Artykuł metodologiczny

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

DOI:

10.3791/62809

⸱

16 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1AdventHelath, 2University of Illinois Chicago School of Public Health, 3Lincoln Memorial University, 4Children’s Mercy Hospital, 5Scripps Clinic, 6Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 7Kansas City University, 8Roblex Rex Veterans Affairs Medical Center, 9California State University San Marcos, 10East Carolina University, 11Massachusetts Institute of Technology, 12Boehringer Ingelheim Norway KS, 13Heartland Center for Mitochondrial Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie wzbogaconych o mitochondria próbek z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek stałych pozwoliło badaczom na przeprowadzenie zarówno funkcjonalnych, jak i analitycznych ocen mitochondriów w różnych eksperymentalnych modalnościach. Badanie to pokazuje, jak przygotować preparaty wzbogacone w mitochondria z zamrożonej tkanki serca i przeprowadzić ocenę analityczną mitochondriów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Profil mitochondrialnego kompleksu transferu elektronów (ETC) jest modyfikowany w tkance serca potomstwa urodzonego przez ćwiczoną lochę. Zaproponowana i przetestowana hipoteza była taka, że regularne ćwiczenia lochy przez matkę w czasie ciąży zwiększyłyby wydajność mitochondrialną bioenergetyki serca potomstwa. Hipoteza ta została przetestowana poprzez wyizolowanie mitochondriów przy użyciu procedury łagodnej izolacji w celu oceny mitochondrialnych ETC i profili superkompleksów. Opisana tu procedura pozwoliła na przetworzenie wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek serca i wyeliminowała konieczność świeżego przygotowania mitochondriów do oceny mitochondrialnych kompleksów ETC, superkompleksów i profili aktywności kompleksów ETC. Protokół ten opisuje optymalny pomiar kompleksu białkowego ETC w multipleksowanym immunoblottingu opartym na przeciwciałach i ocenie super złożonej przy użyciu elektroforezy w żelu natywnym dla koloru niebieskiego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu było dostarczenie szczegółowych kroków do uzyskania wzbogaconego o mitochondria preparatu z wcześniej zamrożonej tkanki serca z nową technologią niskoenergetycznego mechanicznego rozbijania tkanki, która poprawia lizę tkanek i ekstrakcję mitochondriów. Dzięki tej metodzie możliwa jest poprawa wydajności ekstrakcji bez generowania dużego naprężenia ścinającego lub wysokiej temperatury oraz krótki czas homogenizacji (10-12 s)1.

Uzyskanie mitochondriów z archiwalnej zamrożonej tkanki jest cennym atutem do przeprowadzenia zarówno badań funkcjonalnych2, jak i biochemicznych3 w przeciwnym razie nie jest łatwo powtórzyć w dokładnych warunkach eksperymentalnych. Klasyczny homogenizator ze szkła teflonowego Potter-Elvehjem lub homogenizator Dounce był i nadal jest używany w laboratoriach badawczych do homogenizacji tkanek miękkich, takich jak wątroba, nerki i mózg. Jednak homogenizacja twardych tkanek, takich jak mięśnie i serce, wymaga dłuższego czasu homogenizacji, leczenia enzymatycznego, szybkiej homogenizacji i dużego doświadczenia użytkownika. Jest to niekorzystne dla ekstrakcji nienaruszonych organelli, takich jak mitochondria, z tkanek twardych, takich jak mięśnie i serce. Metoda opisana w tym protokole służy do uzyskania wysokowydajnego preparatu wzbogaconego w mitochondria do analizy kompleksów białkowych mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów (ETC) i ich tworzenia nadkompleksów w tkankach serca pobranych od potomstwa urodzonego przez lochę uprawiającą wysiłek fizyczny i prowadzącą siedzący tryb życia, zamrożonego błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywanego w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Metoda ta pozwala na wyizolowanie preparatu wzbogaconego o mitochondria z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek.

Zewnętrzne narażenie ciężarnych gryzoni na nanomateriały może negatywnie wpływać na czynność serca i oddychanie mitochondrialne oraz bioenergetykę u potomstwa podczas ciąży4. Niemniej jednak, wywołane ćwiczeniami aerobowymi pozytywne zmiany w bioenergetyce miocytów płodu podczas ciąży nie zostały jeszcze udokumentowane. Jednak nowe badania dostarczają dowodów na to, że ćwiczenia aerobowe matki w czasie ciąży mają pozytywny wpływ na czynność serca płodu5. W celu uzyskania dalszych dowodów przeprowadzono analizę podłużnego wpływu ćwiczeń matki na sercowe kompleksy mitochondrialnego łańcucha oddechowego u potomstwa (tj. od kompleksu I do kompleksu V) w czasie ciąży.

To badanie ma istotne znaczenie dla zdrowia, ponieważ wyniki mogą sugerować, że ćwiczenia matki poprawiają efektywność produkcji energii w mitochondriach serca potomstwa. W tym badaniu lochy (samice świni) zostały wykorzystane jako model zwierzęcy z dwóch powodów: (i) fizjologia serca jest podobna do human6, oraz (ii) pobranie tkanki serca od potomstwa z różnych punktów czasowych jest możliwe pod instytucjonalnym zatwierdzeniem IACUC. Proponowane badanie ma na celu udzielenie odpowiedzi na wiele podstawowych pytań łączących ćwiczenia matki z ich potencjalnym pozytywnym wpływem na skład komórkowy i biochemiczny tkanki serca potomstwa. Podejście to wymaga delikatnych, ale skutecznych technik izolacji mitochondriów z wcześniej zamrożonej tkanki serca, uzyskanej z długich i kosztownych badań podłużnych, które dotyczyły kwestii zmian bioenergetycznych w miocytach serca płodu podczas ciąży. Metoda opisana w tym badaniu pozwala na wykorzystanie dużych sum wcześniej zamrożonej zarchiwizowanej tkanki do przygotowania wzbogaconego w mitochondria zarówno do badań analitycznych, jak i funkcjonalnych. Badanie pomoże również wypełnić lukę w wiedzy w tej dziedzinie, dostarczając wstępnych danych, które mogą doprowadzić do przyszłych badań określających wpływ ćwiczeń fizycznych matki na zdrowie serca w macicy i poza nią.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zamrożone tkanki serca potomstwa zostały otrzymane od Dr. Seana Newcomera wraz z listem zatwierdzającym instytucję IACUC. Tkanki serca uzyskano z długoterminowego badania podłużnego, zamrożono błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Wszystkie protokoły dotyczące przetwarzania tkanki serca potomstwa były zgodne z wytycznymi komitetów IBC i IACUC Uniwersytetu Kansas City.

1. Przygotowanie i odczynników

UWAGA: Przygotuj wszystkie próbki zgodnie z wytycznymi producenta. Używaj ultra oczyszczonej wody lub jej odpowiednika we wszystkich przepisach i krokach protokołu. Podczas tej procedury należy nosić środki ochrony osobistej (fartuchy laboratoryjne, maskę na twarz, rękawice i okulary/osłonę twarzy). Objętości buforowe są odpowiednie do przetwarzania sześciu próbek tkanek.

  1. Przygotować 1,5 l buforu do przemywania tkanek, łącząc 154,035 g sacharozy (0,3 M wersja ostateczna), 3,904 g HEPES (10 mM wersja ostateczna), 0,111 g EDTA (0,2 mM wersja ostateczna). Dodaj składniki do 1,0 l wody na talerzu mieszającym, dostosuj pH do 7,2 za pomocą rozcieńczonego HCl i uzupełnij do końcowej objętości do 1,5 l
    UWAGA: Na próbkę potrzeba około 200 ml buforu do przemywania (50-300 mg). W ciągu jednego dnia można przetworzyć sześć próbek tkanek. Użyj pozostałego buforu myjącego, aby utworzyć bufor izolacyjny.
  2. Przygotować bufor izolacyjny z buforu płuczącego opisanego wcześniej w kroku 1.1, dodając 210 mg BSA do 210 ml buforu do przemywania . Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą rozcieńczonego roztworu NaOH.
    UWAGA: Na próbkę tkanki potrzeba około 35 ml buforu izolacyjnego; w związku z tym na sześć próbek wymagane jest 210 ml buforu izolacyjnego. Przygotować ten bufor, dodając świeży roztwór BSA (1 mg/ml końcowy) w dniu przygotowania. BSA służy do izolowania mitochondriów, ponieważ poprawia właściwości mitochondriów poprzez usuwanie naturalnych rozprzęgaczy, takich jak wolne kwasy tłuszczowe. Stwierdzono, że BSA ma działanie przeciwutleniające poprzez zwiększenie szybkości utleniania substratów, zwłaszcza bursztynianu, w mitochondriach mózgu7. Alternatywnie, albuminę surowicy bydlęcej można zastąpić tańszymi bezkwasowymi analogami, takimi jak albumina jaja kurzego.
  3. Przygotować 150 ml buforu do rekompozycji, łącząc 0,011 g EDTA (końcowe stężenie 0,2 mM EDTA lub użyć 150 μl 200 mM podstawowego roztworu EDTA na 150 ml buforu do recytacji), 12,836 g sacharozy (0,25 M stężenie końcowe sacharozy) i 0,236 g Tris (10 mM Tris-HCl końcowy). Dostosować pH do 7,8 za pomocą 0,1 N NaOH. Dodać 60 μl koktajlu inhibitorów proteazy tuż przed użyciem.
  4. Przygotować roztwór trypsyny, rozpuszczając 7,5 mg trypsyny w 3,0 ml 1 mM HCl (2,5 mg trypsyny/ml końcowy). Ilość ta wystarcza na jedną próbkę.
    UWAGA: Przygotuj roztwór trypsyny w oparciu o liczbę próbek tkanek planowanych do przetworzenia.
  5. Przygotować roztwór inhibitora trypsyny z soi, łącząc 13,0 mg inhibitora trypsyny w 20 ml buforu izolacyjnego zawierającego BSA (0,65 mg/ml końcowego inhibitora trypsyny).
    UWAGA: Przygotuj świeży roztwór inhibitora trypsyny.
  6. Przygotować odczynnik nadsiarczanu amonu, dodając 0,1 g nadsiarczanu amonu do 1 ml wody (10% nadsiarczanu amonu ostatecznego).
    UWAGA: Odczynnik nadsiarczanu amonu powinien być albo świeżo przygotowany, albo można go porcjować w dużej objętości i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
  7. Przygotować roztwór kwasu aminokapronowego (ACA), łącząc 0,131 g kwasu 6-aminokapronowego w 1,0 ml ultraoczyszczonej wody i przechowywać w temperaturze 4 °C (1 M kwas 6-aminokapronowy końcowy).
  8. Przygotować roztwór barwnika Coomassie brilliant blue, rozpuszczając 1 g Coomassie G-250 w 0,5 ml wody i 0,5 ml 1 M kwasu aminokapronowego (10% końcowe stężenie roztworu barwnika).
  9. Przygotuj 5% digitoniny dla Blue Native-PAGE (BN-PAGE). Obliczyć w przybliżeniu, ile digitoniny jest potrzebne do przygotowania próbki, plus pewna dodatkowa objętość, aby skompensować błędy pipetowania (przeszacowanie o 10 mg). Dla 15 mg: Najpierw rozcieńczyć 15 mg digitoniny w 30 μl 100% DMSO. Wir, aby pomóc digitoninie dostać się do roztworu. Następnie dodać pozostałe 90% ddH2O (270 μL). Delikatnie podgrzej, aby wymieszać roztwór (wir), a następnie ostudź go na lodzie.
  10. Przygotuj natywny bufor anodowy PAGE. Dodaj 50 ml 20x natywnego buforu do pracy PAGE do 950 ml wody, aby uzyskać końcową objętość 1 l. Przygotuj świeży bufor anodowy do natychmiastowego użycia. Użyj tego jako 1x uruchomionego bufora.
  11. Przygotować ciemnoniebieski bufor katodowy. Rozpuścić 0,0160 g błękitu brylantowego Coomassie G-250 w 80 ml natywnego buforu anodowego PAGE; dobrze wymieszaj.
    UWAGA: Przygotuj świeży bufor katodowy do natychmiastowego użycia. Może być potrzebne tylko 60 ml, ale w przypadku jakichkolwiek wycieków należy dodać dodatkowe 20 ml.
  12. Przygotować jasnoniebieski bufor katody. Dodaj 20 ml ciemnoniebieskiego buforu katodowego do 180 ml natywnego buforu anodowego PAGE i dobrze wymieszaj.
    UWAGA: Ten bufor może być użyty tylko raz.
  13. Przygotuj 5% Coomassie G-250 jako dodatek do próbki. Rozcieńczyć 200 μl już przygotowanego 10% bulionu Coomassie (krok 1.8) 200 μl 1 M ACA i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  14. Przygotuj 4x natywny bufor próbki PAGE, łącząc 40% glicerolu, 0,04% Pąsa S, 25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 192 mM glicyny w 10 ml końcowej objętości. Podzielić je na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C w zamrażarce.

2. Izolacja mitochondriów z zamrożonej tkanki serca

UWAGA: Wykonaj procedurę izolacji mitochondriów w chłodni o temperaturze 4 °C. Jednak w przypadku niedostępności komory chłodniczej należy użyć do wykonania zabiegu dużej ilości kąpieli lodowej.

  1. Wyjąć wcześniej zamrożone próbki tkanki serca z zamrażarki w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: W ciągu jednego dnia można wygodnie przetworzyć maksymalnie cztery próbki tkanek w celu izolacji mitochondriów.
  2. Zważyć probówkę zawierającą próbkę tkanki serca i zanotować masę. Przygotować trzy zlewki (każda o pojemności 50 ml) zawierające 40 ml buforu do mycia. Schłodzić każdą zlewkę w kąpieli lodowo-solnej z równymi ilościami lodu i soli zmieszanymi przez 3-5 minut przed przejściem do następnego kroku. Umieść mieszadła magnetyczne w każdej zlewce i ustaw mieszadło na średnią prędkość.
    UWAGA: Nie zamrażaj zlewek nadmiernie i używaj ich natychmiast po tym, jak zaczną pojawiać się chmury kryształków lodu.
  3. Umieść zamrożoną tkankę serca bezpośrednio w lodowatym roztworze w pierwszej zlewce. Odczekaj około 5 minut, mieszając i lekko uciskając tkankę za pomocą pęsety, aby usunąć jak najwięcej krwi.
  4. Zważyć pustą probówkę i odjąć od pierwotnej masy (krok 2.2), aby uzyskać masę netto tkanki serca.
  5. Wyjmij tkankę kleszczami i ściśnij serce czystym ręcznikiem papierowym z bibuły filtracyjnej, aby usunąć krew. Następnie umieść tkankę w drugiej zlewce. Odczekaj około 5 minut, mieszając, aby usunąć nadmiar krwi.
  6. Delikatnie osusz chusteczkę na ręczniku papierowym. Usuń cały tłuszcz, zakrzepłą krew, małżowiny uszne i powięzi (białą tkankę). Następnie połącz tkankę komorową.
  7. Rozdrobnić próbki tkanek za pomocą niszczarki, wykonując czynności 2.7.1-2.7.9.
    1. Umieść tkankę serca (~50-300 mg) w komorze rozdrabniacza tkanek od strony suwaka.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Komora (tuba) rozdrabniacza tkanek do użytku z niszczarką. Homogenizacja tkanek w rurze rozdrabniacza wymaga około 10-12 s na próbkę tkanki. Homogenizacja tkanek jest zakończona, gdy homogenizowana tkanka przejdzie przez perforowany dysk do górnej komory. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Dodaj ~0,2-0,8 ml buforu do płukania po stronie nakrętki probówki.
    UWAGA: Upewnij się, że całkowita objętość próbki i buforu płuczącego łącznie podczas rozdrabniania nie przekracza 0,7-0,8 ml.
  2. Użyj narzędzia do rur, aby szczelnie przykryć komorę niszczarki nasadką niszczarki.
    UWAGA: Nie dokręcaj zbyt mocno korka niszczarki.
  3. Umieść komorę niszczarki w uchwycie niszczarki stroną z suwakiem do dołu. Suwak zazębi się ze złączką w uchwycie niszczarki.
  4. Włóż bit sterownika niszczarki; pozwól, aby bit zazębił się z nasadką niszczarki. Upewnij się, że końcówka jest dobrze zablokowana na swoim miejscu.
    UWAGA: Zawsze używaj w pełni naładowanego sterownika niszczarki.
  5. Ręcznie dociśnij w dół sterownik niszczarki i komorę niszczarki, aż wskaźnik ciśnienia na uchwycie niszczarki osiągnie ustawienie około 2 na uchwycie niszczarki.
    UWAGA: Ustawienie może być na wyższym poziomie, jeśli rozdrabnianie tkanki jest bardziej włókniste.
  6. Uruchom sterownik niszczarki na około 10-12 sekund, naciskając spust sterownika niszczarki, utrzymując ustawienie na 2.
  7. Spójrz na probówkę, aby sprawdzić, czy cała lub większość stałej masy tkanki jest rozdrabniana przez krążek do lizy i przekazywana do górnej komory komory rozdrabniacza, patrząc na rurkę.
    UWAGA: Może być konieczne rozdrabnianie próbki tkanki przez dłuższy czas. Po prostu włóż rurkę do uchwytu niszczarki i kontynuuj proces. Większość rodzajów próbek tkanek wymaga tylko 10-12 sekund rozdrabniania. Podczas gdy każde rozdrabnianie wytwarza pewną ilość ciepła z powodu tarcia, ten krótki czas przetwarzania nie podgrzeje znacząco próbki.
  8. Po rozdrobnieniu próbki wyjmij komorę rozdrabniacza z uchwytu. Użyj narzędzia do rurek, aby zdjąć nasadkę niszczarki i umieść ją na czystej powierzchni do późniejszego użycia.
    UWAGA: Nasadkę niszczarki należy uznać za zanieczyszczoną ekstraktem próbki i, w zależności od rodzaju próbki, może być zanieczyszczona materiałami zakaźnymi. Nie używaj tej samej nasadki niszczarki do innych próbek tkanek, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
  1. Przenieść rozdrobnioną tkankę serca do trzeciej zlewki z 40 ml buforu do przemywania i kostki mieszającej i mieszać tkankę przez 5 minut ze średnią prędkością, znajdując się na płytce mieszającej.
  2. Przefiltrować zawiesinę przez nylonową siatkę monofilamentową (wielkość porów 74 μm) i wyrzucić filtrat. Rozdrobnioną chusteczkę na filtrze przemyć 3x 10 ml buforu myjącego.
    UWAGA: Upewnij się, że monofilament z siatki nylonowej jest wstępnie zwilżony wodą.
  3. Umytą i rozdrobnioną tkankę przenieść do zlewki o pojemności 50 ml z 20 ml buforu do przemywania i umieścić zlewkę w łaźni lodowej na mieszadle magnetycznym. Dodaj 0,5 ml roztworu trypsyny, ciągle mieszając przez 15 minut. Mniej więcej w połowie inkubacji (po około 7,5 minuty) przenieść zawiesinę tkankową do luźno dopasowanego ręcznego homogenizatora szkło na szkle, który pomieści 0-15 ml objętości.

figure-protocol-2
Rysunek 1: Komora rozdrabniacza tkanek (tuba) do użytku z niszczarką. Homogenizacja tkanek w rurze rozdrabniacza wymaga około 10-12 s na próbkę tkanki. Homogenizacja tkanek jest zakończona, gdy homogenizowana tkanka przejdzie przez perforowany dysk do górnej komory. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Delikatnie homogenizować 4-5 pociągnięciami, aby rozproszyć zawiesinę bez wytwarzania piany. Umieścić homogenat w zlewce o pojemności 50 ml i delikatnie mieszać na płytce mieszającej przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Po 15 minutach inkubacji dodać 10 ml buforu izolacyjnego zawierającego inhibitor trypsyny do zlewki zawierającej homogenat i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając.
  3. Ponownie przefiltrować zawiesinę przez filtr nylonowy i zachować filtrat w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  4. Zbierz frakcję cząstek stałych pozostałą na nylonowym filtrze i umieść ją w homogenizatorze szkło po szkle. Dodać 15-20 ml buforu myjącego i delikatnie homogenizować ręcznie przez 25-30 s.
    UWAGA: Na tym etapie filtrat przepływa bardzo wolno. Aby zwiększyć przepływ filtratu, umieść końcówkę lejka tak, aby dotykała wnętrza stożkowej rurki.
  5. Połączyć homogenat z filtratem, zrównoważyć probówki i odwirować przy 600 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Przefiltrować powstały supernatant do nowej stożkowej rurki za pomocą nylonowego filtra, aby uniknąć zanieczyszczenia przez osad. Uruchomić wirówkę ponownie przy 8 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Użyj plastikowej pipety transferowej, aby usunąć supernatant i poświęć 0,2 ml supernatantu z wierzchu puszystej granulki.
  7. Odrzucić supernatant i przepłukać osad 2-3 razy 1 ml buforu izolacyjnego. Upewnij się, że za każdym razem wyrzucasz puszystą białą warstwę zewnętrznej krawędzi.
    UWAGA: Przemyć osad, dodając bufor izolacyjny za pomocą pipety z końcówką o pojemności 1 ml lub nowej pipety transferowej. Dodać bufor z boku probówki, a nie bezpośrednio nad osadem, aby zapobiec pękaniu osadu i zanieczyszczeniu supernatantu. Następnie odessać bufor za pomocą pipety transferowej i powtórzyć proces jeszcze dwa razy.
  8. Dodać 5 ml buforu izolacyjnego do każdej probówki i rozdrobnić osad za pomocą pipety z końcówką o pojemności 1 ml lub nowej pipety do przenoszenia.
  9. Rozcieńczyć zawiesinę 20 ml dodatkowego buforu izolacyjnego i ponownie uruchomić wirówkę przy 8 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml buforu do ponownego zawieszania. Następnie dodać 15 ml więcej buforu, co daje w sumie 20 ml i odwirować przy 8 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Powstały brązowy osad zawiera umyte nienaruszone mitochondria.
  11. Zawiesić osad wzbogacony w mitochondria w 250 μl buforu zawieszającego, w tym inhibitory proteazy. Podwielokrotność w 25 μl, szybkie zamrażanie w ciekłym azocie i przechowywanie w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez kilka lat.
    UWAGA: Zachowaj 5 μl preparatu wzbogaconego w mitochondria do testu analizy białek. W przypadku badania BN-PAGE (Blue native-PAGE) należy poddzielić zawieszony osad w 50 μg białka mitochondrialnego na probówkę. Wirować przy 8 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant i przechowywać osad mitochondrialny (50 μg białka/podwielokrotność) w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez kilka lat.

3. Ocena mitochondrialnego kompleksu transferu elektronów (ETC)

UWAGA: Poszczególne białka mitochondrialne ETC (tj. Complex-I, II, III, IV, V) mogą być oceniane za pomocą standardowego testu immunoblottingowego. Ze względu na różnorodność próbek (cztery punkty czasowe: 48 godzin, 3 miesiące, 6 miesięcy, 9 miesięcy), dwa warunki eksperymentalne (wysiłek fizyczny i siedzący tryb życia) oraz liczbę przeciwciał immunosondujących (pięć przeciwciał), zaleca się multipleksowane immunoblotting. Wykonaj multipleksowane immunoblotty w następujący sposób.

  1. Rozpuścić 50 μg próbki białka wzbogaconego w mitochondria / studzienkę w elektroforezie w żelu poliakrylamidowym o gradiacji 4%-20% (100 V, 90 min).
  2. Przenieść białka na membranę PVDF (75 V; 60 min)
  3. Zawiesić membranę w blokującym roztworze buforowym na co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Czas blokowania można wydłużyć do nocy w temperaturze 4 °C. Bufor blokujący (tabela materiałów) zawiera składniki niepochodzące od ssaków (tj. białka ryb), które z mniejszym prawdopodobieństwem będą miały specyficzne interakcje wiążące z przeciwciałami, a także z innymi białkami ssaków obecnymi w typowych metodach.
  4. Zbadać błonę koktajlem przeciwciał zawierającym przeciwciała anty-Complex-I, II, III, IV, V i inkubować przez noc na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 4 °C.
  5. Następnego dnia umyj membranę i sondę przeciwciałem wtórnym znakowanym IR przez 2 godziny na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze RT (temperatura pokojowa).
  6. Przemyć pięć razy 1x TBS-T (TBS zawierający Tween 20) i raz 1x TBS (buforowana sól fizjologiczna Tris).
    UWAGA: Do ostatniego prania nie dodawaj detergentu do bufora TBS.
  7. Zobrazuj plamę w analizatorze obrazów.

4. Ocena superkompleksu mitochondriów za pomocą elektroforezy w żelu z poliakryloamidu Blue Native (BN-PAGE)

UWAGA: Superzłożony profil ETC może być również oceniony za pomocą techniki BN-PAGE.

  1. Przygotuj koktajl buforowy próbki na 20 μl na 50 μg białka granulek wzbogaconego w mitochondria (7 μl wody + 5 μl 4x natywny bufor do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym + 8 μl 5% digitoniny + 2 μl Coomassie G-250).
    UWAGA: Przygotuj koktajl buforowy próbki podstawowej w zależności od liczby dostępnych próbek (50 μg białka/próbkę). Wybierz odpowiednie ilości digitoniny w oparciu o stężenie białka w osadzie wzbogaconym w mitochondria (Tabela 1)8.
  2. Podgrzej bulion digitoniny w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, wymieszaj i ostudź na lodzie przed przygotowaniem mieszanki wzorcowej.
  3. Dodaj dodatek do próbki Coomassie G-250 tuż przed załadowaniem próbek do żelu.
  4. Dodać 20 μl koktajlu buforowego próbki do probówki zawierającej 50 μg mitochondrialnych osadów białkowych. Solubilizować/ponownie zawiesić osad poprzez delikatne mieszanie osadu pipetą bez wytwarzania piany.
  5. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 20 minut, aby osiągnąć maksymalną rozpuszczalność osadu wzbogaconego w mitochondria. Od czasu do czasu delikatnie przesuwaj rurki, aby zwiększyć rozpuszczalność.
  6. Czekając na inkubację, przygotuj natywny bufor anodowy PAGE/1x bufor uruchomiony oraz bufor katodowy w kolorze ciemnoniebieskim.
  7. Odwirować rozpuszczony osad wzbogacony w mitochondria w temperaturze 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Po odwirowaniu zebrać 15 μl supernatantu do nowych probówek umieszczonych na lodzie.
  9. Dodać odpowiednią ilość 5% odczynnika Coomassie G-250 do supernatantu otrzymanego w kroku 4.8 (patrz Tabela 1).
    UWAGA: 5% objętość Coomassie G-250 powinna być taka, aby końcowe stężenie barwnika wynosiło 1/4 stężenia detergentu. Wykonaj ten krok tuż przed załadowaniem próbek do żelu.
białkoDigitonina/białko4x Bufor do próbek5% digitoninyWodaOstatni tom5% Coomassie G-250
Stosunek (g/g)Przykładowy dodatek
50 μg858720cyfra arabska
50 μg45411201

Tabela 1: Przygotowanie koktajlu buforowego próbki z dwoma różnymi proporcjami detergentu/białka. Aby osiągnąć maksymalną rozpuszczalność białek błonowych z zawiesiny mitochondrialnej, stężenie digitoniny/białka zawiesiny mitochondrialnej należy dostosować do 4-8 g digitoniny/g białka. W tkance serca zastosowano 400 μg digitoniny na 50 μg mitochondrialnych białek zawiesinowych (tj. 8 g digitoniny/g białka mitochondriów) w celu maksymalizacji rozpuszczalności superkompleksów z zawiesiny mitochondriów.

  1. Wlej żel gradientowy 3%-8%, wyjmij grzebień i trzykrotnie zmyj dołki żelu 1x buforem do biegania.
    UWAGA: Żel najlepiej polimeryzuje, jeśli zostanie wylany dzień wcześniej.
  2. Ustaw system elektroforezy i umieść żel w aparacie.
  3. Wypełnić studzienki na próbkę ciemnoniebieskim buforem katodowym.
  4. Załadować 10 μl niebarwionego wzorca białka jako natywny marker masy cząsteczkowej do pierwszego i ostatniego dołka żelu.
  5. Załadować całą ilość supernatantu do próbki + dodatku do próbki Coomassie przygotowanego w kroku 4.9 powyżej do studzienek za pomocą płaskiej końcówki do ładowania żelem.
  6. Ostrożnie napełnij zaporę buforową mini ogniw około 60 ml ciemnoniebieskiego buforu katodowego, nie naruszając próbek w studzienkach, a następnie napełnij zbiornik buforowy natywnym buforem działającym PAGE 1x.
  7. Włączyć zasilanie i elektroforezować próbki pod napięciem 150 V przez około 30 minut.
  8. Usunąć bufor katodowy koloru ciemnoniebieskiego z zapory buforowej (komory wewnętrznej) za pomocą pipety transferowej lub zassać studzienki na próbkę. Napełnij komorę wewnętrzną 150-200 ml jasnoniebieskiego buforu katodowego i uruchom elektroforezę pod napięciem 250 V przez 60 min.
    UWAGA: Czas elektroforezy można określić, sprawdzając, kiedy czoło barwnika migruje zaledwie 0,5 cm nad dnem kasety żelowej.
  9. Wyjmij żel z kasety i umieść go w czystym plastikowym pojemniku. Umyj żel dobrej jakości wodą destylowaną przez 15 minut na bujaku/wytrząsarce orbitalnej.
    UWAGA: Aby usunąć żel gradientowy z kasety, należy obchodzić kasetę od dołu, która jest mocniejsza, aby zminimalizować ryzyko pęknięcia.
  10. Odlewać wodę, zanurzać żel w odpowiedniej ilości odczynnika do barwienia Coomassie GelCode Blue i inkubować przez 1 godzinę na orbicie/bujaku w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Przed użyciem wymieszaj roztwór odczynnika do niebieskiej plamy (tabela materiałów), delikatnie obracając butelkę kilka razy.
  11. Zdekantować roztwór barwnika, dodać wodę destylowaną, kilkakrotnie spłukać wodą, a następnie założyć orbital/wahacz w celu odbarwienia.
    UWAGA: Włóż kawałek gąbki (~3 cm x 0,5 cm) do pojemnika na odbarwianie żelu i pozostaw żel do odbarwienia na noc. Gąbka adsorbuje cząsteczki barwnika bez konieczności wielokrotnych podmian wody.
  12. Przeanalizuj żel w analizatorze obrazu.

5. Ocena superkompleksu mitochondriów za pomocą analizy immunoblot blot

  1. Wykonać nowy zestaw BN-PAGE bez barwienia żelu pod koniec elektroforezy.
  2. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co w sekcji 3 (ocena mitochondrialnego kompleksu transferu elektronów (ETC)), aby zakończyć immunoblotting.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem, przygotowano dobry plon mieszanki białek wzbogaconych w mitochondria z tkanki serca. Około 15 mg/ml mieszanki białek wzbogaconych w mitochondria uzyskano ze średnio 1,2 g zamrożonej tkanki serca pobranej od potomstwa lochy. Obserwacje wykazały, że mniej niż 0,5 g zamrożonej tkanki serca nie dało wystarczającej ilości mieszanki białek wzbogaconych w mitochondria do przeprowadzenia testu BN-PAGE. Ilość preparatu mitochondrialnego była wystarczająca do przeprowadzenia (i) standardowej analizy immunoblo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe kroki dla tego protokołu są wskazane tutaj. Po pierwsze, homogenizacja tkanek powinna być traktowana ostrożnie, aby podczas procesu homogenizacji tkanek nie wystąpiły nadmierne efekty przezroczystości. Należy użyć rozdrabniacza tkanek, który jest częścią technologii cyklicznych zmian ciśnienia (PCT) do wstępnej homogenizacji tkanek9. Ten krok zmniejszy nadmierny cykl udaru homogenizatora szkło na szkle (ryc. 1B), który może dodatkowo zniszczyć i tak już kruch...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była finansowana przez grant Uniwersytetu Kansas City dla Abdulbaki Agbasa i Letnie Stypendium Badawcze dla Daniela Barrery. Autorzy są wdzięczni za pracę redakcyjną dr. Jana Talleya.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas aminokapronowySigma/AldrichA2504-100G
Zestaw kompleksu Anti-Hu Total OxPhosInvitrogen458199
przeciwciało anty-VDACabcamab15895zastosowanie 1 i mikro; g/ml
Coomassie G-250ThermoSientific20279
Coomassie GelCode BlueThermoScientific24592
DigitoninaCabiochem300410
Homogenizator tłuczka szklano-szklanegoVWRKT885451-0020
Image StudioLICOR
IR-Dye sprzężony anty-RabbitAb LICORLC0725
Wielodołkowy czytnik płytekBioTekSynergy HT
Natywny marker masy cząsteczkowejThermoFisherBN2001
Monofilament z siatki nylonowejSmall Part IncCMN-74
Wytrząsarka orbitalnaThermoScientfic
PCT ShredderPressure Bioscience Inc
SEA BLOK Bufor blokującyThermoScienctific37527
Niszczarka PULSE TubePressure Bioscience IncFT500-PS
Wirówka stołowaEppendorf5418
TrypsynaAmrescoM150-1G
Inhibitor trypsynyAmrescoM191-1GWymaga świeżego przygotowania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
  2. Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116(2020).
  3. Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73(2019).
  4. Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
  5. May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095(2020).
  6. Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
  7. Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
  8. Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
  9. Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
  10. McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599(2020).
  11. Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
  12. Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mitochondrial Electron TransferCardiac Tissue MitochondriaFrozen Tissue MitochondriaMitochondrial BioenergeticsMaternal Exercise ModelBlue Native ElectrophoresisMultiplexed ImmunoblottingSupercomplex AssessmentComplex I II ActivityMitochondria Isolation

Powiązane artykuły