Method Article

Izolacja jąder i mikroskopia oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości do badania zmian nukleozyny w neurodegeneracji człowieka

DOI:

10.3791/62789

⸱

September 10th, 2021

 , 
1Brain Science Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurology, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje zoptymalizowany przebieg procesu izolacji jąder i super-rozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego w celu oceny pojedynczych nukleoporyn w nukleoplazmie i NPC w indukowanych pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych i pośmiertnych tkankach ludzkich.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompleks porów jądrowych (NPC) to złożona struktura makromolekularna składająca się z wielu kopii ~30 różnych białek nukleoporynowych (Nups). Łącznie te NUPS działają w celu regulacji organizacji genomu, ekspresji genów i transportu nukleocytoplazmatycznego (NCT). Ostatnio defekty NCT i zmiany w specyficznych NUP zostały zidentyfikowane jako wczesne i widoczne patologie w wielu chorobach neurodegeneracyjnych, w tym stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS), chorobie Alzheimera (AD)/otępieniu czołowo-skroniowym (FTD) i chorobie Huntingtona (HD). Postępy zarówno w mikroskopii świetlnej, jak i elektronowej pozwalają na dokładne badanie struktur subkomórkowych, w tym NPC i jego składników NUP, z większą precyzją i rozdzielczością. Spośród powszechnie stosowanych technik, mikroskopia oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości (SIM) daje niezrównaną możliwość badania lokalizacji i ekspresji poszczególnych Nup przy użyciu konwencjonalnych strategii znakowania opartych na przeciwciałach. Izolacja jąder przed SIM umożliwia wizualizację poszczególnych białek Nup w obrębie NPC i nukleoplazmy w pełni i dokładnie zrekonstruowanej przestrzeni 3D. Protokół ten opisuje procedurę izolacji jąder i SIM w celu oceny ekspresji i dystrybucji Nup w ludzkich komórkach OUN pochodzących z iPSC i tkankach pośmiertnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Częstość występowania chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem wzrasta wraz ze starzeniem się populacji1. Podczas gdy podstawy genetyczne i patologiczne cechy charakterystyczne są dobrze scharakteryzowane, dokładne zdarzenia molekularne prowadzące do uszkodzenia neuronów pozostają słabo poznane2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Ostatnio ekspansja powtórzeń heksanukleotydowych G4C2 w pierwszym intronie genu C9orf72 została zidentyfikowana jako najczęstsza genetyczna przyczyna powiązanych chorób neurodegeneracyjnych: stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) i otępienia czołowo-skroniowego (FTD)13,14. Kilka badań potwierdza obecnie kluczową rolę zakłóceń w maszynerii transportu jądrowego, w tym kompleksów porowych (NPC) i receptorów transportu jądrowego (NTR, karioferyny), jako przyczynę C9orf72 ALS15,16. W niedzielących się komórkach w mózgu szczura nukleozyny rusztowania (Nups) są niezwykle długowieczne. W rezultacie, zmiany w NPC i NCT zostały zgłoszone podczas starzenia17,18,19,20. Co więcej, niektóre nukleozyny lub transportyny, gdy są zmutowane, są powiązane z określonymi chorobami neurologicznymi21,22. Na przykład mutacje w Nup62 zostały powiązane z obustronną martwicą prążkowia u niemowląt (IBSN), zaburzeniem neurologicznym wpływającym na jądro ogoniaste i skorupę23; mutacje w Gle1 są związane z chorobą neuronu ruchowego płodu Ludzki śmiertelny wrodzony przykurcz 1 (LCCS1)24; a mutacje w Aladinie są przyczyną zespołu Triple-A25. Zmiany w funkcjonalnym NCT nasilają się w chorobach neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem, takich jak ALS, choroba Huntingtona (HD) i choroba Alzheimera (AD)16,26,27,28,29,30,31. Ponadto zidentyfikowano specyficzne NUP i NTR jako modyfikatory toksyczności, w której pośredniczy C9orf72 w Drosophila eye28 lub biochemicznie modyfikują stan agregacji białek związanych z chorobą, takich jak FUS i tau27,32,33,34. Podsumowując, te wczesne badania sugerują, że zmieniona NCT może być pierwotną i wczesną patologiczną cechą ALS i FTD. Badania nad systemem modelowym opartym na nadekspresji sugerują, że błędna lokalizacja określonych Nups i karioferin może mieć wpływ na NCT16,35,36,37,38. Jednak te badania patologiczne w rzeczywistości nie łączą cytoplazmatycznych nagromadzeń białek NPC z defektami w strukturze lub funkcji NPC. Na przykład ta patologia może po prostu odzwierciedlać rozregulowanie cytoplazmatycznych pul białek Nup przy niewielkim wpływie na skład i funkcję NPC. W przeciwieństwie do tego, niedawne badanie wykorzystujące mikroskopię oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości (SIM) pokazuje pojawienie się znaczącego uszkodzenia samego NPC, charakteryzującego się zmniejszeniem określonych poziomów Nup w nukleoplazmie i NPC ludzkich neuronów C9orf72 ALS/FTD, co ostatecznie prowadzi do zmiany funkcji NPC jako wczesnego zdarzenia inicjującego kaskady chorób patogennych15.

Przejście makrocząsteczek między jądrem a cytoplazmą jest regulowane przez kompleks porów jądrowych (NPC). NPC to duży kompleks makromolekularny osadzony w otoczce jądrowej składający się z wielu kopii 30 białek nukleoporynowych (Nups)39,40,41. Chociaż stechiometria Nup różni się w zależności od typu komórek42,43,44, utrzymanie ogólnego składu NPC ma kluczowe znaczenie dla NCT, organizacji genomu i ogólnej żywotności komórek39,41,45,46. W rezultacie, zmieniony skład NPC i wynikające z niego defekty w transporcie funkcjonalnym mogą mieć wpływ na niezliczone funkcje komórkowe w dalszej części łańcucha dostaw. Składniki Nup NPC są wysoce zorganizowane w wiele podkompleksów, w tym pierścień cytoplazmatyczny i włókna, kanał centralny, pierścień zewnętrzny, pierścień wewnętrzny, pierścień transbłonowy i koszyk jądrowy. Łącznie, rusztowanie Nups pierścieni wewnętrznych, zewnętrznych i transbłonowych zakotwicza NPC w otoczce jądrowej i zapewnia punkty zaczepienia dla Nups pierścienia cytoplazmatycznego, kanału centralnego i koszyka jądrowego. Podczas gdy małe cząsteczki (<40-60 kD) mogą pasywnie dyfundować przez NPC, aktywny transport większych ładunków jest ułatwiony przez interakcje między receptorami transportu jądrowego (NTR, karioferyny) a FG NUPS włókien cytoplazmatycznych, kanału centralnego i koszyka jądrowego39,40,41,45. Ponadto, garstka Nup może dodatkowo funkcjonować poza NPC, w nukleoplazmie, aby regulować ekspresję genów46,47.

Biorąc pod uwagę, że wymiar boczny pojedynczego ludzkiego NPC wynosi około 100-120 nm40, standardowa mikroskopia szerokokątna lub konfokalna jest niewystarczająca do rozpoznania poszczególnych NPC48. Techniki mikroskopii elektronowej (EM), takie jak TEM lub SEM, są często używane do oceny ogólnej struktury NPCs39,40. Pomimo zalet tych technik do rozpoznawania ultrastruktury NPC, są one rzadziej wykorzystywane do oceny obecności poszczególnych białek Nup w NPC. Ograniczenia techniczne związane z łączeniem znakowania opartego na przeciwciałach lub znacznikach z tymi najnowocześniejszymi technologiami, TEM i SEM, nie zawsze pozwalają na dokładną i wiarygodną ocenę samych NUP w obrębie NPC lub nukleoplazmy. Co więcej, techniki te mogą być trudne technicznie i nie są jeszcze powszechnie dostępne dla wszystkich badaczy. Jednak ostatnie postępy w mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej zwiększyły dostępność technologii obrazowania o wysokiej rozdzielczości. W szczególności SIM daje niezrównaną możliwość obrazowania poszczególnych Nup w rozdzielczości, która zbliża się do wymiarów bocznych jednego ludzkiego NPC40,48,49,50,51. W przeciwieństwie do innych podejść o wysokiej rozdzielczości, takich jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM) i stymulowane zubożenie emisji (STED), SIM jest kompatybilny z konwencjonalnym barwieniem immunologicznym opartym na przeciwciałach49. W ten sposób SIM pozwala na kompleksową analizę wszystkich Nups, dla których dostępne jest określone przeciwciało Nup. Możliwość pobierania próbek i obrazowania wielu różnych Nup w tym samym preparacie zapewnia znaczące korzyści w porównaniu z innymi metodami obrazowania podczas badania wielu białek składających się na NPC. Poniższa procedura szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół oceny poszczególnych składników Nup NPC przy użyciu jąder wyizolowanych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) pochodzących z neuronów (iPSN) i pośmiertnych tkanek ludzkiego ośrodkowego układu nerwowego (OUN).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie próbki krwi do generowania iPSC i autopsji tkanek są zatwierdzane przez Johns Hopkins IRB pod nadzorem etyki Johns Hopkins. Wszystkie informacje o pacjencie są zgodne z ustawą HIPPA. Poniższy protokół jest zgodny ze wszystkimi procedurami bezpieczeństwa biologicznego Johns Hopkins.

1. Przygotowanie preparatów do barwienia immunologicznego i obrazowania

  1. Umieść dodatnio naładowane szkiełko mikroskopowe w pustym cytolejku i narysuj okrąg za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego, aby obrysować obszar do osadzenia jąder.
  2. Dodać 50 μl roztworu kolagenu o stężeniu 1 mg/ml (rozcieńczonego w 1x PBS) do środka okręgu narysowanego w kroku 1.1 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  3. Odessać roztwór kolagenu i pozostawić szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez około 1 godzinę.

2. Przygotowanie buforu do lizy i gradientów sacharozy

  1. Przygotować bufor do lizy i roztwory gradientu sacharozy zgodnie z protokołem zestawu do izolacji jąder.
    1. Dla każdej próbki należy przygotować stożkową probówkę o pojemności 50 ml z buforem do lizy, łącząc 11 ml dostarczonego buforu do lizy, 110 μl dostarczonego 10% roztworu Triton X-100 i 11 μl świeżo przygotowanego lub rozmrożonego 1 M DTT (ditiotreitol).
    2. Dla każdej próbki należy użyć stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu przygotowania 1,85 M roztworu poduszki sacharozy, łącząc 27,75 ml dostarczonego 2 M roztworu poduszki sacharozy, 2,25 ml dostarczonego buforu poduszkowego sacharozy i 30 μl świeżo przygotowanego lub rozmrożonego 1 M DTT.
      UWAGA: Roztwór poduszki sacharozowej o sacharozie o sacharozie o sile 1,85 M jest optymalny dla iPSN i pośmiertnych ludzkich tkanek OUN, ale należy go dostosować do innych typów komórek lub próbek tkanek. Dodatkowe szczegóły dotyczące komórek HEK293, astrocytów pochodzących z iPSC oraz wzbogacania jąder oligodendrocytów z pośmiertnych tkanek OUN zostały niedawno opublikowane15.
  2. Delikatnie wymieszaj roztwory buforu do lizy i sacharozy, odwracając stożkowe rurki i przechowuj je na lodzie.

3. Liza iPSN i pośmiertne badanie ludzkiej tkanki OUN

  1. Przed przystąpieniem do lizy należy umieścić rotor ultrawirówki (bez uchwytów na próbki) w ultrawirówce i pozostawić do wstępnego ostygnięcia do temperatury 4 °C.
  2. Liza iPSNs.
    UWAGA: Protokoły lizy różnią się w przypadku iPSN i pośmiertnej ludzkiej tkanki OUN. Postępuj zgodnie z protokołem dla typu próbki określonym poniżej (krok 3.2: iPSN, krok 3.3: pośmiertne badanie ludzkiej tkanki OUN).
    1. Wyjmij iPSN z inkubatora i odessaj pożywkę. Krótko spłukać 1x PBS i dodać bufor do lizy bezpośrednio do dołka lub płytki.
      UWAGA: Zadbaj o odpowiednie wypłukanie iPSN wystarczającą ilością 1x PBS, aby usunąć zanieczyszczenia i martwe komórki. Objętość buforu do lizy, który ma zostać dodany do płytek iPSN, będzie się różnić. Proszę zapoznać się z Tabelą 1. Upewnij się, że materiał wyjściowy to >2,5 miliona iPSN.
    2. Zeskrobać iPSN za pomocą skrobaka do komórek i przenieść je do pozostałego buforu do lizy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    3. Zakryj każdą stożkową probówkę i wiruj próbki przez 20 sekund, aby ułatwić lizę iPSN.
    4. Pozostaw próbki na lodzie na 1-2 minuty przed kontynuowaniem.
  3. Pośmiertna liza ludzkich tkanek OUN.
    1. Odważ ~ 100 mg zamrożonej pośmiertnej ludzkiej tkanki OUN, tnąc żyletką na szalce Petriego umieszczonej na łóżku z suchego lodu. Pamiętaj, aby pracować na powierzchni otoczonej jednorazowymi podkładkami, aby uniknąć miejscowego zanieczyszczenia tkanek. Zwróć uwagę na konkretne rozwarstwienia istoty szarej w porównaniu z istotą białą (np. płaszcz korowy w porównaniu z leżącą pod nim istotą białą) widoczne w momencie rozwarstwienia tkanki.
      UWAGA: Nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej, w tym okulary ochronne i rękawice podczas pracy z zamrożonymi próbkami tkanek ludzkich pobranych pośmiertnie. Etap ten można również wykonać z wyprzedzeniem, a podwielokrotności tkanek przechowywać w temperaturze -80 °C. 50 mg to ilość wystarczająca do izolacji jąder. Jednak więcej niż 100 mg tkanki często daje niepełną izolację jąder, o czym świadczy obecność nienaruszonej cytoplazmy otaczającej niektóre jądra.
    2. Przygotuj homogenizator Dounce, czyszcząc i dokładnie spłukując wodą destylowaną. Schłodzić homogenizator, umieszczając go na lodzie.
    3. Dodać 100 mg tkanki do świeżo oczyszczonego, opłukanego i schłodzonego (na lodzie) homogenizatora z beczki zawierającego 2 ml przygotowanego buforu do lizy.
    4. Homogenizować w homogenizatorze Dounce zgodnie ze standardową procedurą na lodzie.
      UWAGA: Zazwyczaj 10-20 uderzeń na tłuczek wystarcza, aby poruszać się po próbce bez oporu.
    5. Przenieś 2 ml pośmiertnego homogenatu ludzkiego mózgu do pozostałych 9 ml buforu do lizy w stożkowych probówkach.
    6. Wiruj energicznie przez 30 s i pozostaw na lodzie na 5 minut, aby ułatwić lizę.

4. Izolacja jąder z iPSN i pośmiertna ludzka tkanka OUN

  1. Na dno probówki ultrawirówki ułożyć warstwę 10 ml 1,85 M roztworu poduszki sacharozowej (wykonanego w kroku 2.1.2) i dodać 18 ml 1,85 M roztworu poduszki sacharozowej do każdego lizatu.
  2. Delikatnie wymieszać roztwór lizatu/sacharozy w poduszce (połączone w kroku 4.1), odwracając stożkową probówkę o pojemności 50 ml.
  3. Powoli dodawać 28 ml mieszaniny lizatu i roztworu sacharozy do 10 ml 1,85 M roztworu poduszki sacharozowej w probówce ultrawirówki (od kroku 4.1).
    UWAGA: W stożkowej probówce o pojemności 50 ml znajduje się łącznie 29 ml mieszaniny roztworu poduszki lizatu i sacharozy (kroki 4.1-4.2). Pozostawić 1 ml mieszaniny roztworu poduszek lizatu i sacharozy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zapewnia to dokładne i spójne pipetowanie wszystkich próbek ze względu na lepkość roztworu poduszki sacharozy.
  4. Umieścić probówki ultrawirówkowe w uchwytach i dodać dodatkowy 1,85 M roztwór poduszki sacharozowej (wykonany w kroku 2.1.2) w razie potrzeby w celu zrównoważenia próbek.
  5. Umieścić uchwyty na próbki w wirniku w schłodzonej ultrawirówce i wirować w temperaturze 30 000 x g, 4 °C przez 45 minut.
  6. Wyjąć probówki ultrawirówkowe z uchwytów na próbki i wyrzucić supernatanty. Jądra będą widoczne jako granulki na dolnych bokach probówki do ultrawirówki.
  7. Zawiesić osady jąder w 1 ml dostarczonego buforu do przechowywania jąder przez wirowanie i przenieść do probówki do mikrowirówki.
  8. Odwirować probówki do mikrowirówek w temperaturze 2 500 x g, 4 °C przez 5 minut.
  9. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić jądra poprzez wirowanie w świeżym 1 ml dostarczonego buforu do przechowywania jąder.
  10. Przystąpić do barwienia immunologicznego lub przechowywać jądra w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Jądra mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy i poddawane dwóm cyklom zamrażania/rozmrażania, zanim integralność strukturalna zostanie naruszona.

5. Barwienie immunologiczne izolowanych jąder

  1. Pobrać 10 μl podwielokrotności zawiesiny jąder i policzyć za pomocą hemacytometru lub automatycznego licznika komórek.
  2. Zmontuj przygotowane szkiełka (z kroku 1.3) w cytolejkach.
  3. Do każdego cytolejka ułóż 200 μl bufora magazynującego świeże jądra i ~100 000 jąder.
  4. Delikatnie obrócić jądra na szkiełkach, umieszczając cytolejki w cytowirówce i odwirowując przez 3 minuty przy 100 x g.
  5. Odpiąć cytolejki i natychmiast dodać ~100 μl 4% PFA (paraformaldehydu) do szkiełek i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Jądra można również utrwalać za pomocą metanolu. Stosować metodę utrwalania odpowiednią dla każdego przeciwciała. W przypadku stosowania metanolu należy pominąć etap przepuszczalności (5.7). Cytofunnele są jednorazowego użytku; W tym momencie wyrzuć je.
  6. Myć jądra 3x przez 5 min 1x PBS.
  7. Przepuszczalność jąder za pomocą 0,1% Triton X-100 w 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Zablokuj jądra w roztworze blokowym (10% surowicy koziej lub oślej w 1x PBS) na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Inkubować jądra z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze blokowym przez noc w temperaturze 4 °C.
  10. Myć jądra 3x przez 5 min 1x PBS.
  11. Inkubować jądra z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze blokowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Preferowane są przeciwciała drugorzędowe Alexa Fluor 488, 568 i 647.
  12. Myć jądra 3x przez 5 min 1x PBS.
  13. OPCJONALNIE: Inkubować jądra przez 5 minut z DAPI lub Hoechst, a następnie dwa dodatkowe 5-minutowe płukania z 1x PBS.
  14. Przytrzymaj niestrzępiącą się chusteczkę na krawędzi koła zawierającego jądra, aby całkowicie usunąć ostatnie płukanie PBS.
  15. Dodaj 1 kroplę (~10 μl) twardego podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu (bez DAPI) do każdego szkiełka i delikatnie umieść kwadratowe szkiełka nakrywkowe o wysokiej tolerancji 18 mm x 18 mm na każdym szkiełku.
    UWAGA: W przypadku korzystania z nośnika do montażu na twardo uszczelnianie ślizgowe nie jest konieczne, jeśli slajdy są obrazowane w odpowiednim przedziale czasowym. Immunoreaktywność Nup zazwyczaj pozostawała stabilna na nieuszczelnionych szkiełkach przechowywanych w temperaturze 4 °C przez ~6 miesięcy. Jednak krawędzie szkiełka nakrywkowego można uszczelnić cienką warstwą lakieru do paznokci, jeśli używany jest nośnik do montażu na mokro lub do dłuższego przechowywania.
  16. Chroń szkiełka przed światłem i pozwól im utwardzić się przez noc w temperaturze pokojowej.
  17. Obrazowanie jąder można za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości (SIM).
    UWAGA: Zeiss, Nikon i GE Healthcare produkują mikroskopy SIM. Postępuj zgodnie z protokołami specyficznymi dla systemu w celu pozyskiwania i przetwarzania obrazu. Stosować parametry obrazowania (moc lasera, zestawy filtrów, czas naświetlania) odpowiednie dla każdego Nup i fluoroforu. Podczas obrazowania należy unikać krawędzi okręgu (od kroku 1.1), ponieważ jądra te są zazwyczaj spłaszczone i rozciągnięte w wyniku etapu wirowania (5.4). W pełni zdekonwolucjonizowane i przetworzone obrazy mogą być poddawane szeregowi analiz, w tym detekcji punktowej i pomiarom objętości za pomocą standardowych modułów analizy 3D w oprogramowaniu do analizy obrazu FIJI lub Imaris. Dodatkowe szczegóły dotyczące metod analizy zostały niedawno opublikowane15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać NPC i nukleoplazmatyczne rozmieszczenie oraz ekspresję POM121 w ludzkich jądrach neuronalnych, kontrolne i C9orf72 iPSN zostały zróżnicowane zgodnie z wcześniejszym opisem15. Pośmiertną ludzką korę ruchową i iPSN dnia 32 poddano lizie i poddano izolacji jąder i barwieniu immunologicznemu, jak opisano powyżej. Izolowane jądra NeuN dodatnio zostały zobrazowane za pomocą superrozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SIM) przy użyciu mikroskopu oświetlenia strukturalnego o super...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę niedawną identyfikację deficytów NCT jako wczesnego i znaczącego zjawiska w wielu chorobach neurodegeneracyjnych 16,27,28,30,31, istnieje krytyczna potrzeba dokładnego zbadania mechanizmu, za pomocą którego zachodzi ta patologia. Ponieważ NPC i jego poszczególne białka Nup krytycznie kontrolują funkcjonalny NCT39,41

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pośmiertne ludzkie tkanki OUN zostały dostarczone przez Johns Hopkins ALS Autopsy Bank i Target ALS Postmortem Tissue Core. Praca ta była wspierana przez ALSA Milton Safenowitz Postdoctoral Fellowship (ANC), a także fundusze z NIH-NINDS, Departamentu Obrony, ALS Association, Muscular Dystrophy Association, F Prime, The Robert Packard Center for ALS Research Answer ALS Program oraz Chan Zuckerberg Initiative.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki stożkowe 50 mlFisher Scientific14-959-49A
Ultrawirówka BeckmanBeckman Coulter
Sarstedt83.183
CollagenAdvanced Biomatrix5005
Szkiełka nakrywkoweMatTekPCS-170-1818
CytofunnelThermo Fisher Scientific
Cytospin 4Homogenizatory Fisher ScientificA78300003
DounceDWK Nauki Przyrodnicze357542
DTTSigma AldrichD0632
Probówki EppendorfFisher Scientific05-408-129
Koza Anty-Kurczak Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21449
Kozioł Anty-Myszy Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11029
Kozioł Anty-Myszy Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11031
Kozioł Anty-Myszy Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21236
Kozioł Anty-Królik Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Kozioł Anty-Królik Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11036
Koza Anty-Królik Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21245
Kozioł Anty-Szczur Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11006
Kozioł Anty-Szczur Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11077
Kozioł Anty-Szczur Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21247
HemacytometrFisher Scientific267110
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-550-15
Normalna surowica koziaVector LabsS-1000
Zestaw do izolacji jąder Nuclei PURESigma AldrichNUC201zawiera bufor do lizy, 10% Triton X-100, 2 M gradient sacharozy, roztwór poduszki sacharozy i bufor do przechowywania jąder; Określany w protokole jako "zestaw do izolacji jąder"
PBSThermo Fisher Scientific10010023
PFAElectron Microscopy Sciences15714-S
Prolong Gold AntifadeInvitrogenP36930Określany w protokole jako "twardy nośnik montażowy zapobiegający blaknięciu"
SW 32 Ti Ultrawirówka RotorBeckman Coulter369694Określany w protokole jako "wirnik ultrawirówkowy"
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Trypan BlueThermo Fisher Scientific15-250-061
UltrawirówkiBeckman Coulter344058
Pierwotne przeciwciałanukleoporynowePrzeciwciała pierwszorzędowe odpowiednie do immunofluorescencyjnego wykrywania indywidualnych nukleoporyn są dostępne w wielu firmach 
Skrobaki komórkowe A78710020

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hou, Y., et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (10), 565-581 (2019).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Bang, J., Spina, S., Miller, B. L. Frontotemporal dementia. Lancet. 386 (10004), 1672-1682 (2015).
  4. Blauwendraat, C., Nalls, M. A., Singleton, A. B. The genetic architecture of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 19 (2), 170-178 (2020).
  5. Cacace, R., Sleegers, K., Van Broeckhoven, C. Molecular genetics of early-onset Alzheimer's disease revisited. Alzheimer's & Dementia. 12 (6), 733-748 (2016).
  6. Di Resta, C., Ferrari, M. New molecular approaches to Alzheimer's disease. Clinical Biochemistry. 72, 81-86 (2019).
  7. Karch, C. M., Cruchaga, C., Goate, A. M. Alzheimer's disease genetics: from the bench to the clinic. Neuron. 83 (1), 11-26 (2014).
  8. Kovacs, G. G. Molecular pathology of neurodegenerative diseases: principles and practice. Journal of Clinical Pathology. 72 (11), 725-735 (2019).
  9. McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
  10. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. The Lancet. Neurology. 10 (1), 83-98 (2011).
  11. Dugger, B. N., Dickson, D. W. Pathology of neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 028035(2017).
  12. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  13. DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72 (2), 245-256 (2011).
  14. Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72 (2), 257-268 (2011).
  15. Coyne, A. N., et al. G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD. Neuron. 107 (4), 1124-1140 (2020).
  16. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  17. D'Angelo, M. A., Raices, M., Panowski, S. H., Hetzer, M. W. Age-dependent deterioration of nuclear pore complexes causes a loss of nuclear integrity in postmitotic cells. Cell. 136 (2), 284-295 (2009).
  18. Hetzer, M. W. The role of the nuclear pore complex in aging of post-mitotic cells. Aging (Albany NY). 2 (2), 74-75 (2010).
  19. Savas, J. N., Toyama, B. H., Xu, T., Yates, J. R., Hetzer, M. W. Extremely long-lived nuclear pore proteins in the rat brain. Science. 335 (6071), 942(2012).
  20. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  21. Nofrini, V., Di Giacomo, D., Mecucci, C. Nucleoporin genes in human diseases. European Journal of Human Genetics. 24 (10), 1388-1395 (2016).
  22. Sakuma, S., D'Angelo, M. A. The roles of the nuclear pore complex in cellular dysfunction, aging and disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 68, 72-84 (2017).
  23. Basel-Vanagaite, L., et al. Mutated nup62 causes autosomal recessive infantile bilateral striatal necrosis. Annals of Neurology. 60 (2), 214-222 (2006).
  24. Nousiainen, H. O., et al. Mutations in mRNA export mediator GLE1 result in a fetal motoneuron disease. Nature Genetics. 40 (2), 155-157 (2008).
  25. Cronshaw, J. M., Matunis, M. J. The nuclear pore complex: disease associations and functional correlations. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15 (1), 34-39 (2004).
  26. Chou, C. C., et al. TDP-43 pathology disrupts nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic transport in ALS/FTD. Nature Neuroscience. 21 (2), 228-239 (2018).
  27. Eftekharzadeh, B., et al. Tau protein disrupts nucleocytoplasmic transport in Alzheimer's disease. Neuron. 99 (5), 925-940 (2018).
  28. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  29. Gasset-Rosa, F., et al. Polyglutamine-expanded huntingtin exacerbates age-related disruption of nuclear integrity and nucleocytoplasmic transport. Neuron. 94 (1), 48-57 (2017).
  30. Grima, J. C., et al. Mutant huntingtin disrupts the nuclear pore complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  31. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  32. Guo, L., et al. Nuclear-import receptors reverse aberrant phase transitions of RNA-binding proteins with prion-like domains. Cell. 173 (3), 677-692 (2018).
  33. Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
  34. Yoshizawa, T., et al. Nuclear Import Receptor Inhibits Phase Separation of FUS through Binding to Multiple Sites. Cell. 173 (3), 693-705 (2018).
  35. Chew, J., et al. Aberrant deposition of stress granule-resident proteins linked to C9orf72-associated TDP-43 proteinopathy. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 9(2019).
  36. Zhang, Y. J., et al. Poly(GR) impairs protein translation and stress granule dynamics in C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis. Nat Medicine. 24 (8), 1136-1142 (2018).
  37. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nature Neuroscience. 19 (5), 668-677 (2016).
  38. Zhang, Y. J., et al. Heterochromatin anomalies and double-stranded RNA accumulation underlie C9orf72 poly(PR) toxicity. Science. 363 (6428), (2019).
  39. Beck, M., Hurt, E. The nuclear pore complex: understanding its function through structural insight. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (2), 73-89 (2017).
  40. Lin, D. H., Hoelz, A. The structure of the nuclear pore complex (an update). Annual Review of Biochemistry. 88, 725-783 (2019).
  41. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (11), 687-699 (2012).
  42. Kinoshita, Y., Kalir, T., Dottino, P., Kohtz, D. S. Nuclear distributions of NUP62 and NUP214 suggest architectural diversity and spatial patterning among nuclear pore complexes. PLoS One. 7 (4), 36137(2012).
  43. Ori, A., et al. Cell type-specific nuclear pores: a case in point for context-dependent stoichiometry of molecular machines. Molecular Systems Biology. 9, 648(2013).
  44. Rajoo, S., Vallotton, P., Onischenko, E., Weis, K. Stoichiometry and compositional plasticity of the yeast nuclear pore complex revealed by quantitative fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), 3969-3977 (2018).
  45. Li, C., Goryaynov, A., Yang, W. The selective permeability barrier in the nuclear pore complex. Nucleus. 7 (5), 430-446 (2016).
  46. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complexes and regulation of gene expression. Current Opinion in Cell Biology. 46, 26-32 (2017).
  47. Pascual-Garcia, P., Capelson, M. Nuclear pores in genome architecture and enhancer function. Current Opinion in Cell Biology. 58, 126-133 (2019).
  48. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  49. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nature Neuroscience. 16 (7), 790-797 (2013).
  50. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  51. Wu, Y., Shroff, H. Faster, sharper, and deeper: structured illumination microscopy for biological imaging. Nature Methods. 15 (12), 1011-1019 (2018).
  52. Hampoelz, B., et al. Pre-assembled nuclear pores insert into the nuclear envelope during early development. Cell. 166 (3), 664-678 (2016).
  53. Hampoelz, B., et al. Nuclear pores assemble from nucleoporin condensates during oogenesis. Cell. 179 (3), 671-686 (2019).
  54. Agote-Aran, A., et al. Spatial control of nucleoporin condensation by fragile X-related proteins. The EMBO Journal. 39 (20), 104467(2020).
  55. Colombi, P., Webster, B. M., Fröhlich, F., Lusk, C. P. The transmission of nuclear pore complexes to daughter cells requires a cytoplasmic pool of Nsp1. The Journal of Cell Biology. 203 (2), 215-232 (2013).
  56. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  57. Löschberger, A., Franke, C., Krohne, G., van de Linde, S., Sauer, M. Correlative super-resolution fluorescence and electron microscopy of the nuclear pore complex with molecular resolution. Journal of Cell Science. 127, Pt 20 4351-4355 (2014).
  58. Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, Pt 3 570-575 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nuclei IsolationStructured Illumination MicroscopyNuclear Pore ComplexNucleoporin AlterationsNucleocytoplasmic TransportSuper Resolution MicroscopyHuman NeurodegenerationiPSC Derived CNS CellsAntibody LabelingPostmortem Tissues
Video Coming Soon

Related Articles