Artykuł metodologiczny

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

DOI:

10.3791/62803

⸱

20 maja 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Belozersky Institute of Physico-chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, 2Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, 3Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 4National Research Center, Kurchatov Institute, 5V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology, and Perinatology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół prezentuje technikę mapowania miejsc replikacji w strukturalnie zachowanej chromatynie in situ, która wykorzystuje kombinację wstępnego znakowania EdU-streptawidyny-Nanogold i ChromEMT.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zasady fałdowania DNA w jądrze komórkowym i jego dynamicznych przemian, które zachodzą podczas wypełniania podstawowych funkcji genetycznych (transkrypcja, replikacja, segregacja, itp.) pozostają słabo poznane, częściowo z powodu braku eksperymentalnych podejść do wizualizacji specyficznych loci chromatyny w strukturalnie zachowanych jądrach. W tym miejscu przedstawiamy protokół wizualizacji domen replikacyjnych w monowarstwowej hodowli komórkowej in situ, poprzez połączenie znakowania EdU nowo zsyntetyzowanego DNA z późniejszym wykrywaniem znaczników z amplifikacją Ag cząstek nanozłota i barwieniem chromatyny ChromEM. Protokół ten pozwala na wstępne etykietowanie o wysokim kontraście i wysokiej wydajności, kompatybilne z tradycyjnym utrwalaniem aldehydu glutarowego, które zapewnia najlepszą ochronę strukturalną chromatyny do przetwarzania próbek w temperaturze pokojowej. Kolejną zaletą wstępnego osadzania etykietowania jest możliwość wstępnego wyboru interesujących komórek do sekcji. Jest to szczególnie ważne dla analizy heterogenicznych populacji komórek, a także kompatybilności z podejściami tomografii elektronowej do wysokorozdzielczej analizy 3D organizacji chromatyny w miejscach replikacji oraz analizy poreplikacyjnej rearanżacji chromatyny i segregacji chromatyd siostrzanych w interfazie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Replikacja DNA jest podstawowym procesem biologicznym wymaganym do wiernego kopiowania i przekazywania informacji genetycznej podczas podziału komórki. U wyższych eukariontów replikacja DNA podlega ścisłej regulacji czasoprzestrzennej, która przejawia się w sekwencyjnej aktywacji początków replikacji1. Sąsiednie źródła replikacji uruchamiane synchronicznie tworzą klastry replicons2. Na poziomie mikroskopii optycznej miejsca trwającej replikacji DNA są wykrywane jako ogniska replikacji o różnej liczbie i wielkości. Ogniska replikacji wykazują specyficzne wzorce rozmieszczenia przestrzennego w jądrze komórkowym w zależności od czasu replikacji znakowanego DNA3,4, który z kolei jest ściśle skorelowany z jego aktywnością genu. Dzięki dobrze zdefiniowanej sekwencji replikacji DNA, ściśle uporządkowanej w przestrzeni i czasie, znakowanie replikacyjne jest potężną metodą precyzyjnego znakowania DNA nie tylko do badania procesu replikacji jako takiego, ale także do rozróżniania określonej podfrakcji DNA o określonej aktywności transkrypcyjnej i poziomie zagęszczenia. Wizualizacja replikacji chromatyny jest zwykle wykonywana poprzez wykrywanie głównych składników białkowych maszynerii replikacji DNA (albo przez barwienie immunologiczne, albo przez ekspresję fluorescencyjnych znaczników białkowych5,6) lub poprzez włączenie zmodyfikowanych prekursorów syntezy DNA7,8,9,10. Spośród nich tylko metody oparte na włączaniu zmodyfikowanych nukleotydów do nowo zreplikowanego DNA pozwalają na wychwycenie zmian konformacyjnych w chromatynie podczas replikacji i śledzenie zachowania domen replikacyjnych po zakończeniu ich replikacji.

U wyższych eukariontów pakowanie DNA w chromatynę dodaje kolejny poziom złożoności do regulacji podstawowych funkcji genetycznych (transkrypcja, replikacja, naprawa, itp.). Fałdowanie chromatyny wpływa na dostępność DNA dla regulacyjnych transfaktorów i zmian konformacyjnych DNA (odwijanie podwójnej helisy) wymaganych do syntezy matrycy. Dlatego ogólnie przyjmuje się, że zależne od DNA procesy syntezy w jądrze komórkowym wymagają strukturalnego przejścia chromatyny ze stanu skondensowanego, represyjnego do bardziej dostępnej, otwartej konformacji. Cytologicznie te dwa stany chromatyny definiuje się jako heterochromatynę i euchromatynę. Jednak nadal nie ma zgody co do sposobu fałdowania DNA w jądrze. Hipotezy wahają się od modelu "stopionego polimeru"11, gdzie włókno nukleosomalne zachowuje się jak losowy polimer, dla którego gęstość upakowania jest kontrolowana przez mechanizmy separacji faz, do hierarchicznych modeli fałdowania postulujących sekwencyjne tworzenie struktur podobnych do włókien chromatyny o rosnącej grubości12,13. Hierarchiczne modele fałdowania zyskały ostatnio wsparcie w podejściach molekularnych opartych na analizie kontaktów DNA-DNA in situ (przechwytywanie konformacji chromosomów, 3C), wykazując istnienie hierarchii domen strukturalnych chromatyny14. Ważne jest, aby pamiętać, że jednostki replikacji bardzo dobrze korelują z tymi domenami chromatyny15. Główna krytyka tych modeli opiera się na potencjalnej sztucznej agregacji chromatyny spowodowanej procedurami przygotowania próbki, takimi jak przenikanie błon komórkowych i usuwanie składników niechromatynowych, w celu poprawy kontrastu chromatyny w badaniach ultrastrukturalnych, przy jednoczesnej poprawie dostępności chromatyny dla różnych sond (np. przeciwciał). Niedawny postęp techniczny w selektywnym barwieniu DNA do mikroskopii elektronowej poprzez fotoutlenianie diaminobenzydyny za pośrednictwem wiązania DNA za pośrednictwem fluoroforu (ChromEMT6) pozwolił na wyeliminowanie tej przeszkody. Jednak te same rozważania dotyczą wizualizacji replikacji DNA za pomocą mikroskopii elektronowej17,18. W tym miejscu opisujemy technikę, która pozwala na jednoczesne mapowanie ultrastrukturalne w wysokiej rozdzielczości nowo zsyntetyzowanego DNA i całkowitej chromatyny w nienaruszonych komórkach usieciowanych aldehydem. Technika ta łączy wykrywanie DNA znakowanego EdU za pomocą chemii Click-chemistry z biotynylowanymi sondami i streptawidyną-nanozłotem oraz ChromEMT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół jest zoptymalizowany pod kątem komórek przylegających i został przetestowany na liniach komórkowych HeLa, HT1080 i CHO.

1. Etykietowanie i utrwalanie komórek

  1. Płytki komórkowe na oczyszczonych kwasem szkiełkach nakrywkowych na 3 cm szalce Petriego. Hoduj komórki w pożywce zalecanej dla używanej linii komórkowej do 70% zbieżności.
  2. Dodać EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydynę) z 10 mM zapasu do 10 μM stężenia końcowego i umieścić komórki w inkubatorze na 10 minut lub dłużej (w zależności od celu eksperymentu). W przypadku krótszych impulsów (do 2 minut) należy przygotować szalkę Petriego ze wstępnie podgrzanymi świeżymi pożywkami hodowlanymi uzupełnionymi 10 μM EdU i przenieść do niej szkiełka nakrywkowe, zamiast dodawać EdU bezpośrednio do komórek.
    UWAGA: Wszystkie kolejne kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej, jeśli nie wskazano inaczej.
  3. Utrwal oznakowane komórki 2,5% aldehydem glutarowym, świeżo przygotowanym przez rozcieńczenie 25% bulionu w 100 mM buforze kakodylowym, przez 1 godz.
    UWAGA: Kolejne kroki wykrywania EdU są wrażliwe na czas fiksacji. Dłuższe czasy utrwalania mogą niekorzystnie wpływać na etykietowanie EdU, powodując niższy stosunek sygnału do szumu.
  4. Usunąć aldehyd glutarowy, przemłukując próbki PBS uzupełnionym 5 mM MgCl2 (następnie PBS*). Umyć trzy razy w 10-minutowej inkubacji na każde pranie.
  5. Przepuszczalność błon plazmatycznych za pomocą 1% Triton X-100 w PBS* (następnie PBS*T). Umyć dwa razy w 5-minutowej inkubacji na każde pranie.
  6. Dokładnie umyć próbkę PBS*. Wykonaj pięć zmian i inkubuj przez 5 minut przy każdej zmianie.
  7. Ugasić wolne od pozostałości grupy aldehydowe za pomocą 20 mM glicyny w PBS*, dwa razy po 10 minut każda.
  8. Zablokuj próbki w 1% BSA w PBS* na 30 minut.

2. Reakcja na kliknięcie

UWAGA: Ta procedura jest zmodyfikowana na podstawie wcześniej opublikowanego protokołu19.

  1. Bezpośrednio przed użyciem przygotuj mieszankę reakcji Click-reaction do wykrywania EdU: w probówce mikrowirówki wymieszaj 430 μL 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL 100 mM CuSO4, 1,2 μL azydku biotyny (10 mM w DMSO) i 50 μL 0,5 M kwasu askorbinowego. W celu kontroli jakości znakowania replikacyjnego i procedury Click-Button na poziomie mikroskopii fluorescencyjnej, azydek biotyny można zastąpić AlexaFluor 488-azide.
    UWAGA: Kolejność dodawania składników w powyższej reakcji jest ważna.
  2. Wykonaj reakcję kliknięcia w wilgotnej komorze, aby zminimalizować parowanie i zmiany stężenia w koktajlu reakcyjnym. Przygotować wilgotną komorę, umieszczając mokry arkusz bibuły filtracyjnej na dnie szalki Petriego i przykrywając ją folią parafinową. Umieść szkiełka nakrywkowe na powierzchni folii komórkami skierowanymi do góry i nałóż 50-100 μl koktajlu reakcyjnego na szkiełko nakrywkowe. Reakcja trwa 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Zatrzymać reakcję, przemłukując próbkę 0,1% Triton X-100 w PBS* (PBS*T), pięć razy przez 5 minut każdy.
  4. Zablokuj 1% BSA w PBS*T przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotować roztwór streptawidyny-nanozłota z PBS*T zawierającym 1% BSA. Inkubować próbkę ze streptawidyną, sprzężoną z cząstkami nanozłota o długości 1,4 nm (nanosondami) w 1% BSA + PBS*T przez noc w temperaturze +4 °C w nowo przygotowanej komorze wilgotnej.
  6. Przerwać reakcję i przemyć próbkę w PBS*T, pięć razy przez 10 minut każde.
  7. Stabilizuj kompleks streptawidyny biotyny poprzez postfixing w 1% aldehydzie glutarowym w PBS* przez 30 min.
  8. Usunąć aldehyd glutarowy przez intensywne przemycie wodą dejonizowaną i przemyć próbkę w PBS*, pięć razy przez 20 minut każdy.
  9. Wolne grupy aldehydowe należy stłumić świeżo przygotowanym 1 mg/ml NaBH4 w wodzie, dwa razy po 10 minut każda. Podczas inkubacji tworzą się pęcherzykiH2, które mogą podnieść szkiełka nakrywkowe. Ostrożnie dociśnij je pęsetą.
  10. Umyć wodą dejonizowaną pięć razy przez 5 minut każdy.
    UWAGA: W celu kontroli jakości na etapie etykietowania zaleca się wykonanie etykietowania kontrolnego za pomocą znakowanej fluorescencyjnie streptawidyny (Rysunek 2). Zapewniłoby to oszacowanie intensywności etykietowania i poziomu tła przed przejściem do żmudnych i podatnych na artefakty kolejnych kroków.

3. Wzmocnienie Ag

UWAGA: Ta procedura jest zmodyfikowana z Gilerovitch et al., 1995 (zobacz 20,21).

  1. Ponownie zawiesić 50 g proszku akacjowego w 100 ml wody dejonizowanej. Rozpuść przez 3 dni, odgazuj i przefiltruj przez cztery warstwy gazy. Przechowywać zamrożone w porcjach o pojemności 5 ml w probówkach o pojemności 50 ml. Rozmrozić bezpośrednio przed użyciem.
  2. Dodać 2 ml 1 M MES (pH = 6,1) do 5 ml rozmrożonej porcji roztworu proszku akacjowego, aby uzyskać 7 ml 0,28 M MES (pH = 6,1) w roztworze proszku akacjowego. Mieszaj, powoli kołysząc rurką przez 30 minut. Owiń tubę folią, aby chronić ją przed światłem.
  3. Równocześnie z krokiem 3.2 umyć szkiełka nakrywkowe buforem do płukania (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM sacharozy), trzy razy po 10 minut każde.
  4. Przygotować świeży roztwór galusanu N-propylu (NPG). W probówce o pojemności 15 ml rozpuść 10 mg NPG w 250 μl 96% etanolu i dostosuj do 5 ml wodą dejonizowaną.
  5. Umieść 36 mg mleczanu srebra w owiniętej folią probówce o pojemności 15 ml.
  6. Po zakończeniu kroku 3.2 dodaj 1,5 ml roztworu NPG do mieszanki proszku akacjowego i miel przez kolejne 3 minuty.
    UWAGA: Wszystkie kolejne kroki wykonywane są w ciemni. Użyj nieaktynicznego światła bezpiecznego (żółtego lub czerwonego).
  7. Wyrównać próbkę z buforem myjącym i udać się do ciemnego pomieszczenia. Jednocześnie dodaj 5 ml wody dejonizowanej do mleczanu srebra i rozpuść przez energiczne wstrząsanie przez 1-2 minuty.
  8. Dodaj 1,5 ml roztworu mleczanu srebra do mieszanki proszku akacjowego, powoli kołysz przez 1 minutę. Unikaj tworzenia się pęcherzyków, ponieważ tlen w mieszance spowolni reakcję.
  9. Odcedź roztwór z naczynia ze szkiełkami nakrywkowymi i wlej 3 ml mieszanki mleczanu srebra i akacji w proszku na komórki. Kołysz naczyniem kilka razy i inkubuj przez 2-5 minut. Czas inkubacji zależy od partii proszku akacjowego i temperatury. Powinno to być zdefiniowane eksperymentalnie.
    UWAGA: Dłuższy czas inkubacji może skutkować niespecyficznym wiązaniem srebra.
  10. Aby zatrzymać reakcję, odcedź mieszaninę reakcyjną i dokładnie umyj naczynie trzema do pięciu wymianami wody dejonizowanej, a następnie trzema kolejnymi wymianami przez 5 minut każda.
  11. Sprawdź zabarwienie pod mikroskopem jasnego pola. Dobre zabarwienie powinno być od jasnobrązowego do ciemnobrązowego z bardzo słabym żółtawym tłem.
    UWAGA: Jeśli barwienie się nie rozwija, można natychmiast powtórzyć z już przygotowaną mieszanką (mieszanka jest aktywna przez około 15 minut, jeśli jest przechowywana w ciemności). Jednak plamy w tym przypadku mogą rozwijać się zbyt szybko.

4. Złoty toning

UWAGA: W celu ochrony nanocząsteczek srebra przed rozpuszczeniem przez utlenianie OsO4 w kolejnych procedurach, na tym etapie stosuje się impregnację złotem (Sawada, Esaki, 1994)22.

  1. Spłucz szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną.
  2. W celu ochrony nanocząstek srebra przed rozpuszczeniem przez utlenianieOsO 4 należy inkubować próbki w 0,05% kwasie tetrachloroaurowym przez 2 minuty w ciemności.
  3. Dokładnie myć wodą dejonizowaną przez 10 min.
    UWAGA: Na tym etapie do materiału zawierającego DNA dodawany jest dodatkowy kontrast. Kolor próbki powinien zmienić się z brązowego na.

5. ChromEM

UWAGA: Ten protokół został zmodyfikowany z Ou et al., 201716.

  1. Inkubować szkiełka nakrywkowe i nasycać próbki w 10 μM DRAQ5 w PBS przez 10 minut w ciemności.
  2. Przygotować 0,2% roztwór tetrachlorowodorku diaminoferydyny (DAB) w 50 mM Tris lub PBS:
    rozpuścić DAB w 90% końcowej objętości, energicznie mieszając w ciemności, a następnie dostosować pH do 7,0-7,4 za pomocą NaOH. Dostosuj głośność do 100% i przefiltruj przez filtr 0,22 μM, przechowuj zawinięte w folię.
  3. Dodać roztwór DAB do komórek (2 ml na 3 cm szalki Petriego) i inkubować przez 1 minutę.
  4. Przenieś szkiełko nakrywkowe na szklaną płytkę Petriego i umieść je na stoliku mikroskopu odwróconego. Naświetlić próbkę (kilka pól widzenia) na mikroskopie odwróconym ze źródłem światła metalohalogenkowym i zestawem filtrów Cy5 (640 nm, 1 W/cm2 w płaszczyźnie ogniskowej) przez soczewkę Plan Apo λ 40х (NA = 0,95) przez 10 min.
    UWAGA: Oznaką udanej fotokonwersji DAB jest całkowite fotowybielanie DRAQ5 i tworzenie ciemnych osadów DAB w napromieniowanych jądrach. Jednak to ostatnie nie zawsze jest widoczne przy intensywnym sygnale EdU-srebrno-złotym (zwłaszcza gdy wykorzystywane są przedłużone impulsy EdU).
  5. Umyj wodą dejonizowaną trzy razy przez 5 minut każde.

6. Odwodnienie i zatapianie żywicy epoksydowej

  1. W probówce do mikrowirówek przygotować częściowo zredukowany roztwór tetratlenku osmu, mieszając 2% wodny roztwór K4Fe(CN)6 z równą ilością 2% wodnego roztworu OsO4, aby uzyskać 1% końcowe stężenie obu składników. Szkiełka nakrywkowe inkubować w zredukowanym OsO4 przez 1 godzinę i myć w wodzie dejonizowanej trzy razy przez 5 minut każde.
    UWAGA: Na tym etapie zredukowany związek osmu reaguje z osadami DAB i zwiększa kontrast DNA.
    UWAGA: Osm jest toksyczny, pracuj pod wyciągiem i uchodź się z odpadami zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa.
  2. Odwodnić próbki w serii stopniowanych roztworów etanolu w rosnących procentach: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.
  3. Do infiltracji i zatapiania należy użyć formuły żywicy ze stosunkiem objętościowym składnika w następujący sposób: monomer żywicy epoksydowej: DDSA: MNA: DMP-30 = 9: 6: 4: 0,23 (w/w). Ta formuła miesza się z etanolem.
    1. Inkubować szkiełko nakrywkowe w mieszance etanolu i żywicy (3 części 100% EtOH:1 część żywicy epoksydowej) przez 30 minut.
    2. Inkubować szkiełko nakrywkowe w mieszance etanolu i żywicy (1 część 100% EtOH: 1 część żywicy epoksydowej) przez 2 godziny.
    3. Inkubować szkiełko nakrywkowe w mieszance etanolu i żywicy (1 część 100% EtOH: 3 części żywicy epoksydowej) przez noc.
    4. Zastąp mieszankę etanolu i żywicy świeżo przygotowaną czystą żywicą. Inkubować w czystej mieszance żywic przez 8 godzin. Otwórz naczynie, aby resztki etanolu odparowały.
    5. Przenieść szkiełka nakrywkowe do nowego naczynia z czystą żywicą i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37–42 °C.
    6. Napełnij silikonową formę świeżo przygotowaną żywicą. Umieść szkiełka nakrywkowe komórkami skierowanymi w dół na odpowiedniej formie silikonowej wypełnionej żywicą epoksydową. Żywicę utwardzać przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie w temperaturze 60 °C przez co najmniej 2 dni.
      UWAGA: Składniki mieszanki żywic epoksydowych są potencjalnymi substancjami rakotwórczymi. Nosić rękawice i pracować pod wyciągiem.
  4. Wyjmij płytę żywiczną z formy, oczyść powierzchnię szkiełka nakrywkowego skalpelem lub żyletką. Aby usunąć szkiełko nakrywkowe, wrzuć je do ciekłego azotu, a następnie przenieś płytę do wrzącej wody. W razie potrzeby czynność powtórzyć.
  5. Zlokalizuj napromieniowany obszar pod mikroskopem stereoskopowym i wytnij go z płyty za pomocą piły do metalu lub innego odpowiedniego instrumentu. W razie potrzeby podgrzej płytę w temperaturze 70 °C na płycie grzejnej.
  6. Zamocuj wycięcie w uchwycie na próbkę z ultramikrotomu, aby uzyskać końcowe przycinanie bloków. Za pomocą brzytwy przygotuj próbkę w kształcie piramidy. Zamontuj uchwyt z piramidką na ultramikrotomie i zainstaluj nóż.
    1. Przyciąć blok tak, aby napromieniowane komórki oznaczone etykietą EdU były włączone. Przygotować półcienki przekrój (o grubości 250 nm) odpowiedni do tomografii elektronowej.
      UWAGA: Grubość przekroju można dostosować do wymagań eksperymentalnych.
  7. Odłącz sekcje od krawędzi noża i umieść je na siatkach z jednym rowkiem. W przypadku tomografii elektronowej odcinki o długości fali 250 nm są pobierane na siatki jednoszczelinowe o średnicy 1 mm, a po wysuszeniu sekcje te mogą być obustronnie pokryte węglem. Nie jest konieczne dodatkowe kontrastowanie.
    UWAGA: Ponieważ sekcje zawierają już cząsteczki Au-Ag o wysokim kontraście, nie ma potrzeby dodawania fiducial gold particles do powierzchni przekroju.
  8. Zbadaj siatki w transmisyjnym mikroskopie elektronowym przy małym powiększeniu (około 600x), aby zlokalizować komórki o odpowiednich wzorcach replikacji.
    UWAGA: Ten protokół generuje gęstość etykietowania wystarczająco wysoką, aby można było łatwo wykryć ogniska replikacji nawet przy małym powiększeniu. Wskazane jest najpierw stworzenie mapy odcinka do późniejszej nawigacji i zebranie rzutów kątowych do tomografii. Przełącz się na większe powiększenie i rób zdjęcia w wysokiej rozdzielczości.

7. Tomografia elektronowa

  1. Włóż siatkę do transmisyjnego mikroskopu elektronowego z uchwytem o wysokim nachyleniu. Załaduj próbkę do mikroskopu elektronowego i zlokalizuj obszar zainteresowania.
  2. Ustaw mikroskop w trybie EFTEM w trybie oświetlenia prawie równoległego. Dostrój filtr energii za pomocą szczeliny wyboru energii 20 eV umieszczonej na szczycie o zerowej stracie.
  3. Wstępne napromienianie obszaru akwizycji tomografii z szybkością dawki 40 e/A2/s przez co najmniej 1,5-2 min, co odpowiada całkowitej dawce co najmniej 3000 e/A2.
  4. Dostosuj wysokość eucentryczną za pomocą automatycznego zadania w SerialEM. Sprawdź zadanie autofokusa, aby upewnić się, że działa poprawnie przy zerowym kącie nachylenia i wartości rozmycia celu -0.8 mkm.
  5. Przechyl uchwyt na próbkę do -60° za pomocą zadania Walk-Up.
  6. Ustaw akwizycję tomografii w zakresie od -60 do +60° za pomocą kroku 2.0°. Ekspozycja powinna być ustawiona w zależności od kąta nachylenia, aby utrzymać średnią intensywność w aparacie. Ogranicz przesunięcie obrazu w przypadku, gdy powoduje to przesunięcie energii, a tym samym niewspółosiowość szczeliny. Dane tomografii powinny być zapisane w postaci pliku .mrc.
  7. Zaimportuj plik .mrc do oprogramowania IMOD w celu rekonstrukcji tomografii. Usuń wartości pikseli odstających z powodu promieni rentgenowskich.
  8. Wyrównaj serię pochylenia. Wykonaj wstępną korelację krzyżową, a następnie ręcznie oznacz 10-12 cząstek złota jako fiducials. Śledź model odniesienia i sprawdź, czy każdy powiernik jest prawidłowo śledzony w serii przechyłu. Utwórz tomogramy próbek (plasterki) i ręcznie zaznacz cienkie krawędzie sekcji, aby zapobiec ewentualnemu przechyleniu zrekonstruowanej gęstości wewnątrz objętości. Średni błąd resztkowy dla precyzyjnego wyrównania wynosił mniej niż 1,2 pixa.
  9. Zrekonstruuj tomogram za pomocą algorytmu przefiltrowanej projekcji wstecznej, a następnie przytnij dane wyjściowe, aby dopasować obszar zainteresowania do ostatecznej objętości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogniska replikacji w jądrach komórek ssaków wykazują wyraźne wzorce dystrybucji w jądrze, w zależności od progresji fazy S. Wzorce te korelują z aktywnością transkrypcyjną replikowanych loci. Ponieważ przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje dość silną procedurę fiksacji, dość łatwo jest zastosować znakowanie impulsami replikacyjnymi do specyficznego wykrywania loci chromatyny w różnych stanach transkrypcji, nawet w warunkach zapewniających najlepsze zachowanie strukturalne chromatyny uzyskane przez utrwalenie chemiczne w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda ma kilka zalet w porównaniu z poprzednio opublikowanymi protokołami. Po pierwsze, zastosowanie chemii Click-chemistry do znakowania zreplikowanego DNA eliminuje konieczność denaturacji DNA do wykrywania BrdU za pomocą przeciwciał, co pozwala lepiej zachować ultrastrukturę chromatyny.

Po drugie, wykorzystanie biotyny jako drugorzędnego liganda, który powstaje po utrwaleniu aldehydu glutarowego i odpowiednim wygaszaniu niezwiązanych grup aldehydowych, minimalizuje modyfikac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez RSF (grant #17-15-01290) i RFBR (grant #19-015-00273). Autorzy dziękują programowi rozwojowemu Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego im. Łomonosowa (PNR 5.13) oraz Centrum Doskonałości w dziedzinie obrazowania korelacyjnego firmy Nikon w Instytucie Biologii Fizyko-Chemicznej im. Biełozierskiego za dostęp do oprzyrządowania do obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik
5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU)Thermo FisherA10044
Kwas 2-(4-morfolino)etanosulfonowy (MES)Fisher ScientificBP300-100
AlexaFluor 555-azydekTermo FisherA20012
biotyno-azydekLumiprobeC3730
Albumina surowicy bydlęcejBovalLY-0080
DDSASPI-CHEM26544-38-7
DMP-30SPI-CHEM90-72-2
DRAQ5Thermo Scientific62251
Monomer żywicy epoksydowejSPI-CHEM90529-77-4
Aldehyd glutarowy (25%, klasa EM)TED PELLA, INC18426
Guma arabskaACROS Organics258850010
Chlorek magnezuPanreac141396.1209
NaBH4SIGMA-ALDRICH213462
NMASPI-CHEM25134-21-8
Galusan N-propyluSIGMA-ALDRICHP3130
PBSMP Biomedicals2810305
Mleczan srebraALDRICH359750-5G
Streptawidyna-AlexaFluor 488 koniugatTermo FisherS11223
Koniugat streptawidyny-nanozłotaNanosondy2016
kwas tetrachloroaurowySIGMA-ALDRICHHT1004
Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)CHEM-IMPEX INT'L298
Triton X-100Fluka Chemica93420<
strong>Instruments
Carbon CoaterHitachi
Miedziane siatki jednoszczelinoweTed Pella1GC10H
Cy5 zestaw filtrów fluorescencyjnych (Ex620/60 DM660 Em700/75)NikonCy5 HQAlternatywy: Nóż diamentowy Zeiss, Leica, Olympus
Ultra Wet 45oDiatomeDUAlternatywy: Ted Pella
Mikroskop fluorescencyjnyNikonTi-EAlternatywy: Zeiss, Leica, Olympus
Uchwyt na próbki o wysokim nachyleniuJeol
RotatorBiosanMulti Bio RS-24
Transmisyjny mikroskop elektronowy pracujący pod napięciem 200 kV w trybie EFTEM, z goniometrem o wysokim nachyleniuJeolJEM-2100Alternatywy: FEI, Pęseta Hitachi
Ted Pella523
UltramikrotomLeicaUltraCut-EAlternatywy: RMC
Software
ImageAcquisition Open SourceSerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)
Przetwarzanie obrazuOpen SourceIMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
  2. Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
  3. Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737(2010).
  4. Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
  5. Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
  6. Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
  7. Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
  8. Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
  9. Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
  10. Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
  11. Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
  12. Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
  13. Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
  14. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
  15. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  16. Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
  17. Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
  18. Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
  19. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  20. Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
  21. Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
  22. Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
  23. He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
  24. Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organizacja chromatynyznakowanie EdUcz steczki nanoz otawzmacnianie srebrembarwienie ChromEMfiksacja glutaraldehydemznakowanie przed zatopieniemobrazowanie replikacji DNA

Powiązane artykuły