Ten protokół opisuje zoptymalizowany przebieg procesu izolacji jąder i super-rozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego w celu oceny pojedynczych nukleoporyn w nukleoplazmie i NPC w indukowanych pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych i pośmiertnych tkankach ludzkich.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja jąder i mikroskopia oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości do badania zmian nukleozyny w neurodegeneracji człowieka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kompleks porów jądrowych (NPC) to złożona struktura makromolekularna składająca się z wielu kopii ~30 różnych białek nukleoporynowych (Nups). Łącznie te NUPS działają w celu regulacji organizacji genomu, ekspresji genów i transportu nukleocytoplazmatycznego (NCT). Ostatnio defekty NCT i zmiany w specyficznych NUP zostały zidentyfikowane jako wczesne i widoczne patologie w wielu chorobach neurodegeneracyjnych, w tym stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS), chorobie Alzheimera (AD)/otępieniu czołowo-skroniowym (FTD) i chorobie Huntingtona (HD). Postępy zarówno w mikroskopii świetlnej, jak i elektronowej pozwalają na dokładne badanie struktur subkomórkowych, w tym NPC i jego składników NUP, z większą precyzją i rozdzielczością. Spośród powszechnie stosowanych technik, mikroskopia oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości (SIM) daje niezrównaną możliwość badania lokalizacji i ekspresji poszczególnych Nup przy użyciu konwencjonalnych strategii znakowania opartych na przeciwciałach. Izolacja jąder przed SIM umożliwia wizualizację poszczególnych białek Nup w obrębie NPC i nukleoplazmy w pełni i dokładnie zrekonstruowanej przestrzeni 3D. Protokół ten opisuje procedurę izolacji jąder i SIM w celu oceny ekspresji i dystrybucji Nup w ludzkich komórkach OUN pochodzących z iPSC i tkankach pośmiertnych.
Wprowadzenie
Częstość występowania chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem wzrasta wraz ze starzeniem się populacji1. Podczas gdy podstawy genetyczne i patologiczne cechy charakterystyczne są dobrze scharakteryzowane, dokładne zdarzenia molekularne prowadzące do uszkodzenia neuronów pozostają słabo poznane2,3,4,5,6,7,8,9,10,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie próbki krwi do generowania iPSC i autopsji tkanek są zatwierdzane przez Johns Hopkins IRB pod nadzorem etyki Johns Hopkins. Wszystkie informacje o pacjencie są zgodne z ustawą HIPPA. Poniższy protokół jest zgodny ze wszystkimi procedurami bezpieczeństwa biologicznego Johns Hopkins.
1. Przygotowanie preparatów do barwienia immunologicznego i obrazowania
- Umieść dodatnio naładowane szkiełko mikroskopowe w pustym cytolejku i narysuj okrąg za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego, aby obrysować obszar do osadzenia jąder.
- Dodać 50 μl roztworu kolagenu o stężeniu 1 mg/ml (rozcieńczonego w 1x PBS) do środka okręgu ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zbadać rozkład i ekspresję POM121 w kompleksach porów jądrowych (NPC) oraz w nukleoplazmie ludzkich jąder neuronalnych, zróżnicowano kontrolne i C9orf72 iPSN zgodnie z wcześniejszym opisem15. Pośmiertną korę ruchową człowieka oraz iPSN w 32. dniu różnicowania poddano lizie, izolacji jąder oraz immunobarwieniu zgodnie z powyższym opisem. Izolowane jądra NeuN-dodatnie obrazowano za pomocą super-rozdzielczej mikroskopii iluminacji strukturalnej (SIM) przy użyciu mikroskopu do super-rozdzielczej i.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Biorąc pod uwagę niedawną identyfikację deficytów NCT jako wczesnego i znaczącego zjawiska w wielu chorobach neurodegeneracyjnych 16,27,28,30,31, istnieje krytyczna potrzeba dokładnego zbadania mechanizmu, za pomocą którego zachodzi ta patologia. Ponieważ NPC i jego poszczególne białka Nup krytycznie kontrolują funkcjonalny NCT39,41
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Pośmiertne ludzkie tkanki OUN zostały dostarczone przez Johns Hopkins ALS Autopsy Bank i Target ALS Postmortem Tissue Core. Praca ta była wspierana przez ALSA Milton Safenowitz Postdoctoral Fellowship (ANC), a także fundusze z NIH-NINDS, Departamentu Obrony, ALS Association, Muscular Dystrophy Association, F Prime, The Robert Packard Center for ALS Research Answer ALS Program oraz Chan Zuckerberg Initiative.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki stożkowe 50 ml | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Ultrawirówka Beckman | Beckman Coulter | ||
| Sarstedt | 83.183 | ||
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5005 | |
| Szkiełka nakrywkowe | MatTek | PCS-170-1818 | |
| Cytofunnel | Thermo Fisher Scientific | ||
| Cytospin 4 | Homogenizatory Fisher Scientific | A78300003 | |
| Dounce | DWK Nauki Przyrodnicze | 357542 | |
| DTT | Sigma Aldrich | D0632 | |
| Probówki Eppendorf | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Koza Anty-Kurczak Alexa 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21449 | |
| Kozioł Anty-Myszy Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Kozioł Anty-Myszy Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11031 | |
| Kozioł Anty-Myszy Alexa 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21236 | |
| Kozioł Anty-Królik Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | |
| Kozioł Anty-Królik Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | |
| Koza Anty-Królik Alexa 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21245 | |
| Kozioł Anty-Szczur Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | |
| Kozioł Anty-Szczur Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11077 | |
| Kozioł Anty-Szczur Alexa 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21247 | |
| Hemacytometr | Fisher Scientific | 267110 | |
| Szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Normalna surowica kozia | Vector Labs | S-1000 | |
| Zestaw do izolacji jąder Nuclei PURE | Sigma Aldrich | NUC201 | zawiera bufor do lizy, 10% Triton X-100, 2 M gradient sacharozy, roztwór poduszki sacharozy i bufor do przechowywania jąder; Określany w protokole jako "zestaw do izolacji jąder" |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Prolong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | Określany w protokole jako "twardy nośnik montażowy zapobiegający blaknięciu" |
| SW 32 Ti Ultrawirówka Rotor | Beckman Coulter | 369694 | Określany w protokole jako "wirnik ultrawirówkowy" |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ultrawirówki | Beckman Coulter | 344058 | |
| Pierwotne przeciwciała | nukleoporynowePrzeciwciała pierwszorzędowe odpowiednie do immunofluorescencyjnego wykrywania indywidualnych nukleoporyn są dostępne w wielu firmach |
Bibliografia
- Hou, Y., et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (10), 565-581 (2019).
- Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
