Artykuł metodologiczny

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62809

⸱

16 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1AdventHelath, 2University of Illinois Chicago School of Public Health, 3Lincoln Memorial University, 4Children’s Mercy Hospital, 5Scripps Clinic, 6Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 7Kansas City University, 8Roblex Rex Veterans Affairs Medical Center, 9California State University San Marcos, 10East Carolina University, 11Massachusetts Institute of Technology, 12Boehringer Ingelheim Norway KS, 13Heartland Center for Mitochondrial Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Przygotowanie wzbogaconych o mitochondria próbek z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek stałych pozwoliło badaczom na przeprowadzenie zarówno funkcjonalnych, jak i analitycznych ocen mitochondriów w różnych eksperymentalnych modalnościach. Badanie to pokazuje, jak przygotować preparaty wzbogacone w mitochondria z zamrożonej tkanki serca i przeprowadzić ocenę analityczną mitochondriów.

Streszczenie

Profil mitochondrialnego kompleksu transferu elektronów (ETC) jest modyfikowany w tkance serca potomstwa urodzonego przez ćwiczoną lochę. Zaproponowana i przetestowana hipoteza była taka, że regularne ćwiczenia lochy przez matkę w czasie ciąży zwiększyłyby wydajność mitochondrialną bioenergetyki serca potomstwa. Hipoteza ta została przetestowana poprzez wyizolowanie mitochondriów przy użyciu procedury łagodnej izolacji w celu oceny mitochondrialnych ETC i profili superkompleksów. Opisana tu procedura pozwoliła na przetworzenie wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek serca i wyeliminowała konieczność świeżego przygotowania mitochondriów do oceny mitochondrialnych kompleksów ETC, superkompleksów i profili aktywności kompleksów ETC. Protokół ten opisuje optymalny pomiar kompleksu białkowego ETC w multipleksowanym immunoblottingu opartym na przeciwciałach i ocenie super złożonej przy użyciu elektroforezy w żelu natywnym dla koloru niebieskiego.

Wprowadzenie

Celem tego protokołu było dostarczenie szczegółowych kroków do uzyskania wzbogaconego o mitochondria preparatu z wcześniej zamrożonej tkanki serca z nową technologią niskoenergetycznego mechanicznego rozbijania tkanki, która poprawia lizę tkanek i ekstrakcję mitochondriów. Dzięki tej metodzie możliwa jest poprawa wydajności ekstrakcji bez generowania dużego naprężenia ścinającego lub wysokiej temperatury oraz krótki czas homogenizacji (10-12 s)1.

Uzyskanie mitochondriów z archiwalnej zamrożonej tkanki jest cennym atutem do przeprowadzenia zarówno badań funkcjonalnych2, jak i biochemicznych3 w przeciwnym razie nie jest łatwo powtórzyć w dokładnych warunkach eksperymentalnych. Klasyczny homogenizator ze szkła teflonowego Potter-Elvehjem lub homogenizator Dounce był i nadal jest używany w laboratoriach badawczych do homogenizacji tkanek miękkich, takich jak wątroba, nerki i mózg. Jednak homogenizacja twardych tkanek, takich jak mięśnie i serce, wymaga dłuższego czasu homogenizacji, leczenia enzymatycznego, szybkiej homogenizacji i dużego doświadczenia użytkownika. Jest to niekorzystne dla ekstrakcji nienaruszonych organelli, takich jak mitochondria, z tkanek twardych, takich jak mięśnie i serce. Metoda opisana w tym protokole służy do uzyskania wysokowydajnego preparatu wzbogaconego w mitochondria do analizy kompleksów białkowych mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów (ETC) i ich tworzenia nadkompleksów w tkankach serca pobranych od potomstwa urodzonego przez lochę uprawiającą wysiłek fizyczny i prowadzącą siedzący tryb życia, zamrożonego błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywanego w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Metoda ta pozwala na wyizolowanie preparatu wzbogaconego o mitochondria z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek.

Zewnętrzne narażenie ciężarnych gryzoni na nanomateriały może negatywnie wpływać na czynność serca i oddychanie mitochondrialne oraz bioenergetykę u potomstwa podczas ciąży4. Niemniej jednak, wywołane ćwiczeniami aerobowymi pozytywne zmiany w bioenergetyce miocytów płodu podczas ciąży nie zostały jeszcze udokumentowane. Jednak nowe badania dostarczają dowodów na to, że ćwiczenia aerobowe matki w czasie ciąży mają pozytywny wpływ na czynność serca płodu5. W celu uzyskania dalszych dowodów przeprowadzono analizę podłużnego wpływu ćwiczeń matki na sercowe kompleksy mitochondrialnego łańcucha oddechowego u potomstwa (tj. od kompleksu I do kompleksu V) w czasie ciąży.

To badanie ma istotne znaczenie dla zdrowia, ponieważ wyniki mogą sugerować, że ćwiczenia matki poprawiają efektywność produkcji energii w mitochondriach serca potomstwa. W tym badaniu lochy (samice świni) zostały wykorzystane jako model zwierzęcy z dwóch powodów: (i) fizjologia serca jest podobna do human6, oraz (ii) pobranie tkanki serca od potomstwa z różnych punktów czasowych jest możliwe pod instytucjonalnym zatwierdzeniem IACUC. Proponowane badanie ma na celu udzielenie odpowiedzi na wiele podstawowych pytań łączących ćwiczenia matki z ich potencjalnym pozytywnym wpływem na skład komórkowy i biochemiczny tkanki serca potomstwa. Podejście to wymaga delikatnych, ale skutecznych technik izolacji mitochondriów z wcześniej zamrożonej tkanki serca, uzyskanej z długich i kosztownych badań podłużnych, które dotyczyły kwestii zmian bioenergetycznych w miocytach serca płodu podczas ciąży. Metoda opisana w tym badaniu pozwala na wykorzystanie dużych sum wcześniej zamrożonej zarchiwizowanej tkanki do przygotowania wzbogaconego w mitochondria zarówno do badań analitycznych, jak i funkcjonalnych. Badanie pomoże również wypełnić lukę w wiedzy w tej dziedzinie, dostarczając wstępnych danych, które mogą doprowadzić do przyszłych badań określających wpływ ćwiczeń fizycznych matki na zdrowie serca w macicy i poza nią.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zamrożone tkanki serca potomstwa zostały otrzymane od dr. Seana Newcomera wraz z instytucjonalnym listem zatwierdzającym IACUC. Tkanki serca pozyskano w ramach długoterminowego badania podłużnego, zamrożono błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Wszystkie protokoły dotyczące przetwarzania tkanki serca potomstwa były zgodne z wytycznymi komisji IBC i IACUC Uniwersytetu w Kansas City.

1. Przygotowanie buforów i odczynników

UWAGA: Wszystkie próbki należy przygotować zgodnie z wytycznymi producenta. We wszystkich recepturach i krokach protokołu należy stosować wodę ultra-czystą lub jej odpowiednik. Podczas tej procedury należy stosować środki ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, maseczkę, rękawiczki oraz gogle/osłonę twarzy). Objętości buforów są dostosowane do przetworzenia sześciu próbek tkanki.

  1. Przygotować 1,5 L buforu do płukania tkanek, łącząc 154,035 g sacharozy (stężenie końcowe 0,3 M), 3,904 g HEPES (stężenie końcowe 10 mM) oraz 0,1 g EDTA (stężenie końcowe 0,2 mM). Składniki dodać do 1,0 L wody podczas mieszania na mieszadle magnetycznym, dostosować pH do 7,2 za pomocą rozcieńczonego HCl, a następnie doprowadzić do końcowej objętości 1,5 L.
    UWAGA: Na jedną próbkę (50-30 mg) potrzeba około 20 mL buforu do płukania. W ciągu jednego dnia można przetworzyć sześć próbek tkanki. Pozostały bufor do płukania wykorzystać do przygotowania buforu do izolacji.
  2. Przygotować bufor do izolacji z buforu do płukania opisanego wcześniej w punkcie 1.1, dodając 210 mg BSA do 210 mL buforu do płukania. Dostosować pH do 7,4 za pomocą rozcieńczonego roztworu NaOH.
    UWAGA: Na jedną próbkę tkanki potrzeba około 35 mL buforu do izolacji; zatem dla sześciu próbek wymagane jest 210 mL buforu do izolacji. Bufor ten należy przygotować w dniu przeprowadzenia procedury, dodając świeży roztwór BSA (stężenie końcowe 1 mg/mL). BSA stosuje się do izolacji mitochondriów, ponieważ poprawia on ich właściwości poprzez usuwanie naturalnych odsprzęgaczy, takich jak wolne kwasy tłuszczowe. Wykazano, że BSA wykazuje aktywność przeciwutleniającą, zwiększając tempo utleniania substratów, szczególnie bursztynianu, w mitochondriach mózgowych7. Alternatywnie albuminę wołową można zastąpić tańszymi analogami bezkwasowymi, takimi jak owalbumina.
  3. Przygotować 150 mL buforu do resuspensji, łącząc 0,011 g EDTA (stężenie końcowe 0,2 mM EDTA lub użyć 150 µL roztworu stokowego EDTA 20 mM na 150 mL buforu do resuspensji), 12,836 g sacharozy (stężenie końcowe sacharozy 0,25 M) oraz 0,236 g Tris (stężenie końcowe Tris-HCl 10 mM). Dostosować pH do 7,8 za pomocą 0,1 N NaOH. Bezpośrednio przed użyciem dodać 60 µL koktajlu inhibitorów proteaz.
  4. Przygotować roztwór trypsyny, rozpuszczając 7,5 mg trypsyny w 3,0 mL 1 mM HCl (stężenie końcowe 2,5 mg trypsyny/mL). Taka ilość jest wystarczająca dla jednej próbki.
    UWAGA: Roztwór trypsyny należy przygotować w zależności od liczby próbek tkanki planowanych do przetworzenia.
  5. Przygotować roztwór inhibitora trypsyny z soi, łącząc 13,0 mg inhibitora trypsyny w 20 mL buforu do izolacji zawierającego BSA (stężenie końcowe inhibitora trypsyny 0,65 mg/mL).
    UWAGA: Należy przygotować świeży roztwór inhibitora trypsyny.
  6. Przygotować odczynnik nadsiarczanu amonu, dodając 0,1 g nadsiarczanu amonu do 1 mL wody (stężenie końcowe 10% nadsiarczanu amonu).
    UWAGA: Odczynnik nadsiarczanu amonu powinien być świeżo przygotowany lub można go podzielić na aalikwoty i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
  7. Przygotować roztwór kwasu aminokapronowego (ACA), łącząc 0,131 g kwasu 6-aminokapronowego w 1,0 L ultra-czystej wody i przechowywać w temperaturze 4 °C (stężenie końcowe kwasu 6-aminokapronowego 1 M).
  8. Przygotować roztwór barwnika Coomassie brilliant blue, rozpuszczając 1 g Coomassie G-250 w 0,5 mL wody i 0,5 mL 1 M kwasu aminokapronowego (stężenie końcowe roztworu barwnika 10%).
  9. Przygotować 5% digitoninę do Blue native-PAGE (BN-PAGE). Obliczyć przybliżoną ilość digitoniny potrzebną do przygotowania próbek, dodając zapas na ewentualne błędy pipetowania (nadwyżka 10 mg). Dla 15 mg: Najpierw rozpuścić 15 mg digitoniny w 30 µL 10% DMSO. Wymieszać w wortexie, aby pomóc digitoninie przejść do roztworu. Następnie dodać pozostałe 90% ddH2O (270 µL). Delikatnie podgrzać, aby wymieszać roztwór (wortex), a następnie schłodzić na lodzie.
  10. Przygotować bufor anodowy do native PAGE. Dodać 50 mL 20x buforu do prowadzenia native PAGE do 950 mL wody, aby uzyskać końcową objętość 1 L. Przygotować świeży bufor anodowy do natychmiastowego użycia. Stosować jako 1x bufor do prowadzenia.
  11. Przygotować ciemnoniebieski bufor katodowy. Rozpuścić 0,0160 g Coomassie brilliant blue G-250 w 80 mL buforu anodowego do native PAGE; dokładnie wymieszać.
    UWAGA: Przygotować świeży bufor katodowy do natychmiastowego użycia. Może być potrzebne tylko 60 mL, ale należy przygotować dodatkowe 20 mL na wypadek wycieków.
  12. Przygotować jasnoniebieski bufor katodowy. Dodać 20 mL ciemnoniebieskiego buforu katodowego do 180 mL buforu anodowego do native PAGE i dokładnie wymieszać.
    UWAGA: Ten bufor można wykorzystać tylko raz.
  13. Przygotować 5% Coomassie G-250 jako dodatek do próbek. Rozcieńczyć 20 µL przygotowanego wcześniej 10% roztworu stokowego Coomassie (punkt 1.8) z 20 µL 1 M ACA i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  14. Przygotować 4x bufor do próbek native PAGE, łącząc 40% glicerolu, 0,04% Ponceau S, 25 mM Tris-HCl (pH 6,8) oraz 192 mM glicyny w 10 mL końcowej objętości. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.

2. Izolacja mitochondriów z zamrożonej tkanki serca

UWAGA: Procedurę izolacji mitochondriów należy przeprowadzać w chłodni o temperaturze 4 °C. W przypadku braku dostępu do chłodni, do przeprowadzenia procedury należy użyć kąpieli lodowej o dużej pojemności.

  1. Wyjmij wcześniej zamrożone próbki tkanki serca z zamrażarki -80 °C.
    UWAGA: W ciągu jednego dnia można komfortowo przetworzyć maksymalnie cztery próbki tkanki w celu izolacji mitochondriów.
  2. Zważ probówkę zawierającą próbkę tkanki serca i zapisz masę. Przygotuj trzy zlewki (każda o pojemności 50 mL) zawierające 40 mL buforu piorącego. Chłodź każdą zlewkę w kąpieli lodowo-solnej z równą ilością lodu i soli przez 3-5 min przed przejściem do następnego kroku. Umieść mieszadła magnetyczne w każdej zlewce i ustaw mieszadło na średnią prędkość.
    UWAGA: Nie schładzaj zlewek zbyt mocno i użyj ich natychmiast po pojawieniu się pierwszych chmur kryształków lodu.
  3. Włóż zamrożoną tkankę serca bezpośrednio do lodowatego roztworu w pierwszej zlewce. Odczekaj około 5 min, mieszając i wywierając lekkie naciskanie na tkankę za pomocą pęsety, aby usunąć jak najwięcej krwi.
  4. Zważ pustą probówkę i odejmij tę wartość od masy początkowej (krok 2.2), aby uzyskać masę netto tkanki serca.
  5. Wyjmij tkankę pęsetą i osusz ser czystym ręcznikiem papierowym lub papierem filtracyjnym w celu usunięcia krwi. Następnie umieść tkankę w drugiej zlewce. Odczekaj około 5 min przy ciągłym mieszaniu, aby usunąć nadmiar krwi.
  6. Delikatnie osusz tkankę na ręczniku papierowym. Usuń cały tłuszcz, skrzepy krwi, uszka oraz powięzi (biała tkanka). Następnie połącz tkankę komór właściwych.
  7. Rozdrabniaj próbki tkanki za pomocą rozdrabniacza, wykonując kroki 2.7.1-2.7.9.
    1. Umieść tkankę serca (~50-30 mg) w komorze rozdrabniacza tkankowego od strony tłoka.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Komora rozdrabniacza tkanek (probówka) do użytku z rozdrabniaczem. Homogenizacja tkanki w probówce rozdrabniacza trwa około 10-12 s na próbkę tkanki. Homogenizacja tkanki jest zakończona, gdy zhomogenizowana tkanka przejdzie przez perforowany dysk do górnej komory. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Dodaj ~0,2-0,8 mL buforu płuczącego do strony zakrętki probówki.
    UWAGA: Upewnij się, że całkowita objętość próbki i buforu płuczącego podczas rozdrabniania nie przekracza 0,7-0,8 mL.
  2. Użyj narzędzia do probówek, aby ściśle zamknąć komorę rozdrabniacza zakrętką rozdrabniacza.
    UWAGA: Nie dokręcaj zakrętki rozdrabniacza zbyt mocno.
  3. Umieść komorę rozdrabniacza w uchwycie rozdrabniacza tłokiem skierowanym w dół. Tłok zazębi się z dopasowaniem w uchwycie rozdrabniacza.
  4. Włóż końcówkę wkrętaka rozdrabniacza; pozwól końcówce zazębić się z zakrętką rozdrabniacza. Upewnij się, że końcówka jest ściśle zablokowana na miejscu.
    UWAGA: Zawsze używaj w pełni naładowanego wkrętaka rozdrabniacza.
  5. Ręcznie wywieraj nacisk w dół na wkrętak rozdrabniacza i komorę rozdrabniacza, aż wskaźnik nacisku na uchwycie rozdrabniacza osiągnie ustawienie około 2 na uchwycie rozdrabniacza.
    UWAGA: Ustawienie może być wyższe, jeśli rozdrabniana tkanka jest bardziej włóknista.
  6. Uruchom wkrętak rozdrabniacza na około 10-12 s, naciskając spust wkrętaka rozdrabniacza, utrzymując jednocześnie ustawienie na wartości 2.
  7. Spójrz na probówkę, aby sprawdzić, czy cała lub większość stałej masy tkanki została rozdrobniona przez dysk lizujący i przedostała się do górnej części komory rozdrabniacza.
    UWAGA: Może być konieczne rozdrabnianie próbki tkanki przez dłuższy czas. Wystarczy ponownie umieścić probówkę w uchwycie rozdrabniacza i kontynuować proces. Większość rodzajów próbek tkankowych wymaga rozdrabniania jedynie przez 10-12 s. Chociaż każde rozdrabnianie generuje pewną ilość ciepła z powodu tarcia, tak krótki czas przetwarzania nie podgrzeje znacząco próbki.
  8. Po rozdrobnieniu próbki wyjmij komorę rozdrabniacza z uchwytu. Użyj narzędzia do probówek, aby zdjąć zakrętkę rozdrabniacza i odłożyć ją na czystą powierzchnię do późniejszego użycia.
    UWAGA: Zakrętkę rozdrabniacza należy uznać za zanieczyszczoną ekstraktem z próbki i w zależności od rodzaju próbki może być ona zanieczyszczona materiałami zakaźnymi. Nie używaj tej samej zakrętki rozdrabniacza do żadnych innych próbek tkanek, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.
  1. Przenieś rozdrobnioną tkankę serca do trzeciego zlewka zawierającego 40 mL buforu piorącego i mieszadło magnetyczne, a następnie mieszaj tkankę przez 5 min z umiarkowaną prędkością na mieszadle magnetycznym.
  2. Przefiltruj zawiesinę przez nylonową siatkę monofilamentową (wielkość porów 74 µm) i odrzuć filtrat. Przemyj rozdrobnioną tkankę na filtrze 3x za pomocą 10 mL buforu piorącego.
    UWAGA: Upewnij się, że nylonowa siatka monofilamentowa została uprzednio zwilżona wodą.
  3. Przenieś przemytą i rozdrobnioną tkankę do zlewka o pojemności 50 mL z 20 mL buforu piorącego i umieść zlewek w kąpieli lodowej na mieszadle magnetycznym. Dodaj 0,5 mL roztworu trypsyny, stale mieszając przez 15 min. W połowie czasu inkubacji (około 7,5 min) przenieś zawiesinę tkankową do luźno dopasowanego ręcznego homogenizatora szklanego o pojemności 0-15 mL.

figure-protocol-2
Rycina 1: Komora (probówka) rozdrabniacza tkanek do stosowania z rozdrabniaczem. Homogenizacja tkanek w probówce rozdrabniacza trwa około 10-12 s na próbkę tkanki. Proces homogenizacji tkanek jest zakończony, gdy zhomogenizowana tkanka przejdzie przez perforowany dysk do górnej komory. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Należy delikatnie homogenizować, wykonując 4–5 ruchów, aby rozproszyć zawiesinę bez wytwarzania piany. Homogenizat należy przenieść do zlewki o pojemności 50 ml i delikatnie mieszać na mieszalce magnetycznej przez 15 min w temperaturze 4 °C.
  2. Po 15 minutach inkubacji należy dodać 10 ml buforu izolacyjnego zawierającego inhibitor trypsyny do zlewki z homogenatem i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 4 °C przy delikatnym mieszaniu.
  3. Ponownie przefiltrować zawiesinę przez filtr nylonowy, a otrzymany filtrat przelać do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
  4. Zebrać frakcję cząsteczkową pozostałą na filtrze nylonowym i umieścić ją w homogenizatorze szklanym. Dodać 15–20 ml buforu płuczącego i delikatnie homogenizować ręcznie przez 25–30 s.
    UWAGA: Na tym etapie filtrat przepływa bardzo powolnie. Aby zwiększyć szybkość przepływu, należy oprzeć końcówkę lejka o wewnętrzną ściankę probówki stożkowej.
  5. Połączyć homogenat z filtratem, zrównoważyć probówki i odwirować przy 60 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
  6. Przefiltruj otrzymany nadsącz do nowej probówki stożkowej, używając filtra nylonowego, aby uniknąć zanieczyszczenia osadem. Ponownie odwiruj próbkę przy 8 50 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Należy użyć plastikowej pipety transferowej do usunięcia supernatantu oraz odpipować 0,2 ml supernatantu z górnej części puszystego osadu.
  7. Odlej supernatant i wypłucz osad 2–3 razy za pomocą 1 ml buforu do izolacji. Pamiętaj, aby za każdym razem usuwać puszystą, białą warstwę zewnętrzną.
    UWAGA: Przemyj osad, dodając bufor izolacyjny za pomocą pipety z końcówką 1 ml lub nowej pipety transferowej. Dodawaj bufor do ścianki probówki, a nie bezpośrednio na osad, aby zapobiec jego rozbiciu oraz zanieczyszczeniu supernatantu. Następnie odessij bufor pipetą transferową i powtórz ten proces jeszcze dwukrotnie.
  8. Do każdej probówki należy dodać 5 ml buforu izolacyjnego, a następnie rozbić osad za pomocą pipety z końcówką 1 ml lub nowej pipety transferowej.
  9. Rozcieńczyć zawiesinę, dodając 20 ml dodatkowego buforu izolacyjnego, i ponownie odwirować w wirówce przy 8 50 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
  10. Odlej supernatant i resuspender osad w 5 ml buforu do resuspensji. Następnie dodaj kolejne 15 ml buforu, aby uzyskać łącznie 20 ml, i wiruj z prędkością 8 50 x g przez 15 min. w temperaturze 4 °COdciąć supernatant. Powstały brązowy osad zawiera przepłukane, nienaruszone mitochondria.
  11. Resuspend pellet wzbogacony w mitochondria w 250 µL buforu do resuspensji, zawierającego inhibitory proteaz. Alikwotować do 25 µL, szybkie zamrażanie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C zamrażarka niskotemperaturowa przez kilka lat.
    UWAGA: Zapasowy 5 µL preparatu wzbogaconego w mitochondria do analizy białek. W przypadku badania BN-PAGE (elektroforezy w natywnym układzie z użyciem barwnika Blue Native), podziel resuspensowany osad na* 50 µg białka mitochondrialnego na probówkę. Centryfuguj przy 8 50 x g przez 15 min w temperaturze 4 °COstrożnie odessaj supernatant i przechowuj osad mitochondrialny (50 µg białko/alikwot) w -80 °C zamrażarka niskotemperaturowa przez kilka lat.

3. Ocena kompleksu transportu elektronów (ETC) w mitochondriach

UWAGA: Poziom poszczególnych białek mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów (ETC, tj. Kompleksu I, II, III, IV, V) można ocenić za pomocą standardowego testu immunoblottingu. Ze względu na różnorodność próbek (cztery punkty czasowe: 48 h, 3 miesiące, 6 miesięcy, 9 miesięcy), dwa warunki eksperymentalne (aktywne ćwiczenia i siedzący tryb życia) oraz liczbę przeciwciał do detekcji (pięć przeciwciał), zaleca się zastosowanie multiplex immunoblottingu. Multiplex immunoblotting należy przeprowadzić w następujący sposób.

  1. Rozdziel 50 µg wzbogaconej w mitochondria próbki białek na studzienkę w żelu do elektroforezy poliakrylamidowej z gradientem 4%-20% (10 V, 90 min).
  2. Przenieś białka na membranę PVDF (75 V; 60 min).
  3. Zablokuj membranę w roztworze buforu blokującego przez minimum 1 h w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Czas blokowania można wydłużyć nawet do całej nocy w temperaturze 4 °C. Bufor blokujący (Tabela materiałów) zawiera składniki niemammalijne (np. białka rybie), które rzadziej wchodzą w specyficzne oddziaływania wiążące z przeciwciałami oraz innymi białkami ssaków obecnymi w typowych metodach.
  4. Poddaj membranę inkubacji z koktajlem przeciwciał, w tym przeciwciałami anty-Kompleks I, II, III, IV, V, i inkubuj przez noc na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 4 °C.
  5. Następnego dnia przemyj membranę i poddaj inkubacji z wtórnym przeciwciałem znakowanym IR przez 2 h na wytrząsarce orbitalnej w RT (temperaturze pokojowej).
  6. Przemyj pięciokrotnie 1x TBS-T (buforem TBS z dodatkiem Tween 20), a raz 1x TBS (buforem soli z trzydiaminą).
    UWAGA: Podczas ostatniego przemywania nie dodawaj detergentu do buforu TBS.
  7. Wykonaj obrazowanie blotu w analizatorze obrazu.

4. Ocena superkompleksów mitochondrialnych za pomocą elektroforezy żelowej w układzie Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE)

UWAGA: Profil superkompleksów ETC można również ocenić, stosując technikę BN-PAGE.

  1. Przygotować koktajl buforu do próbek w ilości 20 µL na 50 µg białka z osadu wzbogaconego w mitochondria (7 µL wody + 5 µL 4x buforu do nakładania próbek do natywnej elektroforezy w żelach poliakrylamidowych + 8 µL 5% digitonin lub 2 µL Coomassie G-250).
    UWAGA: Przygotować zapas koktajlu buforu do próbek w zależności od liczby dostępnych próbek (50 µg białka/próbka). Dobrać odpowiednią ilość digitoniny w oparciu o stężenie białka w osadzie wzbogaconym w mitochondria (Tabela 1)8.
  2. Podgrzać zapas digitoniny w temperaturze 95 °C przez 3 min, wymieszać i schłodzić na lodzie przed przygotowaniem mieszaniny głównej (master mix).
  3. Dodać dodatek do próbek Coomassie G-250 bezpośrednio przed nałożeniem próbek na żel.
  4. Dodać 20 µL koktajlu buforu do próbki do probówki zawierającej 50 µg osadu białka mitochondrialnego. Solubilizować/resuspender osad, delikatnie mieszając go pipetą, tak aby nie wytworzyła się piana.
  5. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 20 min, aby uzyskać maksymalną solubilizację osadu wzbogaconego w mitochondria. Od czasu do czasu delikatnie potrząsać probówkami, aby usprawnić solubilizację.
  6. W czasie inkubacji przygotować bufor anodowy do natywnej PAGE/1x bufor do prowadzenia elektroforezy oraz ciemnoniebieski bufor katodowy.
  7. Odwirować solubilizowany osad wzbogacony w mitochondria przy 20,0 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  8. Po wirowaniu zebrać 15 µL supernatantu do nowych probówek umieszczonych na lodzie.
  9. Dodać odpowiednią ilość odczynnika 5% Coomassie G-250 do supernatantu otrzymanego w kroku 4.8 (patrz Tabela 1).
    ​UWAGA: Objętość 5% Coomassie G-250 powinna być taka, aby końcowe stężenie barwnika stanowiło ¼ stężenia detergentu. Wykonać ten krok bezpośrednio przed nałożeniem próbek na żel.
BiałkoDigitonin/białko4x bufor do próbek5% digitoninyWodaObjętość końcowa5%  Coomassie G-250
stosunek (g/g)dodatek do próbki
50 µg8587202
50 µg45411201

Tabela 1: Przygotowanie koktajlu buforu do próbek z dwoma różnymi stosunkami detergentu do białka. Aby uzyskać maksymalną solubilizację białek błonowych z zawiesiny mitochondrialnej, stężenie digitoninowej zawiesiny białek mitochondrialnych powinno zostać dostosowane do zakresu 4-8 g digitonin/g białka. W przypadku tkanki serca wykorzystano 40 µg digitoniny na 50 µg białek zawiesiny mitochondrialnej (tj. 8 g digitonin/g białka mitochondrialnego), aby zmaksymalizować rozpuszczalność superkompleksów z zawiesiny mitochondriów.

  1. Przygotuj żel gradientowy 3%-8%, usuń grzebień i trzy razy wypłucz dołki żelu buforem do elektroforezy 1x.
    UWAGA: Żel najlepiej polimeryzuje, jeśli zostanie przygotowany dzień wcześniej.
  2. Przygotuj układ do elektroforezy i umieść żel w aparacie.
  3. Wypełnij dołki dla próbek ciemnoniebieskim buforem katodowym.
  4. Nanieś 10 µL niebarwionego standardu białkowego jako natywny marker masy cząsteczkowej do pierwszego i ostatniego dołka żelu.
  5. Nanieś całą objętość nadpływu próbki z dodatkiem barwnika Coomassie, przygotowaną w kroku 4.9 powyżej, dołków, używając końcówki do nakładania próbek o płaskim przekroju.
  6. Ostrożnie wypełnij tamę buforową minikomory około 60 mL ciemnoniebieskiego buforu katodowego, nie naruszając próbek w dołkach, a następnie wypełnij zbiornik buforem do natywnej elektroforezy PAGE 1x.
  7. Włącz zasilacz i prowadź elektroforezę próbek przy napięciu 150 V przez około 30 min.
  8. Usuń ciemnoniebieski bufor katodowy z tamy buforowej (komory wewnętrznej) za pomocą pipety transferowej lub odessij go z dołków. Wypełnij komorę wewnętrzną 150-20 mL jasnoniebieskiego buforu katodowego i prowadź elektroforezę przy napięciu 250 V przez 60 min.
    UWAGA: Czas elektroforezy można określić, sprawdzając, kiedy front barwnika przemieści się o 0,5 cm powyżej dolnej krawędzi kasety żelowej.
  9. Wyjmij żel z kasety i umieść go w czystym plastikowym pojemniku. Przemywaj żel wysokiej jakości wodą destylowaną przez 15 min na wstrząsarce orbitalnej lub kołysarce.
    UWAGA: Aby wyjąć żel gradientowy z kasety, chwyć kasetę od dołu, ponieważ ta część jest mocniejsza, co zminimalizuje ryzyko uszkodzenia.
  10. Odlej wodę, zanurz żel w odpowiedniej ilości odczynnika barwiącego Coomassie GelCode Blue i inkubuj przez 1 h na wstrząsarce orbitalnej lub kołysarce w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Przed użyciem wymieszaj roztwór odczynnika Blue stain (Tabela materiałów), delikatnie potrząsając butelką kilka razy.
  11. Zlej roztwór barwnika, dodaj wodę destylowaną, przemyj żel wodą kilka razy, a następnie umieść go na wstrząsarce orbitalnej lub kołysarce w celu odbarwienia.
    ​UWAGA: Włóż kawałek gąbki (~3 cm x 0,5 cm) do pojemnika do odbarwiania żelu i pozostaw żel do odbarwienia przez noc. Gąbka adsorbuje cząsteczki barwnika, eliminując konieczność wielokrotnej wymiany wody.
  12. Przeanalizuj żel za pomocą analizatora obrazu.

5. Ocena superkompleksów mitochondrialnych za pomocą analizy immunoblottingu

  1. Przeprowadź nową serię BN-PAGE, nie barwiąc żelu po zakończeniu elektroforezy.
  2. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 3 (ocena mitochondrialnych kompleksów transportu elektronów (ETC)), aby przeprowadzić immunoblotting.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z protokołem przygotowano wysoką wydajność mieszaniny białek wzbogaconej o mitochondria z tkanki serca. Z przeciętnej masy 1,2 g zamrożonej tkanki serca pobranej od potomstwa lochy uzyskano około 15 mg/mL mieszaniny białek wzbogaconej o mitochondria. Obserwacje wykazały, że masa zamrożonej tkanki serca mniejsza niż 0,5 g nie pozwalała na uzyskanie ilości mieszaniny białek wzbogaconej o mitochondria wystarczającej do przeprowadzenia analizy BN-PAGE. Ilość preparatu mitochondrialnego była wystarczająca do wykonania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe kroki dla tego protokołu są wskazane tutaj. Po pierwsze, homogenizacja tkanek powinna być traktowana ostrożnie, aby podczas procesu homogenizacji tkanek nie wystąpiły nadmierne efekty przezroczystości. Należy użyć rozdrabniacza tkanek, który jest częścią technologii cyklicznych zmian ciśnienia (PCT) do wstępnej homogenizacji tkanek9. Ten krok zmniejszy nadmierny cykl udaru homogenizatora szkło na szkle (ryc. 1B), który może dodatkowo zniszczyć i tak już kruch...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była finansowana przez grant Uniwersytetu Kansas City dla Abdulbaki Agbasa i Letnie Stypendium Badawcze dla Daniela Barrery. Autorzy są wdzięczni za pracę redakcyjną dr. Jana Talleya.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas aminokapronowySigma/AldrichA2504-100G
Zestaw kompleksu Anti-Hu Total OxPhosInvitrogen458199
przeciwciało anty-VDACabcamab15895zastosowanie 1 i mikro; g/ml
Coomassie G-250ThermoSientific20279
Coomassie GelCode BlueThermoScientific24592
DigitoninaCabiochem300410
Homogenizator tłuczka szklano-szklanegoVWRKT885451-0020
Image StudioLICOR
IR-Dye sprzężony anty-RabbitAb LICORLC0725
Wielodołkowy czytnik płytekBioTekSynergy HT
Natywny marker masy cząsteczkowejThermoFisherBN2001
Monofilament z siatki nylonowejSmall Part IncCMN-74
Wytrząsarka orbitalnaThermoScientfic
PCT ShredderPressure Bioscience Inc
SEA BLOK Bufor blokującyThermoScienctific37527
Niszczarka PULSE TubePressure Bioscience IncFT500-PS
Wirówka stołowaEppendorf5418
TrypsynaAmrescoM150-1G
Inhibitor trypsynyAmrescoM191-1GWymaga świeżego przygotowania

Bibliografia

  1. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
  2. Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116(2020).
  3. Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73(2019).
  4. Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
  5. May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095(2020).
  6. Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
  7. Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
  8. Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
  9. Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
  10. McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599(2020).
  11. Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
  12. Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mitochondria tkanki sercamitochondria z mro onej tkankimodel wicze u matekelektroforeza Blue Nativemultipleksowy immunoblottingocena superkompleks waktywno kompleksu I IIizolacja mitochondri w

Powiązane artykuły