Przejściowe oparzenie (65 °C ± 0,5 °C, 3 s) jednej tylnej łapy zmniejsza próg (g) stymulacji filamentem von Freya po stronie ipsilateralnej i zmienia wzorzec chodu. Poza tym oparzenia wywołują zachowanie podobne do depresji w teście wymuszonego pływania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ból wywołany oparzeniami i zachowanie podobne do depresji u myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Oparzenia wodą są najczęstszą przyczyną oparzeń zarówno u osób starszych, jak i młodych. Jest to jedno z głównych wyzwań klinicznych ze względu na wysoką śmiertelność i następstwa w krajach o niskich i średnich dochodach. Oparzenia często wywołują intensywny ból samoistny i uporczywą allodynię, a także problem zagrażający życiu. Co ważniejsze, nadmiernemu bólowi często towarzyszy depresja, która może znacznie obniżyć jakość życia. Ten artykuł pokazuje, jak opracować model zwierzęcy do badania bólu wywołanego oparzeniami i zachowań podobnych do depresji. Po znieczuleniu oparzenia wywołano zanurzeniem jednej tylnej łapy myszy w gorącej wodzie (65 °C ± 0,5 °C) na 3 s. Test von Freya i automatyczna analiza chodu były wykonywane co 2 dni po oparzeniu. Ponadto badano zachowania podobne do depresji za pomocą testu wymuszonego pływania, a test rota-prętowy przeprowadzono w celu zróżnicowania nieprawidłowych funkcji motorycznych po oparzeniu. Głównym celem tego badania jest opisanie rozwoju modelu zwierzęcego do badania bólu wywołanego oparzeniami i zachowań podobnych do depresji u myszy.
Wprowadzenie
Uszkodzenia tkanek, takie jak oparzenia i urazy, są zazwyczaj związane ze współwystępowaniem ostrego bólu. Szacuje się, że 1 80 000 zgonów rocznie spowodowanych jest oparzeniami - zdecydowana większość występuje w krajach o niskich i średnich dochodach z różnych rodzajów oparzeń1. Według ogólnoświatowego raportu, oparzenia są powszechne u dzieci i stanowią około 40%-60% hospitalizowanych pacjentów2,3. Te konkretne urazy są jeszcze poważniejsze, ponieważ mogą wystąpić w życiu codziennym, takim jak wrząca woda lub kąpiel w wodzie4,5. Chociaż w większości przypadków ostry ból może ustąpić samoistnie po wyzdrowieniu z uszkodzenia tkanki, możliwe jest, że stanie się przewlekły z powodu nieprawidłowych zmian w układzie nerwowym6,7.
Ostatnio zasugerowano, że ostry ból może wywołać depresyjny nastrój, a przewlekły ból może powodować niepokój i depresję8,9,10,11. Współistnienie bólu i depresji utrudnia leczenie pacjenta. Depresja ma również tendencję do zwiększania wrażliwości na ból, co prawdopodobnie wywoła bardziej intensywną depresję i ból12. Powikłania bólu i depresji są pokazane w zwierzęcych modelach zapalenia obwodowego13,14,15,16. Szczegółowe mechanizmy leżące u podstaw depresji wywołanej bólem nie są do tej pory dobrze znane17. Dlatego konieczne jest opracowanie skuteczniejszych metod leczenia oparzeń w celu złagodzenia skutków ubocznych i objawów.
Tak więc, niniejsze badanie miało na celu opracowanie modelu zwierzęcego do badania ostrego bólu wywołanego oparzeniami i zachowań podobnych do depresji u myszy. W tym celu zmierzono nieprawidłową wrażliwość dotykową związaną z oparzeniami, zmieniony wzorzec chodu i zachowanie podobne do depresji. Ponadto w niniejszym badaniu podjęto próbę walidacji modelu przy użyciu NLPZ.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Narodowym Uniwersytecie Chungnam w Korei Południowej, a następnie przeprowadzone zgodnie z etycznymi wytycznymi Międzynarodowego Stowarzyszenia Badań nad Bólem18.
1. Wywołanie oparzenia na tylnej łapie
- Samce myszy ICR o wadze 20-25 g należy trzymać w jasnym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (12/12 h cykl jasny-ciemny, 22,5 °C ± 2,5 °C) o wilgotności 40%-60%.
UWAGA: W tym protokole można używać zarówno samców, jak i samic myszy. - Pozwól zwierzęciu na swobodny dostęp do pożywienia i wody oraz aklimatyzuj się przez co najmniej 1 tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu.
UWAGA: Wszystkie zwierzęta były trzymane w grupach, aby wykluczyć zmienne, takie jak stres izolacyjny. - Przypisz myszy losowo do grupy eksperymentalnej lub kontrolnej i przeprowadź ślepe eksperymenty, używając numerów zwierząt jako kodów.
- W dniu indukcji oparzenia znieczulić mysz przez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie 300 μl alfaxalone w dawce 100 mg/kg. Podczas wykonywania indukcji oparzeń należy nosić fartuch chirurgiczny, rękawiczki i maskę.
- Po głębokim znieczuleniu myszy zdezynfekuj okolice prawej tylnej łapy 70% etanolem.
UWAGA: Sprawdź brak reakcji na stymulację szczypania zastosowaną na tylnych palcach u nóg lub ogona, aby potwierdzić stan głębokiego znieczulenia. - Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki po indukcji znieczulenia.
- Zanurz prawą tylną łapę głęboko znieczulonej myszy w gorącej wodzie o temperaturze 65 °C ± 0,5 °C na 3 s. Zrób znak na kostce każdej myszy przed zanurzeniem tylnej łapy w gorącej wodzie, aby zachować spójność w oparzonym obszarze.
- Po wywołaniu oparzeń umieść myszy w czystej klatce domowej i umieść je na poduszce grzewczej, aż zwierzęta wyzdrowieją ze znieczulenia.
UWAGA: Środek przeciwbólowy, paracetamol (200 mg / kg), podawano dootrzewnowo raz dziennie przez 7 dni, począwszy od dnia oparzenia (grupa Tylko oparzenie + paracetamol). Grupa Burn była traktowana solą fizjologiczną jako kontrolą pojazdu. Eksperyment został przeprowadzony zgodnie z metodą opisaną w poprzednim badaniu4.
2. Pomiar mechanicznej allodynii
- Przyprowadź myszy do pokoju testów behawioralnych i pozwól im się zaaklimatyzować co najmniej przez 30 minut przed testem. Podczas wykonywania testu należy nosić fartuch chirurgiczny, rękawiczki i maskę.
- Umieść myszy w kwadratowym pudełku (średnica: 13 cm, wysokość: 12 cm) na podłodze z metalowej siatki (rozmiar oczek: 0,7 cm x 0,7 cm) i pozwól im się zaaklimatyzować przez co najmniej 30 minut.
- Oceń próg mechaniczny tylnej łapy za pomocą metody bodźca wstępującego19,20.
- Delikatnie nakłuwaj serię włókien von Freya w odstępach 5-8 sekund, aby stymulować tylną podeszwę. Uzyskaj wartości wyjściowe w dniu poprzedzającym indukcję spalania.
UWAGA: W teście użyto włókien von Freya o wadze 0,16-1,2 g do pomiaru progu wycofania łapy odpowiednio u wszystkich zwierząt. Test reakcji na wycofanie łapy rozpoczęto przy najmniejszej sile zginania filamentu von Freya (0,16 g w tym protokole). Jeśli nie było odpowiedzi, przykładane było włókno o następnej sile zginającej. - Wykonaj pięć prób, aby ocenić progi mechaniczne dla każdej ipsilateralnej (zranionej) tylnej łapy.
UWAGA: Siła zginania włókna von Freya, która wywołuje odpowiedź więcej niż trzy razy w porównaniu z pięcioma próbami u każdego zwierzęcia, została wyrażona jako próg wycofania łapy (PWT, g). Progi mechaniczne mierzono dzień przed i po 1, 3, 5 i 7 dniach od oparzenia. Działanie przeciwbólowe oceniano 1 godzinę po podaniu paracetamolu zwierzęciu.
3. Automatyczna analiza chodu
- Aklimatyzuj myszy w systemie analizy chodu raz dziennie przez 10-15 minut od 5 dni przed oparzeniem. Podczas wykonywania analizy chodu należy nosić fartuch chirurgiczny, rękawiczki i maskę.
- W dniu testu przynieś myszy do pokoju testów behawioralnych i aklimatyzuj je przez co najmniej 30 minut przed testem.
UWAGA: Wykonuj testy aklimatyzacji i analizy chodu w ciemnym otoczeniu. Ustaw warunki menu programu w następujący sposób.- Po uruchomieniu programu kliknij menu Utwórz nowy eksperyment, aby wyznaczyć folder do zapisania danych.
- Po oznaczeniu ustaw maksymalny czas pracy na 5 s, a maksymalne dopuszczalne zmiany prędkości na 50%.
- Wybierz zarejestrowaną kamerę i ustaw długość chodnika na 30 cm w zakładce Setup (Konfiguracja) programu.
- Na karcie Acquire (Pobieranie) w menu programu wybierz pozycję Open Acquisition (Otwórz pobieranie).
- Na podstawie komunikatów o stanie kliknij przycisk Snap Background, aby uzyskać obraz tła pustego chodnika.
- Kliknij przycisk Rozpocznij akwizycję, a następnie umieść kursor myszy na wejściu do chodnika, po którym można przejść w lewo i w prawo. Nagrywanie rozpocznie się automatycznie po swobodnym ruchu myszy.
UWAGA: Jeśli chód zwierzęcia został pomyślnie zarejestrowany i wykryto wszystkie kroki, zostanie on oznaczony zieloną ikoną jako Bieg zgodny z przepisami. Jeśli oprogramowanie nie wykryje żadnych kroków, wyświetlana jest czerwona ikona, w takim przypadku zaleca się ponowne wykonanie nagrania. Autorzy zalecają zebranie i przeanalizowanie co najmniej pięciu udanych zgodnych przebiegów wykonanych z podobnymi prędkościami biegu. - Na karcie Pobieranie w menu programu wybierz pozycję Klasyfikuj przebiegi.
UWAGA: Po wybraniu danych uzyskanych z powyższego pomyślnego przebiegu zgodności, przejdź do ekranu analizy wideo, na którym zarejestrowano wzorce chodu myszy. - Wybierz przebieg do analizy i kliknij przycisk Automatyczne klasyfikowanie.
- Po wykonaniu automatycznej klasyfikacji usuń nos, rozpoznawanie narządów płciowych i błędne rozpoznawanie łap w celu usunięcia danych śmieciowych w każdym przebiegu, a następnie przeanalizuj dane.
UWAGA: Wszystkie parametry statystyczne są automatycznie analizowane i zapisywane w programie, a wartości surowych danych można znaleźć w menu analizy eksperymentatora. Automatyczną analizę chodu przeprowadzono przed i po 1, 3, 5 i 7 dniach od oparzenia. Ocenę przeprowadzono 30 minut po podaniu paracetamolu w grupie Burn + Acetaminophen i 30 minut po leczeniu solą fizjologiczną w grupie Burn. Eksperyment ten został przeprowadzony zgodnie z metodą opisaną w poprzednich badaniach4,21,22.
4. Pomiar zachowania podobnego do depresji
UWAGA: Zachowanie oparte na rozpaczy, czas bezruchu w wodzie został zmierzony za pomocą testu wymuszonego pływania.
- Przyprowadź myszy do pokoju testów behawioralnych i aklimatyzuj je przez co najmniej 30 minut przed testem. Podczas wykonywania testu wymuszonego pływania noś fartuch chirurgiczny, rękawiczki i maskę.
- Włóż mysz do przezroczystego cylindra z pleksi (10 cm x 25 cm) zawierającego 15 cm wody (25 °C ± 0,5 °C) na 15 minut.
- Po 24 godzinach włóż mysz do cylindra o tych samych warunkach i zmierz czas bezruchu.
UWAGA: Czas bezruchu mierzono dla 5 minut czasu testu, a także rejestrowano czas, w którym myszy przestały się wspinać lub pływać i po prostu unosiły się, aby utrzymać głowę nad powierzchnią wody. Test wymuszonego pływania został przeprowadzony w 7 dniu po oparzeniu. Ocenę przeprowadzono 1 godzinę po podaniu paracetamolu w grupie Burn + Acetaminophen i 1 godzinę po leczeniu solą fizjologiczną w grupie Burn. Eksperyment został przeprowadzony zgodnie z metodą opisaną w poprzednich badaniach23,24.
5. Pomiar normalnej funkcji motorycznej
UWAGA: Test prętów rotacyjnych został przeprowadzony w celu zróżnicowania nieprawidłowych funkcji motorycznych po oparzeniu.
- Przyprowadź myszy do pokoju testów behawioralnych i aklimatyzuj je przez co najmniej 30 minut przed testem. Podczas wykonywania testu wymuszonego pływania noś fartuch chirurgiczny, rękawiczki i maskę.
- Umieść zwierzęta na toczącej się cylindrycznej platformie (5,7 cm szerokości; 3 cm średnicy) zawieszonej 16 cm nad dnem aparatu.
- Pozwól każdemu zwierzęciu trenować raz dziennie na rożnicy przez co najmniej 5 dni przed wywołaniem oparzeń.
- Próbę rota-prętową należy wykonywać co 20 minut przez 2 godziny po podaniu leku. Ustaw czas odcięcia na 2 minuty.
- Zmierz czas, w którym mysz porusza się na obracającym się pręcie ze stałą prędkością 15 obrotów na minutę bez upadku.
UWAGA: Test pręta obrotowego przeprowadzono 7 dni po indukcji oparzenia. Ocenę przeprowadzono bezpośrednio po podaniu paracetamolu w grupie Burn + Acetaminophen oraz po leczeniu solą fizjologiczną w grupie Burn. Alfaxalone został użyty jako kontrola pozytywna dla eksperymentalnie leczonych leków w tym teście. Podczas testu Rotarod mierzony jest czas, w którym mysz porusza się po obracającym się pręcie bez upadku. Eksperyment został przeprowadzony zgodnie z metodą opisaną w poprzednich badaniach22,25.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zminimalizować cierpienie zwierząt i ograniczyć liczbę wykorzystanych osobników zgodnie z wytycznymi Three Rs (Replacement, Reduction, and Refinement), badanie to zostało zaprojektowane z wykorzystaniem minimalnej liczby zwierząt niezbędnej do zebrania istotnych danych, ustalonej w eksperymentach wstępnych. W badaniu tym eksperymenty behawioralne przeprowadzono niezależnie dwukrotnie w następujący sposób. Analizę chodu, mechaniczną allodynię oraz testy zachowań depresyjnych przeprowadzono w grupach: Kontrolnej (n = 5...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Oparzenie jest rodzajem oparzenia termicznego, które jest spowodowane przez podgrzane płyny. Sugeruje się, że w większości przypadków dochodzi do oparzeń pierwszego lub drugiego stopnia, ale długotrwały kontakt ze źródłami ciepła może powodować oparzenia trzeciego stopnia26. W niniejszym badaniu oparzenia wywołano poprzez wystawienie prawej tylnej łapy myszy na działanie gorącej wody o temperaturze 65 °C przez 3 s 4,26. Uszkodzenie tkanki ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Chungnam National University i grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (NRF-2019R1A6A3A01093963 i NRF-2021R1F1A1062509).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Strzykawka 1 ml | BD | 307809 | |
| Probówka 1,5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 ml probówka | SPL | 50050 | |
| Paracetamol BioXtra, ≥ 99,0% | Sigma-Aldrich | A7085-100G | Ten środek przeciwbólowy jest stosowany jako kontrola pozytywna. |
| Alfaxan wielodawkowy (Alfaxalone) | JUROX Pty.Limited | W tym eksperymencie materiał ten został wykorzystany do znieczulenia zwierząt i został wykorzystany jako kontrola pozytywna dla eksperymentalnie leczonych leków w teście rota-pręcikowym. | |
| Zautomatyzowany system analizy chodu CatWalk | Noldus | CatWalk XT | Analiza chodu u swobodnie chodzących gryzoni służy do badania zmian w ruchu kończyn i ustawieniu w modelach z dysfunkcją czuciowo-motoryczną |
| OPTISHIELD (maść okulistyczna Cyclosporin) | Ashish Life Science | Materiał ten został użyty do wykonania maści zapobiegającej wysuszeniu rogówki po indukcji znieczulenia. | |
| Cylinder z pleksi | SCITECH KOREA | produkty na zamówienie | Używany w teście wymuszonego pływania |
| System prętów rotacyjnych | SCITECH KOREA | Przyspieszający pręt rotacyjny | Używany do pomiaru normalnej funkcji motorycznej |
| Włókna von Freya | Coast Medical | NC12775 | Używany do pomiaru mechanicznej kąpieli wodnej Allodynia |
| CHANGSHIN SCIENCE | C-WBE | Stosowany w indukcji oparzeń |
Bibliografia
- Peck, M. D. Epidemiology of burns throughout the World. Part II: intentional burns in adults. Burns. 38 (5), 630-637 (2012).
- Tracy, L. M., Cleland, H. Pain assessment following burn injury in Australia and New Zealand: Variation in practice and its association on in-hospital outcomes. Australasian Emergency Care. 24 (1), 73-79 (2021).
- Montgomery, R. K. Pain management in burn injury. Critical Care Nursing Clinics of North America. 16 (1), 39-49 (2004).
- Kang, D. W., Choi, J. G. Bee venom reduces burn-induced pain via the suppression of peripheral and central substance P expression in mice. Journal of Veterinary Science. 22 (1), 9(2021).
- Abdi, S., Zhou, Y. Management of pain after burn injury. Current Opinion in Anaesthesiology. 15 (5), 563-567 (2002).
- Ullrich, P. M., Askay, S. W. Pain, depression, and physical functioning following burn injury. Rehabilitation Psychology. 54 (2), 211-216 (2009).
- Patwa, S., Benson, C. A. Spinal cord motor neuron plasticity accompanies second-degree burn injury and chronic pain. Physiological Reports. 7 (23), 14288(2019).
- Michaelides, A., Zis, P. Depression, anxiety and acute pain: links and management challenges. Postgraduate Medicine. 131 (7), 438-444 (2019).
- Doan, L., Manders, T., Wang, J. Neuroplasticity underlying the comorbidity of pain and depression. Neural Plasticity. 2015, 504691(2015).
- Vachon-Presseau, E., Centeno, M. V. The emotional brain as a predictor and amplifier of chronic pain. Journal of Dental Research. 95 (6), 605-612 (2016).
- Apkarian, A. V., Baliki, M. N. Predicting transition to chronic pain. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 360-367 (2013).
- Yin, W., Mei, L. A Central amygdala-ventrolateral periaqueductal gray matter pathway for pain in a mouse model of depression-like behavior. Anesthesiology. 132 (5), 1175-1196 (2020).
- Deng, Y. T., Zhao, M. G., Xu, T. J. Gentiopicroside abrogates lipopolysaccharide-induced depressive-like behavior in mice through tryptophan-degrading pathway. Metabolic Brain Disease. 33 (5), 1413-1420 (2018).
- Zhang, G. F., Wang, J. Acute single dose of ketamine relieves mechanical allodynia and consequent depression-like behaviors in a rat model. Neuroscience Letters. 631, 7-12 (2016).
- Edwards, R. R., Smith, M. T. Symptoms of depression and anxiety as unique predictors of pain-related outcomes following burn injury. Annals of Behavioral Medicine. 34 (3), 313-322 (2007).
- Pincus, T., Vlaeyen, J. W. Cognitive-behavioral therapy and psychosocial factors in low back pain: directions for the future. Spine. 27 (5), 133-138 (2002).
- Laumet, G., Edralin, J. D. CD3(+) T cells are critical for the resolution of comorbid inflammatory pain and depression-like behavior. Neurobiology of Pain. 7, 100043(2020).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284(2017).
- Scholz, J., Broom, D. C. Blocking caspase activity prevents transsynaptic neuronal apoptosis and the loss of inhibition in lamina II of the dorsal horn after peripheral nerve injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (32), 7317-7323 (2005).
- Kang, D. W., Choi, J. G. Automated gait analysis in mice with chronic constriction injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56402(2017).
- Kang, D. W., Moon, J. Y. Antinociceptive profile of levo-tetrahydropalmatine in acute and chronic pain mice models: Role of spinal sigma-1 receptor. Scientific Reports. 6, 37850(2016).
- Huang, W., Chen, Z. Piperine potentiates the antidepressant-like effect of trans-resveratrol: involvement of monoaminergic system. Metabolic Brain Disease. 28 (4), 585-595 (2013).
- Can, A., Dao, D. T. The mouse forced swim test. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3638(2012).
- Choi, J. G., Kang, S. Y. Antinociceptive effect of Cyperi rhizoma and Corydalis tuber extracts on neuropathic pain in rats. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 16 (6), 387-392 (2012).
- Mosby's. Mosby's Dictionary of Medicine, Nursing & Health Professions - Seventh edition, Nursing Standard. 20 (22), RCN Publishing Company Ltd. 36(2006).
- Vandeputte, C., Taymans, J. M. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92(2010).
- Isvoranu, G., Manole, E. Gait analysis using animal models of peripheral nerve and spinal cord injuries. Biomedicines. 9 (8), 1050(2021).
- Yankelevitch-Yahav, R., Franko, M. The forced swim test as a model of depressive-like behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52587(2015).
- Yan, H. C., Cao, X. Behavioral animal models of depression. Neuroscience Bulletin. 26 (4), 327-337 (2010).
- Papp, M., Willner, P. An animal model of anhedonia: attenuation of sucrose consumption and place preference conditioning by chronic unpredictable mild stress. Psychopharmacology. 104 (2), 255-259 (1991).
- Seminowicz, D. A., Laferriere, A. L. MRI structural brain changes associated with sensory and emotional function in a rat model of long-term neuropathic pain. Neuroimage. 47 (3), 1007-1014 (2009).
- Yalcin, I., Barthas, F. Emotional consequences of neuropathic pain: insight from preclinical studies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 47, 154-164 (2014).
- Choi, J. W., Kang, S. Y. Analgesic effect of electroacupuncture on paclitaxel-induced neuropathic pain via spinal opioidergic and adrenergic mechanisms in mice. American Journal of Chinese Medicine. 43 (1), 57-70 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
