia uszczelniająca | Excel Scientific, Inc. | 100-SEAL-PLT | |
| Polistyren 96-dołkowe mikropłytki | Greiner Bio-One | 655101 | |
| Polistyren, bez dna, 1536-dołkowe mikropłytki | Greiner Bio-One | 783000 | Wykonane na zamówienie; Uwzględnij odpowiedni czas realizacji przy zakupie. |
| Gumki Sacharoza | |||
| Sigma | S7903 | ||
| Izolacja | 1/2 "x 1/8" Samoprzylepny ekstrakt drożdżowy z kauczuku neoprenowego o wysokiej gęstości | ||
| Fisher Scientific | BP1422 |
Bibliografia
- Wong, R., Piper, M. D. W., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS ONE. 4 (6), (2009).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Spitaler, U., et al. Yeast species affects feeding and fitness of Drosophila suzukii adults. Journal of Pest Science. 93 (4), 1295-1309 (2020).
- Wang, Q. P., et al. PGC1α controls sucrose taste sensitization in Drosophila. Cell Reports. 31 (1), 107480(2020).
- Valtierra-de-Luis, D., et al. Quantification of dose-mortality responses in adult Diptera: Validation using Ceratitis capitata and Drosophila suzukii responses to spinosad. PLoS ONE. 14 (2), 1-11 (2019).
- Williams, M. J., et al. Exposure to bisphenol A affects lipid metabolism in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 114 (5), 414-420 (2014).
- Jajoo, A., Donlon, C., Shnayder, S., Levin, M., McVey, M. Sertraline induces DNA damage and cellular toxicity in Drosophila that can be ameliorated by antioxidants. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Fochler, S., et al. Genetics of alcohol consumption in Drosophila melanogaster. Genes, Brain and Behavior. 16 (7), 675-685 (2017).
- Highfill, C. A., Baker, B. M., Stevens, S. D., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Genetics of cocaine and methamphetamine consumption and preference in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 15 (5), 1007834(2019).
- Keebaugh, E. S., Park, J. H., Su, C., Yamada, R., Ja, W. W. Nutrition Influences caffeine-mediated sleep loss in Drosophila. Sleep. 40 (11), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8 (1), 87(2015).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193(2007).
- Shell, B. C., et al. Measurement of solid food intake in Drosophila via consumption-excretion of a dye tracer. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Wu, Q., et al. Excreta quantification (EX-Q) for longitudinal measurements of food intake in Drosophila. iScience. 23 (1), 100776(2020).
- Park, A., Tran, T., Atkinson, N. S. Monitoring food preference in Drosophila by oligonucleotide tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9020-9025 (2018).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: Comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A Taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jaime, M. D. L. A., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
- IUPAC. Compendium of Chemical Terminology (The "Gold Book"). , Blackwell Scientific Publications. Research Triangle Park, NC. (1997).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560(2014).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107(2014).
Przedruki i uprawnienia
