Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół przygotowania siatek próbek w temperaturach tak wysokich jak 70 °C, przed zamrożeniem zanurzeniowym do eksperymentów krio-EM.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie wysokotemperaturowych siatek na próbki do Cryo-EM
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Siatki próbek do eksperymentów z mikroskopią krioelektronową (cryo-EM) są zazwyczaj przygotowywane w temperaturze optymalnej do przechowywania próbek biologicznych, przeważnie w temperaturze 4 °C, a czasami w temperaturze pokojowej. Niedawno odkryliśmy, że struktura białka rozpuszczona w niskiej temperaturze może nie być funkcjonalnie istotna, szczególnie w przypadku białek z archeonów ciepłolubnych. Opracowano procedurę przygotowania próbek białek w wyższych temperaturach (do 70 °C) do analizy krioelektromagnetycznej. Wykazaliśmy, że struktury z próbek przygotowanych w wyższych temperaturach są funkcjonalnie istotne i zależne od temperatury. Poniżej opisujemy szczegółowy protokół przygotowania siatek próbek w wysokiej temperaturze, na przykładzie 55 °C. W doświadczeniu wykorzystano aparat do witryfikacji zmodyfikowany za pomocą dodatkowej probówki wirówkowej, a próbki inkubowano w temperaturze 55 °C. Szczegółowe procedury zostały dopracowane w celu zminimalizowania kondensacji pary wodnej i uzyskania cienkiej warstwy lodu na siatce. Podano przykłady udanych i nieudanych eksperymentów.
Wprowadzenie
Technologia cryo-EM do rozwiązywania struktur kompleksów białkowych jest stale ulepszana, szczególnie w kierunku uzyskiwania struktur o wysokiej rozdzielczości1,2. W międzyczasie krajobraz jego zastosowania został również rozszerzony poprzez zmianę warunków próbki, takich jak pH lub ligandy, przed procesem witryfikacji3, który obejmuje przygotowanie siatek próbek, a następnie zamrażanie wgłębne4,5. Kolejnym ważnym warunkiem jest temperatura. Chociaż eksperymenty krio-EM, takie jak krystalografia rentgenowska, są wykonywane w niskich temperaturach, struktura rozwiązana przez cryo-EM odzwierciedla strukturę w stanie roztworu przed witryfikacją. Do niedawna większość badań krio-EM analizy pojedynczych cząstek (SPA) wykorzystuje próbki, które są przechowywane na lodzie (tj. w temperaturze 4 °C) przed witryfikacją6, chociaż wiele badań wykorzystuje próbki w temperaturze zbliżonej do temperatury pokojowej7,8,9,10 lub nawet 42 °C11. W niedawnym raporcie przeprowadziliśmy zależne od temperatury badania enzymu reduktoizomerazy kwasu ketolowego (KARI) z termofilnego archeonu Sulfolobus solfataricus (Sso) w sześciu różnych temperaturach od 4 °C do 70°C12. Nasze badania sugerują, że ważne jest przygotowanie siatek próbek w funkcjonalnie odpowiednich temperaturach i że cryo-EM jest jedyną metodą strukturalną, która jest praktycznie wykonalna do rozwiązania struktury tego samego kompleksu białkowego w wielu temperaturach.
Główną trudnością w przypadku witryfikacji w wysokich temperaturach jest zminimalizowanie kondensacji pary wodnej i uzyskanie cienkiego lodu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół używany do przygotowania siatek próbek w wysokich temperaturach w naszym poprzednim badaniu klasy Sso-KARI12. Zakładamy, że czytelnicy lub widzowie mają już doświadczenie w ogólnym przygotowywaniu próbek i procedurach przetwarzania danych do eksperymentów krio-EM i kładziemy nacisk na aspekty związane z wysoką temperaturą.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Ten protokół ma na celu wykorzystanie zmodyfikowanego komercyjnego aparatu do witryfikacji próbek do przygotowania próbek z mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) w określonych temperaturach, szczególnie wyższych niż 37 °C. Ogólna konfiguracja eksperymentalna jest pokazana w Rysunek 1. Jako przykład w protokole podano 55 °C. Aby zapoznać się ze szczegółowymi warunkami w innych temperaturach, zapoznaj się z tabelą uzupełniającą 2 w reference12.
1. Przygotowanie aparatu do witryfikacji
- Zrób 1 cm otwór w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na jej zamkniętym końcu.
- Umieść probówkę w komorze aparatu do witryfikacji na wylocie wody ultradźwiękowej, jak pokazano na Rysunek 2.
UWAGA: Celem jest zminimalizowanie kondensacji wody poprzez doprowadzenie pary wodnej do wymiennika ciepła przez rurę przed dotarciem do całej komory. - Ustaw temperaturę aparatu do witryfikacji na określoną temperaturę (np. 55 °C, jak pokazano na Rysunek 3) i pozwól, aby komora aparatu do witryfikacji osiągnęła 55 °C i 100% wilgotności względnej. Odstaw na co najmniej pół godziny, aby ustabilizować warunki przed rozpoczęciem eksperymentu.
2. Rozgrzewka próbki i narzędzi
- Umieść łaźnię wodną na płycie grzejnej i ustaw płytę grzejną na żądaną temperaturę (tutaj 55 °C). Sprawdź termometrem, czy woda osiąga 55 °C.
- Inkubować próbkę w łaźni wodnej i podgrzewać końcówkę pipety na krawędzi płyty grzejnej przez 2 minuty lub dłużej przed eksperymentem z blottingiem.
UWAGA: Najwyższe ustawienie temperatury dla komory aparatu do witryfikacji to 60 °C. W celu przygotowania siatek o wyższej temperaturze do eksperymentu cyro-EM (np. 70 °C), próbkę inkubuje się w łaźni wodnej w temperaturze 80 °C, a średnią między temperaturą próbki a temperaturą aparatu do witryfikacji szacuje się jako rzeczywistą temperaturę próbki na siatce (w tym przypadku 70 °C). Zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji i ograniczeń dotyczących tego oszacowania.
3. Przygotowanie do eksperymentu z blottingiem
- Rozładowanie jarzeniowe przez dziurawą siatkę opartą na węglu pod ciśnieniem 25 mA przez 30 s lub alternatywnie do wartości w zależności od zastosowanego urządzenia.
- Inkubować pęsetę z siatką w aparacie do witryfikacji przez 2 minuty lub dłużej.
- Napełnij pojemnik z etanem etanem zgodnie ze standardowymi procedurami. Nie pozwól, aby etan się przelał.
UWAGA: Ten krok zajmuje około 10 minut i należy go natychmiast wykonać eksperyment z bibułą, aby uniknąć zamarznięcia. - Umieść bibułę filtracyjną witryfikacyjną w komorze aparatu do witryfikacji nie wcześniej niż 5 minut przed eksperymentem z bibułą.
UWAGA: Zbyt wczesne umieszczenie bibuły filtracyjnej w komorze spowoduje, że stanie się ona zbyt mokra.
4. Eksperyment z bibułą
UWAGA: Trzymając siatkę, upewnij się, że siatka jest stabilna i że jest minimalna powierzchnia kontaktu z pęsetą (Rysunek 4). Ma to na celu utrzymanie najlepszej wydajności chłodzenia etanu i uniknięcie lodu nieszklistego.
- Za pomocą końcówki do pipety nanieś 7-9 μl próbki na siatkę. Następnie odczekaj 1-2 s, osusz przez 1-1,5 s i szybko zanurz próbkę w ciekłym etanie.
- Przenieś siatkę z ciekłego etanu do krioskrzynki, która jest przechowywana w ciekłym azocie.
UWAGA: Ten krok należy wykonać bardzo ostrożnie, ponieważ pęseta jest nadal gorąca, więc cały zbiornik chłodzący jest w tym czasie pełen pary.
5. Kontrola jakości siatek
- Przytnij siatki i prześlij je do instrumentu krio-EM.
- Użyj ekranu wyświetlacza przyrządu cryo-EM i funkcji niskiej dawki w oprogramowaniu, aby sprawdzić stan lodu na siatce i rozkład próbki na siatce.
UWAGA: Często kratki są bardzo suche lub warstwa lodu jest zbyt gruba. Wskaźnik powodzenia siatek przygotowanych w wysokich temperaturach jest znacznie niższy niż w temperaturze pokojowej lub 4 °C. Reprezentatywne wyniki dla siatek dobrych i niezadowalających są przedstawione w następnej sekcji. - Jeśli jakość powstałej siatki nie jest dobra, powtórz proces przygotowania siatki w różnych warunkach (takich jak czas oczekiwania, czas bibuły itp.). Jeśli jakość powstałej siatki jest dobra, powtórz te same kroki, aby uzyskać siatki w innej temperaturze.
6. Zbieranie danych
- Przenieś dobrej jakości siatki do instrumentu kriogenicznego o wysokiej rozdzielczości.
- Gromadzenie i analiza danych odbywa się zgodnie z ustalonymi procedurami.
UWAGA: Jak wykazano w naszej poprzedniej publikacji, na rozdzielczość struktury nie ma wpływu wysoka temperatura12.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przegląd przy małym powiększeniu przedstawiono na Rycini 5A,B. Panel A jest przykładem prawidłowo przygotowanej siatki. Widoczny jest gradient lodu od lewego górnego rogu (grubszy) do prawego dolnego rogu (cieńszy lub pusty). Taka siatka ułatwia znalezienie w obszarze środkowym odpowiedniej grubości warstwy lodu nadającej się do gromadzenia danych, np. w obszarach zaznaczonych niebieskimi i zielonymi ramkami. Siatka B jest zbyt sucha. Kwadraty w siatce wykazują jasny kontras...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W kroku 1 protokołu upewnij się, że probówka wirówkowa została dobrze zainstalowana i nie spada podczas trwania eksperymentu. Ze względu na gromadzenie się dużej liczby kropelek wody w komorze, które mogą zmienić zdolność adsorpcji bibuły filtracyjnej, zaleca się, aby całkowity czas eksperymentu nie przekraczał 30 minut po osiągnięciu przez komorę aparatu do witryfikacji temperatury równowagi. Jeśli czas pracy przekracza 30 minut, operator musi wymienić bibułę filtracyjną i poczekać, aż kabina ponownie zrównoważy tempera...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy dziękują Dr. Hervé Remigy z Thermo Fisher Scientific za przydatne rady. Eksperymenty z krio-EM przeprowadzono w Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM jest wspierany przez Academia Sinica (grant nr AS-CFII-108-110) oraz Taiwan Protein Project (nr grantu. AS-KPQ-109-TPP2). Autorzy dziękują również Pani Hui-Ju Huang za pomoc w przygotowaniu próbki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rurka Falcon | Falcon | 352070 | rozmiar: 50 ml |
| Bibuła filtracyjna | Ted Pella | 47000-100 | Ø 55/20mm, klasa 595 |
| HI1210 | Kąpiel wodna | Leica | |
| K100X | Mikroskopia elektronowa Sciences | wyładowanie jarzeniowe | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 Siatka 200Mesh Cu | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | obrazowanie niskodawkowe |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Pęseta | Vitrobot Ted Pella | 47000-500 |
Bibliografia
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
