Artykuł metodologiczny

Analiza ilościowa tempa wzrostu Aspergillus nidulans przy użyciu mikroskopii na żywo i oprogramowania typu open source

DOI:

10.3791/62778

⸱

24 lipca 2021

 ,  ,  , 
1Microbial Molecular Genetics Laboratory, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD), 2Light Microscopy Unit, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokół obrazowania na żywo bez znaczników, wykorzystujący techniki mikroskopii światła przechodzącego do przechwytywania obrazów, analizy i ilościowego określania kinetyki wzrostu nitkowatego grzyba A. nidulans zarówno w kulturach zanurzonych, jak i w podłożach stałych. Protokół ten może być stosowany w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jest dobrze ustalone, że wzrost kolonii grzybów strzępkowych, głównie zależny od zmian w tempie wzrostu wierzchołków strzępek/grzybni, jest makroskopowo szacowany na zastygłych podłożach, porównując wielkość kolonii. Jednak ilościowy pomiar tempa wzrostu genetycznie różnych szczepów grzybów lub szczepów w różnych warunkach środowiskowych/wzrostu (pH, temperatura, źródła węgla i azotu, antybiotyki itp.) jest wyzwaniem. W związku z tym konieczne staje się poszukiwanie uzupełniających podejść do ilościowego określania kinetyki wzrostu, aby lepiej zrozumieć wzrost komórek grzybów. Ponadto dobrze wiadomo, że grzyby strzępkowe, w tym Aspergillus spp., mają odrębne tryby wzrostu i różnicowania w warunkach podpowietrznych na podłożach stałych lub zanurzonych kulturach. W tym miejscu szczegółowo opisujemy ilościową metodę mikroskopową do analizy kinetyki wzrostu modelowego grzyba Aspergillus nidulans, wykorzystując obrazowanie na żywo zarówno w zanurzonych kulturach, jak i w pożywkach stałych. Przechwytujemy obrazy, analizujemy i określamy ilościowo tempo wzrostu różnych szczepów grzybów w powtarzalny i niezawodny sposób przy użyciu bezpłatnego oprogramowania typu open source do obrazów biologicznych (np. Fidżi), w sposób, który nie wymaga od użytkownika żadnej wcześniejszej wiedzy z zakresu analizy obrazu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grzyby strzępkowe mają ogromne znaczenie społeczno-ekonomiczne i ekologiczne, będąc zarówno kluczowymi narzędziami przemysłowymi/rolniczymi do produkcji enzymów i antybiotyków1,2 oraz jako patogeny roślin uprawnych3, szkodniki owady4 i ludzie3. Co więcej, grzyby strzępkowe, takie jak Aspergillus nidulans, są szeroko stosowane jako organizmy modelowe do badań podstawowych, takich jak badania z zakresu genetyki, biologii komórkowej i ewolucyjnej, a także do badania rozszerzenia strzępek5. Grzyby strzępkowe są wysoce spolaryzowanymi organizmami, które wydłużają się poprzez ciągłe dostarczanie lipidów/białek błonowych i syntezę de novo ściany komórkowej na rozszerzającym się końcu6. Kluczową rolę we wzroście końcówki strzępki i utrzymaniu polaryzacji odgrywa wyspecjalizowana struktura o nazwie "Spitzenkorper" (SPK), wysoce uporządkowana struktura składająca się głównie ze składników cytoszkieletu i spolaryzowanego rozkładu klasy Golgi6,7,8.

Bodźce/sygnały środowiskowe, takie jak interfejs woda-powietrze, światło, stężenie CO2 i stan odżywienia są odpowiedzialne za decyzje rozwojowe podejmowane przez te pleśnie9. W kulturach zanurzonych (płynnych) różnicowanie A. nidulans jest tłumione, a wzrost następuje przez wydłużenie końcówki strzępek6. Podczas wzrostu wegetatywnego bezpłciowe zarodniki (konidia) kiełkują przez przedłużenie wierzchołkowe, tworząc niezróżnicowaną sieć połączonych ze sobą komórek strzępkowych, grzybnię, która może rosnąć w nieskończoność, o ile dostępne są składniki odżywcze i przestrzeń. Z drugiej strony, na podłożu stałym końcówki strzępek wydłużają się i po określonym okresie wzrostu wegetatywnego (kompetencji rozwojowej) inicjowane jest rozmnażanie bezpłciowe, a łodygi konidioforów powietrznych wyrastają z wyspecjalizowanych komórek stopy grzybni6. Powodują one powstawanie wyspecjalizowanych rozwojowych struktur wielokomórkowych zwanych konidioforami, które wytwarzają długie łańcuchy haploidalnych konidiów10, które mogą wznowić wzrost w sprzyjających warunkach środowiskowych.

Powszechnie stosowaną metodą pomiaru wzrostu grzybów nitkowatych jest zaszczepienie zarodników na agarze odżywczym znajdującym się na szalce Petriego i makroskopowe zmierzenie średnicy kolonii kilka dni później11. Średnica/obszar kolonii, najbardziej zależny od zmian w tempie wzrostu grzybni, a mniej od gęstości konidioforów12, jest następnie używany jako wartość wzrostu. Chociaż pomiar wielkości populacji (kolonii) grzybów rosnących na powierzchniach stałych jest całkiem wystarczający, w żadnym wypadku nie jest to najdokładniejsza miara wzrostu. W porównaniu ze średnimi poziomami populacji (średnimi wielkościami kolonii grzybów), pomiary pojedynczych komórek mogą uchwycić heterogeniczność populacji komórek i umożliwić identyfikację nowych subpopulacji komórek, stanów13, dynamiki, szlaków, a także biologicznych mechanizmów, za pomocą których komórki reagują na zmiany endogenne i środowiskowe14,15. Monitorowanie wzrostu i fenotypu komórek grzybów za pomocą mikroskopii poklatkowej jest prawdopodobnie najpowszechniej stosowanym ilościowym podejściem do obserwacji pojedynczych komórek.

Tutaj szczegółowo opisujemy protokół obrazowania na żywo bez znaczników, wykorzystujący techniki mikroskopii światła przechodzącego (takie jak kontrast fazowy, kontrast interferencyjny różnicowy (DIC) i mikroskopia spolaryzowana) do przechwytywania obrazów, które niezależnie od połączonego użycia mikroskopii fluorescencyjnej mogą być wykorzystane do analizy i ilościowego określenia wzrostu polarnego szczepów A. nidulans zarówno w kulturach zanurzonych, jak i w pożywkach stałych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie inokulum

UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane pod komorą z przepływem laminarnym.

  1. Za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej rozprowadzić interesujący szczep grzyba z wywaru glicerolu (-80 °C) na płytki z minimalną ilością pożywki (MM) uzupełnione odpowiednimi wymaganiami żywieniowymi istotnymi dla badanego szczepu [MM: 10,0 g/L glukozy, 20 mL/L roztwór soli (roztwór soli: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2PO4, 2,0 mL/L chloroformu) i 1 mL/L pierwiastków śladowych (pierwiastki śladowe: 40 mg/L Na2B4O7·H2O, 400 mg/LCuSO4, 8 g/LZnSO4, 800 mg/L MnSO4, 800 mg/L FePO4), dostosować pH do 6,8 za pomocą 1 M NaOH, Dodać 1 % (w/v) agaru i wymagane dodatki zgodnie z opisem w16 i autoklaw] (< klasa silna = "xfig" >Rysunek 1).
    UWAGA: Roztwór soli, roztwór pierwiastków śladowych i suplementy są sterylizowane w autoklawie.
  2. Inkubować przez 2-3 dni w temperaturze 37 °C.
  3. Użyj sterylnej wykałaczki (lub pętli do zaszczepiania), przenieś niewielką ilość konidiów, delikatnie dotykając pojedynczej kolonii, na płytki z kompletnymi pożywkami (CM) [CM: 10,0 g/L glukozy, 2,0 g/L peptonu, 1,0 g/L ekstraktu drożdżowego, 1,0 g/L casaminokwasów, 20 mL/L roztworu soli, 1 mL/L pierwiastków śladowych, 5 mL/L roztworu witaminowego (roztwór witaminy: 0,1 g/l ryboflawiny, 0,1 g/l nikotynamidu, 0,01 g/l kwasu p-aminobenzoesowego, 0,05 g/l chlorowodorku pirydoksyny, 1,0 mg/l biotyny), dostosować pH do 6,8 za pomocą 1 M NaOH, dodać 1 % (w/v) agaru i wymagane suplementy zgodnie z opisem w16 i autoklawie]. Autoklaw i przechowywać roztwór witamin w ciemnej butelce o temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W przypadku, gdy wzrost grzybów jest zbyt gęsty, aby zidentyfikować i wyizolować poszczególne kolonie, ponownie nałóż smugi na nową płytkę agarową, aby uzyskać pojedyncze kolonie.
  4. Inkubować przez 3-4 dni w temperaturze 37 °C.
  5. Uzyskać zawiesinę konidialną o wymiarach około 2 x 106 komórek/ml, drapiąc 1 cm od powierzchni konidydowanej kolonii grzybów wyhodowanych na płytkach agarowych CM, używając sterylnej wykałaczki (ryc. S1).
    UWAGA: W razie potrzeby policz konidia za pomocą hemocytometru.
  6. Zebrać konidia A. nidulans w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml z 1,0 ml autoklawowanej wody destylowanej zawierającej 0,05% (v/v) Tween 80 w celu zmniejszenia liczby grudek konidiów.
    UWAGA: Konidia mogą być przechowywane do 2-3 tygodni w temperaturze 4 °C bez istotnej utraty żywotności (A. Athanasopoulos i V. Sophianopoulou, dane niepublikowane). Zaleca się jednak filtrowanie i/lub płukanie zawiesiny konidialnej w celu usunięcia części grzybni i składników odżywczych, aby zapobiec obrzękowi konidiów.

2. Przygotowanie do obrazowania grzybów strzępkowych rosnących na podłożach agarowych (stałych)

UWAGA: Używana jest zmodyfikowana wersja metody 'inverted agar17,18.

  1. Początkowo umieść 10 μl porcji silnie wirowanych konidiałów (około 2 x 104 komórek/ml) w kilku punktach na szalkach Petriego (Ø9 cm) 15 ml MM z 1% (w/v) agarem (Rysunek 2).
    UWAGA: Stosując zmodyfikowaną wersję "metody odwróconego agaru", możliwe jest obrazowanie próbek grzybów przez wiele godzin bez widocznego szkodliwego wpływu na rosnące strzępki.
  2. Inkubować kulturę doświadczalną zgodnie z etapem rozwoju, który ma być badany.
  3. Wytnij blok agaru o średnicy ≈0,8 mm2 zawierający kolonię za pomocą sterylnego skalpela.
    UWAGA: Wymiary bloku agaru, który ma zostać wycięty, zależą od wymiarów sprzętu, który ma być umieszczony później. W niniejszej pracy wykorzystano 8 studni μ-szkiełkowych (patrz poniżej).
  4. Odwrócić i umieścić blok agarowy w studzience z szkiełka μ lub podobnego 8-komorowego szkła nakrywkowego z szkiełkiem nakrywkowym odpowiednim do obrazowania na żywo.
    UWAGA: W przypadku, gdy mikroskopia w świetle przechodzącym będzie stosowana w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną (znakowaną), blok agaru można odwrócić na kroplę płynnego podłoża zawierającego barwnik barwiący żywe komórki, tuż przed obrazowaniem.

3. Przygotowanie do obrazowania grzybów strzępkowych rosnących na płynnym podłożu

  1. Przenieść 10 μl podwielokrotności silnie wirowanej zawiesiny konidialnej (około 2 x 104 komórek/ml) do studzienek 8-dołkowego szkiełka μ zawierającego 200 μl (płynnego) MM z odpowiednimi dodatkami (patrz wyżej).
  2. Inkubuj przez żądany czas w żądanej temperaturze (Rysunek 3).
    UWAGA: Jeśli mikroskopia w świetle przechodzącym będzie używana w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną (znakowaną), kultury płynne mają tę wielką zaletę, że barwniki fluorescencyjne mogą być dodawane w dowolnym momencie podczas eksperymentu19.

4. Przechwytywanie obrazów

UWAGA: Wybór mikroskopu zależy od dostępnego sprzętu. W każdym przypadku zestaw mikroskopu powinien zawierać odwrócony stolik, komorę środowiskową lub przynajmniej pomieszczenie z precyzyjną kontrolą temperatury powietrza.

  1. Przed rozpoczęciem rozgrzej termostatyczną komorę mikroskopu do temperatury 37 °C (chyba że wskazano inaczej lub jest to odpowiednie dla stosowanych gatunków grzybów), aby ustabilizować temperaturę. Komora ta umożliwia modulację temperatury optyki mikroskopu i stolika na próbkę podczas eksperymentów poklatkowych. Należy pamiętać, że aberracje optyczne20 są wprowadzane, gdy normalne olejki immersyjne (przeznaczone do użytku w temperaturze 23 °C) są używane w temperaturze 37 °C lub wyższej.
    UWAGA: Przy ograniczonym budżecie komory inkubacyjne mogą być wykonane z tektury i izolacyjnego materiału opakowaniowego21 lub za pomocą drukarki 3D22.
  2. Włącz mikroskop, zasilanie skanera, zasilanie lasera i komputer, a następnie załaduj oprogramowanie do obrazowania. Umieść μ-szkiełko podstawowe (przygotowane wcześniej) w stoliku mikroskopu i ustaw ostrość.
  3. Znajdź pola widzenia, które zawierają izolowane/nie nakładające się na siebie komórki (lub przynajmniej nie są przepełnione), aby ułatwić pomiary wzrostu podczas analizy obrazu. Weź co najmniej 50 rosnących komórek na próbkę, aby umożliwić solidną analizę statystyczną.
  4. Wybierz żądane podejście do mikroskopii w świetle przechodzącym. Skróć czas naświetlania lub moc lasera i czas przebywania pikseli i/lub zwiększ średnice otworków, aby zminimalizować fotowybielanie komórek grzybów, zgodnie z opisem w innym miejscu 23,24.
  5. Ustaw mikroskop, aby rejestrować obrazy w żądanych odstępach czasu i rozpoczynać akwizycję szeregów czasowych.
    UWAGA: Aby skorygować przesunięcie ogniskowej w czasie (szczególnie w przypadku długich eksperymentów), spowodowane dryftem termicznym, różnymi rozmiarami komórek i ruchem komórek, użyj strategii autofokusa, jeśli jest dostępna w oprogramowaniu mikroskopu.

5. Analiza obrazu

UWAGA: Ta sekcja opisuje kluczowe etapy przetwarzania obrazów z mikroskopii poklatkowej do pomiaru tempa wzrostu A. nidulans. Otwieranie, wizualizacja i przetwarzanie obrazów odbywa się za pomocą oprogramowania ImageJ/Fiji o otwartym kodzie źródłowym25.

  1. Importuj obrazy na Fidżi za pomocą wtyczek | Formaty biologiczne | Importer formatów biologicznych z menu Fidżi z ustawieniami domyślnymi (Rysunek 4A).
    UWAGA: Sprawdź, czy importer formatów biologicznych prawidłowo rozpoznaje kalibrację obrazu. Wymiar obrazu pokazany w oknie obrazu w górnym polu informacyjnym musi być równy oryginalnym wymiarom obrazu (Rysunek 4B). Naciśnij Shift + P, aby wyświetlić i zmienić właściwości obrazu w oprogramowaniu ImageJ/Fiji.
  2. W razie potrzeby użyj histogramu matching26 do korekcji oświetlenia między różnymi klatkami (Obraz | Dostosuj | Korekcja wybielacza | Dopasowanie histogramu) (Rysunek 4C).
  3. W razie potrzeby użyj algorytmu SIFT (Wtyczki | Rejestracja | Linear Stack Alignment with SIFT) do wyrównywania lub dopasowywania stosów obrazów (Rysunek 4D). Wybranie opcji "Translacja" z menu oczekiwanej transformacji powinno wystarczyć, aby skorygować dryf x-y.
    UWAGA: Inne wtyczki mogą być również używane do wyrównywania stosu plasterków obrazu, takie jak Image Stabilizer (https://imagej.net/Image_Stabilizer) lub StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/).
  4. Wybierz strzępki, które rosną równolegle do szkiełka nakrywkowego, unikając tych, które są pochylone. Pamiętaj, aby wybrać strzępki, które rozchodzą się przez rozciągnięcie biegunowe i unikać strzępek z rozgałęzieniami bocznymi i/lub wierzchołkowymi.
  5. Korzystanie z MTrackJ (Wtyczki | MTrackJ) do śledzenia rosnących końcówek strzępek (Rysunek 4E)27. Aby dodać ścieżkę, wybierz przycisk Dodaj na pasku narzędzi i umieść pierwszy punkt na końcówce łącznika, klikając lewym przyciskiem myszy. Szereg czasowy zostanie automatycznie przeniesiony do następnej klatki. Aby zakończyć proces śledzenia, kliknij dwukrotnie myszką na ostatni punkt (lub naciśnij Esc) (Rysunek 4F). Przejdź do innego interesującego punktu (tj. rosnącej końcówki strzępki) w początkowym przedziale czasowym i uruchom ponownie procedurę, mierząc tempo wzrostu innej strzępki.
    UWAGA: Aby zainstalować MTrackJ, postępuj zgodnie z instrukcjami przedstawionymi na stronie https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
  6. Kliknij przycisk Zmierz w oknie dialogowym MTrackJ (Rysunek 4G), aby otworzyć tabelę wyników. Zapisz pomiary ścieżki (punkt menu Plik | Zapisz jako) do żądanego formatu pliku (np. csv), przeanalizuj je i wykreśl (Rysunek 4H).
    UWAGA: Wybranie przycisku Film powoduje utworzenie filmu pokazującego obraz i postęp ścieżki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępując zgodnie z tym protokołem, przechwyciliśmy i przeanalizowaliśmy różne obrazy odpowiadające różnym etapom wzrostu/rozwoju nitkowatego grzyba A. nidulans. Dane przedstawione w tym badaniu zostały przetworzone i przeanalizowane za pomocą oprogramowania Fidżi. Pomiary zostały zapisane jako pliki csv, przeanalizowane statystycznie i przygotowane jako wykresy przy użyciu komercyjnego oprogramowania statystycznego i/lub języka programowania Python przy użyciu bibliotek oprogramowania, takich jak pandas, numpy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monitorowanie wzrostu i fenotypu komórek grzybów za pomocą mikroskopii poklatkowej jest skutecznym podejściem do oceny zachowania komórek w czasie rzeczywistym oraz ilościowego i dokładnego określenia, czy określone leczenie farmakologiczne i/lub interwencja genetyczna powoduje wykrywalny wzrost komórek lub różnice fenotypowe w czasie.

W tym badaniu opisano wiarygodną metodologię obrazowania żywych komórek w celu pomiaru i ilościowej analizy rozwoju grzybów, w tym dynamiki wzrostu rurki zarodk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez projekt "Grecka infrastruktura badawcza do wizualizacji i monitorowania podstawowych procesów biologicznych (BioImaging-GR)" (MIS 5002755), który jest realizowany w ramach działania "Wzmocnienie infrastruktury badawczej i innowacyjnej", finansowanego przez Program Operacyjny "Konkurencyjność, Przedsiębiorczość i Innowacje" (NSRO 2014-2020) i współfinansowanego przez Grecję i UE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
&mikro;-Slide 8 WellIbidi80826Szkiełka obrazowe
Kwas 4-aminobenzoesowyMerckA9878
azhAΔ ngnAΔGenotyp: zhAΔ::p yrGAf; ngnAΔ::p yrGAf; pyroA4 pantoB100 / Referencje:Kolekcja laboratoryjna, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino AcidsGibco223030
ChloroformMerck67-66-3
Penhydrat siarczanu miedzi(II)MerckC8027
GlukozaMerckG8270
GraphPad Prism 8.0OprogramowanieOprogramowanie statystyczne
ImageJNIHOprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów Pętla
inokulacyjnaMerckI8263-500EA
Fosforan żelaza(III)Merck1.03935
Pakiet aplikacji Leica XLeica MicrosystemsOprogramowanie mikroskopu
Siarczan magnezu siedmiowodnyMerck63138
Jednowodny siarczan manganu(II)MerckM7899
Mikroskop Leica TCS SP8Leica Microsystems
Nikotynamid (niacynamid)Supelco47865-U
PeptoneMillipore68971
Szalki Petriego do hodowli mikrobiologicznejKISKERG090
Chlorek potasuMerckP4504
Fosforan potasu jednozasadowyMerckP5655
Chlorowodorek pirydoksynyMerckP6280
Quali - Probówki do mikrowirówek, 1,7 mL, wolne od DNaz, RNaz i pirogenów, sterylneKISKERG052-S
Quali - Probówki do mikrowirówek, 2,0 mL, sterylneKISKERG053-S
Quali - Końcówki standardowe, fazowane, 100-1000 &mikro; LKISKERVL004G
Quali - Końcówki standardowe, skośne, 1-200 &mikro; LKońcówki mikroobjętościowe KISKERVL700G
Quali, bez DNaz, RNaz, 0,1-10 i mikro; L/przezroczystyKISKERGC. PORADY. B
Ryboflawina (B2)Supelco47861
Ostrza skalpela NR 11OdontoMed2011S2771
Chlorek soduMerckS7653
Wodorotlenek soduMerckS8045
Tetraboran sodu dekahydratMerckS9640
VS151 (PilA-GFP i H1-mRFP)Genotyp: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ ryboB2 / Referencje:Kolekcja laboratoryjna, Biratsi et al., 2021
WTGenotyp: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4; pyrG89 / Referencje: TN02A3 -FGSC A1149
Ekstrakt drożdżowyMillipore70161
ZnSO4
Biotyna Merck B4639 GraphPad

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215(2020).
  2. Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
  3. Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
  4. Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
  5. Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
  6. Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
  7. Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. Fungal plasma membrane domains. FEMS Microbiology Reviews. , (2019).
  8. Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
  9. Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
  10. Yu, J. -H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
  11. Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
  12. Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
  13. Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
  14. Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
  15. Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
  16. Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
  17. Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
  18. Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
  19. Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613(2019).
  20. Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
  21. Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
  22. Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
  23. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  24. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494(2020).
  27. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  28. Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).
  29. Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391(2021).
  30. Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
  31. Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
  32. Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
  33. Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
  34. Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705(2017).
  35. Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H. Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).
  36. Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
  37. Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  38. Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
  39. Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fungal Growth RateGrowth KineticsTime Lapse MicroscopyImageJ FijiHyphal Tip TrackingFilamentous FungiColony Growth MeasurementQuantitative Image Analysis

Powiązane artykuły