Przygotowanie wzbogaconych o mitochondria próbek z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek stałych pozwoliło badaczom na przeprowadzenie zarówno funkcjonalnych, jak i analitycznych ocen mitochondriów w różnych eksperymentalnych modalnościach. Badanie to pokazuje, jak przygotować preparaty wzbogacone w mitochondria z zamrożonej tkanki serca i przeprowadzić ocenę analityczną mitochondriów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Profil mitochondrialnego kompleksu transferu elektronów (ETC) jest modyfikowany w tkance serca potomstwa urodzonego przez ćwiczoną lochę. Zaproponowana i przetestowana hipoteza była taka, że regularne ćwiczenia lochy przez matkę w czasie ciąży zwiększyłyby wydajność mitochondrialną bioenergetyki serca potomstwa. Hipoteza ta została przetestowana poprzez wyizolowanie mitochondriów przy użyciu procedury łagodnej izolacji w celu oceny mitochondrialnych ETC i profili superkompleksów. Opisana tu procedura pozwoliła na przetworzenie wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek serca i wyeliminowała konieczność świeżego przygotowania mitochondriów do oceny mitochondrialnych kompleksów ETC, superkompleksów i profili aktywności kompleksów ETC. Protokół ten opisuje optymalny pomiar kompleksu białkowego ETC w multipleksowanym immunoblottingu opartym na przeciwciałach i ocenie super złożonej przy użyciu elektroforezy w żelu natywnym dla koloru niebieskiego.
Wprowadzenie
Celem tego protokołu było dostarczenie szczegółowych kroków do uzyskania wzbogaconego o mitochondria preparatu z wcześniej zamrożonej tkanki serca z nową technologią niskoenergetycznego mechanicznego rozbijania tkanki, która poprawia lizę tkanek i ekstrakcję mitochondriów. Dzięki tej metodzie możliwa jest poprawa wydajności ekstrakcji bez generowania dużego naprężenia ścinającego lub wysokiej temperatury oraz krótki czas homogenizacji (10-12 s)1.
Uzyskanie mitochondriów z archiwalnej zamrożonej tkanki jest cennym atutem do przeprowadzenia zarówno badań funkcjonalnych2, jak i biochemicznych3 w przeciwnym razie nie jest łatwo powtórzyć w dokładnych warunkach eksperymentalnych. Klasyczny homogenizator ze szkła teflonowego Potter-Elvehjem lub homogenizator Dounce był i nadal jest używany w laboratoriach badawczych do homogenizacji tkanek miękkich, takich jak wątroba, nerki i mózg. Jednak homogenizacja twardych tkanek, takich jak mięśnie i serce, wymaga dłuższego czasu homogenizacji, leczenia enzymatycznego, szybkiej homogenizacji i dużego doświadczenia użytkownika. Jest to niekorzystne dla ekstrakcji nienaruszonych organelli, takich jak mitochondria, z tkanek twardych, takich jak mięśnie i serce. Metoda opisana w tym protokole służy do uzyskania wysokowydajnego preparatu wzbogaconego w mitochondria do analizy kompleksów białkowych mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów (ETC) i ich tworzenia nadkompleksów w tkankach serca pobranych od potomstwa urodzonego przez lochę uprawiającą wysiłek fizyczny i prowadzącą siedzący tryb życia, zamrożonego błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywanego w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Metoda ta pozwala na wyizolowanie preparatu wzbogaconego o mitochondria z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek.
Zewnętrzne narażenie ciężarnych gryzoni na nanomateriały może negatywnie wpływać na czynność serca i oddychanie mitochondrialne oraz bioenergetykę u potomstwa podczas ciąży4. Niemniej jednak, wywołane ćwiczeniami aerobowymi pozytywne zmiany w bioenergetyce miocytów płodu podczas ciąży nie zostały jeszcze udokumentowane. Jednak nowe badania dostarczają dowodów na to, że ćwiczenia aerobowe matki w czasie ciąży mają pozytywny wpływ na czynność serca płodu5. W celu uzyskania dalszych dowodów przeprowadzono analizę podłużnego wpływu ćwiczeń matki na sercowe kompleksy mitochondrialnego łańcucha oddechowego u potomstwa (tj. od kompleksu I do kompleksu V) w czasie ciąży.
To badanie ma istotne znaczenie dla zdrowia, ponieważ wyniki mogą sugerować, że ćwiczenia matki poprawiają efektywność produkcji energii w mitochondriach serca potomstwa. W tym badaniu lochy (samice świni) zostały wykorzystane jako model zwierzęcy z dwóch powodów: (i) fizjologia serca jest podobna do human6, oraz (ii) pobranie tkanki serca od potomstwa z różnych punktów czasowych jest możliwe pod instytucjonalnym zatwierdzeniem IACUC. Proponowane badanie ma na celu udzielenie odpowiedzi na wiele podstawowych pytań łączących ćwiczenia matki z ich potencjalnym pozytywnym wpływem na skład komórkowy i biochemiczny tkanki serca potomstwa. Podejście to wymaga delikatnych, ale skutecznych technik izolacji mitochondriów z wcześniej zamrożonej tkanki serca, uzyskanej z długich i kosztownych badań podłużnych, które dotyczyły kwestii zmian bioenergetycznych w miocytach serca płodu podczas ciąży. Metoda opisana w tym badaniu pozwala na wykorzystanie dużych sum wcześniej zamrożonej zarchiwizowanej tkanki do przygotowania wzbogaconego w mitochondria zarówno do badań analitycznych, jak i funkcjonalnych. Badanie pomoże również wypełnić lukę w wiedzy w tej dziedzinie, dostarczając wstępnych danych, które mogą doprowadzić do przyszłych badań określających wpływ ćwiczeń fizycznych matki na zdrowie serca w macicy i poza nią.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zamrożone tkanki serca potomstwa zostały otrzymane od dr. Seana Newcomera wraz z listem zatwierdzającym badania przez instytucjonalną komisję IACUC. Tkanki serca pozyskano w ramach długoterminowego badania podłużnego, zamrożono gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Wszystkie protokoły dotyczące przetwarzania tkanek serca potomstwa były zgodne z wytycznymi komisji IBC oraz IACUC Uniwersytetu Kansas City.
1. Przygotowanie buforów i odczynników
UWAGA: Wszystkie próbki należy przygotować zgodnie z wytycznymi producenta. We wszystkich recepturach i krokach protokołu należy stosować wodę ultra-czystą lub jej odpowiednik. Podczas tej procedury należy stosować środki ochrony osobistej ( fartuch laboratoryjny, maseczkę, rękawiczki oraz gogle/przyłbicę). Objętości buforów są dostosowane do przetworzenia sześciu próbek tkanek.
- Przygotować 1,5 L buforu do płukania tkanek, łącząc 154,035 g sacharozy (stężenie końcowe 0,3 M), 3,904 g HEPES (stężenie końcowe 10 mM) oraz 0,111 g EDTA (stężenie końcowe 0,2 mM). Składniki dodać do 1,0 L wody podczas mieszania na mieszadle magnetycznym, dostosować pH do 7,2 za pomocą rozcieńczonego HCl i dopełnić do objętości końcowej 1,5 L.
UWAGA: Na jedną próbkę (50-300 mg) potrzeba około 200 mL buforu do płukania. W ciągu jednego dnia można przetworzyć sześć próbek tkanek. Pozostały bufor do płukania wykorzystać do przygotowania buforu do izolacji. - Przygotować bufor do izolacji z buforu do płukania opisanego w kroku 1.1, dodając 210 mg BSA do 210 mL buforu do płukania. Dostosować pH do 7,4 za pomocą rozcieńczonego roztworu NaOH.
UWAGA: Na jedną próbkę tkanki potrzeba około 35 mL buforu do izolacji; zatem dla sześciu próbek wymagane jest 210 mL buforu do izolacji. Bufor ten przygotować w dniu użycia, dodając świeży roztwór BSA (stężenie końcowe 1 mg/mL). BSA stosuje się do izolacji mitochondriów, ponieważ poprawia on ich właściwości poprzez usuwanie naturalnych odsprzęgaczy, takich jak wolne kwasy tłuszczowe. Wykazano, że BSA wykazuje aktywność antyoksydacyjną poprzez zwiększenie szybkości utleniania substratów, zwłaszcza bursztynianu, w mitochondriach mózgowych7. Alternatywnie albuminę surowicy bydlęcej można zastąpić tańszymi analogami bezkwasowymi, takimi jak owalbumina. - Przygotować 150 mL buforu do resuspensji, łącząc 0,011 g EDTA (stężenie końcowe 0,2 mM EDTA lub użyć 150 µL roztworu stokowego EDTA 200 mM na 150 mL buforu do resuspensji), 12,836 g sacharozy (stężenie końcowe 0,25 M sacharozy) oraz 0,236 g Tris (stężenie końcowe 10 mM Tris-HCl). Dostosować pH do 7,8 za pomocą 0,1 N NaOH. Bezpośrednio przed użyciem dodać 60 µL koktajlu inhibitorów proteaz.
- Przygotować roztwór trypsyny, rozpuszczając 7,5 mg trypsyny w 3,0 mL 1 mM HCl (stężenie końcowe 2,5 mg trypsyny/mL). Ilość ta jest wystarczająca dla jednej próbki.
UWAGA: Roztwór trypsyny przygotować w zależności od liczby próbek tkanek zaplanowanych do obróbki. - Przygotować roztwór inhibitora trypsyny z soi, łącząc 13,0 mg inhibitora trypsyny w 20 mL buforu do izolacji zawierającego BSA (stężenie końcowe inhibitora trypsyny 0,65 mg/mL).
UWAGA: Przygotować świeży roztwór inhibitora trypsyny. - Przygotować odczynnik persiarczanu amonu, dodając 0,1 g persiarczanu amonu do 1 mL wody (stężenie końcowe 10% persiarczanu amonu).
UWAGA: Odczynnik persiarczanu amonu powinien być przygotowany na świeżo lub można go przygotować w większej objętości, podzielić na alikwoty i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C. - Przygotować roztwór kwasu aminokapronowego (ACA), łącząc 0,131 g kwasu 6-aminokapronowego w 1,0 mL wody ultra-oczyszczonej i przechowywać w temperaturze 4 °C (stężenie końcowe 1 M kwasu 6-aminokapronowego).
- Przygotować roztwór barwnika Coomassie brilliant blue, rozpuszczając 1 g Coomassie G-250 w 0,5 mL wody i 0,5 mL 1 M kwasu aminokapronowego (stężenie końcowe 10% roztworu barwnika).
- Przygotować 5% digitoninę do BN-PAGE (Blue native-PAGE). Obliczyć przybliżoną ilość digitoniny potrzebną do przygotowania próbek, dodając zapas na ewentualne błędy pipetowania (nadwyżka 10 mg). Dla 15 mg: najpierw rozpuścić 15 mg digitoniny w 30 µL 100% DMSO. Wymieszać w wortexie, aby pomóc digitoninie rozpuścić się w roztworze. Następnie dodać pozostałe 90% ddH2O (270 µL). Delikatnie podgrzać, aby wymieszać roztwór (wortex), a następnie schłodzić na lodzie.
- Przygotować bufor anodowy do native PAGE. Dodać 50 mL 20x buforu do prowadzenia native PAGE do 950 mL wody, aby uzyskać objętość końcową 1 L. Świeży bufor anodowy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Stosować jako 1x bufor do prowadzenia.
- Przygotować ciemnoniebieski bufor katodowy. Rozpuścić 0,0160 g Coomassie brilliant blue G-250 w 80 mL buforu anodowego do native PAGE; dobrze wymieszać.
UWAGA: Świeży bufor katodowy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Może być potrzebne tylko 60 mL, ale należy przygotować dodatkowe 20 mL na wypadek ewentualnych przecieków. - Przygotować jasnoniebieski bufor katodowy. Dodać 20 mL ciemnoniebieskiego buforu katodowego do 180 mL buforu anodowego do native PAGE i dobrze wymieszać.
UWAGA: Bufor ten można wykorzystać tylko raz. - Przygotować 5% Coomassie G-250 jako dodatek do próbki. Rozcieńczyć 200 µL wcześniej przygotowanego 10% roztworu stokowego Coomassie (krok 1.8) w 200 µL 1 M ACA i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przygotować 4x bufor do próbek native PAGE, łącząc 40% glicerolu, 0,04% Ponceau S, 25 mM Tris-HCl (pH 6,8) oraz 192 mM glicyny w objętości końcowej 10 mL. Podzielić na alikwoty i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
2. Izolacja mitochondriów z zamrożonej tkanki serca
UWAGA: Procedurę izolacji mitochondriów należy przeprowadzić w pomieszczeniu chłodniczym o temperaturze 4 °C. W przypadku braku dostępu do pomieszczenia chłodniczego, do przeprowadzenia procedury należy użyć dużej kąpieli lodowej.
- Wyjmij wcześniej zamrożone próbki tkanki serca z zamrażarki -80 °C.
UWAGA: W ciągu jednego dnia można komfortowo przetworzyć maksymalnie cztery próbki tkanki w celu izolacji mitochondriów. - Zważ probówkę zawierającą próbkę tkanki serca i zapisz wagę. Przygotuj trzy zlewki (każda 50 mL) zawierające 40 mL buforu płuczącego. Chłodź każdą zlewkę w kąpieli lodowo-solnej z równą ilością lodu i soli przez 3-5 min przed przejściem do następnego kroku. Włóż mieszadła magnetyczne do każdej zlewki i ustaw mieszadło na średnią prędkość.
UWAGA: Nie schładzaj zlewek zbyt mocno; użyj ich natychmiast po pojawieniu się chmur kryształków lodu. - Umieść zamrożoną tkankę serca bezpośrednio w lodowatym roztworze w pierwszej zlewce. Odczekaj około 5 min, mieszając i wywierając lekką presję na tkankę za pomocą pęsety, aby usunąć jak najwięcej krwi.
- Zważ pustą probówkę i odejmij tę wartość od wagi początkowej (krok 2.2), aby uzyskać masę netto tkanki serca.
- Wyjmij tkankę pęsetą i osusz sero czystym ręcznikiem papierowym lub papierem filtracyjnym, aby usunąć krew. Następnie umieść tkankę w drugiej zlewce. Odczekaj około 5 min przy mieszaniu, aby usunąć nadmiar krwi.
- Delikatnie osusz tkankę na ręczniku papierowym. Usuń cały tłuszcz, skrzepy krwi, uszka serca i powięzi (biała tkanka). Następnie połącz tkankę komór wlewowych.
- Rozdrobnij próbki tkanki za pomocą rozdrabniacza, postępując zgodnie z krokami 2.7.1-2.7.9.
- Umieść tkankę serca (~50-300 mg) w komorze rozdrabniacza tkankowego od strony tłoka.
Rycina 1: Komora rozdrabniacza tkanek (probówka) do użytku z rozdrabniaczem.Homogenizacja tkanek w probówce rozdrabniacza trwa około 10-12 s na próbkę tkanki. Homogenizacja tkanek jest zakończona w momencie, gdy zhomogenizowana tkanka przejdzie przez perforowany dysk do górnej komory. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Dodaj ~0,2-0,8 mL buforu płuczącego do strony zakrętki probówki.
UWAGA: Należy upewnić się, że całkowita objętość próbki i buforu płuczącego łącznie podczas rozdrabniania nie przekracza 0,7-0,8 mL. - Za pomocą narzędzia do probówek szczelnie zakręć komorę rozdrabniacza zakrętką do rozdrabniacza.
UWAGA: Nie dokręcaj zbyt mocno zakrętki rozdrabniacza. - Umieść komorę rozdrabniacza w uchwycie rozdrabniacza tłokiem skierowanym w dół. Tłok zazębi się z dopasowaniem w uchwycie rozdrabniacza.
- Włóż końcówkę napędu rozdrabniacza; pozwól, aby końcówka zazębiła się z zakrętką rozdrabniacza. Upewnij się, że końcówka jest szczelnie zablokowana na miejscu.
UWAGA: Zawsze używaj w pełni naładowanego napędu rozdrabniacza. - Ręcznie wywieraj nacisk w dół na napęd rozdrabniacza i komorę rozdrabniacza, aż wskaźnik nacisku na uchwycie rozdrabniacza osiągnie wartość około 2 na uchwycie rozdrabniacza.
UWAGA: Ustawienie może być na wyższym poziomie, jeśli rozdrabniana tkanka jest bardziej włóknista. - Uruchom napęd rozdrabniacza na około 10-12 s, naciskając spust napędu rozdrabniacza, utrzymując jednocześnie ustawienie na poziomie 2.
- Spójrz na probówkę, aby sprawdzić, czy cała lub większość stałej masy tkanki została rozdrobniona przez dysk lizujący i przedostała się do górnej części komory rozdrabniacza.
UWAGA: Może być konieczne rozdrabnianie próbki tkanki przez dłuższy czas. Wystarczy ponownie umieścić probówkę w uchwycie rozdrabniacza i kontynuować proces. Większość rodzajów próbek tkanek wymaga rozdrabniania jedynie przez 10-12 s. Choć każde rozdrabnianie generuje pewną ilość ciepła wskutek tarcia, tak krótki czas przetwarzania nie doprowadzi do znaczącego ogrzania próbki. - Po rozdrobnieniu próbki wyjmij komorę rozdrabniacza z uchwytu. Użyj narzędzia do probówek, aby zdjąć zakrętkę rozdrabniacza i połóż ją na czystej powierzchni do późniejszego użycia.
UWAGA: Zakrętka rozdrabniacza powinna być uznana za zanieczyszczoną ekstraktem z próbki i, w zależności od rodzaju próbki, może być zanieczyszczona materiałami zakaźnymi. Nie używaj tej samej zakrętki rozdrabniacza do innych próbek tkanek, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.
- Przenieś posiekaną tkankę serca do trzeciego zlewki zawierającej 40 mL buforu płuczącego oraz mieszadło magnetyczne i mieszaj tkankę przez 5 min z umiarkowaną prędkością na mieszalniku magnetycznym.
- Przefiltruj zawiesinę przez nylonowy filtr monofilamentowy (rozmiar oczek 74 µm) i odrzuć filtrat. Przemyj posiekaną tkankę na filtrze 3x za pomocą 10 mL buforu płuczącego.
UWAGA: Upewnij się, że nylonowy filtr monofilamentowy został uprzednio zwilżony wodą. - Przenieś wypłukaną i posiekaną tkankę do zlewki o pojemności 50 mL zawierającej 20 mL buforu płuczącego i umieść zlewkę w kąpieli lodowej na mieszalniku magnetycznym. Dodaj 0,5 mL roztworu trypsyny, stale mieszając przez 15 min. W połowie czasu inkubacji (po około 7,5 min) przenieś zawiesinę tkankową do luźno dopasowanego szklanego homogenizatora ręcznego o pojemności 0-15 mL.
Rycina 1: Komora (probówka) do rozdrabniania tkanek do użytku z rozdrabniaczem. Homogenizacja tkanki w probówce do rozdrabniania trwa około 10-12 s na próbkę tkanki. Homogenizacja tkanki jest zakończona, gdy homogenizowana tkanka przejdzie przez perforowany dysk do górnej komory. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
- Delikatnie homogenizować, wykonując 4-5 ruchów, aby rozproszyć zawiesinę bez wytwarzania piany. Przenieść homogenizat do zlewki o pojemności 50 mL i delikatnie mieszać na mieszadle magnetycznym przez 15 min w 4 °C.
- Po 15 min inkubacji dodać do zlewki z homogenizatem 10 mL buforu izolacyjnego zawierającego inhibitor trypsyny i inkubować przez 1 min w 4 °C podczas delikatnego mieszania.
- Ponownie przefiltrować zawiesinę przez filtr nylonowy i zebrać filtrat do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.
- Zebrać frakcję cząsteczkową pozostałą na filtrze nylonowym i umieścić ją w homogenizatorze szklanym. Dodać 15-20 mL buforu płuczącego i delikatnie homogenizować ręcznie przez 25-30 s.
UWAGA: Na tym etapie filtrat przepływa bardzo powoli. Aby zwiększyć szybkość przepływu filtratu, należy oprzeć końcówkę lejka o wewnętrzną ściankę probówki stożkowej. - Połączyć homogenizat z filtratem, zrównoważyć probówki i wirować przy 600 x g przez 15 min w 4 °C.
- Przenieść powstały nadosad do nowej probówki stożkowej, filtrując go przez filtr nylonowy, aby uniknąć zanieczyszczenia osadem. Ponownie wirować przy 8,500 x g przez 15 min w 4 °C.
UWAGA: Do usunięcia nadosadu należy użyć plastikowej pipety transferowej, odrzucając 0,2 mL nadosadu z górnej części puszystego osadu. - Odrzucić nadosad i wypłukać osad 2-3 razy 1 mL buforu izolacyjnego. Należy pamiętać o odrzucaniu puszystej, białej warstwy zewnętrznej krawędzi przy każdym płukaniu.
UWAGA: Osad należy płukać, dodając bufor izolacyjny za pomocą pipety z końcówką 1 mL lub nowej pipety transferowej. Bufor należy dodawać przy ściance probówki, a nie bezpośrednio na osad, aby zapobiec jego rozbiciu i zanieczyszczeniu nadosadu. Następnie odessać bufor pipetą transferową i powtórzyć ten proces jeszcze dwa razy. - Do każdej probówki dodać 5 mL buforu izolacyjnego i rozbić osad za pomocą pipety z końcówką 1 mL lub nowej pipety transferowej.
- Rozcieńczyć zawiesinę dodatkowymi 20 mL buforu izolacyjnego i ponownie wirować przy 8,500 x g przez 15 min w 4 °C.
- Odrzucić nadosad i resuspender osad w 5 mL buforu resuspendingowego. Następnie dodać kolejne 15 mL buforu (łącznie do 20 mL) i wirować przy 8,500 x g przez 15 min w 4 °C. Odrzucić nadosad. Powstały brązowy osad zawiera wypłukane, nienaruszone mitochondria.
- Resuspender wzbogacony w mitochondria osad w 250 µL buforu resuspendingowego z dodatkiem inhibitorów proteaz. Rozdzielić na aliquoty po 25 µL, szybko zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w zamrażarce głębokiej w -80 °C przez kilka lat.
UWAGA: Odłożyć 5 µL preparatu wzbogaconego w mitochondria do analizy białek. W przypadku badania BN-PAGE (Blue native-PAGE) resuspender osad w aliquotach zawierających 50 µg białka mitochondrialnego na probówkę. Wirować przy 8,500 x g przez 15 min w 4 °C. Ostrożnie odessać nadosad i przechowywać osad mitochondrialny (50 µg białka/aliquot) w zamrażarce głębokiej w -80 °C przez kilka lat.
3. Ocena kompleksu transportu elektronów (ETC) w mitochondriach
UWAGA: Poziomy poszczególnych białek mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów (ETC) (tj. kompleksu I, II, III, IV, V) można ocenić za pomocą standardowego testu immunoblottingu. Ze względu na różnorodność próbek (cztery punkty czasowe: 48 h, 3 miesiące, 6 miesięcy, 9 miesięcy), dwie warunki eksperymentalne (ćwiczenia i siedzący tryb życia) oraz liczbę przeciwciał do immunoprobowania (pięć przeciwciał), zaleca się zastosowanie immunoblottingu multipleksowego. Immunoblotting multipleksowy należy przeprowadzić w następujący sposób.
- Rozdziel 50 µg próbki białka wzbogaconego w mitochondria na studzienkę w żelu do elektroforezy poliakrylamidowej z gradientem 4%-20% (100 V, 90 min).
- Przenieś białka na membranę PVDF (75 V; 60 min).
- Blokuj membranę w roztworze buforu blokującego przez minimum 1 h w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Czas blokowania można wydłużyć do całej nocy w temperaturze 4 °C. Bufor blokujący (Tabela materiałów) zawiera składniki niemammalejne (np. białka rybie), które wykazują mniejsze prawdopodobieństwo specyficznych oddziaływań wiążących z przeciwciałami oraz innymi białkami ssaków obecnymi w typowych metodach. - Inkubuj membranę z koktajlem przeciwciał, w tym przeciwciałami przeciwko Kompleksowi I, II, III, IV i V, przez noc na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 4 °C.
- Następnego dnia przemyj membranę i inkubuj z wtórnym przeciwciałem znakowanym IR przez 2 h na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej (RT).
- Przemyj pięć razy 1x TBS-T (TBS z dodatkiem Tween 20) oraz raz 1x TBS (bufor solny z Tris).
UWAGA: Podczas ostatniego płukania nie dodawaj detergentu do buforu TBS. - Wykonaj obrazowanie blotu w analizatorze obrazu.
4. Ocena superkompleksów mitochondrialnych za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w warunkach natywnych (BN-PAGE)
UWAGA: Profil superkompleksów ETC można ocenić również stosując technikę BN-PAGE.
- Przygotować koktajl buforu do próbek w ilości 20 µL na 50 µg białka z osadu wzbogaconego w mitochondria (7 µL wody + 5 µL 4x buforu do nakładania próbek do natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym + 8 µL 5% digitoniny + 2 µL Coomassie G-250).
UWAGA: Przygotować zapas koktajlu buforu do próbek w zależności od liczby dostępnych próbek (50 µg białka/próbka). Dobrać odpowiednią ilość digitoniny w zależności od stężenia białka w osadzie wzbogaconym w mitochondria (Tabela 1)8. - Podgrzać zapas digitoniny w temperaturze 95 °C przez 3 min, wymieszać i schłodzić na lodzie przed przygotowaniem master mixu.
- Dodać dodatek do próbek Coomassie G-250 bezpośrednio przed nałożeniem próbek na żel.
- Dodać 20 µL koktajlu buforu do próbek do probówki zawierającej 50 µg osadu białka mitochondrialnego. Solubilizować/resuspender osad, delikatnie mieszając go pipetą, aby nie wytworzyła się piana.
- Inkubować mieszaninę na lodzie przez 20 min, aby uzyskać maksymalną solubilizację osadu wzbogaconego w mitochondria. Od czasu do czasu delikatnie potrząsać probówkami, aby usprawnić solubilizację.
- Podczas inkubacji przygotować bufor anodowy do natywnego PAGE/1x bufor do prowadzenia elektroforezy oraz ciemnoniebieski bufor katodowy.
- Odwirować zsolubilizowany osad wzbogacony w mitochondria przy 20,000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
- Po wirowaniu zebrać 15 µL supernatantu do nowych probówek umieszczonych na lodzie.
- Dodać odpowiednią ilość odczynnika 5% Coomassie G-250 do supernatantu otrzymanego w kroku 4.8 (patrz Tabela 1).
UWAGA: Objętość 5% Coomassie G-250 powinna być taka, aby końcowe stężenie barwnika stanowiło ¼ stężenia detergentu. Wykonać ten krok bezpośrednio przed nałożeniem próbek na żel.
| Białko | Digitonin/białko | 4x bufor do próbek | 5% dygitonina | Woda | Objętość końcowa | 5% Coomassie G-250 |
| stosunek (g/g) | dodatek do próbki | |||||
| 50 µg | 8 | 5 | 8 | 7 | 20 | 2 |
| 50 µg | 4 | 5 | 4 | 11 | 20 | 1 |
Tabela 1: Przygotowanie koktajlu buforu do próbek z dwoma różnymi stosunkami detergentu do białka. Aby uzyskać maksymalną solubilizację białek błonowych z zawiesiny mitochondrialnej, stężenie digitoniny w stosunku do białka w zawiesinie mitochondrialnej należy dostosować do zakresu 4-8 g digitoniny/g białka. W przypadku tkanki serca zastosowano 400 µg digitoniny na 50 µg białek z zawiesiny mitochondrialnej (tj. 8 g digitoniny/g białka mitochondrialnego), aby zmaksymalizować rozpuszczalność superkompleksów z zawiesiny mitochondriów.
- Odlać żel gradientowy 3%-8%, wyjąć grzebień i trzykrotnie wypłukać oczka żelu buforem do elektroforezy 1x.
UWAGA: Żel najlepiej polimeryzuje, jeśli zostanie odlany dzień wcześniej. - Przygotować system elektroforetyczny i umieścić żel w aparaturze.
- Wypełnić oczka z próbkami ciemnoniebieskim buforem katodowym.
- Nanieść 10 µL niebarwionego standardu białkowego jako natywny marker masy cząsteczkowej do pierwszego i ostatniego oczka żelu.
- Nanieść całą ilość supernatantu z próbki + dodatku Coomassie przygotowanego w kroku 4.9 powyżej do oczek, używając końcówki do nakładania próbek o płaskim przekroju.
- Ostrożnie wypełnić grodź buforową mini-komory około 60 mL ciemnoniebieskiego buforu katodowego, nie zakłócając próbek w oczkach, a następnie wypełnić zbiornik buforowy 1x buforem do natywnej elektroforezy PAGE.
- Włączyć zasilacz i prowadzić elektroforezę próbek przy 150 V przez około 30 min.
- Usunąć ciemnoniebieski bufor katodowy z grodzi buforowej (komory wewnętrznej) za pomocą pipety transferowej lub odessać zawartość oczek. Wypełnić komorę wewnętrzną 150-200 mL jasnoniebieskiego buforu katodowego i prowadzić elektroforezę przy 250 V przez 60 min.
UWAGA: Czas elektroforezy można określić, sprawdzając, kiedy front barwnika przemieści się na ok. 0,5 cm powyżej dna kasety żelowej. - Wyjąć żel z kasety i umieścić go w czystym plastikowym pojemniku. Płukać żel wysokiej jakości wodą destylowaną przez 15 min na wytrząsarce orbitalnej/kołysance.
UWAGA: Aby wyjąć żel gradientowy z kasety, należy trzymać kasetę za dół, który jest mocniejszy, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia. - Odlać wodę, zanurzyć żel w odpowiedniej ilości odczynnika barwiącego Coomassie GelCode Blue i inkubować przez 1 h na wytrząsarce orbitalnej/kołysance w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Przed użyciem wymieszać roztwór odczynnika barwiącego Blue (Tabela materiałów), delikatnie potrząsając butelką kilka razy. - Odlać roztwór barwnika, dodać wodę destylowaną, kilkukrotnie wypłukać wodą, a następnie umieścić na wytrząsarce orbitalnej/kołysance w celu odbarwienia.
UWAGA: Włożyć kawałek gąbki (~3 cm x 0,5 cm) do pojemnika do odbarwiania żelu i pozostawić żel do odbarwienia przez noc. Gąbka adsorbuje cząsteczki barwnika, eliminując konieczność wielokrotnej wymiany wody. - Przeanalizować żel w analizatorze obrazu.
5. Ocena superkompleksów mitochondrialnych za pomocą analizy immunoblottingu
- Przeprowadzić nową serię elektroforezy BN-PAGE bez barwienia żelu po zakończeniu elektroforezy.
- Postępować zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 3 (ocena mitochondrialnego kompleksu transportu elektronów (ETC)), aby przeprowadzić immunoblotting.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zgodnie z protokołem przygotowano wydajną mieszaninę białek wzbogaconą w mitochondria z tkanki serca. Z przeciętnie 1,2 g zamrożonej tkanki serca pobranej od potomstwa lochy uzyskano około 15 mg/mL mieszaniny białek wzbogaconej w mitochondria. Obserwacje wykazały, że masa zamrożonej tkanki serca mniejsza niż 0,5 g nie pozwala na uzyskanie ilości mieszaniny białek wzbogaconej w mitochondria wystarczającej do przeprowadzenia analizy BN-PAGE. Ilość preparatu mitochondrialnego była wystarczająca do wykonania (i) standardowej...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kluczowe kroki dla tego protokołu są wskazane tutaj. Po pierwsze, homogenizacja tkanek powinna być traktowana ostrożnie, aby podczas procesu homogenizacji tkanek nie wystąpiły nadmierne efekty przezroczystości. Należy użyć rozdrabniacza tkanek, który jest częścią technologii cyklicznych zmian ciśnienia (PCT) do wstępnej homogenizacji tkanek9. Ten krok zmniejszy nadmierny cykl udaru homogenizatora szkło na szkle (ryc. 1B), który może dodatkowo zniszczyć i tak już kruch...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była finansowana przez grant Uniwersytetu Kansas City dla Abdulbaki Agbasa i Letnie Stypendium Badawcze dla Daniela Barrery. Autorzy są wdzięczni za pracę redakcyjną dr. Jana Talleya.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas aminokapronowy | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Zestaw kompleksu Anti-Hu Total OxPhos | Invitrogen | 458199 | |
| przeciwciało anty-VDAC | abcam | ab15895 | zastosowanie 1 i mikro; g/ml |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonina | Cabiochem | 300410 | |
| Homogenizator tłuczka szklano-szklanego | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye sprzężony anty-Rabbit | Ab LICOR | LC0725 | |
| Wielodołkowy czytnik płytek | BioTek | Synergy HT | |
| Natywny marker masy cząsteczkowej | ThermoFisher | BN2001 | |
| Monofilament z siatki nylonowej | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Wytrząsarka orbitalna | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOK Bufor blokujący | ThermoScienctific | 37527 | |
| Niszczarka PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Wirówka stołowa | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsyna | Amresco | M150-1G | |
| Inhibitor trypsyny | Amresco | M191-1G | Wymaga świeżego przygotowania |
Bibliografia
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116(2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73(2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095(2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599(2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
