Duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w chorobie niedokrwiennej serca

Podsumowanie

Terapia genowa mięśnia sercowego w chorobie niedokrwiennej serca jest bardzo obiecująca dla przyszłych terapii. W tym miejscu przedstawiamy duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w niedokrwiennym sercu.

Streszczenie

Choroba wieńcowa jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności i zachorowalności na całym świecie. Pomimo postępu obecnych metod leczenia, znaczna część pacjentów z chorobą wieńcową nadal ma objawy. Angiogeneza terapeutyczna za pośrednictwem terapii genowej oferuje nowatorską metodę terapeutyczną poprawiającą perfuzję mięśnia sercowego i łagodzącą objawy. Terapia genowa z różnymi czynnikami angiogennymi została zbadana w kilku badaniach klinicznych. Ze względu na nowatorstwo metody, postęp terapii genowej mięśnia sercowego to ciągła droga od ławki do łóżka. Dlatego do oceny bezpieczeństwa i skuteczności potrzebne są duże modele zwierzęce. Im bardziej duży model zwierzęcy identyfikuje pierwotną chorobę i punkty końcowe stosowane w klinikach, tym bardziej przewidywalne są wyniki badań klinicznych. W tym miejscu przedstawiamy duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w niedokrwiennym sercu świni. Stosujemy klinicznie istotne metody obrazowania, takie jak obrazowanie ultrasonograficzne i ¹⁵_H2O-PET. Aby ukierunkować transfery genów do pożądanego obszaru, stosuje się mapowanie elektroanatomiczne. Celem tej metody jest: (1) naśladowanie przewlekłej choroby wieńcowej, (2) indukowanie terapeutycznej angiogenezy w niedotlenionych obszarach serca oraz (3) ocena bezpieczeństwa i skuteczności terapii genowej przy użyciu odpowiednich punktów końcowych.

Wprowadzenie

Choroba wieńcowa jest odpowiedzialna za ogromną część śmiertelności i obciążenia chorobami na całym świecie¹. Obecne strategie leczenia to interwencje przezskórne, leczenie farmakologiczne i operacja pomostowania². Jednak pomimo postępu tych obecnych metod terapeutycznych, wielu pacjentów cierpi na tak zwaną oporną na leczenie dławicę piersiową, co podkreśla niezaspokojoną potrzebę nowych metod leczenia³. Angiogeneza terapeutyczna za pośrednictwem terapii genowej może być ukierunkowana na tę grupę pacjentów.

Terapia genowa mięśnia sercowego jest najczęściej dostarczana przy użyciu różnych wektorów wirusowych, najczęściej adenowirusa z niedoborem replikacji⁴. Jako geny terapeutyczne stosuje się różne angiogenne czynniki wzrostu. Najbardziej istotnie zbadanymi angiogennymi czynnikami wzrostu są czynniki wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), które pośredniczą w sygnalizacji angiogennej poprzez receptory czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGFR) i ich koreceptory⁵. Kilka badań klinicznych dowiodło korzyści i bezpieczeństwa terapii genowej serca i sprawiło, że ta nowatorska metoda leczenia stała się realistyczną opcją leczenia chorób niedokrwiennych serca^6,7. Jednak koncepcja ta nadal wymaga ulepszenia genów terapeutycznych i wektorów wirusowych, które są testowane na dużych modelach zwierzęcych przed wejściem do klinik. Świnia była często używana jako zwierzę laboratoryjne, ponieważ jej serce jest bardzo podobne do serca ludzkiego. Wielkość układu sercowo-naczyniowego świni pozwala na stosowanie podobnych wynalazków cewników, jakie stosuje się u ludzi. Wszystkie metody obrazowania dostępne dla ludzi mogą być stosowane u świń⁸.

Istnieje kilka dużych modeli zwierzęcych dla przewlekłego niedokrwienia. Najczęściej używany jest model dusiciela ameroid^9,10,11. Wadą tej metody jest inwazyjność, ponieważ torakotomia jest potrzebna, aby uzyskać dostęp do naczyń wieńcowych. Wcześniej w naszej grupie opracowano miniinwazyjny model stentu z wąskim gardłem dla przewlekłego niedokrwienia mięśnia sercowego¹². Metoda ta jest również stosowana w tym manuskrypcie do wywoływania niedokrwienia mięśnia sercowego.

Użyteczność obrazowania ultradźwiękowego znacznie się rozwinęła, pomimo wieku tej metody obrazowania. Na przykład szczep mięśnia sercowego jest nadal używany głównie w badaniach ze względu na swoją nowość. Szczep mięśnia sercowego odzwierciedla zmiany w funkcji skurczowej serca lepiej niż tradycyjny pomiar frakcji wyrzutowej w trybie M¹³. Tak więc tutaj, w dużym modelu zwierzęcym, wykorzystuje się pomiar obciążenia mięśnia sercowego. Aby ocenić czynność serca, rzut serca mierzy się również za pomocą obrazowania kinowego lewej komory podczas angiografii. Pojemność minutowa serca jest mierzona zarówno w spoczynku, jak i pod wpływem stresu wywołanego dobutaminą w celu oceny funkcji mięśnia sercowego w warunkach stresu.

Oprócz pomiarów funkcji serca, informacje na temat perfuzji mięśnia sercowego są niezbędne w badaniach nad terapią genową mającą na celu terapeutyczną angiogenezę. W tym modelu zwierzęcym zwierzęta są obrazowane za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej radiowodnej znakowanej ¹⁵O (¹⁵H₂O-PET), ponieważ jest to złoty standard pomiaru perfuzji mięśnia sercowego. ¹⁵H₂O-PET został wcześniej zatwierdzony do pomiaru perfuzji niedokrwionego serca świni ¹⁴.

Tak więc, metody i modalności wymienione powyżej stanowią doskonałą perspektywę do oceny skuteczności terapii genowej w niedokrwionym sercu.

Protokół

Przedstawione tutaj eksperymenty są przeprowadzane na około 10-tygodniowych samicach świń domowych i są zatwierdzone przez Radę Doświadczalną na Zwierzętach w Finlandii. Zwierzęta ważą 30-40 kg na początku protokołu, co pozwala na ten sam sprzęt zabiegowy i metody obrazowania, jakie są możliwe dla ludzi. Przewlekłe niedokrwienie jest wywoływane 14 dni przed transferem genów, a czas obserwacji po transferze genów zależy od użytego wektora wirusowego. Protokół badania jest pokazany w Rysunek 1. Protokół ten może być stosowany do wykonywania zastrzyków terapii genowej za pośrednictwem adenowirusa lub AAV. Czas pobierania próbki musi być dostosowany do piku ekspresji transgenu, który zależy od użytego wektora wirusowego. Na przykład podczas wykonywania transferów genów adenowirusowych czas pobrania próbki jest ustawiony na 6 dni po transferze genów.

1. Leki

1. Podawać dawkę dobową 200 mg amiodaronu i 2,5 mg bisoprololu w celu zapobieżenia śmiertelnym komorowym zaburzeniom rytmu serca. Leczenie rozpoczyna się 1 tydzień przed operacją niedokrwienia i jest kontynuowane codziennie aż do wizyty kontrolnej.
2. Ponadto należy podawać zwierzętom doustne dawki klopidogrelu (300 mg) i kwasu acetylosalicylowego (300 mg) na 1 dzień przed operacją niedokrwienia, aby zapobiec ostrej zakrzepicy w stencie po umieszczeniu stentu.
3. Na początku operacji niedokrwienia należy podać dożylnie 100 mg lidokainy i 2,5 ml (246 mg/ml)_MgSO4 zwierzętom, aby zapobiec komorowym zaburzeniom rytmu serca.
4. Podać domięśniowe wstrzyknięcie cefuroksymu (500 mg) na początku każdej operacji w celu zapobiegania zakażeniom.
5. Podawać 30 mg enoksaparyny dożylnie na początku operacji niedokrwienia i podskórnie po zabiegu operacyjnym w celu zapobiegania zakrzepicy.
6. W celu znieczulenia i znieczulenia należy podać 1,5 ml atropiny, 6 ml azaperonu (40 mg/ml), propofolu 20 mg/ml z szybkością 15 mg/kg / h i fentanylu 50 μg/ml z szybkością 10 μg/kg/h. Dawki leku były takie same dla każdej świni. Zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi stosowania u zwierząt w celu podania dawki.
7. Znieczulaj zwierzęta podczas wszystkich operacji. Wszystkie operacje powinny być wykonywane w sterylnym środowisku przy użyciu sterylnej techniki.

2. Echokardiografia przezklatkowa

1. Wykonaj echokardiografię przezklatkową przed operacją niedokrwienia, transferem genów i eutanazją, aby ocenić wykrywalny płyn osierdziowy i określić szczep mięśnia sercowego.
2. Umieść przetwornik w trzeciej lub czwartej przestrzeni międzyżebrowej pod pachą świni, aby uzyskać dostęp do krótkich widoków przymostkowych na poziomie zastawki mitralnej, mięśnia brodawkowatego i poziomu wierzchołkowego (wideo 1). Znacznik przetwornika powinien wskazywać mostek świni. Aby zapisać klip, naciśnij przycisk Pobierz.

3. Operacje wewnątrznaczyniowe pod kontrolą fluoroskopową

1. Wykonaj obrazowanie cine lewej komory po angiogramach wieńcowych przed operacją niedokrwienia, transferem genów i pobraniem tkanek.
2. Przygotowanie do operacji
   1. Przygotować się do operacji, uspokajając świnie wstrzyknięciem domięśniowym 1,5 ml atropiny i 6 ml azaperonu.
   2. Po sedacji należy wprowadzić znieczulenie ogólne propofolem i fentanylem do zabiegów angiograficznych u świń w dawkach odpowiednio 15 mg/kg/h i 10 μg/kg/h.
      UWAGA: Świnie są znieczulane na cały zabieg.
   3. Wspomaganie wentylacji poprzez intubację i respirator oraz monitorowanie parametrów fizjologicznych, takich jak EKG i parametry oddechowe.
3. Umieszczenie osłony wprowadzającej
   1. Umieść osłonkę wprowadzającą w prawej tętnicy udowej dla wszystkich operacji, co jest standardową praktyką w kardiologii. Użyj ultradźwięków, aby śledzić tętnicę udową i przekłuć ją igłą wejściową (18 G).
      UWAGA: Użyj osłonki wprowadzającej 8F do transferu genów do mięśnia sercowego i osłonki 6F do wszystkich innych operacji. Przełóż prowadnik osłonki przez igłę, aby przewlec tętnicę i przytrzymaj prowadnik nieruchomo podczas wyjmowania igły.
   2. Włóż osłonkę wprowadzającą wzdłuż prowadnika, a po umieszczeniu usuń prowadnik i podaj świni 1,25 mg diazotanu podjęzykowego w celu wywołania rozszerzenia naczyń wieńcowych.
4. Koronarografia
   1. Wykonaj koronarografię bezpośrednio przed operacją niedokrwienia, transferem genów i pobraniem tkanek. Maszyneria potrzebna do wykonania angiogramów jest pokazana na Rysunek 2.
   2. Użyj cewnika 6F pod kontrolą fluoroskopową z jodowym środkiem kontrastowym, aby zobrazować prawą tętnicę wieńcową i lewą wstępującą tętnicę wieńcową (wideo 2).
5. Obrazowanie cine lewej komory w spoczynku i stresie dobutaminy
   1. Podaj 21 ml bolusa jodowego środka kontrastowego do lewej komory za pomocą cewnika warkoczowego 5F za pomocą automatycznego wstrzykiwacza. Najpierw ustaw czas trwania bolusa na 3 s, a całkowitą objętość na 21 ml. Następnie naciśnij Pojedynczy i Tak.
   2. Obliczyć frakcję wyrzutową za pomocą oprogramowania pomiarowego stacji roboczej angiograficznej. Aby wykonać obliczenia, wybierz opcję Analiza komorowa danego obrazu. Przewiń obraz, aby wybrać przedział czasowy, jeden w rozkurczu i jeden w skurczu. Wybierz narzędzie, aby narysować kontury komór dla każdego przedziału czasowego.
      UWAGA: Oprogramowanie oblicza teraz frakcję wyrzutową i objętość wyrzutową metodą Simpsona. Pomiar frakcji wyrzutowej wykonywany jest w stanie spoczynku i pod wpływem stresu wywołanego dobutaminą.
6. Obrazowanie stresu
   1. Dobutaminę należy podawać dożylnie w dawkach rosnących od 10 μg/kg/min do 20 μg/kg/min w przypadku obrazowania stresu wywołanego dobutaminą, aż do osiągnięcia docelowej częstości akcji serca 160 uderzeń na minutę. Następnie wykonaj obrazowanie filmowe.
7. Operacja niedokrwienia
   1. Umieścić stent z wąskim gardłem w lewej tętnicy wieńcowej (LAD) 14 dni przed transferem genu w celu wywołania przewlekłego niedokrwienia mięśnia sercowego. Po umieszczeniu stentu z wąskim gardłem sprawdź, czy stent z wąskim gardłem jest prawidłowo umieszczony, ograniczając przepływ krwi w naczyniach wieńcowych.
      UWAGA: Stent z wąskim gardłem jest umieszczany na cewniku rozszerzającym i składa się ze stentu z gołego metalu pokrytego rurką z politetrafluoroetylenu uformowaną w kształt wąskiego gardła w celu zmniejszenia przepływu krwi w naczyniach wieńcowych⁹.
8. Definiowanie rozmiaru stentu
   1. Wybierz rozmiar stentu, 3,0/3,5/4,0 x 8 mm, zgodnie z rozmiarem lewej wstępującej tętnicy wieńcowej w angiogramie, korzystając z oprogramowania do automatycznego pomiaru w stacji roboczej angiograficznej (Wideo 3)¹².
9. Rozmieszczenie stentu
   1. Umieść cewkę w lewej tętnicy wieńcowej i wsuń stent z wąskim gardłem do LAD, umieszczając go dystalnie do pierwszej przekątnej.
   2. Napompuj stent do nominalnego ciśnienia w tętnicy za pomocą deflatora o stosunku stentu do światła 1,3, zakotwiczając wąskie gardło na miejscu. Po upływie dodatkowych 15 s należy opróżnić stent i wycofać sprzęt z tętnicy.
      UWAGA: Potwierdź prawidłowe umieszczenie stentu z wąskim gardłem za pomocą angiogramu.

4. Obrazowanie PET

UWAGA: Dzień przed transferem genów wykonaj ¹⁵skanów PET/CT radiowodnych z oznaczeniem O (wymaga środowiska szpitalnego i techników radiologicznych).

1. Obrazowanie referencyjne
   1. Wykonaj tomografię komputerową (CT) przed obrazowaniem odpoczynku i stresu. Użyj informacji z CT do korekcji tłumienia.
2. ¹⁵Obrazowanie wody radiowej z oznaczeniem O
   1. Wykonaj obrazowanie spoczynku i stresu za pomocą bolusa 800 MBq ¹⁵H₂O.
3. Obrazowanie stresu
   1. Wykonać obrazowanie naprężeń za pomocą kolejnego bolusa wodnego 800 MBq ¹⁵O, po odpowiednim rozpadzie promieniotwórczym wynoszącym 12 min.
      UWAGA: Przekrwienie jest wywoływane przez adenozynę (200 μg/kg/min dożylnie), jak opisano wcześniej¹².

5. Transfer genów

1. Mapowanie elektroanatomiczne
   1. Przejdź do mapowania elektroanatomicznego po angiogramie wieńcowym i pomiarach funkcjonalnych (echokardiografia, obrazowanie LV cine).
   2. Wprowadzić cewnik mapujący do lewej komory przez osłonkę kości udowej pod kontrolą fluoroskopową.
      UWAGA: Zarejestruj około 100-150 punktów wokół lewej komory za pomocą cewnika mapującego, aby utworzyć mapę elektroanatomiczną.
2. Wykończenie mapy elektroanatomicznej
   1. Usuń punkty odstające, aby zapewnić bardziej wiarygodną mapę elektroanatomiczną lewej komory.
   2. W tym celu należy wybrać opcję Płaszczyzny tnące mapy i usunąć punkty, które różnią się od punktów tworzących kształt komory. Następnie wybierz opcję Trajektorie dla widoku mapy i usuń punkty, które przebyły się poziomo podczas rejestrowania punktów.
      UWAGA: Upewnij się, że pozostałe punkty pokrywają lewą komorę i w razie potrzeby zarejestruj więcej punktów.
3. Zastrzyki z transferu genów
   1. Wprowadzić cewnik do iniekcji domięśniowej serca do lewej komory przez osłonkę kości udowej pod kontrolą fluoroskopową. Ustawić długość igły iniekcyjnej na 3 mm.
4. Kryteria wstrzyknięć do mięśnia sercowego
   1. Kieruj transferami genów za pomocą systemu mapowania elektroanatomicznego i kieruj wstrzyknięcia do żywotnych, ale hipokinetycznych obszarów lewej komory.
      UWAGA: Aby uzyskać żywotność, jako kryterium należy użyć jednobiegunowego napięcia powyżej 5 mV. W przypadku hipokinezji wybierz lokalne skracanie liniowe (LLS) tak niskie, jak to możliwe, co najmniej poniżej 12%, ale najlepiej poniżej 6%¹³.
5. Iniekcje domięśniowe
   1. W ciągu 30 s wstrzyknąć materiał wektorowy do punktu selekcji (krok 5.4) i trzymać igłę do wstrzykiwań wewnątrz mięśnia sercowego przez dodatkowe 5 sekund przed wycofaniem, aby zapobiec cofaniu się do lewej komory.

6. Eutanazja i pobieranie próbek

UWAGA: Po pomiarach angiogramu wieńcowego i frakcji wyrzutowej opisanych odpowiednio w krokach 3.4.1 i 3.5.2, podaj dożylnie 50 ml nasyconego chlorku potasu znieczulonej świni.

1. Utrwalenie perfuzji serca
   1. Zbierz serce z jamy klatki piersiowej. Spłucz wodą. Umieść igłę 18 G nad zastawką aortalną i podłącz igłę do pompy perfuzyjnej. Perfuzja serca za pomocą 750 ml 1% paraformaldehydu (PFA).
2. Pobieranie próbek
   1. Pokrój serce na plastry o grubości 1 cm za pomocą ostrego noża kuchennego. Pobrać próbki z obszaru transferu genów do 4% PFA i ciekłego azotu.
      UWAGA: Aby pobrać kontrole ujemne, należy pobrać próbkę kontrolną z tylnej ściany lewej komory.
3. Bezpieczne pobieranie tkanek
   1. Pobieraj próbki z odległych tkanek, takich jak płuca, wątroba, nerki, śledziona i jajniki. Pobrać próbki do 4% PFA i ciekłego azotu.

7. Przechowywanie próbek

1. Próbki do barwienia należy przechowywać w 4% PFA przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Codziennie wymieniaj PFA na świeży płyn.
   1. Po 48 godzinach zastąp PFA 15% sacharozą w wodzie dejonizowanej. Przechowywać przez co najmniej 24 godziny przed umieszczeniem próbek w blokach parafinowych. Próbki zamrożone błyskawicznie przechowuje się w temperaturze -70 °C.

Wyniki

Sukces operacji niedokrwienia można potwierdzić za pomocą tego protokołu za pomocą angiogramu wieńcowego i określając obszar hipokinetyczny za pomocą ultrasonografii przezklatkowej (Rysunek 1) przed przystąpieniem do dostarczania genu. Stan niedrożności naczyń wieńcowych można ocenić za pomocą angiogramu wieńcowego, a mapowanie elektroanatomiczne zapewnia obszary niedokrwienne i hibernacyjne.

Skuteczność terapii genowej można przeanalizować, mierząc napięcie obwodow...

Dyskusja

Punkty czasowe tego protokołu mogą być modyfikowane w zależności od użytego wektora wirusowego. Również analizy immunohistologiczne mogą być dobrane w zależności od genu terapeutycznego. W razie potrzeby możliwe jest również dodanie większej liczby punktów czasowych i końcowych do protokołu.

Protokół ten składa się z etapów, które są niezbędne do powodzenia i niemożliwe do późniejszego skorygowania. Po pierwsze, jeśli nie uda się wywołać odpowiedniego niedokrwienia, zwierzę musi zostać wyklucz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1% PFA	VWR	VWRC28794.295	Przygotowany z proszku paraformaldehydu
15 % sacharozy	VWR	VWRC27480.294	Przygotowany ze stałej sacharozy
4% PFA	VWR	VWRC28794.295	Przygotowany z proszku paraformaldehydu
5 F Cewnik warkoczowy	Cordis	534-550S
Cewnik 6 F AR2	Cordis	670-112-00
6 F osłona wprowadzająca	Cordis	504-606X
8 F osłona wprowadzająca	Cordis	504-608X
Kwas acetylosalicylowy			Zmienny producent
Amiodaron			Zmienny producent
Stacja angiograficzna	GE Healthcare
Zestaw angiolaboratoryjny	Mö		Zaprojektowany na potrzeby naszego angiolaboratorium, zawiera sterylne serwety, kubki i waciki
Bisoprolol			Różny producent
Cefuroksym			Różny producent
Clopidogrel			Różny producent
Coroflex Niebieski stent	B.Braun Medical	5029012	Numer katalogowy zależy od wielkości stentu
Crile kleszcze
Cyclotron	GE Healthcare
Dobutamina			Różny producent
System mapowania elektroanatomicznego	Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company
Enoxaparin			Różny producent
Fentanyl			Zmienny producent
Cewnik do iniekcji domięśnia sercowego	Johnson & Johnson
Jod środek kontrastowy	Iomeron
Nóż			Różny producent
Lidokaina			Zmienny producent
Ciekły azot			Zmienny producent
MgSO4			Różny producent
Igła 18 G	Cordis	12-004943
			perfuzyjna
Skaner PET-CT	Siemens Healthcare
Rurka
Propofol			Różni producenci
Skalpel nr 11	VWR	SWAN0503
Diazotan podjęzykowy	Takeda
Aparat ultrasonograficzny	Philips