Artykuł metodologiczny

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62820

⸱

24 września 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Life Science Center for Survival Dynamics, Tsukuba Advanced Research Alliance (TARA), University of Tsukuba, 2Ph.D. Program in Human Biology, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 3International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University, 4Division of Biomimetics, Faculty of Dentistry and Graduate School of Medical and Dental Sciences, Niigata University, 5Faculty of Medicine, University of Tsukuba

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę keratynocytów jamy ustnej pochodzących z podniebienia dorosłej myszy. Podano również metodę oceny z wykorzystaniem barwienia immunologicznego.

Streszczenie

Przez lata, większość badań z udziałem keratynocytów była prowadzona przy użyciu ludzkich i mysich keratynocytów naskórkowych. Ostatnio keratynocyty jamy ustnej przyciągnęły uwagę ze względu na ich unikalną funkcję i cechy. Utrzymują homeostazę nabłonka jamy ustnej i służą jako zasoby do zastosowań w terapiach regeneracyjnych. Jednak badania in vitro, w których wykorzystuje się doustne keratynocyty pierwotne od dorosłych myszy, były ograniczone ze względu na brak skutecznego i dobrze ugruntowanego protokołu hodowli. W tym przypadku pierwotne keratynocyty w jamie ustnej wyizolowano z tkanek podniebienia dorosłych myszy i wyhodowano w komercyjnym podłożu o niskiej zawartości wapnia uzupełnionym surowicą cheleksedową. W tych warunkach keratynocyty były utrzymywane w stanie proliferacyjnym lub podobnym do komórek macierzystych, a ich różnicowanie było zahamowane nawet po zwiększonym pasażu. Analiza ekspresji markerów wykazała, że hodowane keratynocyty jamy ustnej wykazywały ekspresję markerów komórek podstawnych p63, K14 i integryny α6 i były ujemne dla markera różnicowania K13 i markera fibroblastów PDGFRα. W wyniku tej metody uzyskano żywe i zdolne do hodowli komórki, nadające się do dalszych zastosowań w badaniu funkcji nabłonkowych komórek macierzystych jamy ustnej in vitro.

Wprowadzenie

Nabłonek jamy ustnej służy jako pierwsza bariera chroniąca organizm przed stresem środowiskowym, w tym uszkodzeniami chemicznymi lub fizycznymi oraz infekcjami bakteryjnymi i wirusowymi1,2. Błona śluzowa jamy ustnej składa się z zewnętrznej warstwy warstwowego nabłonka płaskonabłonkowego, która składa się z keratynocytów i leżącej poniżej tkanki łącznej zwanej blaszką właściwą, która składa się głównie z fibroblastów i macierzy zewnątrzkomórkowej. Błonę śluzową jamy ustnej myszy można ogólnie podzielić na trzy podtypy: żucie (podniebienie twarde i dziąsło), wyspecjalizowane (język grzbietowy) i błona śluzowa (błona śluzowa policzka, język brzuszny, podniebienie miękkie, wargi) błona śluzowa2,3 (Rysunek 1A). Nabłonek jamy ustnej jest zrogowaciały w błonie śluzowej żucia i specjalistycznej oraz niezrogowaciały w błonie śluzowej wyściółki. Pomimo swojego anatomicznego położenia nabłonek jamy ustnej jest podobny do naskórka skóry, ponieważ składa się z ciasno upakowanych komórek nabłonka o różnym stopniu zróżnicowania: warstwy podstawne zawierające niezróżnicowane komórki; warstwy kolczyste, ziarniste i zrogowaciałe, które tworzą zrogowaciały nabłonek lub warstwy pośrednie i powierzchowne, które tworzą nabłonek niezrogowaciały4. Transgeniczne modele myszy ułatwiły badanie cech komórkowych i molekularnych komórek macierzystych nabłonka jamy ustnej w podniebieniu, błonie śluzowej policzka, języku i dziąśle5,6,7,8,9,10,11. Jednak większość z tych badań wykorzystywała głównie eksperymenty in vivo na myszach. Systemy hodowli komórkowych nie były zazwyczaj stosowane ze względu na brak ustalonych i skutecznych protokołów.

System hodowli in vitro może być używany do analizy molekularnej i biochemicznej regulatorów komórek macierzystych, testów komórkowych i badań przesiewowych leków. Obecnie opracowano protokoły hodowli pierwotnych keratynocytów naskórka skóry, w których podstawowe keratynocyty mogą być z powodzeniem izolowane i hodowane do celów klinicznych i badawczych12,13,14,15. W 1980 roku Hennings i in. wykazali, że niskie stężenie wapnia (< 0,09 mM Ca2+) w pożywce hodowlanej ułatwiało proliferację i utrzymywało komórki w stanie niezróżnicowanym. Wyższy poziom wapnia sprzyjał różnicowaniu komórek i zmniejszonej proliferacji16. Następnie ustalono metodologie hodowli mysich keratynocytów naskórkowych u noworodków i dorosłych, które są szeroko stosowane do wielu modeli myszy o różnym pochodzeniu genetycznym do badań in vitro17,18,19. Chociaż nabłonek skóry i jamy ustnej ma wspólne cechy, wykazuje również wewnętrzne różnice, np. w stanie rogowacenia, szybkości rotacji, ekspresji genów i zdolności gojenia się ran3,11,20,21,22,23,24,25,26.

Chociaż pomyślnie przeprowadzono hodowlę keratynocytów w jamie ustnej człowieka27,28,29, publikacje na temat hodowli keratynocytów w jamie ustnej myszy30,31,32 są ograniczone ze względu na mały rozmiar tkanki docelowej i odmienne cechy komórek w porównaniu z naskórkiem skóry keratynocyty. Protokół ten opisuje techniki izolacji i długoterminowego posiewu pierwotnych keratynocytów jamy ustnej myszy.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu Eksperymentów na Zwierzętach na Uniwersytecie Kumamoto i Uniwersytecie Tsukuba.

1. Przygotowanie odczynników i pożywek hodowlanych

  1. Przygotować 40 ml pożywki hodowlanej keratynocytów zawierającej 60 μM wapnia i 600 μl roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego. Przygotuj 20 ml 0,025% trypsyny i 400 μl roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego.
    1. Rozmrozić roztwór hamujący trypsynę w temperaturze pokojowej i utrzymywać go w temperaturze 4 °C do momentu użycia w kroku 4.1.
      UWAGA: Odczynnik izolacyjny jest przygotowany do izolacji tkanek pięciu myszy.
  2. Aby przygotować pożywkę hodowlaną, należy wziąć 500 ml pożywki i dodać 5 ml roztworu suplementu wzrostu (patrz Tabela materiałów) (zwanego dalej kompletną pożywką) i 20% zubożonej w wapń surowicy bydlęcej (FBS) zubożonej w wapń (FBS)33 (zwanej dalej chelexed-FBS).

2. Wypreparowanie tkanki podniebienia od dorosłej myszy

  1. Ofiarować dorosłą mysz C57BL/6J (samca lub samicę) przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z przepisami zakładu dotyczącymi dobrostanu zwierząt.
    1. Usuń włosy wokół ust za pomocą golarki. Za pomocą nożyczek tnij od policzka w kierunku szczęki, po obu stronach.
      UWAGA: Mysz musi zostać znieczulona przed złożeniem ofiary. Stosuje się znieczulającą mieszaninę medetomidyny, midazolamu i butorfanolu (patrz tabela materiałów).
  2. Użyj kleszczy, aby szeroko otworzyć usta i wchłonąć krew za pomocą bawełnianego wacika. Aby zdezynfekować podniebienie, przetrzyj wnętrze jamy ustnej bawełnianym wacikiem zawierającym 10% jodu powidonu.
  3. Aby zebrać podniebienie myszy, najpierw użyj chirurgicznego ostrza skalpela, aby wykonać nacięcie brzeżne o pełnej grubości wzdłuż podniebienia zębów szczęki. Następnie dokładnie rozetnij całe podniebienie za pomocą raspatorium.
    UWAGA: Raspatorium to narzędzie służące do podnoszenia płata śluzówkowo-okostnowego (patrz Tabela Materiałów) (Rysunek 1B).
  4. Szybko przenieś tkankę podniebienia do 15 ml probówki zawierającej 4 ml kompletnego roztworu + antybiotykowo-przeciwgrzybiczego. Chusteczki należy przechowywać na lodzie, aż będą gotowe do inkubacji.
    UWAGA: W przypadku pobrania od wielu myszy tkanki podniebienia można przechowywać na lodzie do 4 godzin.

3. Wstępne leczenie tkanki podniebienia

  1. W kapturze z przepływem laminarnym przenieść tkanki do naczynia o średnicy 60 mm zawierającego 4 ml kompletnego roztworu pożywki + antybiotyku i antybiotyku.
  2. Za pomocą krótkich, kleszczyków i ostrza skalpela delikatnie usuń krew z tkanek. Umyj chusteczki 10 razy w pełnym podłożu.
  3. Przenieś tkanki do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego 4 ml 0,025% trypsyny + roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego, powierzchnią nabłonka skierowaną w dół.
    UWAGA: Powierzchnię nabłonka, która zakrzywia się do wewnątrz, należy namoczyć w roztworze trypsyny; Blaszka właściwa powinna być skierowana do góry. Tkanka powinna być spłaszczona tak bardzo, jak to możliwe, aby mogła być w całości inkubowana w roztworze trypsyny.
  4. Inkubować tkanki w 0,025% trypsyny przez ~16 godzin w temperaturze pokojowej w kapturze hodowlanym.

4. Pobieranie i hodowla komórek pierwotnych

  1. Za pomocą jednej pary kleszczyków usuń tkankę z roztworu trypsyny (w naczyniu 35 mm) i przenieś do roztworu inhibitora trypsyny w naczyniu o średnicy 60 mm (4 ml na miskę) z powierzchnią nabłonka skierowaną do góry.
  2. Używając kleszczy, aby przytrzymać krawędź podniebienia, delikatnie zeskrob warstwę nabłonka z leżącej poniżej blaszki właściwej za pomocą ostrza skalpela.
    UWAGA: Tkanka łączna nie jest trawiona przez trypsynę, więc nie złuszcza się podczas skrobania.
  3. Aby pobrać maksymalną ilość komórek nabłonka z tkanek, przenieś tkankę do innego naczynia o średnicy 60 mm z 4 ml kompletnego podłoża i powtórz etap skrobania.
    UWAGA: Upewnij się, że nie skrobasz chusteczki końcówką ostrza; Zamiast tego użyj krawędzi ostrza. Skrobanie wykonuje się przez 5-10 minut na tkankę.
  4. Umieść sterylne sitko do komórek 100 μm na wierzchu stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  5. Za pomocą sterylnej pipety przenieś 2 ml roztworu trypsyny (z kroku 4.1) do sitka w celu zwilżenia jego powierzchni.
  6. Za pomocą pipety wymieszać zawiesinę komórek w naczyniu o średnicy 60 mm (z etapów 4.2-4.3) i przefiltrować komórki przez sitko o średnicy 100 μm przygotowane w krokach 4.4-4.5.
  7. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Przygotować 15 μl roztworu błękitu trypanowego i dodać 15 μl zawiesiny komórek (krok 4.6). Przenieść 10 μl mieszanki komórek i błękitu trypanowego do hemocytometru i policzyć liczbę komórek.
    UWAGA: Jeden kawałek podniebienia myszy może dać do 1 miliona komórek.
  8. Podczas liczenia odwirować probówkę (z kroku 4.6) o sile 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Odessać supernatant za pomocą pipety. Dodać 2 ml kompletnej pożywki + chelexed-FBS do probówki. Zawiesić osad komórkowy, kilkakrotnie rozcierając go za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
  10. Płytka 2-5 x 105 komórek z jednej myszy do jednego dołka 24-dołkowej płytki wstępnie pokrytej kolagenem typu I (patrz tabela materiałów).
  11. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 dni bez zmiany pożywki.
  12. Dwa dni po wysiewie zastąp połowę pożywki kompletną pożywką + chelexed-FBS. Sprawdź morfologię komórki pod mikroskopem. Karmić komórki kompletną pożywką + chelexed-FBS co 2 dni.
    UWAGA: Po wysiewie będą obserwowane komórki o różnych rozmiarach. Około 3-5 dni po wysiewie można zaobserwować keratynocyty o morfologii kostki brukowej (Ryc. 2). Potrzeba 1-2 tygodni hodowli, zanim będzie można przeprowadzić pierwsze pasaże, a kolejne 1-2 tygodnie są konieczne, zanim komórki będą gotowe do drugiego i trzeciego pasażu. Następnie komórki będą rosły szybciej i mogą być przygotowane do krioprezerwacji. Komórki można ponownie posiać do jednego dołka (na płytce 24-dołkowej) i płytki 6-dołkowej odpowiednio w pierwszym i drugim pasażu. Późniejsze przejście będzie zależało od wzrostu i gęstości komórek. Po trzecim przejściu można zastosować współczynnik podziału komórek 1:2 lub 1:3.

5. Przejście keratynocytów

  1. Zebrać 2 ml supernatantu z naczynia hodowlanego i przelać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml (na lodzie). Umyj komórki sterylnym 1x PBS dwa razy.
    UWAGA: Gdy komórki osiągną około 70%-80% konfluencji, są gotowe do przejścia.
  2. Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA do naczynia do jednego dołka na 6-dołkowej płytce.
  3. Inkubować przez 5-15 minut w temperaturze 37 °C; po 5 minutach sprawdzić, czy komórki odrywają się od naczynia.
  4. Zneutralizować reakcję za pomocą 1 ml roztworu hamującego trypsynę i 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej + cheleksed-FBS przez delikatne pipetowanie. Następnie przenieś zawiesinę komórek do tej samej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, co w kroku 5.1.
  5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej.
  6. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie umieść 1 ml zawiesiny komórkowej na nowej 24- lub 6-dołkowej płytce hodowlanej.
    UWAGA: Niektóre komórki z wczesnych pasaży można zamrozić w mieszaninie 70% kompletnej pożywki hodowlanej + 20% chelexed-FBS + 10% DMSO. Z jednej zlewającej się płytki hodowlanej można pobrać 1-2 kriowiale komórek.

6. Kriokonserwacja i odzyskiwanie keratynocytów

  1. Zamrażanie komórek
    1. Wzrost keratynocytów do 80%-90% konfluencji.
      UWAGA: Nie dopuszczaj do przerostu komórek, ponieważ może to zmniejszyć ich stan proliferacji i żywotność.
    2. Potraktuj keratynocyty w naczyniu 0,05% trypsyny-EDTA, jak opisano w krokach 5.1-5.5.
    3. Policz keratynocyty za pomocą hemocytometru. Przygotuj kriowiale na podstawie obliczonej liczby komórek, aby umożliwić transfer 1 x 106 komórek/ml do każdej fiolki.
    4. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml roztworu 10% DMSO + 20% cheleksedu-FBS + 70% kompletnej pożywki hodowlanej (9 ml kompletnej pożywki + cheleksed-FBS i 1 ml DMSO).
    5. Dozować komórki do kriowialiów w ilości 1 ml zawiesiny na fiolkę. Umieścić fiolki w pojemniku do przechowywania kriogenicznego na noc w temperaturze -80 °C. Następnego dnia przenieść fiolki do zbiornika z ciekłym azotem.
  2. Odzyskiwanie komórek
    1. Wyjmij kriowial ze zbiornika ciekłego azotu i częściowo rozmrozić w temperaturze pokojowej. W probówce o pojemności 15 ml wymieszać 1 ml zawiesiny komórek z 3 ml kompletnej pożywki hodowlanej + chelexed-FBS.
    2. Odwirować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze 100 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej + cheleksed-FBS.
    3. Umieść zawiesiny komórek w nowych 60-milimetrowych naczyniach hodowlanych pokrytych kolagenem I. Wymieniaj pożywkę hodowlaną co 2-3 dni i przechodź komórki po zlaniu.

7. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Hodowla keratynocytów jamy ustnej na kwadratowych szkiełkach nakrywkowych (22 mm x 22 mm) na płytkach 6-dołkowych (5 x 10 5 komórek/dołek) przez 2 dni.
  2. Utrwal keratynocyty w roztworze 4% paraformaldehydu (PFA) i PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej przed trzykrotnym umyciem 1x PBS.
  3. Przepuszczalność komórek w roztworze 0,1% Trytonu w PBS. Inkubować komórki w odczynniku blokującym (2,5% surowicy koziej, 2,5% surowicy osła) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować przez noc z przeciwciałami pierwszorzędowymi (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Przeciwciała pierwszorzędowe stosowano w następujących rozcieńczeniach: królicze anty-K14 (1:1000), szczurza α6-integryna (1:100), królicze anty-p63 (1:500), królicze anty-K13 (1:100) i kozie anty-PDGFRα (1:100).
  4. Próbki przemyć w roztworze 0,1% Trytona w PBS, a następnie przeprowadzić inkubację z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe (Alexa 488 lub 555) stosowano w rozcieńczeniu 1:300.
  5. Wybarwić wszystkie próbki roztworem Hoechst przez 10 minut i zamontować kuwety na szkiełkach podstawowych.
    UWAGA: Roztwór Hoechsta służy do barwienia jąder komórek.
  6. Wykonaj obrazowanie próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego.
    UWAGA: Jasność i kontrast są dostosowywane do równej intensywności za pomocą oprogramowania do edycji obrazu.

Wyniki

Przegląd procesu sekcji i izolacji keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy
Dysocjowane keratynocyty jamy ustnej pobrano z podniebienia dorosłej myszy i hodowano w dostosowanej pożywce z 20% chelexed-FBS. Podniebienie myszy składa się z podniebienia twardego oraz podniebienia miękkiego (Rysunek 1C). Procedura izolacji keratynocytów jamy ustnej myszy została podsumowana na Rysunku 1D. Tkankę podniebienia wycinano i przenoszono do medium zawierającego roztwór antybiotyk-antymykotyk przed inkubacją w 0,025% roztworze trypsyny w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia tkankę podniebienia poddano działaniu roztworu inhibitora trypsyny oraz pełnej pożywki hodowlanej w równych objętościach. Następnie tkanki zdrapano za pomocą ostrza skalpela chirurgicznego w celu zebrania keratynocytów jamy ustnej. Zawiesinę komórkową przefiltrowano przez sitko komórkowe o oczkach 100 µm i odwirowano. Komórki wysiano następnie na 24-dołkowe płytki powlekane Kolagenem I, zawierające 2 mL pełnej pożywki hodowlanej + chelexed-FBS.

Reprezentatywne wyniki udanej izolacji keratynocytów jamy ustnej myszy
Pierwotne keratynocyty jamy ustnej rosły w monowarstwie i wykazywały morfologię brukową (Rycina 2). Małe kolonie keratynocytów były widoczne w 3-5 dniach (Rycina 2A,B); stawały się one większe i tworzyły zwarte kolonie po 1 tygodniu inkubacji (Rycina 2C). Kolonie keratynocytów wykazywały typowe cechy morfologiczne keratynocytów podstawnych, co wskazywało na ich dobry stan. Ludzkie keratynocyty jamy ustnej pozostawały nieróżnicowane przez kilka pasaży w pełnym medium hodowlanym zawierającym 0,06 mM Ca2+16,28. Pierwszy pasaż wykonano około 2 tygodnie po początkowym wysianiu (Rycina 2D). W późniejszych pasażach keratynocyty wykazywały stabilny wzrost przy krótszym okresie hodowli (Rycina 2E-G). Keratynocyty przestały rosnąć w przypadku wystąpienia znacznej kontaminacji fibroblastami podczas procesu izolacji (Rycina 2H).

Izolowane keratynocyty jamy ustnej myszy wykazują ekspresję markerów komórek podstawnych
Aby potwierdzić status pierwotnych keratynocytów jamy ustnej, przeprowadzono barwienie immunohistochemiczne z wykorzystaniem markerów komórek podstawnych: keratyny 14 (K14) oraz integryny α6.34K14 oraz integryna α6 były wykazane w keratynocytach po hodowli (Rycina 3A,B). Komórki wybarwiono również przeciwciałem przeciwko markerowi komórek macierzystych p63, aby potwierdzić ich właściwości macierzyste. Komórki z wczesnego pasażu (pasaż 4) oraz późnego pasażu (pasaż 7) wykazały jednorodną ekspresję p63 (Rycina 3C,D). W przeciwieństwie do nich, keratynocyty poddane działaniu wysokiego stężenia wapnia (indukcja 1,2 mM przez 2 dni) wykazywały zmniejszoną ekspresję p63 (Rysunek 3E), co wskazuje, że wysokie stężenie wapnia hamuje ekspresję genów związanych z komórkami macierzystymi w pierwotnych keratynocytach, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami16Marker różnicowania keratyna 13 (K13) wykazywał rzadką lub brak ekspresji zarówno wyczesach wczesnych, jak i późnych, oraz znaczną ekspresję po zastosowaniu wysokiego stężenia wapnia (Rycina 3F-H). Aby sprawdzić możliwość zanieczyszczenia hodowli keratynocytów fibroblastami, przeprowadzono barwienie z wykorzystaniem markera fibroblastów PDGFRα, stosując ten sam zestaw keratynocytów w porównaniu z zarodkowymi fibroblastami myszy (MEF). W hodowli keratynocytów nie stwierdzono ekspresji PDGFRα, w przeciwieństwie do wysokiej ekspresji zaobserwowanej w komórkach MEF (Rysunek 3I-3L). Wyniki te wykazały, że zastosowany protokół pozwala na skuteczną izolację keratynocytów warstwy podstawnej oraz utrzymanie tych komórek w stanie niezróżnicowanym.

Schemat sekcji podniebienia myszy, zestaw narzędzi i proces przygotowania tkanki; obejmuje etapy trypsynizacji.
Rysunek 1: Przegląd procedury sekcji i izolacji keratynocytów jamy ustnej myszy. (A) Schematyczne przedstawienie jamy ustnej myszy. (B) Narzędzia użyte do sekcji podniebienia i izolacji keratynocytów jamy ustnej myszy. (C) Obraz podniebienia myszy w polu jasnym. Pasek skali: 100 µm. (D) Podsumowanie protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat wzrostu hodowli komórkowej w czasie, od 3 dni do 2 tygodni, oraz pasażów od 1 do 3; kontaminacja fibroblastami.
Rycina 2: Reprezentatywne wyniki udanej izolacji keratynocytów jamy ustnej myszy. (A-G) Obrazy czasowe hodowli pierwotnych keratynocytów jamy ustnej po 3 dniach (A), 5 dniach (B), 1 tygodniu (C) i 2 tygodniach (D) od izolacji. Przedstawiono morfologię keratynocytów jamy ustnej myszy po pierwszym (E), drugim (F) i trzecim (G) pasażu. (H) Przykład kontaminacji fibroblastami w hodowli keratynocytów jamy ustnej myszy. Pasek skali: 400 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wykazujące ekspresję keratyny i integryny w hodowlach komórkowych; widoczne barwienie Hoechst.
Rysunek 3: Izolowane keratynocyty jamy ustnej myszy wykazują ekspresję markerów komórek podstawnych. (A-B) Reprezentatywne obrazy barwienia immunofluorescencyjnego dla K14 (A; czerwony) i integryny α6 (B; zielony) w 4. pasażu. (C-E) Reprezentatywne obrazy barwienia immunofluorescencyjnego dla p63 (zielony) w 4. pasażu (C), 7. pasażu (D) oraz po traktowaniu wysokim stężeniem wapnia (E). (F-H) Obrazy immunobarwienia dla K13 (zielony) w 4. pasażu (F), 7. pasażu (G) oraz po traktowaniu wysokim stężeniem wapnia (H). (I-L) Obrazy immunobarwienia dla PDGFRα (czerwony) w 4. pasażu (I), 7. pasażu (J), po traktowaniu wysokim stężeniem wapnia (K) oraz w MEF (L). Jądra barwiono Hoechst (niebieski). Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Keratynocyty pierwotne wyizolowane z naskórka ludzkiej lub mysiej skóry są wykorzystywane od wielu lat w badaniach i zastosowaniach klinicznych 12,13,15,18,27,28,29. W przeciwieństwie do tego, ustanowiono kilka protokołów izolacji i hodowli pierwotnych keratynocytów jamy ustnej od dorosłych myszy 30,31,32. W niniejszym badaniu wykorzystano komercyjną kompletną pożywkę hodowlaną i cheleksed-FBS w celu utrzymania keratynocytów w stanie proliferacyjnym lub podobnym do komórek macierzystych. Ten system hodowli może być stosowany w testach molekularnych i biochemicznych w celu lepszego zrozumienia cech komórek macierzystych nabłonka jamy ustnej i powiązanych z nimi chorób.

W tym protokole zawarto kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, stężenie trypsyny i czas inkubacji są niezbędne do wytworzenia żywotnych komórek do kolejnych hodowli. Konsekwentnie stosowaliśmy 0,025% roztwory trypsyny i 16-godzinne okresy inkubacji w kapturze komory w temperaturze pokojowej. Jeśli keratynocyty nie będą inkubowane przez wystarczająco długi czas, nie oddzielą się prawidłowo od tkanki, co spowoduje niższą końcową wydajność komórek. Po drugie, delikatne pipetowanie zawiesiny komórkowej w drugim dniu znacząco wpływa na żywotność komórek. Skrobanie należy delikatnie rozpocząć od strony nabłonka i nie przekraczać 10 minut na próbkę tkanki. Wreszcie pierwsza izolowana zawiesina komórkowa zawiera fibroblasty i inne typy komórek; Te niechciane komórki zwykle zaczną zanikać w kolejnych hodowlach.

Potencjalne ograniczenia zidentyfikowano podczas izolacji komórek i hodowli. W rzadkich przypadkach fibroblasty mogą zostać zanieczyszczone podczas procesu izolacji, a fibroblasty mogą hamować wzrost keratynocytów w kolejnych pasażach (ryc. 2H). Konieczne jest wybranie komercyjnej pożywki, która zawiera inhibitor wzrostu fibroblastów, aby wyeliminować takie zanieczyszczenie w kulturze. Ponieważ podniebienie myszy i inne błony śluzowe jamy ustnej mają stosunkowo małe rozmiary, początkowa wydajność komórek od jednej myszy może być niska. Dlatego cały okres hodowli w tym protokole - do etapu kriokonserwacji - jest dłuższy niż w przypadku pierwotnych keratynocytów skóry. Izolowane keratynocyty jamy ustnej najlepiej stosować w ciągu 10 pasaży, ponieważ dłuższe okresy hodowli mogą zmienić właściwości komórek i obniżyć liczbę komórek macierzystych.

Obecna metoda wykazała, że keratynocyty jamy ustnej myszy wykazywały ciasno upakowaną, brukowaną morfologię i tworzyły jednowarstwowe kolonie w warunkach proliferacji. Wykazali również wysoką ekspresję podstawowych markerów α6-integryny, K14 i markera komórek macierzystych p63. W przyszłych badaniach, oprócz barwienia immunofluorescencyjnego, sekwencjonowanie RNA, RT-PCR i analizy western blot zostaną wykorzystane do weryfikacji niejednorodności komórkowej i czystości doustnych keratynocytów, co jeszcze bardziej poprawi nasze zrozumienie natury tych komórek.

Po 2-3 pasażach keratynocyty jamy ustnej były na tyle stabilne, że można je było wykorzystać w dalszych eksperymentach funkcjonalnych. Co ważne, ten protokół hodowli może być łączony z transgenicznymi liniami myszy, w tym z nokautem genów, Cre-loxP i systemami indukowanymi tet, a także może być stosowany w testach komórkowych i molekularnych. W związku z tym obecny protokół zapewnia naukowcom fundamentalną i skuteczną metodę, którą można wykorzystać do lepszego zrozumienia biologii komórek macierzystych keratynocytów jamy ustnej.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (20H03266) (do A.S.), Grant-in-Aid dla początkujących naukowców (18K14709) (do A.S.), AMED pod numerem grantu JP21gm6110016 i 21bm0704067 (do A.S.) oraz granty badawcze od Takeda Science Foundation (do A.S.). Dziękujemy Centrum Zasobów i Rozwoju Zwierząt na Uniwersytecie Kumamoto oraz Centrum Zasobów Zwierzęcych na Uniwersytecie Tsukuba za doskonałą opiekę nad myszami. Dziękujemy ośrodku IRCMS na Uniwersytecie Kumamoto za wsparcie w zakresie obrazowania konfokalnego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,025% Trypsyna/EDTAGibcoR001100
0,05% Trypsyna/EDTA, czerwień fenolowaGibco25300062
0,4w/v% Roztwór błękitu trypanowegoWako207-17081
10 ml Pipeta serologicznaFalcon357551
100 µ m Nylonowe sitko do komórekFalcon352360
15 ml sterylna probówka stożkowaFalcon352096
2 mL Piper zasysającaFalcon357558
35 mm Naczynie do hodowli komórkowychCorning353801
50 ml sterylna probówka stożkowaFalcon352070
60 mm Naczynie do hodowli komórkowychCorning353802
6-dołkowa płytka do hodowli tkankowejFalcon353046
96 Płytka do hodowli dołków (u dna)Falcon353077
Antybiotyk-Antybiotyk 100xGibco15240062
Biocoat Collagen I naczynie komórkowe 60mmCorning356401
kleszczeAS ONE1-8187-03
ButorfanolMeiji Seika PharmaVetorphale
CoolCell LXCorning432002Przechowywanie kriogeniczne
BawełnaAS ONE63-1452-97
Szkiełka nakrywkowe 22 x 22 μ m kwadratMatsunami Glass Ind.
Fiolka kriogeniczna 1,2 mlThermo Scientific5000-0012
Zdefiniowany inhibitor trypsyny (DTI)GibcoR007100
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich276855-100ML
IgG przeciw królikom osłom (H + L), Alexa Fluor 555InvitrogenA31572
IgG przeciw szczurom osła (H + L), Alexa Fluor 488InvitrogenA21208
Serum dla osłaSigma-AldrichD9663-10ML
EpiLife Zdefiniowany suplement wzrostu (EDGS)GibcoS0120
EpiLife, z 60 &mikro; M wapńGibcoMEPI500CA
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco26140079
Drobne kleszczeBRC Bio Research CenterPRI13-3374
Kozia Receptor anty-PDGF i alfa;R& D SystemsAF1062
Surowica koziaSigma-AldrichG9023-10ML
Kleszcze półzakrzywioneBRC Bio Research CenterPRI13-3376
HemocytometrHirschmann Laborgerä te8100204
HoechstSigma-AldrichB2261
Nożyczki do tęczówkiMuromachi Kikai14090-09
MedetomidineNippon Zenyaku KogyoDomitor
MidazolamAstellas PharmaDormicum
skalpelFeather219AABZX00136000
ParaformaldehydWako162-16065
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem 1x, pH 7,4Gibco10010049
872612jodu powidonuY's Przeciwciało
przeciw cytokeratynie 13Abcamab92551
Królik anty-K14BioLegend905301
Królik przeciwciało anty-p63Abcamab124762
Raspatorium #14JAKO JEDEN8-4599-01
Szczur i alfa; 6-integrinBD Biosciences553745
Triton X-100Wako581-81705
Typ I Płytka 24-dołkowa powlekana kolagenemCorning354408
Type I Półmiska 60 mm powlekana kolagenemCorning356401
Type I Płytka 6-dołkowa powlekana kolagenemCorning355400
C022221No.15 Jednorazowy Kwadratowe

Bibliografia

  1. Presland, R. B., Jurevic, R. J. Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues. Journal of Dental Education. 66 (4), 564-574 (2002).
  2. Squier, C. A., Kremer, M. J. Biology of oral mucosa and esophagus. Journal of the National Cancer Institute Monographs. (29), 7-15 (2001).
  3. Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
  4. Winning, T. A., Townsend, G. C. Oral mucosal embryology and histology. Clinics in Dermatology. 18 (5), 499-511 (2000).
  5. Asaka, T., Akiyama, M., Kitagawa, Y., Shimizu, H. Higher density of label-retaining cells in gingival epithelium. Journal of Dermatological Science. 55 (2), 132-134 (2009).
  6. Bickenbach, J. R. Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin. Journal of Dental Research. 60, Spec No C 1611-1620 (1981).
  7. Bickenbach, J. R., Mackenzie, I. C. Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 618-622 (1984).
  8. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
  9. Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
  10. Willberg, J., Syrjanen, S., Hormia, M. Junctional epithelium in rats is characterized by slow cell proliferation. Journal of Periodontology. 77 (5), 840-846 (2006).
  11. Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
  12. Compton, C. C., et al. Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopic and immunohistochemical study. Laboratory Investigation. 60 (5), 600-612 (1989).
  13. Gallico, G. G., O'Connor, N. E., Compton, C. C., Kehinde, O., Green, H. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. New England Journal of Medicine. 311 (7), 448-451 (1984).
  14. Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 2(2013).
  15. O'connor, N. E., Mulliken, J. B., Banksschlegel, S., Kehinde, O., Green, H. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal-cells. Lancet. 1 (8211), 75-78 (1981).
  16. Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
  17. Caldelari, R., Suter, M. M., Baumann, D., De Bruin, A., Muller, E. Long-term culture of murine epidermal keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 114 (5), 1064-1065 (2000).
  18. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
  19. Yano, S., Okochi, H. Long-term culture of adult murine epidermal keratinocytes. British Journal of Dermatology. 153 (6), 1101-1104 (2005).
  20. Iglesias-Bartolome, R., et al. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
  21. Papagerakis, S., et al. Oral epithelial stem cells - implications in normal development and cancer metastasis. Experimental Cell Research. 325 (2), 111-129 (2014).
  22. Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of Dental Research. 82 (8), 621-626 (2003).
  23. Chen, L., et al. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471(2010).
  24. Chen, L., Gajendrareddy, P. K., DiPietro, L. A. Differential expression of HIF-1alpha in skin and mucosal wounds. Journal of Dental Research. 91 (9), 871-876 (2012).
  25. Simoes, A., et al. Differential microRNA profile underlies the divergent healing responses in skin and oral mucosal wounds. Scientific Reports. 9 (1), 7160(2019).
  26. Turabelidze, A., et al. Intrinsic differences between oral and skin keratinocytes. PLoS One. 9 (9), 101480(2014).
  27. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  28. Izumi, K., Tobita, T., Feinberg, S. E. Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells. Journal of Dental Research. 86 (4), 341-346 (2007).
  29. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
  30. Hatakeyama, S., et al. Establishment of gingival epithelial cell lines from transgenic mice harboring temperature sensitive simian virus 40 large T-antigen gene. Journal of Oral Pathology & Medicine. 30 (5), 296-304 (2001).
  31. Ookura, T., et al. Fibroblast and epidermal growth factors modulate proliferation and neural cell adhesion molecule expression in epithelial cells derived from the adult mouse tongue. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (6), 365-372 (2002).
  32. Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
  33. Brennan, J. K., Mansky, J., Roberts, G., Lichtman, M. A. Improved methods for reducing calcium and magnesium concentrations in tissue culture medium: application to studies of lymphoblast proliferation in vitro. In Vitro. 11 (6), 354-360 (1975).
  34. Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Podstawowa hodowla keratynocytówizolacja podniebienia mysiegomarkery komórek podstawnychstan komórek macierzystychekspresja keratyny 14integryna alfa6trawienie trypsynąpowlekanie kolagenemmacierzyste komórki nabłonka jamy ustnej
Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.